INAUGURAL DISSERTATION - core.ac.uk PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 in E. coli ... During pollen development...
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INAUGURAL DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der Ruprecht-Karls-Universität
vorgelegt von
Diplom-Biologe Rolf Stratmann
Tag der mündlichen Prüfung:
Pektin Methylesterasen (PMEs) und PME-Inhibitor (PMEI) – verwandte Proteine im Maispollen: Genexpression,
subzelluläre Lokalisation und funktionelle Charakterisierung
Gutachter: Prof. Dr. Thomas Rausch
Prof. Dr. Rüdiger Hell
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung........................................................................................................................... 1
2 Einleitung......................................................................................................................................... 3
2.1 Zur Rolle des männlichen Gametophyten in der Reproduktion der Pflanzen................................3
2.2 Pollenschlauchwachstum: Ein besonderer Typ von extremen Spitzenwachstum..................... 4
2.2.1 Der Pollenschlauch............................................................................................................ 4
2.2.2 Steuerung und Regulation des Pollenschlauchwachstums.................................................5
2.2.2.1 Notwendigkeit einer gerichteten Zellwandsynthese...................................................5
Calcium Ionen....................................................................................................................5
GTPasen.............................................................................................................................5
Aktin.................................................................................................................................. 6
cAMP.................................................................................................................................7
Calmodulin CaM............................................................................................................... 7
Protonen.............................................................................................................................8
Kalium und Chlorid Ionen.................................................................................................8
Wachse...............................................................................................................................8
Flavonoide......................................................................................................................... 8
2.2.2.2 Genereller Aufbau der Pollenschlauchzellwand in Dikotyledonen und
Monokotyledonen...................................................................................................................9
2.2.3 Die Rolle der Pektine und ihres Methylierungsstatus........................................................9
2.2.3.1 Pektinbiosynthese.......................................................................................................9
2.2.3.2 Biologische Aufgaben von Pektinen........................................................................ 11
2.2.3.3 Pektin in der Zellwand............................................................................................. 12
2.2.3.4 Signalweiterleitung und Pathogenabwehr durch Oligogalacturonide (OGAs)........ 17
2.2.4 Pektin Methylesterasen.................................................................................................... 17
2.2.4.1 Proteinstruktur und Katalysemechanismus von Pektin Methylesterasen.................18
2.2.4.2 Physiologische Funktionen von Pektin Methylesterasen......................................... 19
2.2.4.3 Regulation von Pektin Methylesterasen................................................................... 20
2.2.4.4 PME Inhibitoren....................................................................................................... 21
2.2.4.5 Die Rolle von PMEs und PMEI-RPs während der Pollenentwicklung:
Der Pollenschlauch als Modellsystem zur Identifizierung von
Pektinstoffwechselvorgängen während des gerichteten Spitzenwachstums........................ 22
3 Zielsetzung......................................................................................................................................24
4 Material und Methoden................................................................................................................ 26
4.1 Pflanzenmaterial...................................................................................................................... 26
4.1.1 Anzucht von Zea mays Pflanzen der Sorte „Lixis“..........................................................26
4.1.2 Pollenproben von Nicotiana tobaccum ........................................................................... 26
4.2 Isolation von Zellwandproteinen aus Maispollen bzw. aus aufgeschlossenen Zellen.............26
4.3 Isolation der Zellwandproteine aus Maisblütengeweben zur Auftrennung in einer
Gelfiltration....................................................................................................................................26
4.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen nach Bradford........................................... 27
4.5 Proteinfällungen.......................................................................................................................28
4.5.1 Acetonfällung von Proteinen aus einer wässrigen Lösung.............................................. 28
4.5.2 Trichloressigsäure-fällung von Proteinen........................................................................ 28
4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese...................................................................................28
4.7 Proteinfärbungen......................................................................................................................29
4.7.1 Coomassiefärbung von Gelen.......................................................................................... 29
4.7.2 Amidoschwarzfärbung..................................................................................................... 29
4.7.3 Ponceaurotfärbung........................................................................................................... 29
4.8 Western-Blot Analyse..............................................................................................................30
4.9 Arbeiten mit Escherichia coli.................................................................................................. 30
4.9.1 Bakterienmedien.............................................................................................................. 31
4.9.2 Herstellung einer Glycerin-Bakterienstocklösung........................................................... 31
4.9.3 Herstellung elektrokompetenter E. coli-(XL1-Blue)-Zellen............................................31
4.9.4 Elektroporation von E. coli.............................................................................................. 32
4.9.5 Proteinexpression der vier rekombinanten Pektin-Methylesterase-Inhibitor-verwandten-
Proteine PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 in E. coli...........................................................................32
4.9.6 Proteinexpression verschiedener Pektin-Methylesterasen und PME-Fragmente in E. coli
...................................................................................................................................................33
4.10 Arbeiten mit Pichia pastoris..................................................................................................33
4.10.1 Pichia pastoris Medien.................................................................................................. 33
4.10.2 Herstellung von elektrokompetenten Pichia pastoris....................................................33
4.10.3 Elektroporation von Pichia pastoris.............................................................................. 34
4.10.4 Proteinexpression in Pichia Pastoris............................................................................. 34
4.11 Affinitätsreinigung von Antiseren......................................................................................... 34
4.12 Lektin Chromatographie........................................................................................................ 35
4.13 Größenausschluss-Flüssigkeitschromatographie................................................................... 35
4.14 Ballistische Transformation...................................................................................................36
4.14.1 Funktionsprinzip der 'Particle Gun' ...............................................................................36
4.14.2 Partikelpräparation ........................................................................................................ 37
4.14.3 Transformation von Nicotiana tobaccum Pollen .......................................................... 37
4.14.4 Pollenkeimung............................................................................................................... 37
4.14.5 Beschuss der Zellen....................................................................................................... 38
4.15 Mikroskopie .......................................................................................................................... 38
4.16 PME Assay ........................................................................................................................... 39
4.16.1 Inhibitionstest für PMEs................................................................................................ 40
4.17 Invertase-Assay......................................................................................................................40
4.18 DNA-Methoden..................................................................................................................... 43
4.18.1 Isolierung von Plasmid DNA im kleinen Maßstab........................................................ 43
4.18.2 Isolierung von Plasmid DNA über Ionenaustauschersäulen..........................................43
4.18.3 Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzenmaterial...............................................43
4.18.4 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA (OD-Messung)......................44
4.18.5 DNA-Fällung zur Reinigung und Konzentrierung.........................................................44
4.18.6 Restriktion von DNA..................................................................................................... 44
4.18.7 Dephosphorylierung der 5´-Enden von DNA-Fragmenten mit alkalischer Phosphatase
...................................................................................................................................................45
4.18.8 Ligation von DNA Fragmenten..................................................................................... 45
4.18.9 RNA-Reinigung und cDNA Synthese........................................................................... 46
4.18.10 PCR-Techniken............................................................................................................46
4.18.11 RLM RACE zur Amplifikation von Volllängen cDNAs.............................................46
4.18.12 Reinigung von DNA Fragmenten................................................................................ 47
4.18.13 Sequenzierung von Plasmiden..................................................................................... 47
4.18.14 DNA-Gelelektrophoresen............................................................................................ 47
4.18.14.1 Agarosegele.......................................................................................................... 47
4.18.14.2 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).............................................. 47
4.18.14.3 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen...........................................48
4.19 RNA-Methoden..................................................................................................................... 48
4.19.1 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von RNA............................................... 48
4.19.2 RNA-Agarosegelelektrophorese.................................................................................... 49
4.20 Vektoren und Oligonucleotide...............................................................................................49
4.21 Abkürzungen und Internetadressen....................................................................................... 52
5 Ergebnisse...................................................................................................................................... 54
5.1 cDNS-Klonierung von vier in Maispollen exprimierten PME-Isoformen.............................. 54
5.2 Identifizierung und Re-Klonierung von zwei Typ I PMEs aus Mais...................................... 54
5.2.1 Re-Klonierung der pollenspezifischen ZmC5 PME: Sequenzkorrektur..........................54
5.2.2 Identifizierung einer neuen Typ I PME aus Zea mays.....................................................56
5.3 Identifizierung und Klonierung von zwei Typ II PMEs aus Mais...........................................59
5.3.1 Identifizierung einer neuen Typ II PME aus Zea mays Pollen........................................ 59
5.3.1.1 Analyse der erhaltenen PME Aktivitätsbanden........................................................60
5.3.2 Identifizierung einer weiteren Typ II PME aus Mais...................................................... 62
5.4 Versuche zur heterologen Expression der rekombinanten PME-Proteine in verschiedenen
Expressionssystemen..................................................................................................................... 63
5.5 Expressionsmuster der Pektin Methylesterasen PME1 bis PME4 in Zea mays mittels
semi-quantitativer RT-PCR........................................................................................................... 64
5.6 cDNS-Klonierung von vier in Maispollen exprimierten PMEI-Isoformen............................. 66
5.7 Entwicklungsabhängige Expression der verschiedenen PMEI-Isoformen..............................67
5.8 Sind die nativen PMEI-RPs aus Zea mays glykosiliert?..........................................................68
5.9 Heterologe Expression von vier rekombinanten, in Maispollen exprimierten PMEI-Proteinen
....................................................................................................................................................... 69
5.10 Indirekter Nachweis von Disulfidbrücken in PMEI-RPs..................................................72
5.11 Versuche zum Nachweis der Komplexbildung zwischen PME- und PMEI-Proteinen.... 74
5.12 In vitro-Versuche zur Inhibition von PME-Aktivität........................................................76
5.13 Wirkung von exogener PME-Gabe auf Pollenkeimung und Pollenschlauchwachstum........77
5.14 Subzelluläre Lokalisierung von Mais PME- und PMEI-Proteinen in wachsenden
Pollenschläuchen mittels Reporter-Fusionen............................................................................79
5.14.1 Klonierungen von zwei Typ I PMEs und zwei Typ II PMEs aus Zea mays in den
Vektor pHD223::RFP............................................................................................................... 79
5.14.2 Klonierung von PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 aus Zea mays in den Vektor pHD32::YFP
...................................................................................................................................................79
5.14.3 Kotransformation von Tabakpollen mit pHD228::PME2::RFP und den PMEI-RP
Vektoren....................................................................................................................................86
6 Diskussion.......................................................................................................................................88
6.1 Identifizierung von Typ I und Typ II PMEs aus Mais.............................................................89
6.2 Transkripte der vier identifizierten Typ I und Typ II PMEs lassen sich in unterschiedlichen
Maisgeweben nachweisen..............................................................................................................90
6.3 In Pollenproben kann nur eine PME Aktivitätsbande und nur eine Typ II PME nachgewiesen
werden............................................................................................................................................91
6.4 Die klonierten PMEs lassen sich weder in den verwendeten bakteriellen Systemen noch im
eukaryontischen Pichia pastoris System zur Expression bringen................................................. 92
6.5 Die Typ I PMEs besitzen eine Invertase- und PME-Inhibitoren homologe N-terminale Pro-
Domäne..........................................................................................................................................95
6.6 Mit Mais PMEI-RPs lassen sich weder Invertase- noch Pektin Methylesterase-Aktivitäten
inhibieren....................................................................................................................................... 98
6.7 Es konnten keine Interaktions/Bindepartner der vier PMEI-RPs nachgewiesen werden........99
6.8 PMEI-RP1 und PMEI-RP3 werden in die Zellwand sekretiert und lokalisieren an der
Pollenschlauchspitze....................................................................................................................100
6.9 PMEI-RP2 lokalisiert im heterologen Tabakpollensystem im sekretorischen Weg, lässt sich
aber nicht in der Zellwand bzw. an der Pollenschlauchspitze nachweisen................................. 101
6.10 Das Typ II PME Fusionsprotein PME2::RFP lässt sich in der Zellwand und im
Pollenschlauch als diffuses Signal nachweisen........................................................................... 102
6.11 Ausblicke............................................................................................................................. 102
7 Literaturverzeichnis.................................................................................................................... 104
8 Danksagung..................................................................................................................................118
1. Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Pektin Methylesterasen (PMEs) und Pektin Methylesterase Inhibitor verwandte Proteine
(PMEI-RPs) im Maispollen: Genexpression, subzelluläre Lokalisation und funktionelle
Charakterisierung
Während der Pollenentwicklung und dem Pollenschlauchwachstum spielen dynamische
Veränderungen der Pektinzusammensetzung in der Zellwand eine entscheidende Rolle. Besonders
die durch Pektin Methylesterasen vermittelte Demethylierung der Pektinmatrix hat Auswirkungen
auf die physikalischen Eigenschaften der Zellwand.
Durch MALDI- bzw. ESI-TOF Untersuchungen von Maispollenproben und Datenbankrecherchen
wurden unterschiedliche Pektin Methylesterasen identifiziert. Nach Erhalt der vollständigen cDNSs
wurden diese in bakterielle und eukaryotische Expressionsvektoren kloniert. Von den vier
identifizierten PMEs besitzen zwei Isoformen eine für Typ I charakteristische Prodomäne. Die
anderen zwei Isoformen besitzen keine Prodomäne und gehören zu den Typ II PMEs. Mit Hilfe der
rekombinanten Proteine sollen, mittels in vitro Untersuchungen, die biologische(n) Funktion(en)
aufgeklärt werden. Mittels semiquantitativer RT-PCR wurde die Expression dieser Gene aus
verschiedenen Pflanzenorganen ermittelt. PMEI-RP Expression konnte nur in Antheren und sich
entwickelnden Pollen nachgewiesen werden. Die PMEs wurden hingegen sowohl in Maisblättern,
Pollen, als auch in weiteren Pflanzenorganen exprimiert. Die subzelluläre Lokalisation der PMEI-
RPs in Pollen wurde zusätzlich durch differentielle Extraktion, durch immunocytochemischen
Untersuchungen und durch transiente Expression von PMEI-RP::Reportergen-Chimären untersucht.
Erstaunlicherweise führten die rekombinanten und nativen PMEI-RPs weder zu einer Inhibition der
PME-Aktivität noch zu einer Inhibition mit Invertasen (Zellwand und Vakuolen-Isoformen).
Darüber hinaus wurden ß-1,3-Glucanasen, Polygalacturonasen und Inulasen durch in vitro Tests als
mögliche Zielproteine ausgeschlossen. In Größenausschluss-Chromatographien unterschiedlicher
Maispollen-Proben und rekombinanter PMEI-RPs konnten nur monomere PMEI-RPs bei ihrem
erwarteten Mr ohne Hinweis auf einen Bindepartner nachgewiesen werden. Versuche die
Proteinkomplexe durch Cross-Linker zu quervernetzen, führten ebenfalls zu keinen nachweisbaren
PMEI-RP Zielproteinkomplexen.
Es liegt nahe, dass einige Isoformen der kürzlich identifizierten komplexen PMEI-RP Familien
entweder andere Zielproteine als Pektin Methylesterasen und Invertasen haben, oder alternativ,
1
1. Zusammenfassung / Summary
weitere noch unbekannte Funktionen aufweisen. Die Expression der PMEI-RP2 Isoform führte zu
einer Reduktion des Pollenschlauchwachstums, was auf eine Interaktion von PMEI-RPs mit PMEs
deuten könnte.
1 Summary
Pectin methylesterase (PME) and PME-inhibitor(PMEI)-related proteins in maize pollen:
Gene expression, subcellular localisation and functional characterisation
During pollen development and pollen tube growth, dynamic changes in the pectin component of
the cell wall are thought to play a crucial role. In particular, pectin methylesterase-mediated
demethylation affects the physical properties of the cell wall.
Through MALDI- and ESI-TOF studies of maize pollen samples respectively and databank
researches different pectin methylesterases have been identified. After aquiring the full length
cDNAs they were cloned into bacterial and eukaryotic expression vectors. Among the four
identified PMEs, two isoforms contained a prodomain, which is typical for type I PMEs, whereas
the other two were without, which is typical for type II PMEs. With the help of the recombinant
proteins, the biological functions of the target proteins should be clarified through in vitro assays.
Via semiquantitative RT-PCRs the expression in different plant tissues has been determined. PME
expression could be confirmed in maize leaves, pollen, as well as in other plant tissues. PMEI
expression could only be observed in pollen. The subzellular localization of the PMEI-RPs was also
adressed by differential extraction, by immunocytochemical analysis, and by transient expression of
PMEI-RP::reportergen fusions. Surprisingly, recombinant and native PMEI-RPs showed no
inhibition of PME activity, neither was an inhibition of invertases (vacuolar and cell wall isoforms)
observed. Additionally ß-1,3-glucanase, polygalacturonase and inulase have been excluded as target
proteins by in vitro assays. Size exclusion chromatography of different maize pollen samples and
recombinant PMEI-RPs revealed only free PMEI-RPs at their expected Mr with no indication of
binding to other target proteins. Also, cross-linking experiments failed so far to identify any target
enzyme(s) for the cloned PMEI-RPs.
The conclusion is, that some members of the recently identified, complex PMEI-RP families either
bind to target enzymes other than invertases and PMEs, or alternatively, exhibit additional yet
unknown functions. The transient expression of PMEI-RP2 resulted in a reduction in pollen tube
length, indicating a possible interaction of PMEI-RPs with PMEs.
2
2. Einleitung
2 Einleitung
Im Folgenden werden zelluläre Prozesse und Komponenten, die am Pektinstoffwechsel und
der sexuellen Fortpflanzung von Pflanzen beteiligt sind, dargestellt. Zuerst werden die
Aufgaben und Funktionen des Pollens, des männlichen Gametophyten, erläutert.
Anschließend wird auf die Notwendigkeit einer gerichteten Zellwandsynthese während des
Pollenschlauchwachstums hingewiesen. Der Aufbau der Pollenzellwand und die bisher
identifizierten Steuerungs- und Regulations-Mechanismen, die während des Pollenwachstums
eine Rolle spielen, werden in den darauf folgenden Abschnitten dargestellt. Dazu gehören
unter anderem die Synthese und die Modifizierung der Pektine, die Demethylierung der
Pektinmatrix durch Pektin Methylesterasen (PMEs) und die mögliche Inhibition letzterer
durch Pektin Methylesterase Inhibitoren (PMEIs) bzw. PMEI verwandte Proteine (PMEI-
RPs). In den folgenden Kapiteln sind die unterschiedlichen Eigenschaften von PMEs und
PMEI-RPs erläutert.
2.1 Zur Rolle des männlichen Gametophyten in der Reproduktion der Pflanzen
Die sexuelle Fortpflanzung von Pflanzen wird durch die Bestäubung und anschließende
Befruchtung der weiblichen Samenanlagen erreicht. Die Pollenkörner werden in den männlichen
Blütenorganen, den Antheren, gebildet und je nach Pflanzenart unterschiedlich verbreitet. Gebildet
werden die Pollen von der Mikrosporenmutterzelle. Aus dieser entstehen durch meiotische Teilung
vier Pollenkörner, die anschließend durch Mitose in eine generative und vegatative Zelle aufgeteilt
werden. Aus der generativen Zelle entstehen durch eine weitere mitotische Teilung die zwei
Spermazellen, die für die doppelte Befruchtung und Bildung des Embryos bzw. des triploiden
Endosperms benötigt werden (McCormick, 1993).
Durch Wind oder Insekten können die reifen dehydratisierten Pollenkörner auf die Narben anderer
Blütenpflanzen transportiert werden. Handelt es sich dabei um eine kompatible Narbe,
rehydratisiert der Pollen innerhalb weniger Minuten, und aus einer der Poren in der Exine keimt ein
Pollenschlauch aus (Bedinger, 1992). Während dieser Zeit wird aus dem unpolaren Pollenkorn
durch massive Umstrukturierungen eine stark polarisierte Zelle, die sich durch einige
Besonderheiten von anderen Pflanzenzellen abhebt.
3
2. Einleitung
Neben Wurzelhaaren sind Pollen die einzigen stark polarisierten Zellen in Pflanzen. Der
Pollenschlauch wächst ausschließlich an der Spitze und besitzt das im Pflanzenreich schnellste
Wachstum (Taylor & Hepler, 1997).
Der Maispollen zum Beispiel wird innerhalb der ersten 5 Minuten nach erfolgter Bestäubung
rehydratisiert, keimt aus und kann in 24 bis 36 Stunden eine Strecke von bis zu 50 cm im
Narbengewebe zurücklegen. Das entspricht ungefähr einem Längenwachstum von 1 cm/h
(Barnabas, 1984; Mascarenhas, 1993). Während der Befruchtung muss der Pollenschlauch durch
die Cuticula in die Narbe eindringen und basalwärts Richtung Ovar in das Griffelparenchym
hineinwachsen. Die Pollenschläuche wachsen in einem spezialisierten Gewebe, dem „Transmitting
Tissue“ innerhalb des Griffels zu den Samenanlagen, wo jeweils nur ein Pollenschlauch in eine
Mikropyle hineinwächst. Dort kommt es zum Platzen der Pollenschlauchspitze und die beiden
Spermakerne werden an ihrem Zielort freigesetzt (Bedinger et al., 1994; Palanivelu & Preuss,
2000).
2.2 Pollenschlauchwachstum: Ein besonderer Typ von extremen Spitzenwachstum
2.2.1 Der Pollenschlauch
Das Streckenwachstum findet in einem kleinen Bereich an der Spitze des Pollenschlauches statt und
ist auf eine schnelle Versorgung von neuen Membran- und Zellwand-Bestandteilen angewiesen.
Diese werden durch Golgi-Vesikel an die Spitze transportiert und sekretiert. Zellwandbestandteile
und Membranen werden recycelt und man kann Aktin-vermittelte polarisierte
Organellenbewegungen beobachten. Der stark polarisierte Pollenschlauch lässt sich in
unterschiedliche Bereiche aufteilen. Wenige Mikrometer hinter der Spitze findet sich die so
genannte „Clear-zone“, die sich durch das Fehlen jeglicher Zellorganellen auszeichnet. In diesem
Bereich liegen sehr viele Vesikel vor (Hepler et al., 2001). Dahinter folgt eine Zone, die reich an
Mitochondrien und endoplasmatischen Reticulum ist, gefolgt von einer weiteren Zone, in der die
Organellen und Kerne vorliegen. Fast der gesamte Pollenschlauch wird von einer großen Vakuole
ausgefüllt. Das Cytoplasma flankiert die Pollenschlauchwände und konzentriert sich in der Spitze.
Erreicht der Schlauch eine bestimmte Länge, werden die nicht mehr benötigten Abschnitte durch
Kallosestopfen von der restlichen Zelle getrennt (Franklin-Tong et al., 1996; Mascarenhas, 1993;
Parre & Geitmann, 2005b).
4
2. Einleitung
2.2.2 Steuerung und Regulation des Pollenschlauchwachstums
2.2.2.1 Notwendigkeit einer gerichteten Zellwandsynthese
Um die Eizelle zu finden, müssen Pollenschläuche durch unterschiedliche Gewebe
hindurchwachsen. Dies können sie nur durch eine gerichtete Zellwandsynthese erreichen, die es
ihnen ermöglicht, jeweils in eine Samenanlage hineinzuwachsen. Das Auffinden und Ansteuern der
Eizelle wird von intrazellulären und extrazellulären Faktoren bestimmt. Im folgenden werden
unterschiedliche Moleküle, die einen Einfluss auf die Entwicklung des Pollenschlauches haben
können, aufgeführt. Calcium2+ Ionen spielen dabei scheinbar eine Schlüsselrolle, indem sie
unterschiedliche Regulierungsprozesse miteinander vernetzen.
Calcium Ionen
Pollenschläuche besitzen einen ungefähr 20 µm steil abfallenden intrazellulären Ca2+ Ionen
Gradienten unterhalb der Spitze. Dieser ist für das gerichtete Längenwachstum essentiell (Messerli
& Robinson, 1997; Taylor & Hepler, 1997). An der Spitze wird eine Ca2+ Konzentration von 10 µM
gemessen (Messerli et al., 2000), die jedoch innerhalb 20 µm auf 150 bis 200 nM absinkt. Der Ca2+
Einstrom ist an der Pollenschlauchspitze am höchsten und nimmt mit zunehmender Entfernung ab
(Holdaway-Clarke et al., 1997; Messerli & Robinson, 2003). Es ist bekannt, dass hohe Ca2+
Konzentrationen mit der Sekretion von Vesikeln assoziiert sind (Battey et al., 1999; Blackbourn &
Battey, 1993). Camacho und Malho (2003) konnten zeigen, dass durch die Veränderung von
intrazellulärem Ca2+ die Sekretion von Vesikeln reguliert wird. Sie zeigten, dass durch die
Freisetzung von Ca2+ auf einer Seite der Pollenschlauchspitze sich diese immer in die Richtung mit
der erhöhten Ca2+ Konzentration ausrichtet und ihr Wachstum in diese Richtung fortsetzt. Dies wird
durch ein erhöhtes Fusionieren und Recyclen von Vesikeln und Membranbestandteilen erreicht.
GTPasen
G-Proteine dienen als einfache Schalter. Im GTP gebundenen Zustand übermitteln sie extrazelluläre
Signale an Effektormoleküle, die in der Signalkaskade nachgeschaltet sind. Im GDP gebundenen
Zustand werden keine Signale weitergeleitet (Symons & Settleman, 2000). Der Einstrom von Ca2+
wird unter anderem durch GTPasen reguliert (Lin et al., 1996). Für Pollen konnte Kost et al. (1999)
zeigen, dass eine dominant negative Rac Mutation eine Inhibition des Längenwachstums
5
2. Einleitung
verursacht. Die Expression von konstitutiv aktivem Rop führt zu einem verstärkten Wachstum (Li
et al., 1999). Durch das Injizieren von Anti-Rop1Ps Antikörper konnte ebenfalls gezeigt werden,
dass es zum Arrest des Pollenschlauchwachstums kommt (Li et al., 1999). Zheng und Yang (2000)
konnten schließlich zeigen, dass durch das Injizieren von At-Rop1 Antikörpern bzw. durch die
Expression von dominant negativen At-Rop1 Mutanten der Ca2+ Gradient verschwindet und es zum
Arrest des Wachstums kommt.
Aktin
In Tabakpollen modulieren GTPasen das Aktin Cytoskelett innerhalb der Pollenschlauchspitze.
Kurze F-Aktinbündel liegen direkt unter der Spitze, ihre Struktur wird durch eine Rho GTPase
moduliert. Wird die GTPase deaktiviert, verschwinden die F-Aktinbündel und es kommt zum
Arrest des Wachstums, wird sie überaktiviert, bilden sich längere Aktinkabel die zum Anschwellen
der Pollenschlauchspitze führen (Fu et al., 2001). Während der „Selbst Inkompatibilitäts“ Reaktion
von Mohnpollen kommt es ebenfalls zu einem starken Ca2+ Anstieg in der Pollenspitze (Franklin-
Tong et al., 1993) und zur anschließenden Depolymerisierung der Aktinfilamente und somit zum
Arrest des weiteren Wachstums (Snowman et al., 2002). Mögliche Effektormoleküle in
Tabakpollen umfassen unter anderem eine Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PI-4,5-P2 ) Kinase
und PIP2 (Kost et al., 1999). PIP2 fördert die Aktinpolymerisierung in tierischen Zellen (Chen et
al., 2000; Moreau & Way, 1998) und wird als einer der Hauptregulatoren für die Aktinorganisation
und Vesikelsekretion angesehen (Martin, 1998). Es dient als Substrat einer
phosphoinositidabhängige Phospholipase C, die PIP2 in das membrangebundene Diacylglycerol
und das lösliche Inositol 1,4,5-Trisphosphat IP3 umsetzt. IP3 dient als Signalmolekül und kann Ca2+
Kanäle öffnen. Möglicherweise wird auf diese Weise der Ca2+ Spitzengradient, der für das
Pollenschlauchwachstum essentiell ist, mit aufgebaut (Franklin-Tong et al., 1996; Hepler et al.,
2001). Weitere Effektormoleküle, die auf den Aktinstoffwechsel einwirken könnten sind Profilin,
Aktin depolymerisierender Faktor (ADF), Gelsolin und Ca2+ (Gibbon et al., 1998; Kovar et al.,
2000; Smertenko et al., 1998; Vidali & Hepler, 2001). Profiline binden globuläres G-Aktin in einer
Ca2+ abhängigen Reaktion und werden mit Aktindynamiken in Mais in Verbindung gebracht. Nur
ein geringer Teil (~10%) des gesamten Aktins liegt im Maispollenschlauch filamentös vor (Kovar
et al., 2000). Die in der Pollenschlauchspitze vorliegende Ca2+ Konzentration von ~ 10 µM ist für
die Verknüpfung von Pollen G-Aktin und Profilin ideal (Kovar & Staiger, 2000).
6
2. Einleitung
cAMP
In unterschiedlichen Experimenten konnte Moutinho et al. (2001) zeigen, dass durch
Manipulationen der cAMP Konzentration über „Caged Probes“ und eines löslichen cytosolischen
Pollen Signalprotein mit Adenylat Cyclase Aktivität, sich die Richtung, in die die Spitze wächst,
beeinflussen lässt. Ein Gradient lässt sich jedoch nicht nachweisen. Nachgeschaltete Zielproteine
sind unter anderem die Protein Kinase A PKA (Assmann, 1995; Biermann et al., 1990), CREBs
(„cAMP response element-binding factors“) (Katagiri et al., 1989), zyklisch Nukleotiden-gesteuerte
Kationen Kanäle in Arabidopsis (Leng et al., 1999) oder in Tabak plasmamembrangebundene
Calmodulin bindende Kanäle, die eine putative zyklische Nukleotidbindedomäne besitzen(Arazi et
al., 2000).
Calmodulin CaM
Calmodulin ist in der Lage Signale von unterschiedlichen Prozessen zu integrieren und könnte für
den Signalaustausch zwischen Ca2+ Ionen Steuerung und cAMP Regulierung mitverantwortlich sein
(Trewavas et al., 2002). Es ist ein multifunktionelles Protein ohne eigene katalytische Aktivität, das
mindestens 30 unterschiedliche Zielproteine binden kann. Dazu gehören Ca2+ Transport ATPasen,
Phosphodiesterasen, Myosin leichte Ketten Kinasen und andere CaM-abhängige Protein Kinasen.
Ca2+-Calmodulin Komplexe binden an Zielproteine und verändern ihre Funktion (Hoeflich & Ikura,
2002). CaM ist unter anderem an Prozessen der Vesikelsekretion (Gilroy, 1996; Schuurink et al.,
1996), Zellaxenfixierung und Aufteilung von sich entwickelnden Fucus Zygoten beteiligt (Love et
al., 1997). Obwohl sich kein CaM Gradient im Pollenschlauch nachweisen lässt, konnten Gough
und Tayler (1993) zeigen, dass die CaM-Bindung trotz gleichmäßiger Verteilung in Fibroblasten
am Zellende stärker ist. Rato et al. (2004) zeigten, dass in der Pollenschlauchspitze eine höhere
CaM Bindung/Aktivität auftritt und diese für das Wachstum und die Re-Orientierung wichtig ist.
Der Pollen richtet sein Wachstum scheinbar im Spitzenbereich nach der höchsten lokalen freien
CaM Konzentration aus. In 2005 konnten Shang et al. zeigen, dass es in Lilienpollen einen
spannungsabhängigen Ca2+ Kanal gibt und dieser durch extrazelluläres CaM reguliert werden kann
(Shang et al., 2005). Vor kurzem konnten Yoon et al. (2006) zeigen, dass in Petunienpollen zwei
membrangebundene calmodulinähnliche Proteinkinasen, die für die Polarität und das
Pollenschlauchwachstum wichtig sind, vorkommen. Die Ca2+ Konzentration für die Pi CDPK1
Aktivierung korreliert eng mit der Ca2+ Konzentration, die in der Wachstumszone der
Pollenschlauchspitze vorliegt.
7
2. Einleitung
Protonen
Im Pollenschlauch existiert neben dem beschriebenen Ca2+ Gradienten noch ein Protonengradient.
Der pH Gradient reicht von der leicht sauren Spitze bis hinunter zu der so genannten alkalischen
Bande nahe der „Clear Zone“. Die Protonen dringen an der Spitze ein und treten nahe der „Clear
Zone“ seitlich wieder aus. Vermutlich wird der Protonenfluss durch ATPasen nahe der „Clear
Zone“ aufrechterhalten. Im Vergleich zu Ca2+ wird der pH Gradient durch Inhibitoren des
Pollenschlauchwachstums nicht aufgelöst (Feijo et al., 1999).
Kalium und Chlorid Ionen
Kalium und Chlorid Ionen werden ebenfalls mit dem Pollenschlauchwachstum in Verbindung
gebracht (Messerli et al., 1999). Die Bedeutung von Kalium ist noch weitestgehend unklar. Die
Chlorid Ionen dringen ca. 20 bis 25 µm unterhalb der Spitze durch die Seiten des Pollenschlauches
in diesen hinein und werden aus der Spitze wieder heraustransportiert (Zonia et al., 2002). Neuere
Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass der Chlorid Ionen Strom keinen Einfluss auf das
Pollenschlauchwachstum hat (Messerli et al., 2004).
Wachse
Wachs-Mutanten (cer) von können eine veränderte Pollenkit Zusammensetzung aufweisen und in
ihrer männlichen Fruchtbarkeit eingeschränkt sein (Aarts et al., 1995; Hulskamp et al., 1995; Preuss
et al., 1993). Das Unvermögen der cer Mutanten, die Wasserfreisetzung aus den Narben zu
stimulieren, wird als Beweis angesehen, dass Lipide in der Pollenwand an der Zell-Zell-Erkennung
beteiligt sind und für eine Hydration des Pollen benötigt werden (Elleman et al., 1992; Wolters-Arts
et al., 1998).
Flavonoide
Das Fehlen von bestimmten Flavonoiden, kleinen aromatischen Molekülen, kann ebenfalls zur
Sterilität des Pollens führen (Taylor & Hepler, 1997; Ylstra et al., 1994). Die Flavonole liegen in
cytosolischen Kompartimenten vor, werden während der Keimung schnell mit spezifischen Zuckern
konjugiert (<1 Minute) und Formen so eine einzigartige Klasse von pollenspezifischen Flavonolen
(Vogt & Taylor, 1995; Xu et al., 1997; Zerback et al., 1989). Flavonoide sind aber scheinbar nicht
bei allen Pflanzen für eine erfolgreiche Befruchtung notwendig. In Arabidopsis konnte durch eine
Nullmutation im ersten für die Flavonoidbiosynthese benötigten Enzym gezeigt werden, dass dieser
8
2. Einleitung
Pollen auch ohne Flavonoide nicht in seiner Fruchtbarkeit eingeschränkt ist (Burbulis et al., 1996).
2.2.2.2 Genereller Aufbau der Pollenschlauchzellwand in Dikotyledonen und Monokotyledonen
Die Pollenwand besteht in der Regel aus zwei bis drei Schichten. Die innere Schicht besteht aus
einer inneren Kallose Hülle (ß1-3 Glucan), die mit einem Gemisch aus Pektin mit Cellulose und
Hemicellulose ummantelt ist, während die zweite Schicht, die Exine, aus Sporopollenin besteht. An
der Pollenschlauchspitze lässt sich keine Kallose nachweisen. In einigen Spezies sind die Pektin
und Cellulose Komponenten in zwei Schichten aufgeteilt und formen eine dreischichtige Zellwand
(Li et al., 1994; Taylor & Hepler, 1997).
Auf diese zwei bzw. drei Schichten wird während der Pollenkornentwicklung noch eine weitere
Schicht, die so genannte Tryphine bzw. Pollenkit-Schicht aufgelagert. Sie besteht aus den
Überresten des Tapetums, das nach seinem Abbau auf die Pollenkörner abgelagert wird.
Die Tryphine setzt sich aus unterschiedlichsten Komponenten wie z.B. Wachs, Lipidtröpfchen,
kleinen aromatischen Molekülen und Proteinen zusammen (Taylor & Hepler, 1997).
2.2.3 Die Rolle der Pektine und ihres Methylierungsstatus
Die äußere Pollenschlauchwand erscheint mikroskopisch gesehen eine Extension der pektischen
inneren Wand, der Intine, zu sein. Im ungekeimten Pollen ist das Pektin an den Aperturen, an denen
der Pollenschlauch hervortreten kann, angereichert (Li et al., 1994).
Mit Hilfe von Antikörpern, die unterschiedliche Pektinzusammensetzungen erkennen können,
wurde gezeigt, dass methylesterifiziertes Pektin an der Pollenschlauchspitze und in sekretorischen
Vesikeln, die mit der Spitze fusionieren, vorkommt (Geitmann et al., 1995; Jauh & Lord, 1996; Li
et al., 1994). Demethyliertes Pektin kommt hauptsächlich in der äußeren Pollenschlauchwand vor.
Zu geringem Teil ist es auch in der Spitze nachgewiesen worden (Geitmann et al., 1995; Li et al.,
1994).
2.2.3.1 Pektinbiosynthese
Für die Biosynthese von Pektinen werden mindestens 53 verschiedene enzymatischen Aktivitäten
benötigt (Mohnen, 1999). In der Arbeitsgruppe von Maor Bar-Peled konnte das Enzyms GalAT aus
angereicherten Golgifraktionen isoliert werden. Dieses Protein transferiert GalA von UDP-GalA auf
endogenes Homogalacturonan oder auf exogene Oligalacturonide. Auch wurde gezeigt, dass die
Aktivität von GalAT und Pektin Methyltransferasen im Lumen des Golgi liegen (Gu & Bar-Peled,
9
2. Einleitung
2004; Sterling et al., 2001). Nach bisherigem Kenntnisstand geht man davon aus, dass UDP-GalA
durch eine/mehrere Epimerase/n aus UDP-GlcA auf bzw. an der cytoplasmatischen Seite des Golgi
gebildet wird. UDP-GalA wird dann durch einen UDP-GalA:UMP Antiporter in das Lumen des
Golgis transportiert. Im Golgi wird schließlich GalA durch GalAT auf ein unbekanntes
Startmolekül übertragen. Eine im Golgi vorhandene Pectin Methyltransferase esterifiziert
Methylgruppen an den GalA Einheiten (Gu & Bar-Peled, 2004; Sterling et al., 2001).
Die Pektine werden also nach ihrer Synthese im medialen und trans Golgi methyliert und durch das
Anknüpfen von weiteren Mono- bzw. Poly-sacchariden im trans Golgi modifiziert (Staehelin &
Moore, 1995; Vian & Roland, 1991; Zhang & Staehelin, 1992). Das Pektin kann während dem
Transport zur Plasmamembran weiter modifiziert werden. Mit einer 70 - 80 %-igen Methylierung
der Galacturonsäure-Einheiten wird das Pektin schließlich in den Zellwandraum sekretiert (Carpita
& Gibeaut, 1993; Liners et al., 1994). Innerhalb des Golgi-Netzwerkes werden während der
Zellwandsynthese weitere pektische und hemicellulosische Glycoproteine gebildet und mittels
Vesikeln zur Plasmamembran transportiert. Dort verschmelzen die Vesikel mit der Plasmamembran
und ihr Inhalt wird in die bestehende bzw. sich bildende Zellwand integriert (Staehelin & Moore,
1995).
Die Methylierung der Pektine verhindert, dass sich schon während des Transportes zum Zielort Ca2+
Verbindungen zwischen ihnen ausbilden und sie in einer mehr oder weniger flexiblen Form
vorliegen (Carpita & Gibeaut, 1993). Nicht in allen Geweben werden Pektine stark methyliert
sekretiert (Knox, 1990). Die Wurzelepidermiszellen des Klees können zum Beispiel auch schwach
10
Abbildung 2.1Modell der Pektinbiosynthese nach Bar-Peled Quelle:http://cell.ccrc.uga.edu/~mao/biosyn/text.htm
2. Einleitung
methyliertes Pektin sekretieren (Lynch & Staehelin, 1992). In Tabakpollen wird durch die
vorzeitige Demethylierung der Pektine durch eine konstitutiv aktive PME ein Arrest des
Pollenschlauchwachstums erreicht (Bosch et al., 2005).
2.2.3.2 Biologische Aufgaben von Pektinen
Pektine gehören zu einer Familie von komplexen Polysacchariden, die in allen primären
Zellwänden vorkommen. Die komplexe Struktur der Pektine und die Tatsache, dass Pflanzen eine
Großzahl an Genen zur Pektinbiosynthese entwickelt haben, legen nahe, dass sie vielfältige
Aufgaben während des Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung haben. Neben ihrer
Funktion als Zellwandmatrix sind sie auch in der Signalweiterleitungen und Pathogenabwehr
involviert (Ridley et al., 2001).
Es wird angenommen, dass während der Biogenese einer neuen Zellwand Pektine die ersten
Komponenten sind, die in die Zellplatte eingelagert werden (Carpita et al., 1989). Danach werden
weitere Pektinbestandteile, Cellulose-Mikrofibrillen und Hemicellulose in den extrazellulären
Raum sekretiert. Während dessen kommt es zur Ausbildung der Mittellamelle und der Primärwand
(Matar & Catesson, 1988). Die hydrophobe Pektinmatrix kann den Einbau neuer
Zellwandbausteinen modulieren, verhindert das Cellulose-Einheiten aggregieren (Jarvis, 1992) und
sie gibt den eingelagerten Cellulose-Mikrofibrillen die Möglichkeit während Restrukturierungen der
Zellwand aneinander entlang zu gleiten (Cosgrove, 2000).
Die Zell-Zell-Adhäsion wird durch das beidseitige Sekretieren von Pektinen gewährleistet. Durch
den regulierten Abbau der Pektine und der Zell-Zell-Adhäsion können sich im parenchymatischen
Gewebe Interzellularen oder das für den Blattfall benötigte Trenngewebe bilden (Knox, 1990;
Roberts & McCann, 2000).
Burton et al. (2000) und Manfield et al. (2004) zeigen in zwei Studien, dass durch das Stilllegen
einer Cellulose Synthase Isoform bzw. das Inhibieren der Cellulose Synthese durch Isoxaban,
Pektine die Aufgaben der Cellulosekomponenten zum Teil ausgleichen können. Bis zu diesem
Zeitpunkt ist man davon ausgegangen, dass Cellulose und Hemicellulose die Hauptkomponenten
sind, die dem Zellinnendruck entgegenwirken. Die fehlenden Cellulosekomponenten werden durch
eine verstärkte Pektinbiosynthese und einer Anreicherung von demethylesterifizierten Pektinen in
der Zellwand kompensiert (Burton et al., 2000; Manfield et al., 2004).
Die Pektinmatrix beeinflusst unter anderem die Porosität (Baron-Epel et al., 1988), die Dicke
(Vincken et al., 2003), den pH Wert, den Ionenhaushalt und die Wasserkonzentration der Zellwand
11
2. Einleitung
(Willats et al., 2001a). Die Porosität wird unter anderem durch die Dimerisierung von RG-II durch
Bor Ionen moduliert. Pflanzen die einen Bormangel aufweisen, besitzen eine gestörte RG-II
Dimerisierung. Dieser Mangel manifestiert sich in einem reduziertem Wachstum, vergrößerten
Poren und einem Anschwellen der Zellwand. Durch die Zugabe von Bor Ionen lässt sich der Effekt
jedoch beseitigen (Fleischer et al., 1999). Untermauert wird dies durch die Arabidopsis Mutante
mur1, die einen Defekt im RG-II Syntheseprozess besitzt, der den Austausch der Fucosyl- mit
Galactose-Resten zur Folge hat. Der Phänotyp gleicht dem von Pflanzen, die unter Bormangel
aufgezogen werden bzw. einem akuten Bormangel ausgesetzt sind und lässt sich durch die Zugabe
von Bor Ionen oder L-Fucose wieder beseitigen (O'Neill et al., 2001). Eine weitere Arabidopsis
Mutante mit stark verringertem Wachstum heißt Quasimodo (Bouton et al., 2002). Im Vergleich zu
wildtyp Pflanzen ist ihr Gehalt an Galacturonsäuren um 25% herabgesetzt. Dies hat zur Folge, dass
die Zell-Zell-Adhäsion nicht mehr richtig funktionieren kann und die Pflanzen einen Zwergwuchs
aufweisen. Vor kurzem konnten Lebouf et al. (2005) zeigen, dass dies durch eine Reduktion der
Ca2+ vernetzten Homogalacturonen an den Kontaktpunkten von reifen Zellen verursacht wird. Das
Fruchtfleisch von Cnr Tomaten Mutante besitzt ebenfalls eine schwächere Zell-Zell-Adhäsion. Im
Vergleich zu wildtyp Tomatenpflanzen hat sich hier das Verhältnis von demethylesterifiziertem zu
methylesterifiziertem Homogalacturon verlagert. Die Cnr Mutante könnte folglich einen Fehler in
einer Pektin Methylesterase, die Homogalacturon demethylesterifiziert, haben (Orfila et al., 2002).
Bei der Arabidopsis Mutante quartet können sich die Mikrosporen nach der Gametogenese nicht
voneinander trennen und es bildet sich eine Pollentetrade. Einer der QUARTET loci (QRT3) kodiert
für eine Polygalacturonase (Rhee & Somerville, 1998; Somerville, et al., 2003).
2.2.3.3 Pektin in der Zellwand
Pektin ist eine heterogene Polymergruppe die aus mehr als 17 verschiedenen Monosacchariden, aus
denen sich wenige Polysaccharide zusammensetzen, aufgebaut ist. Das Rückgrat von Pektinen
besteht aus 1,4 verknüpften Galacturon-A Einheiten (GalA). Drei Hauptkomponenten lassen sich in
der Zellwand beschreiben: Homogalacturon (HG), Rhamnogalacturon II (RG-II) und
Xylogalacturon (XGA). Im Fall von HG und XGA können die Pektine am O6 methylesterifiziert
sein und am O2 und O3 Acetyl-gruppen tragen. Rhamnogalacturon I (RG-I) setzt sich aus den sich
wiederholenden Disaccharid 1,2-a-L-rhamnosyl-1,4-a-D-galactopyranosyluronicA Einheiten, die
am O2 und O3 Acetyl-gruppen tragen und am O4 mit neutralen Zuckern substituiert sein können. In
Abbildung 2.2 sind die einzelnen Pektinbestandteile schematisch dargestellt.
12
2. Einleitung
Obwohl die einzelnen Komponenten, aus denen sich das Pektinnetzwerk zusammensetzt, bekannt
sind, ist der Zusammenbau dergleichen in der Zellwand weitgehend unklar. Früher ist man davon
ausgegangen, dass das Pektinrückgrat eine lange Kette mit HG und RG-I Bereichen ist. „Glattes“
Pektin besteht in diesem Modell hauptsächlich aus HG und „haariges“ Pektin aus RG-I, XGA,
Arabinan und AG-I. Ein neues Modell von Vincken et al. (2003) geht davon aus, dass RG-I als
Rückgrat, an das HG, RG-II, XGA und weitere Pektinkomponenten gebunden werden können,
fungiert. In Abbildung 2.3 sind das alte und neue Modell schematisch dargestellt.
13
Abbildung 2.2Schematische Darstellung der an der Pektinmatrix beteiligten Komponenten
In der Legende sind die einzelnen Symbole der verschiedene Monosaccharideinheiten aus denen sich die Pektine zusammensetzen erklärt. Die Bedeutung der Symbole sind in Abbildung 2.3 und 2.4 identisch. Abbildung aus (Vincken et al., 2003).
2. Einleitung
Die Matrix wird durch Quervernetzungen der pektischen Komponenten erreicht. Drei
unterschiedliche Vernetzungen sind bekannt:
Ca2+ GeleDurch die Einlagerung von Ca2+ Ionen zwischen demethylesterifizierten Carboxylgruppen können zwei HG-Ketten quervernetzt werden. Für die Quervernetzung werden mindestens 10 zusammenhängende demethylesterifizierte GalA Einheiten benötigt.Borat-Diol-EsterHG Moleküle können auch durch Borat-Diol-Ester zwischen den Apifuranosylresten von 2-O-methyl-D-Xyl-enthaltenden RG-II Seitenketten quervernetzt werden. RG-II ist integraler Bestandteil von HG.Uronyl-EsterEine weitere Hypothese geht davon aus, dass durch Transesterifizierungen Uronylester gebildet werden können. Als Donorsubstrat fungiert dabei eine methylesterifizierte GalA Einheit. Als Empfänger könnte jedes Zellwandpolysaccharid in Frage kommen. Pektin Methylesterasen sind mögliche Kandidaten für die Transesterifizierungsreaktionen.
14
Abbildung 2.3Schematische Darstellung der makromolekularen Pektinstruktur A: In diesem Modell ist das Pektinrückgrat eine verlängerte Kette mit HG und RG-I Regionen. AI, AII und AIII illustrieren den Übergang von HG zu RG-I, Rhamnogalacturon Regionen mit einer GalA zu Rha Ratio >1, und einer Rha-Einheit die verstreut zwischen zwei HG Einheiten liegen können. R ist das reduzierende und NR das nichtreduzierende Ende. Um die Bilder übersichtlich zu halten wurden XGA und weitere Pektinkomponenten nicht in das Modell mit einbezogen.
B,C,D: In diesem Modell wird RG-I mit neutralen- (AG-1, Arabinan und möglicherweise AG-II), HG- sowie XGA-Seitenketten verknüpft.
2. Einleitung
Die drei möglichen Quervernetzungen sind in Abbildung 2.4 dargstellt. In Abbildung 2.5 ist der
hypothetische Aufbau der Mittellamelle und primären Zellwand dargestellt.
15
Abbildung 2.4Darstellung der unterschiedlichen Möglichkeiten der PektinquervernetzungenA: Quervernetzung durch Ca2+ Ionen Bindung zwischen zwei demethylesterifizierten GalA Einheiten zweier Hgs. Es werden mindestens 10 hintereinander demethylierte GalA Einheiten für eine stabile Ca2+ Bindung benötigt.
B: HG Moleküle können auch durch Borat-Diol Ester, die sich zwischen den Apifuranosyl Einheiten der 2-O-methyl-D-Xyl-enthaltenden Seitenketten von RG-II bilden, vernetzt werden.
C: Durch Transesterifizierungsreaktionen könnten Uronyl-Ester zwischen demethylierten GalA Einheiten und anderen Zellwandbestandteilen entstehen. Abbildung aus (Vincken et al., 2003)
2. Einleitung
16
Abbildung 2.5Modell des Pektinnetzwerkes in der Mittellamella und der primären Zellwand A: Seitlicher Anblick von zwei primären Zellwänden die durch eine Mittellamella verbunden sind. 1 Die Mittellamella wird von Pektinmolekülen, die in die Zellplatte sekretiert werden, gebildet. Durch Ca2+ HG Seitenkettenquervernetzungen werden angrenzende Pektinschichten aneinander gebunden. 2 RG-II Quervernetzung darunterliegender Schichten mittels Borat-Diol Ester. Der Zellwanddurchmesser hängt von der Anzahl der aufgelagerten Pektin und Cellulose Komponenten ab. 3 Das RG-I Rückgrat wird mit seinen Seitenketten gegen eine Cellulose Mikrofibrille gedrückt. Die Seitenketten umgeben die Mikrofibrille und halten sie so am Platz.
B: Aufsicht auf die Zellwand (von der Plasmamebran zur Mittellamella) 4 Quervernetzungen können zwischen zwei benachbarten Pektinschichten, aber auch innerhalb der gleichen Schicht auftreten. 5 AG-I und Arabinane füllen die Löcher in der Zellwand auf. Damit die Darstellung übersichtlich bleibt, sind Hemicellulose und weitere Bestandteile nicht eingezeichnet. Regionen ohne Methylierung sind durch Schatten dargestellt. * sind Cellulose Mikrofibrillen; cm Zellmembran; pcw primäre Zellwand; ml Mittellamella. Die anderen Symbole sind in 2.2 erklärt. Abbildung aus (Vincken et al., 2003).
2. Einleitung
2.2.3.4 Signalweiterleitung und Pathogenabwehr durch Oligogalacturonide (OGAs)
Oligogalacturonide sind kurze Homogalacturon Abschnitte mit einer Länge von 10 bis 15 1,4
verknüpften Galacturon Einheiten, die durch den Abbau von Homogalacturon durch
Endopolygalacturonasen und Endopektinlyasen von Pflanzenpathogenen freigesetzt werden können
(Cote et al., 1998). Die freigesetzten OGAs können von den Pflanzenzellen detektiert werden und
eine Reihe von Abwehrreaktionen, wie z.B. PR-Protein Synthese („pathogenesis related proteins“),
Stomataverschluss, Verstärkung der Zellwand, Produktion von ROS („reactiv oxygene species“)
und Apoptose („hypersensitive response, HR“) einleiten (Bolwell, 1999; Bolwell et al., 2001; Cote
et al., 1998; Cote & Hahn, 1994; Hahn et al., 1981). Auch bei Verwundungsreaktionen können sie
eine Rolle spielen (Rojo et al., 1999; Simpson et al., 1998).
Während der Fruchtreife können OGAs die Bildung von Ethylen induzieren und die Reifung
beschleunigen (Baldwin EA, 1988; Brecht JK, 1988; Melotto et al., 1994; Simpson et al., 1998).
Neben der Fruchtreifung können sie noch antagonistisch auf das Phytohormon Auxin wirken
(Altamura et al., 1998; Bellincampi et al., 1996; Branca et al., 1988).
2.2.4 Pektin Methylesterasen
Pektin Methylesterasen (PMEs, EC 3.1.1.11) katalysieren die Demethylesterifizierung von O6-
methylesterifizierten Galacturonsäure-Einheiten von Homogalacturon und haben in der
Entwicklung von Pflanzen vielseitige Aufgaben. Sie sind unter anderem an Prozessen der
Sprossverlängerung (Balestrieri et al., 1990; Micheli et al., 2000), Fruchtreifung (Harriman et al.,
1991), Samenkeimung (Ren & Kermode, 2000), Mikrosporongie und Pollenschlauchwachstum
(Bosch et al., 2005; Jiang et al., 2005; Wakeley et al., 1998), Wurzelentwicklung (Wen et al.,
1999), Blattentwicklung (Pilling et al., 2004) und Blütenentwicklung (Mu et al., 1994) beteiligt.
Pektin Methylesterasen werden von einer Multigenfamilie kodiert (Richard et al., 1996). Nach
Sequenzierung des Arabidopsis thaliana Genoms konnten 66 PME-verwandte Gene identifiziert
werden (Nature2000, 2000; Salanoubat et al., 2000). PME Proteine lassen sich in der Regel durch
Unterschiede in ihrem Molekulargewicht, Isoelektrischen Punkt und ihrer Aktivität in saure,
neutrale und basische PMEs einteilen (Bordenave & Goldberg, 1993). Daneben werden sie auch
noch in zwei Klassen, den so genannten Typ I und Typ II Pektin Methylesterasen aufgeteilt
(Micheli, 2001). Typ I PME Gene besitzen 2-3 Introns und kodieren ein Signalpeptid (Pre-
Domäne), das für die Translokation in das endoplasmatische Reticulum zuständig ist, eine Pro-
Domäne, die scheinbar unterschiedliche bzw. mehrere Funktionen besitzen kann, sowie die
17
2. Einleitung
katalytisch aktive PME-Domäne. Im Vergleich zu Typ I PMEs besitzen Typ II PMEs 5 bis 6
Introns und nur eine kurze bzw. keine Pro-Domäne. Die Pro-Domäne der PMEs und die Invertase-
und Pektin Methylesterase Inhibitoren, im folgenden Pektin Methylesterase Inhibitor-verwandte
Proteine (PMEI-RPs) genannt, weisen auffällige Ähnlichkeiten auf (Giovane et al., 2004; Greiner
et al., 1998; Hothorn et al., 2004a; Hothorn et al., 2004b; Rausch & Greiner, 2004). PMEs aus
phytophatogenen Mikroorganismen weisen starke Ähnlichkeiten mit den Typ II PMEs auf.
Aufgrund dieser Homologien werden ihnen ähnliche Eigenschaften zugesprochen (Micheli, 2001).
Pektin Methylesterasen, die aus Zellwänden isoliert und charakterisiert wurden, besitzen nur die
PME-Domäne. Es konnten keine PMEs mit Pro-Domäne in der Zellwand nachgewiesen werden
(Bordenave & Goldberg, 1993). Ob es sich bei den isolierten PMEs um Typ I oder Typ II Proteine
handelt, lässt sich auf Grund fehlender DNS Sequenzinformationen nicht sagen. Die vorhandenen
cDNS Sequenzen sind entweder unvollständig, ohne die für das 5' Ende kodierenden Pre/Pro-
Domänen Region, oder sie gehören zu den Typ II PMEs (Albani et al., 1991; Bordenave &
Goldberg, 1993; Bordenave & Goldberg, 1994; Harriman et al., 1991; Johansson et al., 2002;
Markovic et al., 2002; Markovic & Jornvall, 1986; Richard et al., 1996). Dies hängt unter anderem
damit zusammen, dass die meisten identifizierten und charakterisierten PMEs aus Agrarpflanzen,
wie z.B. Tomaten, Karotten, Bananen und Mung Bohnen, isoliert wurden und von diesen nur sehr
begrenzte DNS Sequenzinformationen vorliegen.
2.2.4.1 Proteinstruktur und Katalysemechanismus von Pektin Methylesterasen
Durch kristallographische Untersuchungen von drei unterschiedlichen PMEs konnte gezeigt
werden, dass es sich bei ihnen um eine rechts gedrehte parallele ß-Helix handelt, die sich aus sieben
Spiralen, die wiederum aus drei ß-Blättern bestehen, zusammensetzt (Di Matteo et al., 2005;
Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002). Diese Struktur ist für am Pektinstoffwechsel
beteiligten Enzyme typisch (Jenkins et al., 2001; Jenkins & Pickersgill, 2001). Die katalytische
Domäne ist bei der Tomaten und Karotten PME relativ gleich aufgebaut. In beiden kommt es durch
einen nukleophilen Angriff einer Asparaginsäure D153 bzw. D157 auf die Carboxymethylgruppe
des Pektins. Durch zwei Glutaminreste (Q109, Q131 bzw. Q113,Q135) wird das Zwischenprodukt
stabilisiert. Die Aminosäuren D132 bzw. D136 fungieren vermutlich als Protonendonor (Johansson
et al., 2002). In Abbildung 2.6 ist die Struktur eines katalytischen Zentrums dargestellt.
18
2. Einleitung
2.2.4.2 Physiologische Funktionen von Pektin Methylesterasen
Wie schon weiter oben erwähnt, liegen die PMEs in einer Multigenfamilie vor und kodieren
unterschiedliche Isoformen, die je nach Bedarf bei bestimmten Aufgaben im Apoplasten erfüllen
(Micheli, 2001). Manche Isoformen werden konstitutiv in der gesamten Pflanze, andere gezielt
während der Fruchtreifung, Mikrosporongie und Pollenkeimung, Samenkeimung,
Wurzelentwicklung, Blütenentwicklung, Blattentwicklung sowie Sprossverlängerung exprimiert
(Balestrieri et al., 1990; Bosch et al., 2005; Harriman et al., 1991; Jiang et al., 2005; Micheli et al.,
2000; Mu et al., 1994; Pilling et al., 2004; Ren & Kermode, 2000; Wakeley et al., 1998; Wen et al.,
1999).
Daneben gibt es auch noch PMEs, die von phytophatogenen Organismen wie Insekten und Pilzen
gebildet werden. PMEs von Phytophatogenen weisen eine starke Homologie zu den Typ II Pflanzen
PMEs auf und besitzen vermutlich ähnliche Eigenschaften (Lord, 2000; Micheli, 2001; Mu et al.,
1994). Bisher wurden zwei unterschiedliche Substratumsetzungen beschrieben: PMEs können
entweder blockweise mehrere aufeinanderfolgende Galacturonsäuren-Einheiten (GalA)
demethylesterifizieren und so Blöcke von 12 und mehr demethylierten GalA Einheiten bilden, oder
aber zufällig GalA Einheiten am Homogalacturonrückgrat demethylesterifizieren. Für die
Verfestigung der Pektinmatrix durch die Bildung von Ca2+ Quervernetzungen sind Blöcke von
mindestens 14 demethylierten GalA Einheiten erforderlich (Jarvis, 1984; Jarvis et al., 1996).
Phytophatogene Mikroorganismen exprimieren in der Regel PMEs die zufällig einzelne GalA
Einheiten demethylesterifizieren und damit eine Infektion der Pflanze ermöglichen. Durch die
19
Abbildung 2.6Struktur des katalytischen Zentrums der Tomaten PME(A)Katalyseregionen sind in violett, stabilisierende Bereiche in orange und substratbindende in blau dargestellt. Der Pfeil zeigt auf den katalytischen Spalt.
(B)Detaildarstellung der am katalytischen Prozess beteiligten Aminosäuren und Wassermoleküle
Abbildung aus (Di Matteo et al., 2005).
2. Einleitung
zufällige Demethylierung werden Protonen freigesetzt, die zu einem Absenken des pH Wertes in
der Zellwand führen (Lord, 2000; Micheli, 2001). Durch diese Absenkung können dann weitere
PMEs und pektinabbauende Enzyme, wie z.B. (Endo-)Polygalacturonidasen, aktiviert werden.
Polygalacturonidasen können ihr Substrat erst nach Demethylesterifizierung des
Homogalacturonrückgrates erkennen und enzymatisch umsetzen (Wakabayashi et al., 2003).
2.2.4.3 Regulation von Pektin Methylesterasen
Durch die Verwendung von Antikörpern, die in der Lage sind unterschiedliche Pektinepitope zu
markieren, konnten spezifische Pektin Mikrodomänen in Zellwänden nachgewiesen werden
(Lenartowska et al., 2001; Li et al., 1994; Liners & Van Cutsem, 1992; Stepka et al., 2000). Häufig
verwendete Antikörper sind JIM5, erkennt schwach methylesterifiziertes Pektin, JIM7, erkennt
stark methyliertes Pektin, LM7, erkennt Bereiche mit zufällig demethylierten Pektin und 2F4, der
Ca2+ vernetzte Pektinbereiche markiert. Der Nachweis spezifischer Pektin Mikrodomänen setzt eine
Regulierung der PMEs in der Zellwand voraus.
Viele PMEs zeigen eine gewebespezifische Expression bzw. werden erst bei bestimmten
Entwicklungsvorgängen, wie z.B. der Fruchtreifung und Pollenentwicklung, induziert. Die
Regulation von PMEs beginnt also schon auf transkriptioneller Ebene (s.o.).
Pektin Methylesterasen aus phytophatogenen Mikroorganismen demethylesterifizieren das Pektin
meist zufällig und weichen dadurch die Zellwandmatrix für die bevorstehende Infektion auf
(Micheli, 2001). In Pflanzen werden ebenfalls PMEs mit einem zufälligen Demethylierungsmuster
exprimiert. Durch die zufällige Demethylierung der Pektinmatrix kann es zur Gelbildung und
Aufweichung der Zellwand kommen (Jarvis, 1984; Jarvis et al., 1996). In die so vorbereitete Matrix
können neue Zellwandbestandteile integriert werden und es kann zum Zellwachstum kommen. Es
wurden auch PMEs charakterisiert, die je nach pH Wert ihr Demethylierungsmuster verändern
können und so zu einer Festigung bzw. Lockerung der Pektinmatrix beitragen können (Catoire et
al., 1998; Denes et al., 2000; Goldberg et al., 2001). Daneben können sie auch von zwei- und drei-
wertigen Kationen (Moustacas et al., 1991) sowie benachbarten Carboxyl- und Methyl-gruppen in
ihrer Aktivität moduliert werden (Catoire et al., 1998; Limberg et al., 2000; Willats et al., 2001b).
PMEs, die aus ihrem pflanzlichen Kontext gelöst wurden, können ebenfalls ihre enzymatischen
Eigenschaften verändern. Das Zellwandmilieu spielt folglich eine bedeutende Rolle in der
Modulation der PME Aktivität und der nachgeschalteten Prozesse (Willats et al., 2001b).
Phytohormone können ebenfalls zur Regulation von Pflanzen PMEs eingesetzt werden. Auxin
20
2. Einleitung
induziert in der Regel die PME Expression (Brian & Newcomb, 1954; Overvoorde et al., 2005),
während ABA die PME Aktivität in Tomatensamen steigern (Downie et al., 1998) bzw. in
Zedernsamen inhibieren kann (Ren & Kermode, 2000). Gibberilinsäure (GA3) führte in
Zedernsamen, Chamaecyparis nootkatensis, zu einer Aktivierung der PME Aktivität (Ren &
Kermode, 2000).
Eine weitere Möglichkeit PMEs zu regulieren ist das Exprimieren von Inhibitoren, die entweder
unspezifisch oder gezielt PMEs binden (Camardella et al., 2000; Wolf et al., 2003). Die Pro-
Domänen von Typ I Pektinesterasen sind den Pektin Methylesterase Inhibitor-verwandten Proteinen
(PMEI-RPs) sehr ähnlich und könnten bis zum Erreichen der Zellwand für die Inhibierung
notwendig sein (Bosch et al., 2005).
2.2.4.4 PME Inhibitoren
Mac Millan und Peromblen (1995) wiesen in Kartoffelzellwänden ein Molekül nach, das in der
Lage ist, pflanzliche PMEs zu inhibieren. Bei diesem Molekül handelt es sich jedoch nicht um
einen PME Inhibitor auf Proteinbasis, sondern um eine mit Seitenketten versehene Uronsäure mit
einem Molekulargewicht von ca. 200 kDa (McMillan & Perombelon, 1995).
1990 wurde der erste Inhibitor auf Proteinbasis in Kiwi, Actinidia chinensis, identifiziert und
charakterisiert (Balestrieri et al., 1990; Camardella et al., 2000). Vor kurzem konnten zwei weitere
PME-Inhibitoren aus Arabidopsis thaliana kloniert und charakterisiert werden (Raiola et al., 2004;
Wolf et al., 2003). Bei dem Versuch die Pektin Methylesterasen-inhibierende Proteindomäne zu
charakterisieren und einzugrenzen fiel auf, dass sie starke Homologien mit den Pro-Domänen von
Typ I PMEs und mit der Familie von Invertase Inhibitoren aufweisen (Greiner et al., 1998; Pressey,
1967). Aufgrund der Proteinsequenz lassen sich Kandidatenproteine folglich nicht in Invertase-
bzw. PME-Inhibitoren aufteilen, sondern werden in der Proteinfamilie „Pektin Methylesterase
Inhibitor-verwandte Proteine, PMEI-RPs“ zusammengefasst (Rausch & Greiner, 2004). Alle PMEI-
RPs besitzen ein Molekulargewicht um die 17 kDa, vier Cyteine, die zwei essentielle
Disulfidbrücken ausbilden und eine relativ ähnliche dreidimensionale Struktur, die sich aus einem
Kern von vier α-Helices und einer N-terminalen liegenden spiralförmigen Erweiterung
zusammensetzt (Camardella et al., 2000). Durch das Herstellen von PME-Invertase Inhibitor
Chimären wurde von Hothorn et al. (2004) versucht, die Funktion der N-terminalen Erweiterung zu
identifizieren (Hothorn et al., 2004a; Hothorn et al., 2004b). Die Autoren kamen zu dem Ergebnis,
dass die Extension eine kritische Rolle während der PME Bindung spielen soll und wichtig für die
21
2. Einleitung
Interaktin von PMEIs mit PMEs ist. Vor kurzem konne Di Matteo et al. (2005) jedoch zeigen, dass
während der Bindung des Kiwi PMEI mit einer Tomaten PME die N-terminale Erweiterung vom
Enzymkomplex wegzeigend frei in Lösung ist und scheinbar nicht für die PMEI-PME Bindung
erforderlich ist (Di Matteo et al., 2005). Die Stabilität des Enzym-Inhibitor Komplexes ist meist pH
abhängig und sinkt im basischen. Ab einem pH Wert von ca. 8,5 bilden sich keine Komplexe mehr
(D'Avino et al., 2003).
2.2.4.5 Die Rolle von PMEs und PMEI-RPs während der Pollenentwicklung: Der Pollenschlauch als Modellsystem zur Identifizierung von Pektinstoffwechselvorgängen während des gerichteten Spitzenwachstums
Durch Transkriptom-untersuchungen konnte gezeigt werden, dass PME Transkripte besonders
häufig in Pollen vorkommen (Becker et al., 2003; Honys & Twell, 2003; Lee & Lee, 2003; Pina et
al., 2005). Mit Hilfe des Affymetrix ATH1 Genomarray, das 60 von den 66 bekannten putativen
PME Genen aufweist, konnte ebenfalls gezeigt werden, das einige PME Gene zu den am häufigsten
vorkommenden Transkripten in Pollen gehören (Pina et al., 2005).
Der Pollenschlauch besitzt ein äußerst schnelles gerichtetes Spitzenwachstum, das durch
unterschiedlichste Faktoren reguliert werden kann (s.o.). Die Effekte dieser Faktoren führen nicht
nur zu Veränderungen innerhalb der Pollenschlauchspitze, sondern auch zu Veränderungen in der
Pollenschlauchwand. Die Spitze besteht fast ausschließlich aus einem Pektinnetzwerk (Ferguson C,
Teeri TT, Siika-aho M, Read SM, Bacic A, 1998), in das ständig neues Zellwandmaterial sekretiert
und eingebaut wird (Li et al., 1997; Taylor & Hepler, 1997). Während dieses Prozesses müssen
permanent Plasmamembranbestandteile und möglicherweise Zellwandkomponenten recycelt
werden. Vor kurzem erschienen mehrere Veröffentlichungen, in denen gezeigt wurde, dass für ein
korrektes Pollenschlauchwachstum eine kontrollierte Pektinmodifizierung durch PMEs erforderlich
ist (Bosch et al., 2005; Bosch & Hepler, 2006; Jiang et al., 2005). Die Überexpression der Tabak
PME NtPPME1 oder Zugabe exogener PME führt zum Arrest des Pollenschlauchwachstums. An
der Spitze lässt sich normalerweise nur stark methylesterifiziertes Pektin nachweisen. In den
NtPPME1 überexprimierenden Pollenschläuchen ist das Pektin an der Pollenschlauchspitze
demethyliert und die Zellwand verdickt (Bosch et al., 2005; Bosch & Hepler, 2006; Jiang et al.,
2005; Parre & Geitmann, 2005a). Vermutlich ist es durch die vorzeitige Demethylierung des
Pektins zur Bildung von Ca2+ Quervernetzungen und damit zu einer Verfestigung der Zellwand
gekommen. Immunhistochemische Untersuchungen zeigen, dass kurz hinter der
22
2. Einleitung
Pollenschlauchspitze die Methylierung der Pektinmatrix nachlässt und die Flanken fast nur noch
aus Demethylesterifizierten Pektinen besteht (Lenartowska et al., 2001; Stepka et al., 2000). Die
Flanken können sich also verfestigen und den Pollenschlauch stabilisieren, während die
Pollenschlauchspitze noch in der Lage ist die Richtung vorzugeben. Dieser Prozess setzt eine
Regulierung der pektinmodulierenden Enzyme voraus. Die Funktionen der PMEI-RP homologen
Pro-Domäne von Typ I PMEs konnten vor kurzem durch den Einsatz von Protein-Fluoreszenz-
Reporter Chimären zum Teil aufgeklärt werden (Bosch et al., 2005). Die Pro-Domäne der Tabak
NtPPME1 inhibiert zum einen die enzymatische Aktivität der PME-Domäne, wird aber auch für die
korrekte Lokalisierung benötigt. Das Signalpeptid alleine reicht nicht aus, um NtPPME1 in die
Zellwand zu dirigieren. Wann es zur Prozessierung von Typ I PMEs kommt, ist noch unklar:
entweder vor der Sekretion in die Zellwand oder kurz danach (Micheli, 2001).
23
3. Zielsetzung
3 Zielsetzung
Eine der Hauptkomponenten in der Zellwand des Pollens ist Pektin. Der Methylierungsgrad der
Homogalacturon-Komponenten weicht dabei in unterschiedlichen Bereichen des wachsenden
Pollenschlauches stark voneinander ab. Während an der Pollenschlauchspitze das Pektin stark
methyliert ist, nimmt der Anteil an demethyliertem Pektin mit zunehmender Entfernung von der
Pollenschlauchspitze zu. Der Methylierungsgrad beeinflusst die mechanischen Eigenschaften der
Pollenschlauchwand. Damit kommt der Regulation der für die Deesterifizierung verantwortlichen
Pektin Methylesterasen (PMEs) eine zentrale Bedeutung zu. In Pflanzen kommen PME-Enzyme als
große Genfamilie vor und auch im Pollen werden mehrere PME-Isoformen exprimiert. Vor kurzem
wurden die ersten pflanzlichen Pektin-Methylesterase-Inhibitoren (PMEI) kloniert und ihre
Expression in Pollen wurde für Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Bemerkenswerterweise zeigen
die Proteinsequenzen dieser PMEI eine signifikante Sequenzähnlichkeit zur N-terminalen
Prodomäne der so genannten Typ I PMEs. Damit ergibt sich folgendes Szenario: Der
Methylierungsgrad der Pektinmatrix des wachsenden Pollenschlauches wird über Pektin
Methylesterasen reguliert, wobei verschiedene PME-Isoformen entweder unter der Regulation einer
autoinhibitorischen Domäne stehen, oder Zielprotein eines PMEI sein können. Da bis zum Beginn
der Arbeit dieser Sachverhalt noch nicht untersucht wurde, sollte versucht werden, putative Mais
PMEIs und PMEs zu identifizieren, zu charakterisieren und möglicherweise eine Funktion der
beteiligten Proteine während des Pollenschlauchwachstums nachzuweisen.
Das Mais-System wurde aufgrund folgender Kriterien ausgesucht:
Es handelt sich um eine weltweit verbreitete Kulturpflanze, die in weiten Teilen der Welt als
Grundnahrungsmittel angebaut wird. In Europa und Nordamerika wird Mais hauptsächlich als
Viehfutter angebaut. Im Jahr 2005 wurden laut Statistik der FAO (Food and Agriculture
Organization) weltweit 701,7 Millionen Tonnen Mais produziert. Damit liegt Mais vor Weizen
(629,6 Mio. t) und Reis (618,4 Mio. t). Mais ist also eine weit verbreitete Pflanze mit hohem
wirtschaftlichem Nutzen. Dieser Nutzen lässt sich z.B. durch die Erforschung von
Stoffwechselvorgängen während der Bestäubung und Befruchtung optimieren. Möglicherweise
ließen sich so Verfahren zur Aufhebung von männlicher Sterilität bei Hybridmais und anderen
Nutzpflanzen entwickeln. Für die Erforschung solcher Grundlagen bietet das Maissystem den
Einsatz zahlreicher zellbiologischer und biochemischer Methoden. Im folgenden werden einige der
Möglichkeiten, die zur Aufklärung des Pektinstoffwechsels in Pollen herangezogen werden können,
24
3. Zielsetzung
dargestellt.
Es lassen sich relativ einfach große Mengen an Maispollen ernten und weiterverarbeiten. Dank
hervorragender Mais EST-Sequenzinformationen und Datenbanken lassen sich Online sehr schnell
sequenzbezogene Untersuchungen durchführen. Mögliche Kandidatengene können durch
Partikelbeschuss in Pollen bzw. andere Gewebearten eingebracht werden. Durch eine
Veränderungen des Phänotyps lassen sich so in vielen Fällen Funktionen des Kandidatenproteins
ermitteln bzw. in Silica Ergebnisse bestätigen. Durch die Koppelung des Kandidatenproteins an ein
z.B. fluoreszierendes Reporterprotein lässt sich in vielen Fällen auch noch die Lokalisation und
möglicherweise Funktion in der Zelle bzw. im Gewebeverband bestimmen. Lokalisation und
Phänotyp können also wertvolle Informationen für das Verständnis von Kandidatenproteinen
liefern. Die Größe des Maispollens erleichtert desweiteren die Durchführung von histologischen,
ultrastrukturellen und histochemischen Untersuchungen.
25
4. Material und Methoden
4 Material und Methoden
4.1 Pflanzenmaterial
4.1.1 Anzucht von Zea mays Pflanzen der Sorte „Lixis“
Im Rahmen der Arbeit wurden Maispflanzen der Sorte Zea mays „Lixis“ im Freiland und im
Gewächshaus angezogen. Die Anzucht von Maiskeimlingen erfolgte in Minigewächshäusern auf
nassem Küchenpapier. Zur Anzucht von Mais in Erde wurden Maiskörner direkt in Schalen mit
Erde gepflanzt und regelmäßig gegossen. Zur Bestäubung wurde frischer Maispollen auf frisches
Narbengewebe gegeben.
Die reifen Pollen wurden während der Blütezeit mehrmals am Tag in einem großen Becherglas
geerntet und anschließend gewogen. Proben, die nicht sofort verwendet werden konnten, wurden in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Neben Maispollen wurden noch verschiedene andere Proben wie z.B. Entwicklungsstadien von
Antheren, intakte bzw. leere Pollensäcke, mit Pollen bestäubtes bzw. unbestäubtes Narbengewebe,
Blattproben und verschieden Samenproben genommen.
4.1.2 Pollenproben von Nicotiana tobaccum
Zur heterologen Expression von potentiellen PMEIrps und PMEs wurde wildtyp Tabakpollen der
Sorte Nicotiana tabacum verwendet.
4.2 Isolation von Zellwandproteinen aus Maispollen bzw. aus aufgeschlossenen Zellen
Die Proben wurden gründlich in Flüssigstickstoff gemörsert bzw. in der Retsch-mühle pulverisiert
und jeweils mit 1 ml / 500 mg Frischgewicht Extraktionspuffer versetzt. Nach 15 Minuten
Zentrifugation bei 13000 rpm wurde der Überstand, welcher die löslichen Invertasen, PMEs und
Zucker enthält, abgenommen. Das Sediment wurde drei Mal gewaschen durch Resuspension in
Tris-Maleatpuffer und jeweils 15 minütiger Zentrifugation bei 13000 rpm. Da das erhalten
Sediment recht locker ist, wird es anschließend bei 100k rpm in einer Beckmann
Tischultrazentrifuge für 30 Minuten abzentrifugiert.
Um die Zellwandgebundenen Proteine zu eluieren wurde das Sediment in Salzelutionspuffer gelöst
26
4. Material und Methoden
und 30 Minuten bei 4°C geschüttelt. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei 100k rpm wurde der
Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt.
Extraktionspuffer A: 0.1 M Maleinsäure und 0.1 Tris-base werden gegeneinander titriert bis ein
pH von 7 eingestellt ist (~ 0,025 M Maleinsäure und 0,075 M Tris-base). Pro
50 ml Extraktionspuffer wird eine Tablette CompleteTM Mini Protease
Inhibitor Cocktail mit EDTA (Roche Diagnostics GmbH) gelöst.
Salzelutionspuffer: 1 M NaCl gelöst in Extraktionspuffer
4.3 Isolation der Zellwandproteine aus Maisblütengeweben zur Auftrennung in einer Gelfiltration
Für diese Isolation wurden unterschiedliche Proben wie z.B. Maispollen, Maispollen gekeimt,
Pollen auf Narbengewebe gekeimt und Narbengewebe alleine herangezogen. Die Proben wurden
ähnlich wie unter 4.2 aufgereinigt, jedoch wird hier ein Puffer gewählt, der die physiologischen
Bedingungen der Pollenzellwand simulieren soll. Da sich die meisten PMEs und
Zellwandinvertasen nur mit hohen Salzwerten eluieren lassen, wurde zu manchen Extraktionen
noch KCl bis zu einer finalen Konzentration von 0,6 mM hinzugegeben. Nach Elution der
Zellwandproteine wurde wieder auf den Extraktionspuffer B umgepuffert und die Probe
konzentriert.
Die Proben wurden bis zu einer Proteinkonzentration von 1,5-2,5 mg/ml konzentriert und
anschließend in Gelfiltrationen bzw. Inhibitionsversuchen eingesetzt.
Extraktionspuffer B: 50 mM MES Puffer pH 5,5, 250 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM
PMSF
Extraktionspuffer C: wie Extraktionspubber B jedoch mit insgesamt 0,6 mM KCl
4.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen nach Bradford
Basische Aminosäuren–Seitenketten von Proteinen bilden mit Coomassie Brilliant Blue G-250
Komplexe, die in Lösung blau erscheinen. Die Intensität der Färbung ist proportional zu der Menge
Protein im Reaktionsansatz (Bradford, 1976). Das Absorptionsmaximum der Komplexe liegt bei
595 nm. Die Proteinkonzentration kann durch Messung der OD595 im Vergleich mit einer Eichkurve
bestimmt werden. 800 μl in H2O verdünnte Proteinlösung (für Nullabgleich 800 μl H2O verwenden)
werden zu 200 μl filtrierter Bradford–Reagenz-Stocklösung pipettiert und 5 bis maximal 30 min
inkubiert. Die Messung der OD595 erfolgt am Spektralphotometer. Die Ermittlung der
27
4. Material und Methoden
Konzentration, einer Proteinlösung, erfolgt durch den Vergleich mit den Werten einer Eichkurve,
die aus Verdünnungen eines Proteinstandards (BSA) erstellt wurde.
4.5 Proteinfällungen
4.5.1 Acetonfällung von Proteinen aus einer wässrigen Lösung
Bei der Acetonfällung wurden vier Volumen eiskaltes 100 %iges Aceton mit der Probe gemischt
und mindestens eine Stunde bei -20 °C inkubiert. Die gefällten Proteine wurden anschließend 30
min bei 15.000 x g und 4 °C abzentrifugiert und das Sediment mit 90 % Aceton gewaschen. Nach
erneuter Zentrifugation (15 min bei 15.000 x g und 4 °C) konnte das Sediment kurz bei 37 °C
getrocknet und in dem SDS-Probenpuffer (z.B. Rotiload, Roth) aufgenommen werden. Zur
Verwendung in Enzymmessungen wurde das Sediment im jeweiligen Puffer aufgenommen.
4.5.2 Trichloressigsäure-fällung von Proteinen
Eine selektivere Fällung von Proteinen ist mit Trichloressigsäure (TCA) möglich. Dazu wurde die
Probe mit 1/9 Volumen eiskalter 100 % TCA versetzt und 30 min auf Eis inkubiert. Die gefällten
Proteine wurden wie nach der Acetonfällung abzentrifugiert und weiterbehandelt. Die Zugabe von
Desoxycholat (4mg/ml) hilft auch sehr kleine Proteine, die sonst in Lösung bleiben, auszufällen.
4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Proteine wurden über diskontinuierliche SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese
aufgetrennt(Laemmli, 1970). Dabei werden die Proteine im Sammelgel zu einer scharfen Bande
fokussiert und im sich anschließenden Trenngel nach ihrem relativen Molekulargewicht
aufgetrennt. Der Acrylamidgehalt des Sammelgels lag bei 4,5 % (w/v), die Trenngele wiesen
dagegen 8 bis 15 % (w/v) Acrylamid auf. Der Gelansatz enthielt Acrylamid, Sammelgelpuffer (4 x
Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris-base, 0,4 % SDS, pH 6,8 (HCl)) bzw. Trenngelpuffer (4 x
Trenngelpuffer: 1,5 M Tris-base, 0,4 % SDS, pH 8,8 (HCl)) und A. bidest. Zuletzt wurden
Ammoniumperoxodisulfat und TEMED zugegeben, die die Polymerisationsreaktion starten. Es
wurde zuerst das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Sobald das Gel
auspolymerisiert war, wurde das Isopropanol entfernt, das Sammelgel gegossen und der Kamm für
die Ausbildung der Probentaschen platziert. Die Proben wurden vor dem Auftragen kurz
abzentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Außerdem wurde auf das Gel ein
28
4. Material und Methoden
Proteingrößenmarker (meist LMW Calibration Kit, Pharmacia) aufgetragen, um eine
Größenbestimmung der Proteine nach dem Lauf zu ermöglichen. Der Gellauf erfolgte in 1 x
Laufpuffer (20 mM Glycin, 2,5 mM Tris-base, 0,1 % SDS) bei 100 V im Sammelgel und 200 V im
Trenngel bis die Bromphenolblaufront (aus Probenpuffer) aus dem Gel austrat.
Die Gele wurden entweder mit Coomassie gefärbt (6.7) oder in der „Western-Blot“ Analyse
eingesetzt(6.8).
4.7 Proteinfärbungen
4.7.1 Coomassiefärbung von Gelen
Das Proteingel wurde nach der Gelelektrophorese mit in 0,2 % Coomassie Brilliant Blau G-250 in
45 % Ethanol (v/v), 10 % Essigsäure (v/v) für 30 bis 60 Minuten gefärbt. Die Gele wurden in der
gleichen Lösung ohne Farbstoff entfärbt und anschließend in Aufbewahrungslösung (45 % (v/v)
Methanol, 2,5 % (v/v) Glycerol) bei 4 °C gelagert oder zwischen Cellophan im Trockenschrank
getrocknet.
4.7.2 Amidoschwarzfärbung
Die Amidoschwarzfärbung, auch Naphtolblau-färbung genannt, wurde benutzt, um Proteine nach
dem immunologischen Nachweis direkt auf der PVDF- bzw. Nitrocellulose-Membran sichtbar zu
machen. Eine kurze Inkubationszeit von 5 bis 10 Minuten in der Färbelösung (0,1% Naphtol Blue
Black (Sigma-Aldrich), 20% Methanol, 7% Essigsäure) reicht aus um die Proteine sichtbar zu
machen. Das Detektionslimit liegt bei ca. 100ng Protein.
4.7.3 Ponceaurotfärbung
Die Amindoschwarz-färbung lässt erst nach dem immunologischen Nachweis der Proteine einen
Rückschluss auf die Proteinmenge und Proteinverteilung in der Probe zu. Nach einer solchen
Färbung ist jedoch die Membran und die darauf befindlichen Proteine nicht mehr weiter zu
verwenden. Um direkt nach einem „Western-Blot“-transfer auf einer PVDF- bzw Nitrocellulose-
Membran die Proteine sichtbar zu machen wurden die Membranen direkt nach dem Proteintransfer
in die Ponceaufärbelösung (0,2% Ponceau S, 3% TCA, 2% Sulfosalicylsäure) gelegt und für 5-10
Minuten gefärbt. Anschließend wurden die Membranen mit H2O kurz gewaschen, eingescannt und
mit 1x TBST gewaschen.
29
4. Material und Methoden
4.8 Western-Blot Analyse
Der „Western-Blot“ ermöglicht die Erkennung spezifischer Proteine. Eine Proteinmischung wird
nach elektrophoretischer Auftrennung an eine Nitrocellulose-Membran gebunden und die
Einzelkomponenten durch spezifische Antikörper identifiziert. Das „Western-Blot“-Gel wird
entweder nass oder halbtrocken auf eine PVDF- bzw. Nitrocellulose-Membran transferiert
(Immobilon P, Millipore; Fast-Blot, Biometra; Transblot SD Semi-Dry Transfer Cell, BioRad).
Geblottet wird 30-45 Minuten bei 15 mA („Semidry“-Blot). Die Membran wird nach dem Transfer
mit Ponceau S Lösung gefärbt, um den Transfer der Proteine zu überprüfen.
Anschließend wird die Membran ÜN bei 4°C oder 1h bei RT in Blockierungslösung (5%
Magermilchpulver in TBST (100 mM NaCl, 20 mM Tris-base pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,005%
Tween-20)) abgesättigt. Alle weiteren Schritte erfolgen bei RT auf dem Schüttler. Zuerst erfolgt die
45 minütige Inkubation mit dem Erst-Antikörper in 2% Milch-TBST. Drei Waschschritten mit 1x
Waschlösung, TBST, für 5 min folgt die Inkubation (45 min) mit dem Zweit-Antikörper (HRP-
Konjugat 1:10000 verdünnt in 2% Milch-TBST). Nach drei weiteren Waschschritten in 1x
Waschlösung inkubiert man die Membran mit SuperSignalTM Substrate (Lösung A und B vorher im
Verhältnis 1 : 1 mischen) bei Verwendung eines Zweit-Antikörpers mit HRP-Konjugat
(SuperSignalTM Substrate, Western Blotting Kit, Pierce). Der Membran wird in einer
Autoradiographiekassette ein HyperfilmTM aufgelegt. Die Expositionsdauer hängt von der
Signalstärke ab und kann variiert werden.
4.9 Arbeiten mit Escherichia coli
Für alle Klonierungsarbeiten wurde der E. coli Stamm XL1-Blue (Stratagene) verwendet.
Genotypische Besonderheiten: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F´proAB lacIq
ZΔM15 Tn10(Tetr)]c.
Zur Überexpression von Proteinen wurde der E. coli Stamm Rosetta-gamiTM (Novagen) verwendet.
Dieser besitzt das Plasmid pRARE (codiert für sechs tRNAs, die selten in E. coli genutzt werden,
sowie eine Chloramphenicol-Resistenz zur Selektion). Zudem ist in diesem Stamm die Ausbildung
von Disulfidbrücken durch Mutationen in den Thioredoxin (trxB) und Glutathion (gor) Reduktase
Enzymen begünstigt. Genotypische Besonderheiten: Δara-leu7697 ΔlacX74 ΔphoAPvu II phoR
araD139 ahpC galE galK rpsL F’[lac+(lacIq)pro] gor522::Tn10 trxB::kan pRARE.
30
4. Material und Methoden
4.9.1 Bakterienmedien
LB-Medium: 1 % Bacto Tryptone (Difco); 0,5 % Bacto Yeast Extract (Difco); 1 % NaCl, pH 7
(NaOH); Low Salt LB: wie LB, aber nur 0,5 % NaCl.
TB-Medium (für Proteinüberexpression): TB I und TB II getrennt ansetzen und erst nach dem
Autoklavieren 1 Teil TB I mit 9 Teilen TB II mischen. TB I: 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4. TB
II: 12 g Tryptone, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glycerol, ad 900 ml mit H2O.
Für Festmedien wurde zusätzlich 1,5 % Agar eingewogen. Der Zusatz von Antibiotika erfolgte nach
dem Autoklavieren und Abkühlen auf circa 60 °C unter sterilen Bedingungen mit folgenden
Endkonzentrationen: Ampicillin: 100 mg/l; Kanamycin: 50 mg/l; Spectinomycin: 100 μg/ml;
Zeocin: 20 μg/ml (in „Low Salt“-LB); Chloramphenicol: 34 μg/ml
4.9.2 Herstellung einer Glycerin-Bakterienstocklösung
Die Bakterien (z.B. transformierte XL1-Blue) werden auf einer LBAmp-Platte ausplattiert und ÜN
bei 37°C inkubiert. Von dieser Platte impft man eine Übernachtkultur (10 ml LBAmp-Medium) an
und inkubiert ÜN bei 37°C bei 180-200rpm auf dem Schüttler. Zu 500 μl 70% Glycerin-Lösung
gibt man 500 μl Bakteriensuspension, mischt gut und lagert diese Bakterienstocklösung bei –80°C,
wo sie für mehr als 2 Jahre haltbar ist.
4.9.3 Herstellung elektrokompetenter E. coli-(XL1-Blue)-Zellen
Es wurden 500 ml Low Salt LB-Medium mit 10 ml E. coli Übernachtkultur angeimpft und bis zu
einer OD600 nm von 0,7 bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Kultur auf
Eis gekühlt und 15 min bei 2.500 g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die
Bakterien in 500 ml eiskaltem A. bidest (alle Lösungen steril) resuspendiert. Nach einem weiteren
Zentrifugationsschritt bei 2.500 g und 4 °C für 15 min, wurde das Sediment in 250 ml eiskaltem A.
bidest resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Sediment in 20 ml 10 % Glycerin
resuspendiert. Die Bakterien wurden wieder 15 min bei 2.500 g und 4 °C zentrifugiert und das
Sediment schließlich in 2 ml 10 % Glycerin resuspendiert. Die Bakterien wurden nun in 50 μl
Aliquots auf Eppendorfgefäße verteilt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die
Lagerung erfolgte bis zur Transformation bei -80 °C. Die Zellen wurden durch eine
Kontrolltransformation mit pUC19 überprüft, wobei die Transformationseffizienz über 108 cfu/μg
DNA liegen sollte.
31
4. Material und Methoden
4.9.4 Elektroporation von E. coli
Die Elektroporation wurde in speziellen Küvetten (Innendurchmesser: 0,1 cm) mit dem „Gene
PulserII“ (Bio-Rad) bei folgenden Geräteeinstellungen durchgeführt: 200 Ohm; 1,8 kV; 25 μF.
Dazu wurden die kompetenten Zellen kurze Zeit auf Eis aufgetaut und zu 50 μl Bakterienlösung 0,5
bis 2 μl eines Ligationsansatzes oder reiner Plasmidlösung zugegeben. Nach einer Minute wurde
das Gemisch aus Bakterien und DNA in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette gegeben und für
mindestens 4,5 msek das elektrische Feld angelegt. Danach wurde sofort 1 ml SOC-Medium in die
Küvette gegeben und gut durchmischt. Die Suspension wurde in ein Eppendorfreaktionsgefäß
überführt und 1 h bei 37 °C inkubiert. Je nach Ansatz wurden variable Volumina auf
Selektionsplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
SOC-Medium: 20 g/l Bacto Tryptone (Difco); 0,5 g/l Bacto Yeast Extract (Difco); 0,5 g/l NaCl;
0,186 g/l KCl; 2,03 g/l MgCl2; 3,96 g/l Glucose (Monohydrat), pH 7,0
4.9.5 Proteinexpression der vier rekombinanten Pektin-Methylesterase-Inhibitor-verwandten-Proteine PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 in E. coli
Zur Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli wurde in dieser Arbeit das QIAexpress
pQE-System (Qiagen) verwendet.
Aus einer elektro-transformierten E. coli Kultur (Rosetta-gamiTM), die das entsprechende
Expressionsplasmid (siehe Vektorliste) enthält, wird jeweils eine 50 ml ÜNK in LBAntibiotikum
,Chloramphenicol mit 0,6 % Glukose bei 37 °C angelegt. Diese ÜNK wird nun in ein größeres Volumen
LB mit 0,6 % Glukose überführt. Das Verhältnis von ÜNK zum neuen Medium sollte ca. 1/30 für
eine Inkubation bei 18 °C betragen. Die Bakteriensuspension wird bis zu einer OD600nm von 0,8-1
wachsen gelassen. Nun wird eine Probe von 200 µl genommen, die als Nullprobe dient.
Gleichzeitig wird ein Teil des Volumens in einen neuen Kolben überführt, der als negative
Kontrolle zur nun folgenden Induktion dient. Induziert wird mit 0,1–1 mM IPTG (Isopropyl–ß–D–
Thiogalactosid). IPTG bindet an das lac Repressorprotein und inaktiviert dieses. Ist der lac
Repressor einmal inaktiviert, können von der RNA–Polymerase stromaufwärts gelegene Sequenzen
transkribiert werden. In verschiedenen Zeitabständen, meist 2h + 4h + 6h + ÜN, werden nun Proben
von 200 µl von dem induzierten und nicht induzierten Ansatz entnommen. Diese werden bei 4500
Upm für 5 min in der Tischzentrifuge abzentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Die
Sedimente werden mit 200 µl 2x Probenauftragspuffer (mit DTT) versetzt und 1/8 der Probe (25µl)
in der SDS–PAGE analysiert, 1/40 (5µl) im Western Blot.
32
4. Material und Methoden
Die vier PMEI-RPs wurden nach Vortests in zwei Liter TB-Medium bei 18 °C für 16-18h bei
200Upm induziert. Die Bakterien wurden anschließend bei 18 °C und 200upm geerntet, mit 200ml
Waschpuffer (500mM NaCl, 50mM NaPO4, 25mM Imidazol, 10% Glycerol, pH 7,5) gewaschen
und mit einer „French Press“ (EmulsiFlex-C5, Avestin) bei 70-100 MPa aufgeschlossen.
Unlösliches Protein wurde 45min lang bei 22000g abzentrifugiert und anschließend in eine IMAC-
Säule, die mit 2-3ml Ni-NTA Agarosematrix (Qiagen) gefüllt ist, gegeben. Nach Bindung des 6His-
markierten rekombinanten Proteins an die Matrix, wurde diese mit 300ml Waschpuffer gewaschen.
Das gereinigte Protein wurde schließlich in 10 1ml Fraktionen eluiert (500mM NaCl, 50mM
NaPO4, 250mM Imidazol, 10% Glycerol, pH 7,5).
4.9.6 Proteinexpression verschiedener Pektin-Methylesterasen und PME-Fragmente in E. coli
Siehe Tabelle 3.2. Es wurden verschiedene Vektoren und Bakterienstämme ausgetestet. In keinem
Expressionsversuch konnte rekombinantes Pektin Methylesterasen Protein nachgewiesen werden.
4.10 Arbeiten mit Pichia pastoris
4.10.1 Pichia pastoris Medien
YPD: 1% Hefe Extrakt, 2% Peptone, 2% Dextrose
YPDS: 1% Hefe Extrakt, 2% Peptone, 2% Dextrose, 1 M Sorbitol
BMGY: 1% Hefe Extrakt, 2% Peptone, 100 mM Kalium Phosphat Puffer pH 6, 1,34% Hefe
Stickstoff Basis (YNB) w/o Ammonium Sulfat, 1 % (w/v) Ammonium Sulfat, 4*10-5% Biotin,
1% Glycerol
BMMY: 1% Hefe Extrakt, 2% Peptone, 100 mM Kalium Phosphat Puffer pH 6, 1,34% Hefe
Stickstoff Basis (YNB) w/o Ammonium Sulfat, 1 % (w/v) Ammonium Sulfat, 4*10-5% Biotin,
1% methanol
4.10.2 Herstellung von elektrokompetenten Pichia pastoris
Die Hefen wurden in 500 ml YPD Medium bis zu einer OD595 von 1,5 angereichert und
anschließend mit 1500 x g bei 4°C geerntet. Die Hefen werden zwei mal mit je 500 ml eiskaltem
sterilen Bidest und 20 ml eiskaltem 1 M Sorbitol gewaschen. Die Hefen wurden schließlich in 4 ml
Sorbitol aufgenommen und in 80 µl Aliquots aufgeteilt. Die beste Transformationseffizienz hatten
33
4. Material und Methoden
die kompetenten Hefen direkt nach Herstellung. Die restlichen wurden in Flüssigstickstoff
schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt.
4.10.3 Elektroporation von Pichia pastoris
Die Hefen wurden auf Eis mit 5 µg des gewünschten zuvor linearisierte pPICZalphaA Plasmids
versetzt. Die Elektroporation wurde in 0,2cm Küvetten mit dem „Gene PulserII“ (Bio-Rad) bei
folgenden Geräteeinstellungen durchgeführt: 1,5 kV, 200Ω, 25 μF. Anschließend wurden die Hefen
in 1 ml 1 M sterilem Sorbitol bei 30°C für zwei Stunden geschont. Die Selektion von
transformierten Hefen erfolgte auf YPDS Platten die mit 100 mg/l Zeocin versetzt wurden.
4.10.4 Proteinexpression in Pichia Pastoris
Die Hefeklone wurden bei 30°C in 50 ml BMGY Medium ÜN angezogen und am nächsten Tag mit
1500 x g geerntet. Anschließend wurde das Sediment mit 100 ml BMGY Medium resuspendiert
und für 2-5 Tage bei 28°C kultiviert. Zur Proteinexpression wurde das Medium mit 1% Methanol
alle 24h komplementiert. Der Überstand mit dem rekombinanten Protein wurde anschließend
geerntet und zur Proteinfällung mit 80% Ammonium Sulfat versetzt. Das erhaltene Sediment wurde
in Bindungspuffer (300 mM NaCl, 50 mM Phosphat Puffer pH 7,5) aufgenommen und über eine
Nickel-Ionen-Säule gereinigt.
Zur Identifizierung von positiven Klonen wurden die Hefen im kleinen Maßstab angezogen und im
Western-Blot mit anti-myc Antikörpern analysiert.
4.11 Affinitätsreinigung von Antiseren
Um Antikörper zu reinigen bzw. aufzukonzentrieren, nutzt man die spezifische Bindung zwischen
Antigen und Antikörper aus. Die Antigen-Antikörper-Bindung kann durch
Veränderung der Ionenkonzentration, des pHs etc. wieder gelöst werden. Polyklonales
Kaninchenserum enthält ca. 8 – 16 mg Immunglobulin. Davon sind ca. 1 % spezifisch gegen das
zum Immunisieren gerichtete Epitop als IgG vorhanden. Die unspezifischen Antikörper können z.B.
in „Western-Blots“ zu einer Vielzahl von Banden, die die spezifische(n) überlagern, führen.
Das PMEI-RP3-Antiserum, das PMEI-RP2,PMEI-RP3 und PMEI-RP4 detektiert, wurde mit
rekombinanten PMEI-RP3 Protein affinitätsgereinigt. Ca. 2mg des rek. Proteins in
Koppelungspuffer (0,1M NaHCO3, 0,5M NaCl, pH 8,3) werden mit 0,5g vorbereiteter CNBr-
aktivierter Sepharose 4B versetzt und eine Stunde bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Matrix
34
4. Material und Methoden
in eine Econo-Pac-Säule überführt, mit Koppelungspuffer gewaschen und verbliebene
Bindungsstellen gegen Amine mit 10ml 100mM Tris-HCl, pH 8 für 2h bei RT abgeblockt. Schwach
gebundene Proteine wurden durch abwechselndes Waschen (3x) mit 10ml 100mM Sodium Acetat,
500mM NaCl, pH4,5 und 10ml 100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 8 entfernt.
Die Matrix wird in 1x TBS (20mM Tris, 150mM NaCl, pH 7,4) überführt und bei 4°C gelagert.
5ml des Antiserums werden mit 500µl 10x TBS versetzt und ÜN bei 4°C mit der vorbereiteten
Sepharose 4B-PMEI-RP3 Matrix inkubiert Nicht gebundene Antikörper werden durch Waschen mit
1x TBS entfernt. Anschließend werden die spezifischen Antikörper in 500µl Fraktionen mit
Elutionspuffer (200mM Glycin, 1mM EGTA, pH 2,8) eluiert. Der saure pH wurde durch Zugabe
von 1/10 Volumen 200mM Tris, pH 8,5 neutralisiert. Zur Stabilisierung und Konservierung wurden
den Fraktionen 0,1mg/ml BSA und 0,02% NaN3 zugesetzt. In den ersten Fraktionen eluieren
Antikörper mit einer relativ schwachen spezifischen Bindung gegen PMEI-RP3. In den späteren
Fraktionen eluieren PMEI-RP3 Antikörper mit einer relativ starken spezifischen Bindung gegen
PMEI-RP3. Je nach Fragestellung hat man verschiedene PMEI-RP Antikörper zur Verfügung. Im
Western-Blot wurden Verdünnungen von 1:200 bis 1:1000 verwendet.
4.12 Lektin Chromatographie
Zur Aufreinigung von glycosilierten Proteinen wurden Pflanzenlysate über eine Concanavalin A
(ConA) Sepharose Matrix gegeben. Pflanzenproben wurden in 1x ConA Puffer (50mM Na Acetat,
1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM PMSF, pH 6,3) aufgenommen, der Überstand nach
Zentrifugation mit der ConA-Sepharose gemischt und für 1h bei RT inkubiert. Die Suspension
wurde in eine Säule gegeben und die nicht-glykosilierten Proteine im Durchfluss aufgefangen. Die
Matrix wird mit 50ml 1x ConA-Puffer gewaschen und die gebundenen Proteine anschließend mit
ConA-Puffer und 15% methyl-α-D-Glucopyranosid eluiert.
4.13 Größenausschluss-Flüssigkeitschromatographie
Zum Auftrennen von Protein und Proteinkomplexen wurden verschiedene Pflanzenproben auf eine
Sephadex G100F Säule (BIO-RAD) und über eine Superdex200 Hiload16/60 Säule (Pharmacia)
geladen. Im folgenden werden die Daten der Pharmacia Anlage beschrieben. Das System bestand
aus einer P-500 Kolbenpumpe, einer Superdex200 Säule (120ml Volumen), einem UV-MII UV-
Meter und dem Fraktionssammler Frac-100. Die Ergebnisse und das System wurden mit der
Software „FPLC-Director V.1.1“ bearbeitet bzw. konfiguriert. Alle verwendeten Puffer wurden
35
4. Material und Methoden
sterilfiltriert (0,2µm filters) und entgast. Während einem Pufferwechsel wurde die Säule mit
mindestens 2 Säulenvolumen des neuen Puffers equilibriert. Proben wurden mittels einer 1ml
Probenschleife auf die Säule geladen.
Pflanzenextrakte wurden in MES-Puffer (50mM MES pH 5,5, 250mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM
CaCl2), rekombinante Proteine in NaPO4-Puffer (50mM NaPO4, 300mM NaCl, pH 7,5) aufgetrennt.
Die Fraktionen wurden entweder in Enzymmessungen verwendet oder aber für Western-Blot
Versuche mit Aceton bzw. TCA sedimentiert. Das Acetonsediment wurde direkt in SDS-
Probenauftragspuffer aufgenommen. Das TCA-Sediment wurde einmal mit Aceton gewaschen und
ebenfalls in SDS-Probenauftragspuffer aufgenommen.
4.14 Ballistische Transformation
Zur ballistischen Transformation von Zellen wurde die Partikelkanone Biolistic PDS-1000/He (Bio-
Rad) nach Anleitung des Herstellers verwendet. Dabei werden mit DNA beladene Goldpartikel
unter hohem Druck auf das Gewebe geschossen. Dringt der DNA-beladene Artikel im Bereich des
Zellkerns in die Zelle ein, kann es zu einer Expression der DNA und damit transienten
Transformation der Zelle kommen.
4.14.1 Funktionsprinzip der 'Particle Gun'
Plasmid-DNA wird auf kleinste Wolframpartikel bzw. Goldpartikel (1,3 µm bzw. 1,6 µm)
aufgebracht. Diese gelangen bei starker Beschleunigung unter Zerstörung der Zellwand in die Zelle
und ihren Kern. Hier kommt es zur Expression der eingebrachten Gene.
Die Partikelkanone besitzt eine Überdruckkammer, die durch eine Berstscheibe von der unteren
Unterdruckkammer getrennt ist. In der unteren Kammer wird das zu transformierende
Pflanzenmaterial positioniert und ein Vakuum angelegt. In der oberen Kammer wird mittels Helium
ein Überdruck erzeugt. Sobald die Druckdifferenz zwischen den Kammern einen für die
Berstscheibe charakteristischen Wert erreicht, zerreißt diese. Es entsteht eine nach unten gerichtete
Druckwelle, die einen mit Wolframpartikeln (Microcarriern) beladenen Macrocarrier beschleunigt.
Dieser fliegt nach unten, bis er auf ein Stopnetz trifft. Die Microcarrier selbst gelangen durch die
Maschen des Netzes und fliegen nahezu ungebremst auf die Zellen.
36
4. Material und Methoden
4.14.2 Partikelpräparation
60 mg Goldpartikel (1-1,6 µm) wurden in 1 ml 100 % Ethanol 2 min gevortext, abzentrifugiert,
2mal mit sterilem Bidest gewaschen und in 1 ml 50 & Glycerol aufgenommen.
Zur Präparation eines Doppelschusses wurden unter kontinuierlichem vortexen 25 µl der
Goldpartikellösung mit 2-5 µg DNA (nicht mehr als 10 µl) kombiniert. Darauf folgten 25 µl CaCl2
(2,5 M) und 10 µl Spermidin (0,1 M) und es wurde weiter für 2 min gevortext. Nach kurzem
Abzentrifugieren (max. 4000 rpm) wurde der Überstand entfernt und das Pellet in 200 µl 100 %
Ethanol resuspendiert.. Nach erneutem Abzentrifugieren wurde der Ethanol entfernt und durch
frische 15 µl ersetzt. Anschließend wurde das Pellet durch 2 min Sonifikation im Wasserbad und
heftigem Pippettieren gelöst und jeweils 8 µl auf die Mitte der Makrocarrier (Bio-Rad) verteilt. Die
Partikel sollten dabei möglichst gut verteilt sein, um eine Streuung beim Beschuss zu erreichen.
4.14.3 Transformation von Nicotiana tabacum Pollen
10xSalze:10mM CaCl2, 10mM Kcl, 8mM MgSO4, 16 mM H3BO3, 300µM CuSO4
2xPTNT (steril filtriert): 10 % Saccharose, 0,6% MES (15mM), 0,06 % Casein acid-hydroxylase
(1,5%, Sigma), 2x Salz, 20 mg/l Rifampicin, 25 % PEG-6000
PTNT-5 cm-Petrischalen: 25 ml 2x PTNT, 25 ml Phytagel (0,5 %, Sigma)
4.14.4 Pollenkeimung
Die Keimung von Tabakpollen wurde im Zusammenhang mit deren ballistischer Transformation
durchgeführt. Es wurde das Pollenkeimmedium PTNT verwendet. Alle Antheren einer Blüte
wurden in 5 ml 1x-PTNT-Medium gegeben und kräftig gevortext. Um die Antheren zu entfernen,
wurde der gesamte Ansatz sofort durch ein Sieb gegeben und gleich im Anschluss daran mittels
Vakuumpumpe und Abnutschflasche auf eine mit Wasser angefeuchtete Filtermembran (Millipore,
HAWP 047 00) gebracht. Diese wurde kopfüber auf eine PTNT-Platte gelegt. Beim anschließenden
Abziehen der Membran blieben die Pollen auf der Platte haften. Die Transformation erfolgte
unmittelbar nach dem Aufbringen der Pollen auf die Platte.
1x PTNT-Flüssigmedium(pollentube Nicotiana tabacum): 5 % Saccharose, 0,3 % MES (Sigma),
0,03 % Caseinacidhydrolysat (Sigma 'Amicase'), 1 mM CaCl2*2H2O, 1 mM Kcl, 0,8 mM
MgSO4*7H2O, 1,6 mM H3BO3, 10 µM CuSO4 *5H2O, 10 mg/l Rifampicin (in Methanol) (Sigma),
pH 5,9 mit KOH, 12,5 % PEG (BDH, specially purified)
PTNT wurde als 2x-Medium angesetzt, sterilfiltriert und bei 4°C gelagert. 1x PTNT entstand durch
37
4. Material und Methoden
Verdünnung des 2x PTNT mit A.bidest.
Pollenkeimplatten: 2x PTNT wurde im Wasserbad (90°C) erhitzt und 1:1 mit kochendem Phytagel
(0,5%) (Sigma) gemischt. Es wurden sofort je 3 ml in eine Petrischale (5,5 cm) gegossen. Die
Platten wurden bis zum Gebrauch bei 4°C gelagert.
4.14.5 Beschuss der Zellen
Die Transformation wurde unter der Sterilbank durchgeführt. Sämtliche Materialien waren
autoklaviert oder mit absolutem Ethanol desinfiziert. Für jeden Schuss wurde eine Berstscheibe in
ihre Halterung eingesetzt. Stopnetz und Macrocarrier wurden gemäß der Anleitung in ihre
Halterung eingesetzt und im obersten Einschub der Unterdruckkammer positioniert. Das in der
Unterdruckkammer angelegte Vakuum betrug 25 Inches Hg. Die Petrischalen mit den Pollen befand
sich auf der Halterung im zweituntersten Einschub (Position 3, Abstand zum Macrocarrier 9 cm).
Zum Beschuss der Pollen wurden Berstscheiben (Bio-Rad) verwendet, die bei 1100 psi reißen.
Nach dem Beschuss wurde der Tabakpollen im Dunkeln inkubiert und in Schalen mit Parafilm
umwickelt. Die Analyse der Tabakpollen erfolgte nach 6 bis 16 Stunden unter dem Mikroskop.
4.15 Mikroskopie
Fluoreszenz Mikroskopie
Der keimende Pollen wurden 6 bis 16 Stunden nach der transienten Transformation unter dem
Lichtmikroskop analysiert. Der Pollen wurde hierfür mit der Oberseite auf ein Deckgläschen
übertragen. Verwendet wurde ein Inverslichtmikroskop (DMIL, Leica). Bilder wurden mit einer
angeschlossenen Digitalkamera und dem Software-Programm 'Analysis' aufgenommen. Zur
Detektion der grünen Fluoreszenz des GFP wurde ein FITC-Filter verwendet: er lässt
Anregungslicht der Wellenlängen von 450 nm bis 490 nm passieren. Die Emission ist durch einen
515 nm Langpassfilter auf die Wellenlängen oberhalb von 515 nm beschränkt. Das GFP leuchtet
mit diesem Filter intensiv grün. RFP fluoresziert mit diesem Filter gelblich. Zur Detektion des RFP
wurde der für das DsRed-Protein optimierte Filter XF 137-2 verwendet. Sein Anregungsbereich
liegt bei 540 nm; durchgelassen werden Wellenlängen über 585 nm. RFP fluoresziert mit diesem
Filter intensiv rot.
Confokale Laser Scanning Mikroskopie
Weitere mikroskopische Analysen wurden mit einem konfokalen Laser scanning Mikroskop
(LSM510 Meta, Zeiss) durchgeführt. Die folgenden Anregungs- und Detektions-Wellenlängen
38
4. Material und Methoden
wurden verwendet:
GFP: Anregung 488nm; Nachweis: Breitband 505-530nm
RFP: Anregung 543nm; Nachweis: Breitband 560-615nm
YFP: Anregung 500nm; Nachweis: 535nm
CFP: Anregung 436nm; Nachweis: 480nm
4.16 PME Assay
Der verwendeten PME-Assay [67] basiert auf der Bildung von Methanol, das während der
Demethylesterifizierung des Pektins von den PMEs abgegeben wird. Das Methanol (COOCH3)
kann mit Hilfe einer Alkoholoxidase (AO) zu Formaldehyd (CH2O) umgesetzt werden, welches
wiederum als Substrat für eine Formaldehyd-Dehydrogenase (FDH) dient, die daraus Formiat
(COOH) bildet. Die bei der Dehydrogenierung des Formaldehyds freiwerdenden Elektronen werden
zur Reduktion von NAD+ zu NADH genutzt. Dieser Schritt lässt sich photometrisch bei 340 nm
verfolgen.
Beispiel eines Assayansatzes (600µl):
542,4µl NAD+-Lösung (0,4 mM NAD in Natriumphosphat-Puffer pH 7,5)
4,8µl FDH (= 0,2 U, Sigma F-1879)
48µl Pektin-Lösung (0,5%ig in Bidest, Sigma P-9135)
4,8µl AO (= 1 U, Sigma A-2404)
2-20µl PME-Extrakt
Für ein Experiment wurden die 12fachen Menge des obigen Ansatzes ohne PME-Extrakt als
Mastermix vorbereitet und auf Polystyrol-Küvetten verteilt. Anschließend wurde die entsprechende
Menge PME-Extrakt zugegeben, schnell gemischt und im Photometer vermessen.
Zur Berechung der PME-Aktivität in Katal wird die Steigung im linearen Bereich der Kurve
bestimmt. Aus der Steigung wiederum lässt sich nach dem Lambert-Beer’schen-Gesetz der Umsatz
an NADH berechnen (mol = 6178 für 1 mol NADH)
ΔE=εmol * c * d
c = Konzentration von hier NADH in mol/l
d = Schichtdicke der Küvette in cm (meist 1)
39
4. Material und Methoden
Gleichzeitig ist die Definition von Katal: 1 Katal = 1 mol/sec
Daraus lässt sich unter Berücksichtigung der eingesetzten PME-Extrakt- bzw. Pflanzenmaterial-
Mengen die Aktivität in nKatal / mg FG bestimmen.
4.16.1 Inhibitionstest für PMEs
Die zu untersuchenden PMEI-RP Proben/Fraktionen werden 30min mit den PME
Proben/Fraktionen bei RT in MES-Puffer inkubiert. Dies soll die Bindung der Interaktionspartner
sicherstellen. Die Bindung kann durch Substrat verhindert werden. Anschließend werden die
Ansätze, wie oben beschrieben, im Photometer vermessen.
4.17 Invertase-Assay
Aktivitätsbestimmung und Inhibitionstests der Invertasen
Invertasen spalten das Disaccharid Saccharose in die Einfachzucker Glucose und Fructose. Es wird
ein Messverfahren angewendet, bei dem man indirekt die entstehende Glucosemenge misst. Da
Glucose selbst schwer photometrisch zu bestimmen ist, wird folgender gekoppelter Enzymtest
verwendet:
Das entstehende NADPH absorbiert Licht der Wellenlänge 340 nm. Diese Absorption ist mit dem
Photometer bestimmbar. Es wird also mit dem Photometer nach oben genannter Reaktion die OD
gemessen. Die Extinktion gibt Aufschluss über die Menge an 340nm entstandener Glucose und
damit über die Enzymaktivität der Invertase.
40
4. Material und Methoden
Durchführung der Messung
Saccharoselösung: 100mM Saccharose 0,342 g/10 ml
Stoplösung 1M NaPO4-Puffer pH 7,2 : 37,9 g/l NaH2PO4 pH 7,2, 97,1 g/l NaH2PO4
Reaktionspuffer: 40mM TEA pH 7,2 mit KOH einstellen, 8mM MgSO4x7H2O
NADP-Lösung: 36mM NADP 19 mg/ml in ddH2O
ATP-Lösung: 30mM 23,6 mg/ml in ddH2O
Vorinkubationsansatz: 10-50 µl Invertasefraktion
[5-10 µl Inhibitor (unterschiedliche Konzentrationen)]
Ad 200 µl P1-Puffer
200 µl Endvolumen
Zuerst wird ein Vorinkubationsansatz vorbereitet. Dieser ist nötig, da evtl. endogenem bzw.
zugesetztem Inhibitor Zeit gegeben werden muss, an die Invertase zu binden. Das Substrat
stört diesen Prozess (Substratschutz des Enzyms) (Sander 1996).
Der Ansatz wird ca. 30 min bei 37°C leicht auf dem Wärmeblock geschüttelt.
Hydrolyse: Vorinkubationsansatz
+100 µl Saccharoselösung
300 µl Gesamtansatz
Dem Vorinkubationsansatz wird Saccharoselösung zugegeben, die eigentliche Enzymreaktion
findet für 1 h bei 37°C statt.
Stop der Hydrolyse: Hydrolyseansatz
+30 µl Stoplösung
330 µl Endvolumen
Direkt nach dem Zugeben der Saccharoselösung für die Negativkontrolle oder nach einer Stunde
Hydrolyse wird das Stopreagenz zur Neutralisation des pH-Wertes zugegeben und der gesamte
Ansatz für 5 min bei 95°C denaturiert.
Danach kann die Lösung bis zur eigentlichen Messung bei –20°C auch längere Zeit gelagert
41
4. Material und Methoden
werden.
Messansatz: 20 µl NADP-Lösung
20 µl ATP-Lösung
2 µl Hexokinase/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (3mg/ml Roche)
20-100 µl des gestoppten Hydrolyseansatzes
Ad 1000 µl Reaktionspuffer
1 ml Messansatz
Vor Zugabe des Hydrolyseansatzes kann man diesen nochmals kurz abzentrifugieren um evtl.
Schwebeteilchen, die die Messung stören könnten, zu verhindern. Nach Zusammenpipettieren wird
der Messansatz noch 15 min inkubiert. Danach erfolgt die Extinktionsbestimmung bei 340 nm
Wellenlänge. Als Referenz dient eine Küvette mit P1-Puffer anstelle des Hydrolyseansatzes in der
Messlösung. Berechnung der entstandenen Glucosemenge:
Die Enzymaktivität in pkatal kann auf die Menge eingesetzten Materials bezogen werden, um die
relative Enzymaktivität einer Proteinaufreinigung darzustellen.
42
4. Material und Methoden
4.18 DNA-Methoden
4.18.1 Isolierung von Plasmid DNA im kleinen Maßstab
Zur schnellen Identifizierung von positiven Bakterienklonen wurde das Protokoll zur alkalischen
Lyse von Birnboim und Doly abgeleitet (Birnboim & Doly, 1979). Dazu wurden zunächst 1 bis 5
ml einer Bakterienübernachtkultur 1 min bei 15.000 x g sedimentiert und in 300 μl GTE-Puffer (50
mM Glukose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Nach Zugabe von 300 μl
Lysispuffer (200 mM NaOH, 1% SDS) wurden die Bakterien 5 min bei RT lysiert. Die Zugabe von
300 μl 3 M Kaliumacetat (pH 4,8) führte zum Ausfallen der genomischen DNA sowie Proteinen,
die 15 min bei 15.000 x g abzentrifugiert wurden. Der resultierende Überstand wurde mit dem
gleichen Volumen Isopropanol versetzt und die Plasmid-DNA 15 min bei 14.000×g und 4 °C
abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 μl 70% (v/v) Ethanol gewaschen und nach 5 minütiger
Zentrifugation bei 37 °C getrocknet. Die DNA wurde in der Regel direkt in dem Verdauansatz
aufgenommen, dem außerdem RNase zugesetzt wurde.
4.18.2 Isolierung von Plasmid DNA über Ionenaustauschersäulen
Eine Minipräparation wurde ausgehend von 1 bis 2 ml Übernachtkultur mit dem QIAprepR
Miniprep Kit (QIAGEN) durchgeführt. Zur Gewinnung größerer Mengen Plasmid DNA wurde
ausgehend von 50 oder 100 ml Übernachtkultur der QIAGENR Midi Kit (QIAGEN) verwendet.
4.18.3 Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzenmaterial
Zur Isolation genomischer DNA wurden circa 20 bis 100 mg Gewebe in Flüssigstickstoff
zerkleinert und mit 500 μl Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 9, 400 mM LiCl, 25 mM
EDTA, 1 % SDS) versetzt. Nach einer Zentrifugation für 5 min bei 15.000 x g wurden 350 μl des
Überstandes mit dem gleichen Volumen Isopropanol gemischt und die genomische DNA 10 min
bei 15.000 x g sedimentiert. Nach einem Waschschritt mit 70 % EtOH wurde das Sediment
getrocknet und je nach Größe in circa 20 bis 50 μl ½ TE-Puffer aufgenommen. Die DNA wurde
anschließend bei 4 °C bzw. -20°C gelagert.
43
4. Material und Methoden
4.18.4 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA (OD-Messung)
Die in die DNA eingebauten Basen absorbieren Licht verschiedenster Wellenlänge mit einem
Absorptionsmaximum im UV-Bereich bei 260 nm. Dies macht man sich für die Konzentrations-
und Reinheitsbestimmung zunutze. Um die Konzentration einer DNA-Lösung zu bestimmen, misst
man die Absorption dieser Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260). Die Konzentration
einer Lösung mit doppelsträngiger DNA berechnet sich dann wie folgt:
(OD260 x Verdünnungsfaktor x 50) / 1000 = DNA-Konzentration (in μg/ml)
Berechnet man die Konzentration einer Lösung mit einzelsträngiger DNA (zum Beispiel die
Konzentration von Oligonukleotiden für die PCR oder für Sequenzierungen), verwendet man die
Formel:
(OD260 x Verdünnungsfaktor x 33) / 1000 = DNA-Konzentration (in μg/ml)
Das Verhältnis von OD260/OD280 gibt Aufschluss darüber, wie rein die isolierte DNA
tatsächlich ist, da z.B. Verunreinigungen durch Proteine eine höhere Extinktion bei 280nm
ergeben. Liegt der Quotient zwischen 1,8 und 2,0, so ist die DNA-Lösung sehr rein und kann
für weitere Experimente eingesetzt werden.
4.18.5 DNA-Fällung zur Reinigung und Konzentrierung
Gibt man Ethanol oder Isopropanol zu einer DNA-Lösung hinzu, so bildet sich in Anwesenheit
einwertiger Kationen ein DNA-Präzipitat, das sich durch Zentrifugation sedimentieren lässt. Eine
DNA-Lösung wird mit 1/10 Volumen einer 3 M Natriumacetatlösung pH 5,2 versetzt. Hinzu gibt
man das 2,5-fache Volumen an absolutem Ethanol. Nach gründlichem Mischen fällt man
mindestens 30 min bei -20°C. Fällt man mit Isopropanol, so wird die DNA-Lösung mit dem 0,7-
fachen Volumen an Isopropanol versetzt und für 30 min bei RT inkubiert. Beide Fällungen ziehen
eine 15-minütige Zentrifugation mit 15000 x g bei 4°C nach sich. Das Sediment wäscht man ein-
bis zweimal mit 70%igem Ethanol und trocknet es für 2 min bei 37°C oder in einer „Speed Vac“.
Aufgenommen wird es schließlich in 0,1-1x TE, pH 8,0 oder in H2O.
4.18.6 Restriktion von DNA
Restriktionsenzyme sind bakterielle Restriktionsendonukleasen, die die DNA sequenzspezifisch
schneiden, wobei 5´- bzw. 3´-Überhänge („sticky ends“) oder doppelsträngige DNA-Enden („blunt
ends“) entstehen. Die Fragmentierung von DNA mit Restriktionsenzymen dient u.a. der Analyse
44
4. Material und Methoden
von Plasmiden und in präparativem Maßstab zur Gewinnung von DNA-Fragmenten zur in vitro
Rekombination neuer Plasmide. Pro Mikrogramm zu verdauender DNA werden 1-5 „Units“
Restriktionsenzym eingesetzt. Das Endvolumen des Ansatzes (20-200μl) richtet sich nach der
Menge des eingesetzten Enzyms, da die Glycerinkonzentration (die Enzym-Lagerpuffer enthalten
bis 50% Glycerin) 10% nicht überschreiten sollte. Die vom Hersteller mitgelieferten, den Enzymen
entsprechenden 10-fach konzentrierten Reaktionspuffer werden so eingesetzt, dass sie ein Zehntel
des Ansatzvolumens betragen. Die Inkubationszeit (i.d.R. bei 37°C) beträgt zwischen 0,5 und 2 h,
um einen vollständigen Verdau zu gewährleisten, kann auch ÜN verdaut werden.
4.18.7 Dephosphorylierung der 5´-Enden von DNA-Fragmenten mit alkalischer Phosphatase
Wird linearisierte Vektor-DNA für eine Ligation eingesetzt, so können die endständigen
5´-Phosphatgruppen mittels alkalischer Phosphatase (CIAP = Calf intestinal alkaline phosphatase)
abgespalten werden, um eine intramolekulare Religierung des linearisierten Vektors bei der
Ligation zu verhindern. 5-10 µg linearisierte Vektor-DNA werden sowohl mit 5 µl 10x CIAP-
Dephosphorylierungspuffer als auch mit 3 µl CIAP (5 U/µg DNA) in einem Gesamtvolumen von
50 µl inkubiert. Alternativ wurden 5 µl 10x CIAP-Dephosphorylierungspuffer und 3 µl CIAP (5
U/µg DNA) direkt zu einem Restriktionsverdau-Ansatz (50 µl) pipettiert und mit H2O auf ein
Volumen von 100 µl eingestellt. Die Inkubationszeit beträgt mindestens eine Stunde und erfolgt bei
37°C. Vor der Ligation mit dem "Insert"erfolgt eine Reinigung des Vektors
4.18.8 Ligation von DNA Fragmenten
Das Enzym DNA-Ligase (Roche) des Bakteriohagen T4 katalysiert in Anwesenheit von ATP die
Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten 3´-Hydroxyl- und
5´Phosphatgruppen doppelsträngiger DNA. Pro Ligationsansatz wird die Ligasekonzentration
üblicherweise auf 1 U/10 µl eingestellt. An Vektor-DNA werden 100-200 ng eingesetzt und die 4-
5 fache Molarität an Insert-DNA. Es wird 1µl des vom Hersteller mitgelieferten 10-fach Puffers
zugegeben und das Endvolumen mit sterilem bidest. Wasser auf 10 μl eingestellt. Der Ansatz wird
entweder bei 4°C für 4 h oder bei 16°C im Wasserbad ÜN inkubiert.
45
4. Material und Methoden
4.18.9 RNA-Reinigung und cDNA Synthese
Zur Herstellung von cDNA wurde aus den entsprechenden Geweben Gesamt-RNA über einen
RNA-Extraktionskit (RNeasy Plant Mini Kit, Quiagen) isoliert. Dabei erfolgte auf der Säule ein
DNase-Verdau, um eine Kontamination der RNA mit genomischer DNA auszuschließen. Nach
photometrischer Konzentrationsbestimmung wurden jeweils 2 μg Gesamt-RNA unter Verwendung
der OmniscriptR Reversen Transkriptase (Quiagen) mit einem Oligo-dT Primer nach
Herstellerprotokoll in cDNA umgeschrieben. Um einer Degradation der RNA vorzubeugen, wurde
den Reaktionen jeweils RNaseOUTTM (Invitrogen) zugesetzt. Die cDNA wurde anschließend kurz
denaturiert und in Aliquots bei -20 °C gelagert.
4.18.10 PCR-Techniken
Zur Anreicherung von bestimmten Sequenzbereichen wurden die Taq-, Pfu- und Vent-Polymerase
sowie die zugehörigen Puffer von Invitrogen, Promega bzw. NEB verwendet. Ein Standard-PCR
Ansatz setzte sich zusammen aus: 1 μl template (z.B. 10 - 20 ng Plasmid/cDNA), 0,5 μl sense-
Primer (50 μM), 0,5 μl antisense-Primer (50 μM), 0,5 μl dNTP-Mix (10 mM), 2,5 μl 10 x Puffer,
0,9 μl MgCl2 (50 mM), 0,1 μl Polymerase (5 U/μl) und ad 25 μl Bidest.
Standard PCR-Programm (Gerät: RoboCyclerR Gradient 40, Stratagene):
1. Denaturierung 3 - 5 min 94 °C
2. Amplifikationszyklen (35 x) Denaturierung 30 s 94 °C
Primer-Annealing 30 s (zwischen 50 und 64 °C)
Elongation (0,5 bis 5) min 72 °C
3. Elongation 5 bis 10 min 72 °C
Die Elongationszeit in den Zyklen wurde in Abhängigkeit von der Länge des zu amplifizierenden
Bereiches modifiziert.
4.18.11 RLM RACE zur Amplifikation von Volllängen cDNAs
Der GeneRacer™-Kit (Invitrogen) ermöglicht eine spezifische Amplifikation von Volllängen
cDNAs (Schaefer, 1995). Ausgehend von Gesamt-RNA werden in einem ersten Schritt alle freien
Phosphatgruppen durch eine alkalische Phosphatase gespalten. Im nächsten Schritt wird die 7-
Methylguanosin-Kappe am 5’Ende von Volllängen RNAs gespalten und das entstehende 5’Ende
mit einem RNA-Oligonukleotid (Adapter) ligiert. Nach der reversen Transkription kann mit einer
Kombination aus einem Adapter-spezifischen 5’Primer sowie einem genspezifischen 3’Primer das
46
4. Material und Methoden
5’Ende der cDNAs amplifiziert werden, wohingegen für das 3’Ende ein genspezifischer sowie ein
Oligo-dT-Primer kombiniert werden. Um die Spezifität zu erhöhen, kann eine zweite „nested“ PCR
mit Primern innerhalb des Amplifikats durchgeführt werden. Die RACE-PCR Produkte wurden
über einen PCR-Reinigungskit aufgereinigt und anschließend in den Vektor pGEM-T kloniert.
4.18.12 Reinigung von DNA Fragmenten
DNA-Fragmente aus PCR-Reaktionen, Restriktionen und anderen Ansätzen wurden über das PCR
Purification KitR von Qiagen aufgereinigt.
4.18.13 Sequenzierung von Plasmiden
Alle Sequenzierungsreaktionen wurden bei der Firma SeqLab (Göttingen) durchgeführt.
4.18.14 DNA-Gelelektrophoresen
4.18.14.1 Agarosegele
Zur Auftrennung von DNA-Proben wurden standardmäßig Gele mit 0,8 bis 1,5 % Agarose in 1 x
TAE verwendet (20 x TAE: 2 M Tris-base, 1 M Natriumacetat, 50 mM Na2-EDTA, pH 7,2). Vor
dem Gelauftrag wurde die Probe mit einem entsprechenden Volumen 5 x DNA-Auftragspuffer (50
% Glycerin, 5 x TAE-Puffer, 1 % Orange G (w/v)) gemischt. Als Größenmarker dienten
„Smartladder“ (Eurogentec) sowie die „2log ladder“ (NEB), der Gellauf erfolgte bei 70 bis 100 V in
1 x TAE. Zur Visualisierung der DNA wurde das Gel nach dem Lauf 10 min in einer
Ethidiumbromid-Lösung (1 mg/l) gefärbt und zweimal für 5 min in VE-Wasser geschwenkt.
Anschließend wurde das Gel unter UV-Licht digitalisiert, wobei die DNA durch das interkalierte
Ethidiumbromid violett fluoreszierte.
4.18.14.2 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
DNA-Fragmente unter 300 bp sowie geringe DNA-Mengen konnten besser in nativen Gelen
analysiert werden. Dazu wurden 12 % PAA-Gele verwendet, die aus 2,45 ml Bidest, 1,75 ml
nativer Trenngelpuffer (1,5 M Tris-base, pH 8,8), 2,8 ml Acrylamid (29,2 % (w/v) Acrylamid, 0,8
% Bisacrylamid (37,5:1)), 30 μl APS (10 % Ammoniumperoxodisulfat in Bidest) sowie 7 μl
TEMED hergestellt wurden. Die DNA-Proben wurden mit 5 x Auftragspuffer versetzt und mit
einem Größen- und Mengenstandard auf das Gel geladen. Der Gellauf erfolgte in nativem
47
4. Material und Methoden
Elektrophoresepuffer (3,6 g/l Tris-Base, 14,4 g/l Glycin, pH 8,6) bei 200 V. Danach wurde das Gel
5 min in einer Ethidiumbromidlösung (1 mg/l) gefärbt, 5 min in VE Wasser entfärbt und unter UV-
Licht visualisiert.
4.18.14.3 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die entsprechende Probe wurde in einem Agarosegel aufgetrennt und anschließend ein Teil der
Spur mit Ethidiumbromid gefärbt sowie die Position des gewünschten Fragmentes unter UV-Licht
markiert. Das Gel wurde anschließend wieder zusammengesetzt, ein Gelstück an entsprechender
Position ausgeschnitten sowie die DNA über einen Gelextraktionskit (QIAquick Gel Extraction
KitR, Qiagen) isoliert.
4.19 RNA-Methoden
Die RNA für die cDNA-Synthese wurde wie unter 6.11.8 beschrieben mit einem Kit isoliert. Für
die Isolation und Reinigung von RNA aus Pollen und Samen wurde jedoch ein Protokoll verwendet,
dass die RNA Reinigung aus Pflanzenorganen, die reich an Polysacchariden, Sporopollenin und
weiteren problematischen Pflanzenverbindungen sind, erlaubt(Ying Zeng & Tao Yang, 2002). Ca.
0,7g Pflanzenproben wurden in Flüssigstickstoff gemörsert bzw. in der Retsch-Mühle pulverisiert,
in 15 ml 65°C vorgewärmten RNA-Extraktions Puffer (2% CTAB, 2% PVP (mol wt 25,000), 100
mM Tris-HCl pH8, 25 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,05% Spermidin Trihydrochlorid, 2% ß-
Mercaptoethanol) aufgenommen und 10 min lang bei 65°C inkubiert (zwischendurch vortexen).
Anschließend wurde das gleiche Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) zugesetzt, gevortext
und 10 min mit 10.000 x g bei 4°C abzentrifugiert. Der sehr dickflüssige Überstand wurde
nochmals mit Chloroform-Isoamylalkohol gereinigt und schließlich mit 30.000 x g für 20 min bei
4°C zentrifugiert. Zu der erhaltenen Lösung wurde das 0,25fache Volumen von 10 M LiCl
zugegeben, gemischt und über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Die ausgefallene RNA wurde drei mal
mit 75% Ethanol gewaschen, mit 30.000 x g für 30 min bei 4°C abzentrifugiert, luftgetrocknet und
in DEPC-H2O aufgenommen. Die erhaltene RNA wurde Aliquotiert und bei -80°C aufbewahrt.
4.19.1 Bestimmung der Konzentration und Reinheit von RNA
Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch in wässriger Lösung bei 260 nm (ε=25 μl x
μg-1 x cm-1). Die Absorption bei 280 nm gab zudem einen Hinweis auf die Reinheit der RNA-
Präparation. Die Konzentration einer Lösung von RNA berechnet sich wie folgt:
48
4. Material und Methoden
(OD260 x Verdünnungsfaktor x 40) / 1000 = RNA-Konzentration (in μg/ml)
4.19.2 RNA-Agarosegelelektrophorese
Zur Überprüfung der RNA-Qualität und Konzentration wurden jeweils 1 μg der RNA-
Präparationen auf ein 1 % Agarose Gel in TBE (0,98 M Tris-base, 0,89 M Borsäure, 25 mM EDTA,
pH 8,4) aufgetragen. Die RNA wurde mit RNA-Auftragspuffer (50 % Glycerin, 5 x MOPS, 1 %
Bromphenolblau) versetzt und nach dem Gelauftrag bei 70 V aufgetrennt. Den Gelen wurde
entweder direkt Ethidiumbromid zugesetzt oder diese nach dem Lauf gefärbt und die RNA unter
UV-Licht visualisiert.
4.20 Vektoren und Oligonucleotide
Vektoren:
Name Herkunft VerwendungpET-22b(+) Vektor Novagen Proteinexpression in den periplasmatischen Raum
pHD32::YFP AG Kost Transiente Transformation von Pollen
pHD223::RFP AG Kost Transiente Transformation von Pollen
pETM20 EMBL Proteinexpression
pQE30 Novagen Proteinexpression
pICZαA Invitrogen Proteinexpression in Pichia pastoris
Oligonucleotide (Hergestellt von MWG):
Name Sequenz (5’-3’) VerwendungIPME1-S cgg ggt acc ttg cgc ggc cgg cgt Klonierung PMEI-RP1 in pETM20
IPME1-AS acc gct cga gtc aat gga cat gtt cgt aa Klonierung PMEI-RP1 in pETM20
IPME2-S cgg ggt acc tta cgc ctg cgg cgg t Klonierung PMEI-RP2 in pETM20
IPME2-AS tcc gct cga gtc aga tca tgt tgg aga g Klonierung PMEI-RP2 in pETM20
IPME3-S acg ggg tac ctt aag ggt agg gga gg Klonierung PMEI-RP3 in pETM20
IPME3-AS catgct cga gtc ata tca tgt ttg caa gcg Klonierung PMEI-RP3 in pETM20
IPME4-S cgg ggt acc tta acg gca agg gca agg Klonierung PMEI-RP4 in pETM20
IPME4-AS catgct cga gtc ata tca tgt ttg caa gcg Klonierung PMEI-RP4 in pETM20
ZmC5short cgg ggt acc gtc ggt gtg gtc gcc Klonierung PME1 ohne SP in pQE30
ZmC5Nfull cgg ggt acc atg gca aag gct ctc cta ggt Klonierung PME1 in pQE30
ZmC5Nhalf cgc gga tcc acg ccg aac gcg atc gtg g Klonierung PME1 für AS bzw. Enzymassay
Phactin_L GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG semiquantitative RT-PCR
Phactin_R CTCGGCCTTGGAGATCCACATC semiquantitative RT-PCR
ZmC5_pET22b_Sense ccg gaa ttc agg tgt ggt cgc cac cgt cac Klonierung PME1 in pET22b
49
4. Material und Methoden
ZmC5_pET22b_AS tcc gaa gct tct tga act tga aac caa gta tg Klonierung PME1 in pET22b
ZmC5_pYEX-BX_S+PMEI aaa ctg cag atg agaggatcg cat cac cat cac cat cac atg Klonierung PME1 mit Prodomäne in pYEX
gca aag gct ctc cta ggt
ZmC5_pYEX-BX_S-PMEI aaa ctg cag atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac Klonierung PME1 ohne Prodomäne in
atg gac ctc ggc atg ttc ag pYEX
PME3_S_pQE30_BamHI aca tgg atc caa gtc gaa gct cgc caa ga Klonierung PME3 in pQE30
PME3_AS_pQE30_HindIII cgc aag ctt atg cat gct tgt tcg atc c Klonierung PME3 in pQE30
PME3_S_pET_KpnI cgg ggt acc aag tcg aag ctc gcc aag Klonierung PME3 in pETM20m
PME3_AS_pET_XhoI ccg ctc gag tat gca tgc ttg ttc gat cc PME3 in pETM20m
pETM20V8mod_AS cat gct cga gtc ata tca tgt ttg caa gag Seuenzierungsprimer
ZmC5realEndPstI gca ttg gtt ctg cag cct cta gaa ctt gaa acc aag tat gtg c Klonierung in pQE30
ZmC5Seq1 aag cgg tcc ggg aac a Sequenzierungsprimer
ZmC5Seq2 acc atg acg atc tcg t Sequenzierungsprimer
ZmC5Seq3 cgc gct ctc ggt cat g Sequenzierungsprimer
PME2_Sense2 aca tac atg cat gcg cca tgg cgc agc gag cgg tgg c Klonierungsprimer
PME_RACE_S_nested aga cgc aga tct aca act gca cca tc RACE Primer
PME_RACE_AS_nested cgg cgc gtc gtt ccg gaa cac cac gcc gta c RACE Primer
putPME_Sense aca tac atg cat gcg cca tgg cgc agc gag cgg tgg ac Klonierungsprimer
putPME_Antisense atg cca agc ttg gta cct act tgg gcg gtg gct gga tcc ac Klonierungsprimer
PME_RACE_AS tgg ccg ccc ttg gcg ccg ggc ttg RACE Primer
PME_RACE_Sense gcc gct ggc caa gcc cgg cgc caa g RACE Primer
pPICZalphaA_Forw tct ctc gag aaa aga gag gct g Sequenzierungsprimer
pICZalphaA_Rev ttg ttc tag aaa gct ggc ggc Sequenzierungsprimer
PMEIrp1 Sense tat agt cga cat ggc tgg agc ccg ggc act g Klonierung PMEI-RP1 in pHD32
PMEIrp2 Sense tat agt cga cat ggc ggg aac ccg tgc cct g Klonierung PMEI-RP2 in pHD32
PMEIrp3 Sense tat agt cga cat ggg gca agc ctc acg gct c Klonierung PMEI-RP3 in pHD32
PMEIrp4 Sense tat agt cga cat ggg gca agc cta ccc acg Klonierung PMEI-RP4 in pHD32
PME3 Sense tat agt cga cat ggc ccg gcc gcg cct c Klonierung PME3 in pHD32
PMEIrp1 AS gta ggg ccc atg gac atg ttc gta agg gat c Klonierung PMEI-RP1 in pHD32
PMEIrp2 AS gta ccc ggg gat cat gtt gga gag cga gc Klonierung PMEI-RP2 in pHD32
PMEirp3 AS gta ccc ggg tat cat gtt tgc aag agc ca Klonierung PMEI-RP3 in pHD32
PMEIrp4 AS gta ccc ggg tat cat gtt tgc aag cgt atg Klonierung PMEI-RP4 in pHD32
PME3 AS tgg ctg ccg gcg tac tac tac ccc ggg tac Klonierung PME3 in pHD32
PME4_pHD32_Sense atg tcg aca tgg ccg cgg tga cca gcg ccg ac Klonierung PME4 in pHD32
PME4_pHD32_AS ata tgg gcc ccc ctt tgg tga atc cca tga cg Klonierung PME4 in pHD32
PME2_pHD32_Sense atg tcg aca tgg cgc agc gag cgg tgg cca c Klonierung PME2 in pHD32
PME2_pHD32_AS atg ggc ccc ttg ggc ggt ggc tgg atc cac g Klonierung PME2 in pHD32
PME1_pHD32_Sense atg gta aca tgg caa agg ctc tcc tag gtg gc Klonierung PME1 in pHD32
PME1_pHD32_AS atg agc tcg aac ttg aaa cca agt atg tg Klonierung PME1 in pHD32
ZmC5_Northern cag caa gag ggt caa ctg g Northern Blot
ZmC5_Northern_AS agg aat gca aac ggt aaa gg Northern Blot
PME2_Northern_Sense gag cag cgg cat cta cta cg Northern Blot
PME2_Northern_AS tta gac ctt taa gcc tcc ttt gt Northern Blot
50
4. Material und Methoden
PME3_Northern_Sense tcg cag aca cct acc tct cc Northern Blot
PME3_Northern_AS atg gaa acg cgt gtc agt a Northern Blot
PMEI_put_S gca tgt ccg cca gcg tga ag Klonierungsprimer
PMEI_put_S2 cag gaa gcc aaa gct ctg aac Klonierungsprimer
PME1_AK_S_BamHI cgc gga tcc atg aag acc gcc acc ttc tc Klonierung PME 1 Fragment für Antiserum
PME4_5_RACE aac ccg tcg gcg cag gtg tag RACE Primer
PME4_5_RACE_nested ggc gtc gtc cag gag ctt ctt gca c RACE Primer
PME4_PMEID_S_pQE30 cgc gga tcc gtg acc agc gcc gac gac aac g Klonierung PME4 Prodomäne in pQE30
PME4_PMEID_AS_pQE30 tcc ccc ggg tca gga cag gag ctt ccg gtt tg Klonierung PME4 Prodomäne in pQE30PME4_PMED_S pETM20 tgc cat ggt gca gct gcc cgg ctt tca gag Klonierung PME4 Domäne in pETM20
PME4_PMED_AS_pETM20tcc gct cga gtt acc ctt tgg tga atc cca Klonierung PME4 Domäne in pETM20
PME4_K_AS_HindIII ccc aag ctt acc ctt tgg tga atc cca Klonierung PME4 in pETM20
Pichia_Rev2 agg aac agt cat gtc taa ggc tac Sequenzierungsprimer
Pichia_S_ID ccg gaa ttc aaa gac tcg cgc cgc cga ctg Klonierung PME1 Prodomäne in pICZαA
Pichia_AS2 cgg ggt acc gcg aac ttg aaa cca agt atg tgc Klonierung PME1 Prodomäne in pICZαA
pETM20V8mod_AS cat gct cga gtc ata tca tgt ttg caa gag Sequenzierungsprimer
51
4. Material und Methoden
4.21 Abkürzungen und Internetadressen
A Adenin A.bidest zweifach destilliertes Wasser Arabidopsis thaliana AckerschmalwandAbb. Abbildung Amp Ampicillin AP Alkalische Phosphatase APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosin-5'-triphosphat bp Basenpaar(e) bzw. Beziehungsweise C Cytosin ca. circa CaMV Engl.: Cauliflower mosaic virus (BlumenkocDNA copy DNA Cm Chloramphenicol C-terminal Carboxyterminal CWI Zellwand-Invertase dATP Desoxyadenosin-5'-triphosphat dCTP Desoxycytidin-5'-triphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat dGTP Desoxyguanosin-5'-triphosphat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsuäure dNTP 2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphat DTT Dithiotreitol dTTP Desoxythymidin-5'-triphosphat E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglykol-bis-(ß-Aminoethylether)N,NER Endoplasmatisches Retikulum EtOH Ethanol F Farad g Erdbeschleunigung G Guanin GFP Grünes Fluoreszierendes Protein h Stunde Hz Hertz (Frequenz) IPTG Isopropylthiogalactosid kb Kilobase(n) kD Kilodalton Km Kanamycin kV Kilovolt M Nukleotide A oder C MCS engl.: Multiple Cloning Site mRNA engl.: messenger RNA N Nukleotide A, G, T oder C Nicotiana tabacum Tabak Nr. Nummer NtCIF Nicotiana tabacum Zellwand-inhibitor der ß-Fructofuranosidase N-terminal Aminoterminal NtVIF Nicotiana tabacum Vacuolen-inhibitor der ß-Fructofuranosidase OD x nm Optische Dichte bei x nm
52
4. Material und Methoden
ORF Open reading frame PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR engl.: polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PEG Polyethylenglycol pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration pI Isoelektrischer Punkt PME Pektin Methylesterase PMEI Pektin Methylesterase-Inhibitor PMEI-RP Pektin Methylesterase-Inhibitor related protein psi engl.: pounds per square inch (Einheit für Druck) PTNT Pollen Tube Nicotiana tabacum (N.t. Pollenkeimmedium) R Nukleotide A oder G RFP Rotes Fluoreszierendes Protein RNA Ribonukleinsäure rpm engl.: rotations per minute (Umdrehungen pro Minute) RT RaumtemperaturRT-PCR Reverse transkriptions PCR s.o. (u.) siehe oben (unten) SDS Natriumdodecylsulfat T Thymin Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA (Puffer) Taq Thermus aquaticus (thermophiler Prokaryot) TBE Tris-Borsäure-EDTA (Puffer) TBS engl.: tris bufferd saline TBST TBS mit Tween TE Tris-EDTA-Puffer TEMED N,N,N',N' Tetramethyldiamin Tet Tetracyclin Tris Tris(hydroxymethyl) U Unit (Enzymaktivität) UTR Engl. : untranslated region UV Ultraviolet v/v Volumenprozent (Volumen pro Volumen) VE-Wasser Vollentsalztes Wasser VI Vakuoläre Invertase Vol. Volumen W Nukleotide A oder T w/v Massenprozent (Masse pro Volumen) wt Wildtyp X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-ß-D-Galaktopyranosid Y Nukleotide C oder T YFP Gelbes (yellow) Fluoreszierendes Protein Zea mays Mais z.B. zum Beispiel
Nicht angegeben sind die Abkürzungen von international gebräulichen SI-Einheiten und
Internetseiten für standard in silica Untersuchungen.
53
5. Ergebnisse
5 Ergebnisse
Eine der Hauptkomponenten der Pollenzellwand ist Pektin. Pektin wird während des
Pollenschlauchwachstums an der Spitze stark methylesterifiziert in die Zellwand sekretiert. Durch
die Aktivität von Pektin Methylesterasen wird das Pektin mit zunehmender Entfernung von der
Pollenschlauchspitze fortschreitend demethyliert. Es bildet sich ein von der Spitze abnehmender
Gradient im Methylierungsgrad der Homogalacturon-Komponente des Pektins. Mit dem
Methylierungsgrad verändern sich auch die mechanischen Eigenschaften der
Pollenschlauchzellwand. Pektin Methylesterasen und deren Regulation spielen damit eine zentrale
Rolle während des Pollenschlauchwachstums. PME-Enzyme kommen in Pflanzen als große
Genfamilien vor und auch im Pollen werden mehrere Isoformen exprimiert. Aus Arabidopsis
thaliana wurden vor kurzem die ersten pflanzlichen Pektin Methylesterase Inhibitoren (PMEI) aus
Pollen kloniert und ihre Expression in Pollen bestätigt. Die Proteinsequenz der identifizierten
PMEIs weisen eine signifikante Sequenzähnlichkeit mit den Pro-Domänen der so genannten Typ I
PMEs auf.
Pektin Methylesterasen regulieren den Methylierungsgrad der Pektinmatrix und damit die
mechanischen Eigenschaften der Pollenschlauchzellwand. Dabei können verschiedene PME
Isoformen unter der Regulation unterschiedlicher PMEIs sowie/oder autoinhibitorischer Typ I
Domänen stehen. Um diesen Sachverhalt weiter aufzuklären, wurden putative PMEIs und PMEs
identifiziert und charakterisiert. Darüber hinaus wurden Hinweise auf mögliche Funktionen der
beteiligten Proteine während des Pollenschlauchwachstums gefunden.
5.1 cDNS-Klonierung von vier in Maispollen exprimierten PME-Isoformen
5.2 Identifizierung und Re-Klonierung von zwei Typ I PMEs aus Mais
5.2.1 Re-Klonierung der pollenspezifischen ZmC5 PME: Sequenzkorrektur
1998 beschrieb Wakeley et al. eine Pektin Methylesterasen DNS Sequenz, die ausschließlich in der
späten Pollenentwicklung transkribiert werden soll (Wakeley et al., 1998). Während
Klonierungsarbeiten viel auf, dass die vorhergesagten Proteindomänen teilweise nicht vollständig
54
5. Ergebnisse
sind und dass es durch eine Basen-Insertion und -Deletion im Bereich der Prodomäne zu einem
„Frameshift“ gekommen ist. Das Ergebnis wurde mittels korrekturlesender Polymerasen und
Sequenzierung der unterschiedlichen PME1 Klone bestätigt. In Abbildung 5.1 sind die abgeleiteten
Aminosäurensequenzen der von Wakeley et al. publizierten „ZmC5“, PME1 im folgenden und der
korrigierten cDNS Sequenz mittels des „ClustalW“ Algorithmus gegenübergestellt.
55
Abbildung 5.1Vergleich der abgeleiteten Aminosäurensequenzen der publizierten „ZmC5“ mit der korrigierten PME1 Pektine MethylesteraseDie Stellen an denen es durch Fehler in der cDNS Sequenz zu Änderungen in der Proteinsequenz kommt sind gelb unterlegt. Das Signalpeptid wurde mittels „SignalIP 3.0“ bestimmt und ist grün unterlegt. Mittels Datenbankabgleich mit der „Conserved Domain Database“ wurde die PMEI-RP Domäne und die PME Domäne bestimmt und farblich hervorgehoben; blau=PMEI-RP-, rot=PME-Domäne.
ZmC5 MAKALLGGLSAILVVAVVVGVVATVTRSGKKAGDNFTVPGEASLANVRQVGQVPVRAHPV 60PME1 MAKALLGGLSAILVVAVVVGVVATVTRSGKKAGDNFTVPGEASLATSGKSVKSLCAPTLY 60 *********************************************. : : . ZmC5 QGVVREDVVPGHQWHREPQGGVPQRGQGGAGVGPDGGRAVQVDRRGQGSDSMTESAREDC 120PME1 KESCEKTLSQATNGTENPKEVFHSVAKVALESVQTAVEQSKSIGEAKASDSMTESAREDC 120 : .: : . : .:*: . . .: . . . : ..:.************ ZmC5 KKLLEDAADDLRGMLEMAGGDIKVLFSRSDDLETWLTGVMTFMDTCVDGFVDEKLKADMH 180PME1 KKLLEDAADDLRGMLEMAGGDIKVLFSRSDDLETWLTGVMTFMDTCVDGFVDEKLKADMH 180 ************************************************************ ZmC5 SVVRNATELSSNALAITNSLGGILKKMDLGMFSKDSRRRLLSSEQDEKGWPVWMRSPERK 240PME1 SVLRNATELSSNALAITNSLGGILKKMDLGMFSKDSRRRLLSSEQDEKGWPVWMRSPERK 240 **:********************************************************* ZmC5 LLASGNQPKPNAIVAKDGSGQFKSIQQAVDAVPKGHQGRYVIYVKAGLYDEIVMVPKDKV 300PME1 LLASGNQPKPNAIVAKDGSGQFKSIQQAVDAVPKGHQGRYVIYVKAGLYDEIVMVPKDKV 300 ************************************************************ ZmC5 NIFMYGDGPKQSRVTGRKSFADGITTMKTATFSVEASGFICKNMGFHNTAGAERHQAVAL 360PME1 NIFMYGDGPKQSRVTGRKSFADGITTMKTATFSVEASGFICKNMGFHNTAGAERHQAVAL 360 ************************************************************ ZmC5 RVQGDLAAFYNCRFDAFQDTLYVQPRRQFFRNCVVSGTIDFIFGNSAAVFQNCLIITRRP 420PME1 RVQGDLAAFYNCRFDAFQDTLYVHARRQFFRNCVVSGTIDFIFGNSAAVFQNCLIITRRP 420 ***********************:.*********************************** ZmC5 MDNQQNSVTAHGPTDPNMKSGLVIQNCRLVPDQKLFPDRFKIPSYLGRPWKEFSRLVIME 480PME1 MDNQQNSVTAHGRTDPNMKSGLVIQNCRLVPDQKLFPDRFKIPSYLGRPWKEFSRLVIME 480 ************ *********************************************** ZmC5 STIADFVKPEGYMPWNGDFALKTLYYAEYNNRGPGAGTSKRVNWPGFHVIGRKEAEPFTA 540PME1 STIADFVKPEGYMPWNGDFALKTLYYAEYNNRGPGAGTSKRVNWPGFHVIGRKEAEPFTA 540 ************************************************************ ZmC5 GPFIDGAMWLKYTGAPHILGFKF 563PME1 GPFIDGAMWLKYTGAPHILGFKF 563 ***********************
5. Ergebnisse
Die Unterschiede der abgeleiteten Aminosäurensequenzen sind in der Abbildung 5.1 gelb unterlegt.
Die durch „CDD“ Datenbankabgleich erhaltenen konservierten Proteindomänen sind über den
Sequenzen blau, PMEI-RP (pfam04043), und rot, PME Domäne (pfam01095) hervorgehoben. Das
Singalpeptid, das für die Translokation in das ER benötigt wird ist grün unterlegt. Es wurde mittels
„SignalIP 3.0“ bestimmt.
Für die weitere Charakterisierung dieser Mais PME wurde die proteinkodierende Sequenz in
unterschiedliche Zielvektoren eingebracht. Die Klonierung und Expression von rekombinanten
Pektin Methylesterasen ist im Abschnitt 5.4 beschrieben.
5.2.2 Identifizierung einer neuen Typ I PME aus Zea mays
Während der „MaizeGDB“ Datenbanksuche nach weiteren PMEI-RPs wurde eine genomisches
Fragment identifiziert, dass durch Datenbankvergleiche mit konservierten Proteinsignaturen den
PMEI-RPs zugeordnet wurde. Die Suche wurde auf genomische Klone ausgeweitet, da die Suchen
gegen ESTs und TUGs keine neuen PMEI-RP Kandidaten lieferten. Mit der erhaltenen Sequenz
wurde weiter nach genomischen Sequenzen bzw. ESTs gesucht und versucht, das komplette Gen zu
identifizieren. Durch Sequenzüberlappungen konnte ein Teil der möglichen Zielsequenz und die
dazugehörige Aminosäuresequenz ermittelt werden. Das identifizierte Teilfragment besteht aus 438
Aminosäuren und umfasst laut Proteinvorhersage eine PMEI-Domäne und einen Teil einer PME
Domäne, Abbildung 5.2.
Die komplette Sequenz wurde durch die Kombination von „RACE“ und Datenbankabgleichen
ermittelt und durch RT-PCR bestätigt. Die Primer für die 5'RACE wurden gegen Sequenzabschnitte
innerhalb des PMEI-RP kodierenden Bereich erstellt. Die Primer für die 3'RACE wurden gegen
Sequenzbereiche erstellt, die zwischen dem PMEI und PME kodierenden Bereich liegen, Abbildung
5.3.
56
Abbildung 5.2Schema des neu identifizierten Typ I Pektin Methylesterasen-fragmentes Im Schema lassen sich die vorhergesagte PMEI-Domäne in blau und ein Teil einer Pektin Methylesterase Domäne in rot erkennen. Vorhersage mittels „CDD“.
5. Ergebnisse
Mittels der 5' RACE konnte ein für AS 1 bis AS 86 kodierende PMEI-RP Fragment identifiziert
und die bereits vorhandene Sequenz korrigiert werden. Durch die 3' RACE konnten keine neuen
Sequenzinformationen erhalten werden. Die mittels der 5' RACE korrigierten Sequenz wurde mit
der MaizeGDB ein weiterer Datenbankabgleich durchgeführt und mit Hilfe des ESTs AY112201
die voraussichtliche DNS-Sequenz bestimmt. Die 1859 Basenpaare umfassende PME4 Sequenz
konnte nach Datenbankabgleichen (MaizeGDB bzw. PlantaGDB) weder als EST bzw. TUG
gefunden werden. Es wurden nur TUGs bzw. PUTs angezeigt, die keine PMEI-RP Domäne
aufweisen bzw. in ihrer Sequenz Abweichungen zur neu identifizierten PME haben (Daten nicht
gezeigt). Nach Korrektur der Sequenzdaten wurde festgestellt, dass der erste 3' RACE PME4
Primer aufgrund von Sequenzfehlern nicht mehr an die Ziel-cDNS binden konnte. Die
Aminösäurensequenz der voraussichtlichen Typ I PME ist in Abbildung 5.4 dargestellt.
57
Abbildung 5.3Schema der RACE Strategie zur Identifizierung einer neuen Typ I PME aus Zea mays, PME4Schematische Darstellung der durchgeführten RACE zur Identifizierung der vollständigen DNS Sequenz von PME4. Ausgehend von dem putativen Startcodon wurden die 5' Primer gegen die Sequenzbereiche 383-403 sowie 260-284 gerichtet und die 3' Primer gegen die Sequenzbereiche 471-490 und 510-530 gerichtet. 5' UTR: 5' Untranslated Region; SP: Signalpeptid; PMEI-RP- und PME-Domäne
5. Ergebnisse
Die PME4 cDNS kodiert eine 625 AS lange putative Typ I Pektin Methylesterase. Das Protein hat
laut in Silica Vorhersage ein 29 AS langes Signalpeptid, eine PMEI-RP Domäne (pfam04043) und
eine putative konservierte Pektin Methylesterase Domäne (PS00503). In Abbildung 5.4 sind die
beschriebenen Bereiche farbig hervorgehoben. Bei der identifizierten Pektin Methylesterase handelt
es sich um eine Typ I PME mit einem vorhergesagten pI von 5,95 und einem Molekulargewicht von
64302,71 Dalton (ohne Signalpeptid). Durch „ClustalW“ Sequenzvergleiche konnte bei fast allen
untersuchten Typ I PMEs (abgeleitet von Microarray Daten, „digitalen Northern“ Analysen und
TUGs; www.tair.org, www.maizegdb.com) N-terminal ein vier Aminosäuren langes Motiv
identifiziert werden, das als Erkennungs- bzw. Prozessierungs-Motiv dienen könnte (Micheli,
2001). Die Konsensussequenz dieses 4 AS langen Motivs lautet R(R/K)L(L/M). Die PME4
58
10 20 30 40 50 60 MANRVTVASV IAAVGIVAVI GTMAAVTSAD DNDGNMLSSV KVSTVCAFTR YPEKCEQSLK 70 80 90 100 110 120 HVVSDTSSPE DVFRDALNVA LDEVSTAFQR SAHIGKDAQD KLSRNAMDVC KKLLDDATED 130 140 150 160 170 180 LRGMARLKPA DLVRHVKDLR VWVSGVMTYV YTCADGFEKP ELKEAMDKML QNSTELSSNA 190 200 210 220 230 240 LAILTRLGEL LPQEAKALNA TLPGAGHGRR LLGWQMGEAE EVTSGGRGLP AVNDKQLGEI 250 260 270 280 290 300 ADVANANRKL LSDHAALRGR GVLTTGLVGT FDEIQYGRSG VPPSDFPKWM PASQRRLLQL 310 320 330 340 350 360 PGFQRPNKVV AQDGSGDFKT ITEAITAVPN TFEGRFVIYV KAGTYKEYVT VPKNMANIFM 370 380 390 400 410 420 YGDGPTQTVV TGDKSNAGGF ATFASATFSA EGNGFICKSM GFVNTAGPEG HQAVAMHVQG 430 440 450 460 470 480 DKSVFYNCRF EGYQDTLYVH ANRQFFRDCE VLGTVDFIFG NSAALFQNCL MTVRKPGDSQ 490 500 510 520 530 540 SNMVTAQGRT DPNMPTGIVL QGCRIVPEQA LFPDRLQIAT YLGRPWKEYA RTVVMESTIG 550 560 570 580 590 600 DLIRPEGWAE WMGDLGLKTL YYAEYANTGP GAGTSKRVNW PGYHVIGQAD ATAFTAGAFI 610 620 DGASWLQSTG TPNVMGFTKG
Abbildung 5.4PME4 AminosäurensequenzDargestellt sind die 625 Aminosäuren der unprozessierten PME4. Die ersten 29 AS sind grün hervorgehoben und stellen das durch in Silica analyse ermittelte Signalpeptid zur Translokation in das ER dar. Der Bereich, der durch Datenbankvergleiche als PMEI-RP Domäne (pfam04043) erkannt wurde, ist in blau, die Pektinesterasedomäne (pfam01095) in braun dargestellt. Zusätzlich wurde in blau die durch einen Prosite Datenbankabgleich ermittelte PME-Signatur kenntlich gemacht (PS00503). Das Protein besitzt ohne Signalpeptid einen pI von 5.95 und ein Molekulargewicht von ca. 64302,71 Dalton. Mögliche Prozessierungsstellen (Konsensusmotiv R(R/K)L(L/M)) sind rot unterlegt.
5. Ergebnisse
Aminosäurensequenz besitzt drei mögliche putative Prozessierungsstellen, die in der Abbildung 5.4
rot unterlegt sind. Das fertige Protein hat einen vorhergesagten pI von 6,5 bis 7,2 (je nach
Prozessierungsstelle) und ist aufgrund seines pI vermutlich nur schwach an die Zellwand gebunden.
In Abbildung 5.8 sind die Aminosäuresequenzen von ZmPME1 und ZmPME4 aus Mais, NtPPME1
aus Tabak, VANGUARD1 aus Arabidopsis und LePME aus Tomate gegenübergestellt. Wichtige
Sequenzabschnitte sind farblich hervorgehoben. Die vier konservierten Cysteine der Pro-Domäne
sind rot, das putative Prozessierungsmotiv R(R/K)L(L/M) blau und Aminosäuren, die im
Reaktionszentrum liegen, sind grün unterlegt. Interessanterweise besitzen manche Typ I PMEs das
vier Aminosäuren lange Prozessierungsmotiv mehrmals. Die Klonierung und Expression von
rekombinanten Pektin Methylesterasen ist im Abschnitt 5.5 beschrieben.
5.3 Identifizierung und Klonierung von zwei Typ II PMEs aus Mais
5.3.1 Identifizierung einer neuen Typ II PME aus Zea mays Pollen
Mittels isoelektrischen Fokussierung wurden Extrakte aus Maispollen und Maiskeimlingen
aufgetrennt. Von den Maiskeimlingen wurde der Vegetationskegel und bis zu ein Zentimeter
darunter liegendes Pflanzengewebe, ohne Maiskorn, verwendet. Anschließend wurden die
Gelbereiche mit PME-Aktivität mittels O-Naphtol-Nachweis identifiziert (Hou & Lin, 1998)
und isoliert. In Abbildung 5.5 ist das Gel nach dem PME-Farbnachweis zu sehen.
59
Abbildung 5.5Isoelektrische Fokussierung von zwei Zea mays ProbenDurch den PME-Aktivitätsnachweis färben sich Bereiche mit PME-Aktivität rot. In beiden Proben kann in einem pH Bereich von ca. 10 (weißer Pfeil) PME-Aktivität nachgewiesen werden. Im Maispollen ist dies die einzige Bande die detektiert werden konnte. In der Probe aus Maiskeimlingen kann noch eine schwächere Aktivitätsbande im pH Bereich von ca. 9 nachgewiesen werden (schwarzer Pfeil).
5. Ergebnisse
Auf dem Gelphoto ist deutlich die Rotfärbung, die durch freigesetztes O-Naphtol hervorgerufen
wird, zu erkennen. Zellwandgebundene Proteine besitzen meist einen stark basischen pI und werden
durch ionische Wechselwirkungen an Zellwandkomponenten gebunden. Der pI der Aktivitätsbande
liegt bei einem ungefähren pI von 10. Die zuvor von Wakeley et al. beschriebene PME1 „ZmC5“
besitzt ebenfalls einen pI von ~ 9,9 und könnte für die Aktivitätsfärbung in diesem pI Gelbereich
verantwortlich sein. Anhand von Datenbankrecherchen konnten noch weitere PME ESTs
identifiziert werden, deren abgeleitete PMEs ebenfalls einen stark basischen pI besitzen und in
Maispollen exprimiert werden können. Man kann also davon ausgehen, dass in der Aktivitätsbande
unterschiedliche PMEs vorliegen.
5.3.1.1 Analyse der erhaltenen PME Aktivitätsbanden
Nach IEF-Trennung wurde das gefärbte IEF-Gel in 20% Essigsäure fixiert und die Banden
vorsichtig herausgeschnitten. Die Banden wurden mittels „MALDI TOF“ und „ESI TOF“
Verfahren am „Zentrum für molekulare Biologie Heidelberg“ (ZMBH) in der AG von Dr. Thomas
Ruppert mit Hilfe von Dr. Matthias Reiss untersucht. Es ließen sich PME spezifische Fragmente
aus der Aktivitätsbande der Pollenprobe nachweisen.
Durch die massenspektrometrischen Untersuchungen der gefärbten Gelbanden konnten zwei PME
Fragmente identifiziert werden: VILDLKPGAGFR und GSVDFIFGFGR. Die Fragmente können
von einer bzw. unterschiedlichen PMEs abstammen. Mit den erhaltenen AS-Sequenzen wurde
anschließend ein „MASCOT“ Datenbankabgleich durchgeführt und 13 der Sequenz entsprechende
ESTs identifiziert. 12 der ESTs sind aus Mais und 9 davon aus reifen Pollen bzw. Antheren, siehe
Tabelle 5.1 im.
Akzession Masse Mowse Bewertungsalgorithmus Ursprung
1 gi|5816332 5906 87 Mais Antheren und Pollen
2 gi|13635176 15347 83 Weizenähre
3 gi|6989610 17342 83 Mais Antheren und Pollen
4 gi|7135152 16829 83 Mais Antheren und Pollen
5 gi|6918388 19804 82 Unterschiedliche Maisgewebe
6 gi|26454994 20142 82 Mais Unigen IV
7 gi|26454989 20998 82 Mais Unigen IV
8 gi|21481396 20849 82 Maispollen
9 gi|21481435 21311 82 Maispollen
10 gi|21236626 21711 82 Maispollen
11 gi|21330094 21934 82 Maispollen
12 gi|8318661 21983 82 Unterschiedliche Maisgewebe
13 gi|5928701 22792 81 Mais Antheren und Pollen
60
Tabelle 5.1: „MASCOT“-Datenbankabgleich
5. Ergebnisse
Die zwei identifizierten Peptidfragmente werden jeweils zusammen einem EST zugeordnet.
Mit der konsensus DNS-Sequenz der 12 ESTs wurde anschließend die „Maize Genetics and
Genomics“ Datenbank durchsucht und ein vorläufiges Genprodukt „TUG“ identifiziert:
ZmTUC-02-12-23.7679. Die Benennung der TUGs wurde während der Arbeit mehrmals geändert
und schließlich von der „Plant Genome Database“ fortgeführt. Die aktuelle Bezeichnung lautet
PUT-151a-Zea_mays-905143604. Die vollständige DNS-Sequenz wurde mittels korrekturlesender
DNS Polymerasen durch RT-PCR bestimmt. Die daraus abgeleitete Aminosäurensequenz und die
mittels „Conserved Domain Database, CDD“ ermittelten putativen Proteindomänen sind in
Abbildung 5.6 zu sehen.
Durch die MALDI- und ESI-TOF Verfahren konnte nur eine Pektin Methylesterase in der
Aktivitätsbande der Pollenprobe nachgewiesen werden.
61
10 20 30 40 50 60 MAQRAVATMT TNKPLLLLAL ASALLGAAPA AANAPGGAFS NWVAMNQQSY ALYAQKSVGD 70 80 90 100 110 120 GGKEPLDKKL SEAEKKKVTY VVDPSGKGDY TNITAALEDI PVSNTKRVIL DLKPGAQFRE 130 140 150 160 170 180 KLFLNISKPF ITFRSDPKKP AVVVWNDTAA TNGKDGKPVG TVGSATLAVE SDYFTAYGVV 190 200 210 220 230 240 FRNDAPLAKP GAKGGQAVAV RLFGTKTQIY NCTIDGGQDT LYDHKGLHYF KGCLIRGSVD 250 260 270 280 290 300 FIFGFGRSFY EDCRIESVVK EVAVLTAQQR SKSIEGAIDT GFSFKNCSIG GVKGGQIYLG 310 320 330 340 350 360 RAWGDSSRVV YSYTKMGEEV VPVGWDGWQI AKPESSGIYY GEFKCFGPGA DAKKKKRVGW 370 380 ALDLTEAQAK PFVGTHYVLG DTWIQPPPK
Abbildung 5.6PME2 AminosäurensequenzOben: „CDD“ Proteindomänenvorhersage Unten: Dargestellt sind die 389 Aminosäuren der unprozessierten PME2. Die detektierten MALDI TOF bzw. ESI TOF Fragmente sind gelb unterlegt. Die ersten 32 AS sind grün hervorgehoben und stellen das durch in Silica analyse ermittelte Signalpeptid zur Translokation in das ER dar. Der Bereich der durch Datenbankvergleiche als Pektinesterasedomäne erkannt wurde (pfam01095) ist in braun dargestellt. Zusätzlich wurde in rot die durch einen Prosite Datenbankabgleich ermittelte PME-Signatur kenntlich gemacht (PS00503). Das Protein besitzt ohne Signalpeptid einen pI von 9,07 und ein Molekulargewicht von ca. 39kDa.
5. Ergebnisse
Die PME2 cDNS kodiert ein 389 Aminosäuren langes Protein, das laut „Signal IP“ ein Signalpeptid
von AS1 bis AS32 besitzt. Ein „CDD“ Datenbankabgleich klassifiziert das unbekannte Protein als
Pektin Methylesterase. Der Erwartungswert für putative Proteindomänen wurde bei 0,010 belassen.
Umso kleiner der Erwartungswert (E-value) ist, umso wahrscheinlicher ist die vorhergesagte
Domänenfunktion. Eine putative konservierte Pektin Methylesterase Domäne liegt zwischen AS 79
und AS 381 (pfam01095). Die entsprechenden Bereiche sind in Abbildung 5.3 markiert. Die
Prosite Pektin Methylesterase Signatur ist rot unterlegt (PS00503). Bei dem identifizierten Protein
handelt es sich um eine Typ II PME mit einem vorhergesagten pI von 9,07 und einem
Molekulargewicht von 38765 Dalton (ohne Signalpeptid). Die Klonierung und Expression von
rekombinanten Pektin Methylesterasen ist im Abschnitt 5.4 beschrieben.
5.3.2 Identifizierung einer weiteren Typ II PME aus Mais
Während den Datenbankrecherchen unter www.maizegdb.org wurden noch weitere PMEs
gefunden. Neben der im Maispollen exprimierten Typ II PME2 wurde noch eine weitere Typ II
PME, TUG ZmTUC03-08-11.21451, identifiziert. Die Benennung der TUGs wurde während der
Promotionszeit mehrmals geändert und anschließend von der „Plant Genome Database“ fortgeführt.
Wird mit der durch RT-PCR verifizierten DNS Sequenz bzw. mit der ZmTUC03-08-11.21451 DNS
Sequenz ein Datenbankabgleich mit der „PlantGDB“ durchgeführt, erhält man zwei PUTs:
PUT-151a-Zea_mays-112399 und PUT-151a-Zea_mays-905143604. Diese von der PlantGDB
zusammengesetzten putativen Transkriptfragmente stimmen in weiten Teilen mit der erhaltenen
ZmTUC03-08-11.21451 Sequenz überein, sind jedoch nicht identisch. In Abbildung 5.7 ist die
durch RT-PCR abgeleitete Aminosäurensequenz dargestellt.
62
5. Ergebnisse
Die 1038bp lange PME3 DNS kodiert ein 346 Aminosäuren langes Protein. Mittels „Signal IP“
wurde das 27 AS lange Signalpeptid vorhergesagt. Das Protein wurde mit Hilfe der „CDD“
Datenbank als putative Pektin Methylesterase identifiziert (pfam01095). Ohne Signalpeptid besitzt
das Protein laut in Silica Vorhersage einen pI von 7,82 und ein Molekulargewicht von 35096
Dalton. In Abbildung 5.7 ist das Signalpeptid durch grüne Schrift und die PME Domäne durch
braune Schrift dargestellt. Die teilweise vorhandene Prosite-Signatur ist rot dargestellt. Die
Klonierung und Expression von rekombinanten Pektin Methylesterasen ist im folgenden Abschnitt
5.4 beschrieben.
5.4 Versuche zur heterologen Expression der rekombinanten PME-Proteine in verschiedenen Expressionssystemen
Antiseren gegen bestimmte Proteine sind ein hilfreiches Mittel um spezifische Charakteristika, wie
z.B. die Lokalisation in vivo, zu bestimmen. Auch lassen sich mit ihnen eine Vielzahl an weiteren
Fragestellungen, durch z.B. „Western-Blot“ Experimente, beantworten. Ein Ziel ist es folglich mit
rekombinanten Proteinen Antiseren herzustellen bzw. biochemische Charakteristika der rek.
Enzyme zu untersuchen.
Es wurden eine Vielzahl an unterschiedlichen Expressionsvektoren und -systemen für die
63
10 20 30 40 50 60 MARPRLLLTF LLAAAAVLTT VPGVALAKSK LAKKSDDVVN GPLLTEKIQA KKTLIVGPDE 70 80 90 100 110 120 EFKTVQSAID AVPAGNAEWV IVHLRSGLHR GKVVIPENKP FIFVRGNGKG RTSISHESAS 130 140 150 160 170 180 SDNAESAAFT VNSDNVIVFG VSFRNSARVG LVNDPEIRSV AAMVAGDKVA FYHCAFYSPH 190 200 210 220 230 240 HTLFDSAGRH YYESCYIQGN IDFIFGSGQS IFQCPEIFVR PDRRTEIRGS ITAQVRQEED 250 260 270 280 290 300 SSGFVFLKGK VYGVGEVYLG RVTAPDSRVI FADTYLSKTI HPAGWTTIGY SGSTDKVTLA 310 320 330 340 EFNCTGPGAD VTNRVPWSRR FSPDDAAKYL TIDFINGKDW LPAYYY
Abbildung 5.7PME3 AminosäurensequenzDargestellt sind die 346 Aminosäuren der unprozessierten PME2. Die ersten 27 AS sind grün hervorgehoben und stellen das durch in Silica Analyse ermittelte Signalpeptid zur Translokation in das ER dar („Singal IP“). Der Bereich der durch Datenbankvergleiche als Pektinesterasedomäne erkannt wurde (pfam01095) ist in braun dargestellt. In rot sind Teile der Prosite-Signatur dargestellt (PS00503). Das Protein besitzt ohne Signalpeptid einen pI von 7,82 und ein Molekulargewicht von ca. 35kDa.
5. Ergebnisse
Herstellung von rekombinanten PME Protein verwendet. Es wurden unterschiedliche
Kulturbedingungen, wie z.B. Induktionsstärke, Temperatur, Zeit und Kulturvolumen ausgetestet,
sowie unterschiedliche Kontrollen, wie z.B. Promoteraustausch, Induktions DTT Kontrollen, etc.
durchgeführt (siehe Material & Methoden). In keinem der Expressionssysteme ließ sich
rekombinantes Protein nachweisen. Alle Klone wurden kontrollsequenziert. In Tabelle 5.2 sind die
Unterschiedlichen Expressionsvektoren und Systeme aufgeführt.
Vektor Expressionssystem Geplante Verwendung
pQE30::PME1NtΔ314AS
PQE30::PME1w/SP
PQE30::PME1Ct240AS
PQE30::PME2w/SP
PQE30::PME3w/SP
PETM20m::PME3w/SP
PQE30::PME3w/SP
PET22b::PME1w/SP
Escherichia coli
BL21, OrigamiTM,
Rosetta-gamiTM
PME-Domäne; Antiserum (AS) bzw. Charakterisierung
Protein ohne Signalpeptid (SP); AS bzw. Charakterisierung
Fragment der PME-Domäne; AS
PME-Domäne, AS bzw. Charakterisierung
Sekretion der PME1-Domäne in den periplasmatischen
Raum; AS bzw. Charakterisierung
PPICZαA::ProPME1w/SP
PPICZαA::PME2w/SP
PPICzαA::PME3w/SP
Pichia pastoris X33 PME1 Pro-Domäne; AS bzw. Charakterisierung
PME-Domäne; AS bzw. Charakterisierung
Tabelle 5.2: Expressionsvektoren und -systeme, sowie die geplante Verwendung
5.5 Expressionsmuster der Pektin Methylesterasen PME1 bis PME4 in Zea mays mittels semi-quantitativer RT-PCR
Die durch Datenbankrecherchen erhaltenen PME Daten sind zum Großteil aus Pollen bzw.
Antheren gewonnen worden. Um zu testen, in welchen Pflanzenorganen diese PMEs transkribiert
werden, wurde aus verschiedenen Geweben gesamt-RNS isoliert und mittels RT-PCR auf die
unterschiedlichen PMEs getestet. In Abbildung 5.8 ist das Vorkommen der vier PMEs in
unterschiedlichen Geweben dargestellt.
64
5. Ergebnisse
Wie aus der Abbildung zu entnehmen ist, werden die vier Pektin Methylesterasen aus Zea mays in
unterschiedlichen Geweben transkribiert. Das Transkript der Pektin Methylesterase PME1 kann in
Maispollen, Maissamen und Maisblättern nachgewiesen werden. Die spezifischen PCR-Produkte
sind in Abbildung 5.8 durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Im Narbengewebe konnten keine
Transkripte der vier PMEs nachgewiesen werden. Im Samen kommt es zur schwachen
65
Abbildung 5.8PME Exressionsmuster in unterschiedlichen MaisgewebenA: Durch Pfeile sind die unterschiedlichen Mais PMEs markiert. Neben den spezifischen PCR Fragmenten wurden auch noch unspezifische PCR Produkte detektiert. Alle vier PMEs werden sowohl im Pollen als auch im Blatt, bis auf PME3, transkribiert. Im Samen lässt sich nur ein sehr schwaches PME1 PCR Produkt erkennen. In Wurzelgewebe lässt sich nur PME2 nachweisen. Im Narbengewebe lässt sich keine der vier Pektin Methylesterasen nachweisen. PME1 ~1700bp; PME2 ~1200bp; PME3 ~1000bp; PME4 ~1800bp; B: Aktinkontrolle; in allen Gewebeproben lassen sich zwei Aktintranskripte detektieren (weiße Pfeile). Die Transkriptmenge in den Gewebeproben erscheint gleichmäßig (semi-quantitative RT-PCR).
5. Ergebnisse
Transkription von PME1. In der Wurzel lassen sich nur PME2 Transkripte nachweisen. Das PME4
PCR Produkt wird bei ca. 2100 Basenpaare detektiert. Trotz dem etwas zu großen Laufverhalten im
TAE-Agarosegel konnte während der späteren Klonierung die PME4 Sequenz bestätigt werden. In
allen Ansätzen wurde die gleiche Menge cDNS benutzt. Da sich in allen PCR Reaktionen der
internen Kontrolle zwei Aktinprodukte in ca. gleicher Menge nachweisen lassen, kann man von
einer semi-quantitativen RT-PCR sprechen.
5.6 cDNS-Klonierung von vier in Maispollen exprimierten PMEI-Isoformen
Die vier Pektin Methylesterase Inhibitor verwandten Proteine PMEI-RPs wurden durch eine
Analyse der Mais-EST-Datenbank (ZmDB, (Gai et al., 2000)) mit Hilfe der Sequenz eines Tabak
Invertase Inhibitors, Nt-INH1(Greiner et al., 1998) identifiziert. Jan Eufinger konnte in seiner
Diplomarbeit zeigen, dass die PMEI-RPs ausschließlich in Maispollen vorliegen. Die Daten der
ZmDB wurden später in die MaizeGDB integriert.
Die bisherigen Inhibitionsversuche mit rekombinanten PMEI-RP-Proteinen auf Invertase- und
PME-Proben haben bisher zu keinen eindeutigen Ergebnissen geführt. Dies könnte daran liegen,
dass die erforderlichen Disulfidbrücken nicht bzw. falsch ausgebildet sind. Um die richtigen
Ausbildungen der Disulfidbindungen zu gewährleisten, wurden die proteinkodierenden
Sequenzbereiche ohne Signalpeptid mit Hilfe der PCR-Technik angereichert und nach
enzymatischem Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen in die schon vorbereiteten
pETM20m-Vektoren eingebracht. Der pETM20 Vektor musste vor der Klonierung jedoch noch
modifiziert werden. Als einziges Restriktionsenzym für die 5'-Klonierung steht NcoI zur
Verfügung. Diese Restriktionsschnittstelle kommt jedoch in jeder PMEI-RP Sequenz vor und kann
folglich nicht verwendet werden. Der Vektor wurde zur Modifikation mit NcoI verdaut, mit Mung
Bohnen Nuclease behandelt, dephosphoryliert und anschließend mit dem „KpnI-Linker“ von „New
England Biolabs“ zum Vektor pETM20m ligiert. In diesem Vektor wird das Kandidatengen hinter
eine für Thioredoxin kodierende Sequenz fusioniert. Bei den vorangegangenen PMEI-RP
Proteinreinigungen wurde kaum lösliches Protein erhalten. Die Fusionierung mit Thioredoxin soll
diesen Nachteil beseitigen. Das Kandidatenprotein erhält man nach anschließender Spaltung des
Fusionsproteins mit der TEV-Protease. Desweiteren soll Thioredoxin die Bildung von
Disulfidbrücken fördern und die Löslichkeit des Produktes erhöhen.
Die erhaltenen Klone wurden zur Kontrolle sequenziert und anschließend in den Rosetta-gamiTM
66
5. Ergebnisse
Bakterienstamm eingebracht. Der Rosetta-gamiTM-Stamm besitzt neben der Eigenschaft ein leicht
oxidierendes Zellmilieu zu haben das Plasmid pRARE. Dieses Plasmid kodiert fünf tRNS
Moleküle, deren Basentripletts in Bakterien kaum vertreten sind und das Fehlen dergleichen die
Proteinsynthese verhindern kann. Die Expression von rekombinanten Pektin Methylesterase-
Inhibitoren ist im Abschnitt 5.9 beschrieben.
5.7 Entwicklungsabhängige Expression der verschiedenen PMEI-Isoformen
Es wurden unterschiedliche Pflanzenextrakte hergestellt und im „Western-Blot“ auf das
vorhandensein von PMEI-Proteinen getestet. In Abbildung 5.9 sind unterschiedliche Maisgewebe
mit dem affinitätsgereinigtem PMEI-RP3 Antikörper inkubiert worden. Deutlich ist zu erkennen
das die nativen PMEIs nur im Pollen vorkommen. Ca. zwei Tage bevor der Pollen reif ist, sind
bereits PMEIs nachweisbar. Am Tag an dem es zur Pollenausschüttung kommt, lässt sich die größte
Menge an PMEIs nachweisen. Die Ergebnisse untermauern die vorangegangenen „Northern-Blot“
Untersuchungen (Diplomarbeit Jan Eufinger 2002).
67
Abbildung 5.9Epression von PMEI-RPs in Zea mays GewebenProben -3 bis 0: Maispollenproben kurz vor der Pollenausschüttung (Tag 0). Es lassen sich nur native PMEI-RPs in den Pollenproben nachweisen. Die Amidoschwarz gefärbte Membran ist gleichmäßig beladen. An Tag 0 lässt sich die größte Menge an PMEI-RPs nachweisen (Pfeil). (Tag 0 ist im Amidoschwarzstainig etwas stärker gefärbt. Das stärkere Immunsignal lässt sich dadurch jedoch nicht erklären. Im Narben-, Sproß-/Blatt- und Wurzelgewebe lassen sich keine PMEI-RPs nachweisen.
5. Ergebnisse
5.8 Sind die nativen PMEI-RPs aus Zea mays glykosiliert?
Möglicherweise ist für die Funktion der nativen PMEI-RPs eine Glykosilierung notwendig. Zum
Nachweis wurden Maispollenproben über eine Concanavalin-A Säule gereinigt. Es handelt sich
hierbei um eine Lektin Chromatographie bei der Proteine über ihre Zuckerreste an die Matrix
gebunden werden. Wie in Abbildungen 5.10 und 5.11 zu sehen ist, binden die nativen Mais PMEI-
RPs nicht an die Concanavalin-A Matrix. PMEI-RPs lassen sich nur im Rohextrakt und Con-A
Durchfluss nachweisen. Eine Glykosilierung der nachgewiesenen nativen PMEI-RPs findet nicht
statt und ist für die Funktion im Maispollen vermutlich nicht erforderlich. Der Bandensprung in
5.10 lässt sich durch das Vorhandensein von Disulfidbindungen der nicht-reduzierenden Proben
erklären. Durch diese Bindungen kann sich das Protein nicht ganz entfalten und läuft in einer SDS-
PAGE weiter, als wenn diese reduziert und gelöst wären.
68
Abbildung 5.10Nachweis eines redox-shift von PMEI-RP BandenAn die Concanavalin-A Säule binden spezifisch Glykoproteine. Es lassen sich nur in den Probenspuren 1,2 und 4,5 PMEI-RPs nachweisen. Im Con-A Eluat, Spuren 3 und 6, findet sich kein Immunsignal. Spur 1: Rohextrakt; Spur 2: Durchlauf; Spur 3: Eluat; Spur 4: Rohextrakt reduziert; Spur 5: Durchlauf reduziert; Spur 6: Eluat reduziert; 15%ige SDS-PAGE, affi-Anti-PMEI-RP3
5. Ergebnisse
5.9 Heterologe Expression von vier rekombinanten, in Maispollen exprimierten PMEI-Proteinen
Die besten Expressionsergebnisse wurden bei einer IPTG Konzentration von 0,1mM und einer
Inkubation von 18h bei 16°C und 180rpm erreicht. Stellvertretend für alle durchgeführten
Proteinreinigungen werden in Abbildung 5.12, 5.13, 5.14 und 5.15 jeweils eine Reinigung
dargestellt. In Abbildung 5.16 sieht man die gesammelten Fraktionen einer Trx::PMEI-RP2
Proteinreinigung, die bereits mit der „TEVase“ gespalten und über eine Nickel-Säule von
His6Thioredoxin und His6Tevase getrennt wurde. Im Verlauf der weiteren Proteinaufarbeitung wurden
durch Dialysen und „TEV“ Spaltung große Mengen an rekombinanten Protein verloren. Es kommt
bereits während der Dialyse zum TEV-Spaltungspuffer zum Ausfallen von rekombinantem Protein.
Dies konnte bei allen vier PMEI-RP Proteinen beobachtet werden. Besonders Trx::PMEI-RP1 bzw.
PMEI-RP1 neigt dazu, während den weiteren Schritten sehr rasch zu präzipitieren und zu
degradieren. Meist lässt sich nur noch eine sehr geringe Menge an geschnittenem PMEI-RP1
Protein nachweisen. Trotz langem waschen, können kontaminierende Proteine nicht mehr
ausgewaschen werden.
69
Abbildung 5.11PMEI-RP Nachweis nach Concanavalin-A ChromatographieEs lassen sich nur in den Probenspuren 1 und 2 PMEI-RPs nachweisen. Im Con-A Eluat, Spur 3, findet sich kein Immunsignal. In A werden zwei Banden detektiert (schwarze Pfeile), in B überlagern sich zwei Banden (weißer Pfeil). Spur 1: Rohextrakt; Spur 2: Durchlauf; Spur 3: Eluat; 15%-ige Tris-Tricine SDS-PAGE, affi-anti-PMEI-RP3 A und anti-PMEI-RP1 B
5. Ergebnisse
70
Abbildung 5.13Reinigung von His6Trx::PMEI-RP2 aus Rosetta-gamiTM BakterienCoomassiefärbung einer 15%-igen „SDS-PAGE“. Geladen wurden Totallysat 10µl, Sediment 5µl, Überstand 10µl, Durchlauf 10µl, Waschpuffer je 20µl, Fraktionen 1 bis 10 je 10µl geladen. Die Fraktionen F3 bis F5 weisen die höchste Konzentration an rekombinanten Protein auf. Neben dem rekombinanten Protein (Pfeil) lassen sich noch weitere Banden nachweisen. Trx::PMEI-RP2 lässt sich bei ~ 32 kDa nachweisen. Dies entspricht dem vorhergesagten Molekulargewicht. Das rekombinante Protein verteilt sich über mehrere 500µl Fraktionen.
Abbildung 5.12Reinigung von His6Trx::PMEI-RP1 aus Rosetta-gamiTM BakterienCoomassiefärbung einer 15%-igen „SDS-PAGE“. Geladen wurden Totallysat 10µl, Überstand 10µl, Durchlauf 10µl, Waschpuffer je 20µl, Fraktionen 1 bis 5 je 10µl geladen. Es wird sehr sauberes Protein erhalten, das kaum Kontaminationen aufweist. Trx::PMEI-RP1 bandet bei ungefähr 32 kDa (Pfeil). Nur wenig rek. Protein lässt sich nachweisen. 500µl pro Fraktion.
5. Ergebnisse
71
Abbildung 5.14Reinigung von His6Trx::PMEI-RP3 aus Rosetta-gamiTM BakterienCoomassiefärbung einer 15%-igen „SDS-PAGE“. Geladen wurden Totallysat 10µl, Überstand 10µl, Durchlauf 10µl, Waschpuffer je 20µl, Fraktionen 1 bis 5 je 10µl geladen. Relativ saubere His6Trx::PMEI-RP3 Reinigung mit wenig kontaminierenden Proteinen. Fast das gesamte rekombinante Protein lässt sich in Fraktion 2 nachweisen. Gesammelt wurden 1ml Fraktionen.
Abbildung 5.15Reinigung von His6Trx::PMEI-RP4 aus Rosetta-gamiTM BakterienCoomassiefärbung einer 15%-igen „SDS-PAGE“. Geladen wurden Totallysat 10µl, Sediment 5µl, Überstand 10µl, Durchlauf 10µl, Waschpuffer je 20µl, Fraktionen 1 bis 9 je 10µl geladen. In den Hauptfraktionen F2 bis F5 lassen sich neben großen Mengen an rekombinantem Protein bei ~ 32 kDa (Pfeil) noch weitere Banden nachweisen. Hierbei kann es sich um bakterielle Proteine oder aber um Degradationsprodukte von Trx::PMEI-RP4 handeln. 500µl pro Fraktion.
5. Ergebnisse
5.10 Indirekter Nachweis von Disulfidbrücken in PMEI-RPs
Nach Reinigung und Prozessierung der rekombinanten PMEI-RPs wurden diese im „Western-Blot“
und mit Hilfe von Coomassiefärbung auf einen Bandensprung unter reduzierenden und
nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht. Nicht-reduzierte Proben besitzen noch
Disulfidbindungen und halten das Protein in einer kompakteren Form. Durch die kompakte Form
laufen die Proteine in einer „SDS-PAGE“ weiter als im reduzierten Zustand. In Abbildung 5.17
wurde die Membran mit affinitätsgereinigtem PMEI-RP3 Antikörpern inkubiert und ausgewertet.
Die polyklonalen Antikörper binden an PMEI-RP2, PMEI-RP3 und PMEI-RP4. Das PMEI-RP2
Signal ist schwächer. Im Vergleich zu den anderen zwei dargestellten PMEI-RPs. wird nur das
reduzierte Protein erkannt. Aus diesem Grund wurde der Bandensprung von PMEI-RP2 durch
Coomassiefärbung nachgewiesen, Abbildung 5.18. Für PMEI-RP1 konnte ebenfalls ein
Bandensprung nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
72
Abbildung 5.16Prozessierung von His6Trx-PMEI-RP2 in His6Trx und PMEI-RP2Spur 1: LMW-Marker; Spur 2: Trx-PMEI-RP2 vor TEV-Spaltung; Spur 3: 3h nach TEV-Verdau; Spur 4: Fertig prozessiertes rekombinantes PMEI-RP2 Protein, das von His6Trx und His6Tevase gereinigt wurde. Einfacher Pfeil: His6Trx::PMEI-RP2; Spitzer Pfeil; PMEI-RP2: weißer Pfeil: His6Trx. Die Bande bei 28 kDa könnte His6Tevase sein (Spur 2&3). 15%-ige „SDS-PAGE“
5. Ergebnisse
73
Abbildung 5.17Hinweis von Disulfidbrücken bei den rekombinanten Proteinen PMEI-RP2, PMEI-RP3 und PMEI-RP4Zwischen den Proben mit DTT und ohne DTT wurden jeweils Spuren freigelassen. Die gereinigten PMEI-RP3 Antikörper detektieren nur die reduzierte Form von PMEI-RP2 (weißer Pfeil). PMEI-RP3 und PMEI-RP4 werden sowohl reduziert als auch nicht reduziert vom Antikörper erkannt. Die Banden bei 32 kDa sind noch Überreste der Thioredoxinfusionsproteine. Die Banden zwischen den Probenspuren bei 45 und 66 kDa werden durch Kreuzreaktionen der Antikörper mit Markerproteinen verursacht. 15%-ige „SDS-PAGE“; affinitätsgereinigte PMEI-RP3 Antikörper.
Abbildung 5.18Hinweis von Disulfidbrücken von PMEI-RP2 unter reduzierenden und nicht-reduzierenden BedingungenCoomassie Färbung, da der Antikörper das nicht-reduzierte PMEI-RP2 nicht detektiert. Aufgetragen wurden unterschiedliche Mengen an prozessierten PMEI-RP2 Protein geladen. Der schwarze Pfeil zeigt den Bandensprung innerhalb einer Spur. Während dem Gellauf diffundiert DTT aus der Markerspur in die ersten zwei Probenspuren ohne DTT hinein; 15%-ige „SDS-PAGE“
5. Ergebnisse
5.11 Versuche zum Nachweis der Komplexbildung zwischen PME- und PMEI-Proteinen
In Publikationen, die sich mit Invertasen, PMEs und anderen am Zuckerstoffwechsel beteiligten
Enzymen befassen, wurde gezeigt, dass unter physiologischen Bedingungen viele Inhibitor-Proteine
mit ihren Zielproteinen einen stabilen Komplex bilden. Daher wurde versucht mit unterschiedlichen
Methoden Proteinkomplexe zwischen PMEs und PMEIs nachzuweisen. Unter anderem wurde
versucht durch Co-Immunpräzipitationen mit anti-PMEI-RP3 Antikörpern, die kovalent an eine
Protein-A-Sepharose Matrix gebunden waren, natives PMEI-RP3 und mögliche gebundene
Zielproteine nachzuweisen. In diesen Versuchen konnte kein natives PMEI-RP3 Protein und somit
keine Zielproteine präzipitiert werden. Wie sich später in Immunfluoreszenzen herausstellte, sind
die Antikörper gegen PMEI-RP1 und PMEI-RP3 nicht in der Lage, die nativen Proteine zu
detektieren. Zusätzlich wurde auch ein „Far-Western Blot“ Versuch mit rekombinantem PMEI-
RP3 Protein durchgeführt („Overlay“). Auch hier konnten keine neuen Banden oberhalb 20kDa
detektiert werden. Anschließend wurden noch unterschiedliche „Cross-Linker“ wie DSP, DMP und
EDC eingesetzt. Proteinkomplexe ließen sich so aber auch nicht nachweisen (Daten nicht gezeigt).
Da die bisherigen Versuche Protein-Komplexe mit den PMEI-RPs nachzuweisen zu keinen
Ergebnissen führten, wurde abschließend eine „Größen-Ausschluss-Flüssigkeitschromatographie“
durchgeführt. Als Matrix wurde „Sephadex G100-Fine“ verwendet.
Mit Hilfe der „Sephadex G100-Fine“-Säule wurden unterschiedliche Maisproben aufgetrennt. Unter
anderem wurden Extrakte aus Pollen, Pollen mit Narbengewebe, Pollen gekeimt auf Narbengewebe
sowie Narbengewebe alleine aufgetrennt. Die Probenvorbereitung wurden unter weitestgehend
nativen Bedingungen durchgeführt. In allen durchgeführten Läufen konnten nur monomere PMEI-
RPs nachgewiesen werden. Stellvertretend für die durchgeführten Läufe ist in Abbildung 5.19 die
Auftrennung einer Maispollenprobe dargestellt. In Abbildung 5.20 sind die PME Aktivitäten der
einzelnen Fraktionen abgebildet.
Neben der „Sephadex G100-F“ Säule wurde auch eine „Superdex 200“ FPLC von Pharmacia
verwendet. Neben einer besseren Trennung der Proteine lässt sich jedoch kein Unterschied
nachweisen.
In Tabelle 5.3 sind die Ergebnisse aller untersuchten Proben zusammengefasst.
74
5. Ergebnisse
75
Abbildung 5.19Maispollen „Sephadex G100-Fine“ GelfiltrationEs lassen sich nur monomere Inhibitoren nachweisen (Pfeile). Die putativen Zielproteine sind um Fraktion 18 und um Fraktion 27 vorhanden. 15%-ige Tris-Tricine SDS-PAGE; anti-PMEI-RP1; Ponceaurot unterlagert
Abbildung 5.20Relative PME Aktivität der einzelnen Sephadex-G100 FraktionenEs können zwei Pektin Methylesterase Aktivitäts-maxima nachgewiesen werden. Die erste Aktivitätsspitze liegt um Fraktion 17, die zweite um Fraktion 27. Eingesetzt 25µl von 600µl Fraktionen.
5. Ergebnisse
Proben Laufverhalten PMEI-RP1 Laufverhalten PMEI-
RP2/3/41 Pollen monomer monomer2 Pollen mit Narbengewebe monomer monomer3 Pollen auf Narbengewebe gekeimt monomer monomer4 Rekombinantes PMEI-RP2 monomer5 Rekombinantes PMEI-RP3 monomerTabelle 5.3 Gelfiltration
Sollte es sich bei den Proteinen tatsächlich um Pektin Methylesterase Inhibitoren handeln, würde
man eine Interaktion mit den Zielproteinen erwarten. In Abbildung 5.20 sieht man, dass es zwei
Aktivitätsmaxima gibt. In den entsprechenden Fraktionen, Abbildung 5.19, lassen sich weder
PMEI-RP1 noch PMEI-RP2/3/4 nachweisen.
In den Tabakpollen, die transient mit PME2::RFP und PMEI-RP1::YFP bzw. PMEI-RP3::YFP
transformiert wurden, kann man sehen, dass beide Proteine in der Zellwand vorliegen. Es lässt sich
jedoch beobachten, Abbildung 5.25, dass die Lokalisationen nicht übereinstimmen.
5.12 In vitro-Versuche zur Inhibition von PME-Aktivität
Die vier rekombinanten PMEI-RPs wurden auf ihre inhibitorische Wirkung gegen Mais Pollen,
Samen-, Narben-, Wurzel-PMEs und PMEs aus der Spitze von Keimlingen (1cm der Spross-spitze)
untersucht. Als PME bzw. Invertase Proben wurden unter anderem die Gelfiltrationsfraktionen
verwendet. In diesen können keine der zu charakterisierenden PMEI-RPs nachgewiesen werden.
Mit den rekombinanten PMEI-RPs ließ sich in in vitro Untersuchungen keine Inhibition der PME-
und Invertase-Proben nachweisen. Mit dem Arabidopsis thaliana Pektin Methylesterase Inhibitor
AtPMEI1 konnte jedoch die PME-Aktivität der Keimlingsproben komplett gehemmt werden, siehe
Abbildung 5.21.
76
5. Ergebnisse
5.13 Wirkung von exogener PME-Gabe auf Pollenkeimung und Pollenschlauchwachstum
Biochemische Versuche Pektin Methylesterasen und PMEI-RPs zu charakterisieren haben zu
keinen Resultaten, die Hinweise auf eine mögliche Interaktion der betreffenden Kandidatenproteine
geben, geführt. Aus diesem Grund wurden zellbiologische Untersuchungen mit den betreffenden
Proteingruppen durchgeführt.
Geht man davon aus, dass es sich bei den vier PMEI-RPs tatsächlich um Pektin Methylesterase
Inhibitoren handelt, würde man erwarten, dass das Fehlen dieser zu einer erhöhten PME Aktivität
führen würde. Im folgenden Versuch wurde untersucht, welche Effekte eine erhöhte PME Aktivität
auf die Pollenkeimung bzw. auf das Pollenschlauchwachstum haben kann. Zu diesem Zweck
wurden Petrischalen mit Pollen-Keim-medium, dass unterschiedliche Orangenschalen PME
Konzentrationen (Sigma-Aldrich) aufweist, hergestellt. Auf diese Pollenkeimplatten wurde
anschließend Tabak- und Mais-pollen gegeben, siehe Abbildung 5.22. Man kann erkennen, dass mit
steigender PME Aktivität die Pollenschläuche kürzer und schmaler werden Abbildung 5.22A >
5.22D >5.22G.
77
Abbildung 5.21PME-Inhibitionsversuch mit AtPMEI1Der Arabidopsis thaliana PME Inhibitor AtPMEI1 ist in der Lage, die Aktivität von Orangenschalen- (Sigma) und Mais Spross-spitzen PME (1cm der Spitze) vollständig zu inhibieren.
5. Ergebnisse
78
Abbildung 5.22Gekeimter Maispollen auf Pollenkeimplatten, die mit unterschiedlichen PME Konzentrationen (Sigma, aus Orangenschalen) versetzt wurdenA,B,C: Kontrollplatten ohne PME-Zusatz, die meisten der Maispollen keimen aus und besitzen ein normales Pollenschlauchwachstum. D,E,F: Platten mit 0,3U/ml PME-Aktivität im Keimmedium, hier sind die Pollenschläuche kürzer und viele Pollen sind nicht in der Lage auszukeimen. Die Pollenschläuche sind teilweise schmaler als die der unbehandelten Pollen. G,H: Platten mit 0,6U/ml PME-Aktivität im Keimmedium, nur noch sehr wenige Pollen sind in der Lage auszukeimen bzw. zu wachsen. Auskeimende Pollen sind sehr kurz und sehr dünn im Vergleich zu unbehandelten Pollenschläuchen. Maßstabsbalken A,B,D,G: 200µm; C: 100µm; F,H: 50µm
5. Ergebnisse
5.14 Subzelluläre Lokalisierung von Mais PME- und PMEI-Proteinen in wachsenden Pollenschläuchen mittels Reporter-Fusionen
Eine weitere Möglichkeit Kandidatenproteine zu charakterisieren, besteht darin, die betreffenden
Zielproteine im heterologen Tabakpollen bzw. im Maispollen zu exprimieren. Die kodierenden
Sequenzen der PMEI verwandten Proteine wurden in den Vektor pHD32::YFP und die der PMEs in
den Vektor pHD223::RFP eingebracht. Die zwei unterschiedlichen Vektoren wurden aufgrund ihrer
unterschiedlichen fluoreszierenden Proteine ausgesucht. Mit diesen ist es möglich, die putativen
PMEI-RPs und die möglichen PME Zielproteine zusammen in Pollensystemen zur Expression zu
bringen und mögliche Interaktionen zu beobachten. Die verwendeten Primer und die
entsprechenden Restriktionsschnittstellen sind in der Primerliste im Material und Methodenteil
aufgeführt.
Die Expressionvektoren pHD32::YFP und pHD223::RFP besitzen neben einer N-Terminalen
fluoreszierenden Proteinsequenz den Promotor LAT52, der im Gegensatz zum CaMV35 Promotor
in Pollen aktiv ist. Die beiden Vektoren wurden unserer Arbeitsgruppe von der AG Kost zur
Verfügung gestellt. Alle erhaltenen Klone wurden mittels Sequenzierung überprüft.
5.14.1 Klonierungen von zwei Typ I PMEs und zwei Typ II PMEs aus Zea mays in den Vektor pHD223::RFP
Die Sequenzen der PME1, PME2, PME3 und PME4 wurden in den Hilfsvektor pCR2.1
(Invitrogen) eingebracht und kontrollsequenziert. Aus Zeitgründen konnte nur die PME2
kodierende Sequenz erfolgreich in den Zielvektor pHD223::RFP eingebracht werden. Die
Integration der DNS an den Restriktionsschnittstellen wurde durch eine Kontrollsequenzierung
bestätigt. In Abbildung 5.23 sind transient transformierte Tabakpollen abgebildet.
79
5. Ergebnisse
80
Abbildung 5.23Fluoreszenz- und Hellfeld-Konfokalaufnahmen von pHD223::PME2::RFP transient transformierten TabakpollenA,B: Man kann ein diffuses Signal im gesamten Pollenschlauch bis zur Spitze sehen. C,D: schwaches diffuses Signal, dass in der Vakuole zu fehlen scheint. Die großen globulären Gebilde sind vermutlich Cytoplasmaströme, die sich durch die ausgesparte Vakuole als große Vesikel abheben. Eine leichte Zellwandfärbung ist zu beobachten (Pfeil). E,F: Bis auf ein paar Aussparungen scheint der gesamte Pollenschlauch gefärbt zu sein. An der Pollenschlauchspizte findet sich ein schmaler Spalt ohne Signal (Plasmamebran). Die Zellwand ist stark gefärbt (Pfeil). G,H: Bis auf wenige Aussparungen erscheint der gesamte Pollenschlauch gefärbt. Sehr gut ist zu erkennen, wie das Cytoplasma durch die Plasmamembran von der durch Fluoreszenz gefärbten Zellwand getrennt ist (Pfeil).
5. Ergebnisse
Vor kurzem erschienen zwei Publikationen, die zeigen, dass die Überexpression einer PME in
Pollen zu einem Phänotyp führen kann, der sich unter anderem durch verkürztes Streckenwachstum
und eine dickere Zellwandspitze auszeichnet (Bosch et al., 2005; Jiang et al., 2005).Eine mögliche
Verdickung der Zellwandspitze konnte teilweise beobachtet werden, siehe auch Abbildung 5.23,F.
Eine Verkürzung der transient transformierten Tabakpollen konnte jedoch nicht beobachtet werden.
Sie erreichen die gleiche Länge wie untransformierte Pollen (Daten nicht gezeigt).
5.14.2 Klonierung von PMEI-RP1 bis PMEI-RP4 aus Zea mays in den Vektor pHD32::YFP
Die kodierenden Sequenzen der jeweiligen PMEIs wurden in den Vektor pHD32::YFP kloniert und
schließlich mittels ballistischer Transformation transient in Tabakpollen zur Expression gebracht. In
Abbildung 5.24, 5.25, 5.26 und 5.27 sind Aufnahmen verschiedener Pollentransformationen
zusammengefasst.
Das PMEI-RP1::YFP Fusionsprotein (Abb. 5.24) wurde anhand der Fluoreszenz im sekretorischen
Weg, ER und Golgi, detektiert. Sehr deutlich ist die Fluoreszenz im Zellwandraum zu erkennen,
5.24G Pfeil. Die beobachteten Lokalisierungen von PME-RP1::YFP entsprechen den in Silica
Vorhersagen. Auch befinden sich die putativen Zielproteine im sekretorischen Stoffwechselweg des
Pollens. Eine Interaktion zwischen den PMEI-RPs und PMEs bzw. Zellwandinvertasen ist also in
vivo möglich. In Abbildung 5.25 lässt sich das fluoreszierende Fusionsprotein sehr gut in den
einzelnen Bereichen, der Pollenschlauchspitze erkennen. Deutlich lässt sich die Fluoreszenz im
Zellwandraum, in einer schmalen Zone an der Plasmamembran der Pollenschlauchspitze, sowie in
Golgi und ER ähnlichen Strukturen nachweisen. In der Spitzenwachstumszone lässt sich eine
Schwächung der Fluoreszenz nachweisen. Die Zone, in der das Spitzenwachstum stattfindet, ist
meist frei von sichtbaren Zellstrukturen.
Im Gegensatz zum PMEI-RP1::YFP lässt sich bei PMEI-RP2::YFP ein Phänotyp nachweisen (Abb.
5.26). Die meisten (~80%) der transient transformierten Tabakpollen sind nicht fähig zu keimen,
hören auf zu wachsen bzw. sterben während des späteren Pollenschlauchwachstums ab. In
Abbildung 5.26,H wachsen die wildtyp Pollen durch das gesamte Gesichtsfeld und darüber hinaus
weiter. Die meisten der transient transformierten Pollen zeigen ein stark eingeschränktes Wachstum
und sind meist nicht länger als maximal 500µm (wildtyp Pollen ist zu diesem Zeitpunkt meist >
2000µm lang, das entspricht ca. der doppelten Breite des Gesichtsfelds von Abbildung 5.26,H); es
gibt jedoch auch Pollenschläuche, die sich nicht vom wildtyp Phänotyp unterscheiden lassen.
81
5. Ergebnisse
Möglicherweise ist hier der Expressionsstärke und damit die biologische Aktivität zu schwach. In
der Wachstumszone lässt sich in intakten Pollen kaum Fluoreszenz nachweisen.
82
Abbildung 5.24Fluoreszenz- und Hellfeld-konfokalaufnahmen von pHD32::PMEI-RP1::YFP transient transformierten TabakpollenA,B,C: Kotransformation mit einem Vakuolenmarker (CyanFP). Man erkennt sich kreuzende Querbanden in der Zellwand; D,E: schwaches Signal an der Pollenspitze (Pfeil); F: starkes Signal an der Pollenschlauchspitze; G,H: starkes Signal in der Zellwand, ER und Golgi; I: Fluoreszenz im der Pollenschlauchspitze, die Signalintensität nimmt mit Abstand zur Pollenspitze ab, im ER und im Golgi
5. Ergebnisse
Die Klonierung von pHD32::PMEI-RP4::YFP konnte wegen unterschiedlicher PCR- und
Klonierungsartefakten, sowie der abgelaufenen Promotionszeit, nicht mehr untersucht werden.
Aufgrund der hohen AS-Sequenzhomologie (76%) zu PMEI-RP3 wird jedoch angenommen, dass
die Proteine sehr ähnliche Funktionen besitzen und daher die Ergebnisse von PMEI-RP3 auch für
PMEI-RP4 gelten könnten (Abb. 5.27). In der Abbildung lässt sich das Fusionsprotein im
Zellwandraum, im ER und Golgi nachweisen. In der Wachstumszone des Pollenschlauchs, lässt
sich im Vergleich zu PMEI-RP1 transient transformiertem Tabakpollen, häufig Fluoreszenz
nachweisen. Wie bei PMEI-RP1 lässt sich auch hier kein Phänotyp nachweisen.
83
Abbildung 5.25Fluoreszenz-konfokalaufnahmen von pHD32::PMEI-RP1::YFP transient transformierten TabakpollenWeiße Pfeile markieren den Zellwandraum. Der blaue Pfeil markiert die Anlagerung von PMEI-RP1::YFP Fusionsproteinen an die Zellmembran der Pollenschlauchspitze. Der schwarze Pfeil zeigt auf die Wachstumszone der Pollenschlauchspitze. Man kann deutlich erkennen, dass in der Wachstumszone fast kein Fusionsprotein nachzuweisen ist.
5. Ergebnisse
84
Abbildung 5.26Fluoreszenz- und Hellfeld-konfokalaufnahmen von pHD32::PMEI-RP2::YFP transient transformierten TabakpollenA,B,E: Man kann ein ER und Golgi typisches Signal erkennen, jedoch kein Signal in der Zellwand. C,D: Die ER- und Golgi-färbung würden für den sekretorischen Weg sprechen, jedoch ist das Signal in der Pollenschlauchspitze schwächer (Pfeil). Man würde erwarten, dass bei einem sekretierten Protein auch hier das Signal stark ist. In der Zellwand ist kein Signal nachweisbar. F,G: kurz nach dem Auskeimen arretierter Pollenschlauch. H: Während die wildtyp Pollen eine normale Keimung und ein normales Pollenschlauchwachstum besitzen, sind die meisten der transformierten Tabakpollen in ihrer Keimfähigkeit und ihrem Wachstum stark benachteiligt (Pfeile). I: arretierter Pollenschlauch. Verdickte Pollenschlauchspitze (Pfeil), keine Zellwandfärbung
5. Ergebnisse
85
Abbildung 5.27Fluoreszenz- und Hellfeld-konfokalaufnahmen von pHD32::PMEI-RP3::YFP transient transformierten TabakpollenA,B,C,D,E,F: Das gelb fluoreszierende Fusionsprotein kann im ER, Golgi und in der Zellwand nachgewiesen werden. Weiße Pfeile markieren die Zellwand. F: Teilausschnitt von A. Die Zellwand, weißer Pfeil, ist deutlich vom Zellinnenraum (blauer Pfeil) abgetrennt. Der blaue Pfeil markiert eine schmale Zone an der Pollenschlauchspitze, in der das PMEI-RP3::YFP Fusionsprotein vermutlich von Vesikeln vor der Freigabe in den Zellwandraum herantransportiert wird. Im Vergleich zu PMEI-RP1::YFP lässt sich hier die Wachstumszone in der Pollenschlauchspitze kaum wahrnehmen.
5. Ergebnisse
5.14.3 Kotransformation von Tabakpollen mit pHD228::PME2::RFP und den PMEI-RP Vektoren
Die unter 5.3.1 beschriebene Typ II PME2 wurde mit den drei PMEI-RP Isoformen PMEI-RP1,
PMEI-RP2 und PMEI-RP3 transient im heterologen Tabakpollensystem zur Koexpression gebracht.
Mit diesen Versuchen sollte überprüft werden, ob das putative Zielprotein PME2 mit den PMEI-
RPs kolokalisiert. In Abbildung 5.28 sind einige transient kotransformierte Tabakpollen dargestellt.
Die PMEI-RP1::YFP Fluoreszenz lässt sich in ca. 90% der kotransformierten Tabakpollen nur noch
sehr schwer im Zellwandraum nachweisen (Abbildung 5.28, DEF). In intakt aussehenden
Pollenschläuchen ist keine PMEI-RP1::YFP Fluoreszenz in der Zellwand zu lokalisieren. An der
Pollenschlauchspitze hingegen lässt sich meist im Zellwandinneren eine schmale Zone mit PMEI-
RP1::YFP Fluoreszenz nachweisen (siehe auch Abbildung 5.25). Teilweise findet man Pollen, die
zwar noch leben, aber kein Längenwachstum mehr aufweisen (Abbildung 5.28, DEF). In diesen
lassen sich drei Bereiche unterscheiden: eine Zone in der PME2::RFP und PMEI-RP1 Fluoreszenz
nachweisbar ist (Abbildung 5.28, DEF blauer bzw. weiße Pfeil(e)); dahinter ein breite Zone in der
sich nach außen hin abnehmend PME2::RFP Fluoreszenz nachweisen lässt; der dritte Bereich ist die
Kontaktzone zwischen Zellinnenraum und Zellwandraum, die sich durch ein Fehlen an Fluoreszenz
auszeichnet. Generell lässt sich festhalten, dass sich in noch wachsenden Pollenschläuchen so gut
wie keine PMEI-RP1::YFP Fluoreszenz und nur eine schwache PME2::RFP Fluoreszenz im
Zellwandraum nachweisen lässt. Im Unterschied dazu lassen sich bei Einzeltransformanten die
Fusionsproteine durch die entsprechende Fluoreszenz sehr gut im Zellwandraum nachweisen. In
den PME2::RFP und PMEI-RP2::YFP Kotransformanten ist die RFP::Fluoreszenz im
Zellwandraum, im Vergleich zu einzeln transformierten Tabakpollen, nur noch schwach vorhanden.
86
5. Ergebnisse
87
Abbildung 5.28Fluoreszenz-konfokalaufnahmen von pHD32::PMEI-RP1::YFP und pHD228::PME2:RFP transient kotransformierten TabakpollenA: PMEI-RP2::YFP Fluoreszenz lässt sich nicht im Zellwandraum nachweisen. D: Es lässt sich eine leichte Fluoreszenz im Zellwandraum nachweisen. Zwischen der äußersten Zellwandschicht und dem Zellinnenraum hat sich eine breite Zone gebildet. Nur in der äußersten Zone lässt sich PMEI-RP1::YFP Fluoreszenz nachweisen (blauer Pfeil). B: Die PME2::RFP Fluoreszenz lässt sich im Zellwandraum und im Pollenschlauch nachweisen (weiße Pfeile). Die Pollenschlauchspitze erscheint ausgefranst (grauer Pfeil, B). E: Im Vergleich zu B ist das Signal in der Pollenschlauchspitze fokussiert. In der äußersten Zellwandschicht (weiße Pfeile), in der Zone dazwischen (grauer Pfeil) und im Zellinnenraum lässt sich PME2::RFP Fluoreszenz nachweisen. C und F: Überlagerung von A und B bzw. D und E
6. Diskussion
6 Diskussion
Die Forschungsarbeiten der letzten Jahre zeigen, dass Pektin Methylesterasen und Pektin
Methylesterasen Inhibitoren im Pflanzenreich wichtige Funktionen ausüben können. Die
Identifizierung und Charakterisierung spezifischer Pektindomänen in Zellwänden führt zu dem
Schluss, dass verschiedene PMEs mit spezifischen Charakteristika für die Ausbildung solcher
Domänen benötigt werden(Lenartowska et al., 2001; Stepka et al., 2000; Willats et al., 2001b). Die
Regulierung der an diesen Prozessen beteiligten PMEs durch Ionenzusammensetzung,
Pektinzusammensetzung, pH und der kürzlich beschriebenen Inhibitorproteinen ist von großer
Bedeutung(Balestrieri et al., 1990; Catoire et al., 1998; Denes et al., 2000; Micheli, 2001; Wolf et
al., 2003).
Das Pollenschlauchsystem bietet zur Identifizierung und Charakterisierung von PMEs und deren
Regulation durch Inhibitorproteine ideale Bedingungen. Pollen sind stark polarisierte Zellen mit
einem sehr schnellen direktionalen Wachstum und ihre Zellwand besteht hauptsächlich aus Pektin.
An der Pollenschlauchspitze kommt es zur Sekretion von stark methyliertem Pektin, das mit
zunehmender Entfernung von der Pollenschlauchspitze demethyliert vorliegt. Der unterschiedliche
Methylierungsgrad der Pektinmatrix ist für die mechanischen Eigenschaften der
Pollenschlauchwand von großer Bedeutung. Mit zunehmender Demethylierung und der sich daran
anschließenden Quervernetzung durch z.B. Ca2+ Ionen wird die Pektinmatrix verfestigt und
stabilisiert so den Pollenschlauch(Ferguson et al., 1998; Li et al., 1994; Taylor & Hepler, 1997).
Die bisher beschriebenen PMEIs zeigen auf Proteinebene schwache aber signifikante
Sequenzähnlichkeiten zur N-terminalen Pro-Domäne der so genannten Typ I PMEs(Micheli, 2001).
Diese schwachen aber signifikanten Sequenzhomologien sind für PMEI-RPs typisch.
Es lässt sich folgendes Szenario ableiten: Pektin Methylesterasen regulieren den Methylierungsgrad
des Pektinnetzwerkes. Dabei können unterschiedliche PME Isoformen unter der Regulation einer
autoinhibitorischen Domäne stehen, oder Zielproteine eines PMEI sein. Um diesen Sachverhalt
weiter aufzuklären wurde versucht, putative PMEs und PMEIs zu identifizieren und zu
charakterisieren, sowie eine Funktion der beteiligten Proteine während des
Pollenschlauchwachstums nachzuweisen.
88
6. Diskussion
6.1 Identifizierung von Typ I und Typ II PMEs aus Mais
Mittels Datenbankrecherchen (MaizeGDB) und MALDI bzw. ESI TOF MS Untersuchungen
wurden verschiedene pollenexprimierte Typ I und Typ II Pektin Methylesterasen identifiziert. Es
wurden zwei Typ I und zwei Typ II PMEs, die mit hoher Wahrscheinlichkeit in Maispollen
exprimiert werden, in unterschiedliche Expressionvektoren kloniert (5.4). Mit den daraus
resultierenden rekombinanten Proteinen sollten biochemische Eigenschaften aufgeklärt und für
weitere Untersuchungen Antiseren gewonnen werden. Es konnten mehrere PMEs identifiziert
werden, von denen mindestens vier in Maispollen transkribiert werden, zwei Typ I PMEs, PME1
und PME4, und zwei Typ II PMEs, PME2 und PME3. In Abbildung 5.1 ist ein Alignment der vier
putativen PMEs ohne Signalpeptid, die Typ I PMEs ohne Pro-Domäne, dargestellt. Die von den
Autoren Markovic und Janecek beschriebenen fünf für PMEs charakterischen Regionen sind gelb
unterlegt(Markovic & Janecek, 2004). Die zwei identifizierten Typ II PMEs aus Mais besitzen
keine typische Region 1 und die PME3 keine typische Region 2. Welche Auswirkungen diese
Abweichungen auf die biochemischen Eigenschaften der Proteine haben kann zu diesem Zeitpunkt
nicht abgeschätzt werden. Die Funktionen der ersten drei Segmente sind noch nicht aufgeklärt. Das
dritte Segment beinhaltet eine Asparaginsäure (Asp136), die am aktiven Zentrum beteiligt sein soll.
Es gibt auch PMEs bei denen diese Asparaginsäure durch Asparagin oder Alanin ersetzt ist. Im Fall
der Mais PME3 wurde Asp136 durch Histidin ersetzt. Das vierte Segment besitzt eine an der
Substratbindung beteiligte aromatische Aminosäure, Phenylalanin Phe160, und eine stark
konservierte Asparaginsäure Asp150, die im aktiven Zentrum liegt. Das fünfte Segment liefert zwei
weitere am aktiven Zentrum beteiligte stark konservierte Aminosäuren, Arginin Arg225 und
Tryptophan Trp224. Die Funktionen der ersten drei Regionen sind bis heute nicht identifiziert.
89
6. Diskussion
6.2 Transkripte der vier identifizierten Typ I und Typ II PMEs lassen sich in unterschiedlichen Maisgeweben nachweisen
Die Datenbanksequenzen der vier identifizierten Pektin Methylesterasen wurden fast ausschließlich
aus männlichen Blütenständen und Pollen gewonnen. Teilweise wurde auch ein cDNS-Mix aller
Maisgewebearten verwendet. Sollten sich die PMEs nur im Pollen nachweisen lassen, wäre dies ein
Indiz dafür, dass es sich bei den beschriebenen PMEs um Proteine handelt, die spezifische und
einzigartige Funktionen während der Pollenentwicklung haben können. Alle vier PMEs lassen sich
in Maispollen und in den Blättern nachweisen (5.5). Es wurden semi-quantitative RT-PCRs, in der
90
PME1 ------------------------------------------------------------PME4 ------------------------------------------------------------PME2 MAQRAVATMTTNKPLLLLALASALLGAAPAAANAPGGAFSNWVAMNQQSYALYAQKSVGD 60PME3 -------------MARPRLLLTFLLAAAAVLTTVPG-------------VALAKSKLAKK 34 Region 1PME1 ----------ASGNQPKPNAIVAKDGSGQFKSIQQAVDAVPKGHQGRYVIYVKAG-LYDE 49PME4 ---------QLPGFQ-RPNKVVAQDGSGDFKTITEAITAVPNTFEGRFVIYVKAG-TYKE 49PME2 GGKEPLDKKLSEAEKKKVTYVVDPSGKGDYTNITAALEDIPVSNTKRVILDLKPGAQFRE 120PME3 SDDVVNGPLLTEKIQAKKTLIVGPDE--EFKTVQSAIDAVPAGNAEWVIVHLRSG-LHRG 91 : : . :* . ::..: *: :* :: ::.* .
PME1 IVMVPKDKVNIFMYGDGPKQSRVTGRKSFADG------ITTMKTATFSVEASGFICKNMG 103PME4 YVTVPKNMANIFMYGDGPTQTVVTGDKSNAGG------FATFASATFSAEGNGFICKSMG 103PME2 KLFLNISKPFITFRSDPKKPAVVVWNDTAATNGKDGKPVGTVGSATLAVESDYFTAYGVV 180PME3 KVVIPENKPFIFVRGNGKGRTSISHESASSDN---------AESAAFTVNSDNVIVFGVS 142 : : . * . .: : : .: : . :*:::.:.. . .: Region 2 Region 3PME1 FHN-----TAGAERHQAVALRVQGDLAAFYNCRFDAFQDTLYVHARRQFFRNCVVSGTID 158PME4 FVN-----TAGPEGHQAVAMHVQGDKSVFYNCRFEGYQDTLYVHANRQFFRDCEVLGTVD 158PME2 FRNDAPLAKPGAKGGQAVAVRLFGTKTQIYNCTIDGGQDTLYDHKGLHYFKGCLIRGSVD 240PME3 FRNSARVGLVNDPEIRSVAAMVAGDKVAFYHCAFYSPHHTLFDSAGRHYYESCYIQGNID 202 * * . ::** : * :*:* : . :.**: :::..* : *.:* Region 4PME1 FIFGNSAAVFQNCLIITRRPMDNQQNSVTAHGRTDPNMKSGLVIQNCRLVPDQKLFPDRF 218PME4 FIFGNSAALFQNCLMTVRKPGDSQSNMVTAQGRTDPNMPTGIVLQGCRIVPEQALFPDRL 218PME2 FIFGFGRSFYEDCRIESVVKEVAVLTAQQRSKSIEGAIDTGFSFKNCSIGGVK------- 293PME3 FIFGSGQSIFQCPEIFVRPDRRTEIRGSITAQVRQEEDSSGFVFLKGKVYGVG------- 255 **** . :.:: : : :*: : : Region 5PME1 KIPSYLGRPWKEFSRLVIMESTIADFVKPEGYMPWNGDFALKT-LYYAEYNNRGPGAGTS 277PME4 QIATYLGRPWKEYARTVVMESTIGDLIRPEGWAEWMGDLGLKT-LYYAEYANTGPGAGTS 277PME2 GGQIYLGRAWGDSSRVVYSYTKMGEEVVPVGWDGWQIAKPESSGIYYGEFKCFGPGADAK 353PME3 --EVYLGRVTAPDSRVIFADTYLSKTIHPAGWTTIGYSGSTDK-VTLAEFNCTGPGADVT 312 **** :* : : :.. : * *: .. : .*: ****...
PME1 KRVNWPGFHVIGRKEAEPFTAGPFIDGAMWLKYTGAPHILGFKF- 321PME4 KRVNWPGYHVIGQADATAFTAGAFIDGASWLQSTGTPNVMGFTKG 322PME2 KKKRVGWALDLTEAQAKPFVGTHYVLGDTWIQPPPK--------- 389PME3 NR--VPWSRRFSPDDAAKYLTIDFINGKDWLPAYYY--------- 346 :: : :* : :: * *:
Abbildung 6.1Vergleich der vier Mais PME DomänenDargestellt sind die PME-Domänen der vier Mais Pektin Methylesterasen mit den von Marcovic et al. beschriebenen fünf PME-Regionen (gelb unterlegt)(Markovic & Janecek, 2004).
* identische AS; : konservierte Substitution; . semi-konservierte Substitution
6. Diskussion
Aktin als interner Standard diente, durchgeführt. Im Samen lässt sich nur die Typ I PME1 und in
der Wurzel die Typ II PME2 nachweisen. Im Vergleich zum Pollen sind die beschriebenen Pektin
Methylesterasen Transkriptmengen in den anderen Pflanzengeweben geringer bzw. nicht
vorhanden. Die hohen Transkriptmengen in Pollen lassen sich durch das schnelle direktionale
Wachstum erklären. Eine der Hauptkomponenten der Pollenschlauchwand ist Pektin und die Spitze
des Pollenschlauchscheitels besteht aus nur einer Pektinschicht(Ferguson et al., 1998). Um eine
schnelle und gerichtete Zellwandsynthese während des Pollenschlauchwachstums zu ermöglichen,
werden an der Pollenschlauchspitze viel Pektin und pektinmodifizierende Enzyme, wie z.B. PMEs,
die sich durch unterschiedliche Aktivitäten und Regulationsmechanismen auszeichnen können,
benötigt. Da in den ESI und MALDI TOF MS Untersuchungen nur eine PME nachgewiesen
werden konnte, liegt es nahe, dass es während der Translation zu einer Regulation der Proteinmenge
kommt.
6.3 In Pollenproben kann nur eine PME Aktivitätsbande und nur eine Typ II PME nachgewiesen werden
Neben den durch die Datenbankrecherchen erhaltenen PMEs wurden zur weiteren Identifizierung
von PMEs MALDI und ESI TOF MS Untersuchungen von Maispollenproben durchgeführt. Die
Maispollenproben wurden mit Hilfe Isoelektrischer Fokussierung aufgetrennt (5.3.1ff). Mittels
eines PME Aktivitätstests wurden die Bereiche im Gel markiert, die PME Aktivität aufweisen.
Festzuhalten ist, dass nur eine PME Aktivitätsbande in den Pollenproben nachgewiesen werden
konnte. Die Proteine banden bei einem pI von ~10. Die Proteine in dieser Bande sind durch den
basischen pI vermutlich relativ stark an die Zellwand gebunden. In Maiskeimlingen lässt sich noch
eine weitere Aktivitätsbande mit einem pH von ~9 nachweisen. Nach Auswertung der MALDI und
ESI TOF MS Daten wurden zwei PME Fragmente identifiziert. Durch Datenbankabgleiche konnten
diese zwei Fragmente einer PME zugeordnet werden. Bei der nachgewiesenen PME handelt es sich
um die bereits durch Datenbankrecherchen identifizierten Typ II PME2. Die identifizierte PME2
wird im Pollen exprimiert und könnte die gemessene PME Aktivität verursachen. Es kann jedoch
nicht ausgeschlossen werden, dass weitere Pektin Methylesterasen im Maispollen und in der
untersuchten Probe vorliegen, diese aber aufgrund von unterschiedlichen Aktivitäten und
Proteinmengen nicht durch ESI und MALDI TOF MS Untersuchungen nachgewiesen werden
konnten. Andere PMEs könnten auf Proteinebene kaum vorhanden sein und daher mittels MS
Untersuchungen schlecht nachweisbar sein. Ihre Aktivität könnte, trotz einer geringeren
91
6. Diskussion
Proteinmenge, über der von stärker exprimierten PME Proteinen liegen. Die Transkriptmengen der
PMEs im Pollen erscheinen relativ gleich. Nur die PME2 konnte als Protein nachgewiesen werden.
Es scheint sich, unter den gegebenen Versuchsbedingungen, bei der Typ II PME2 um die
vorherrschende translatierte Isoform im Maispollen zu handeln.
6.4 Die klonierten PMEs lassen sich weder in den verwendeten bakteriellen Systemen noch im eukaryontischen Pichia pastoris System zur Expression bringen
Nach Identifizierung und Klonierung unterschiedlicher PMEs und PME Teilfragmenten in
bakterielle und eukaryotische Expressionsvektoren wurden verschiedene Kulturbedingungen für die
Expression ausgetestet. Die Vektoren wurden kontrollsequenziert und die Sequenz auf das
Vorhandensein von seltenen Basentripletts untersucht. In einer Forschungsarbeiten wird darauf
hingewiesen, dass es schwierig sein kann, PMEs in bakteriellen Expressionssystemen zu
exprimieren und das die Expression in eukaryontischen Systemen häufiger zum Erfolg führt(Peng
et al., 2005). Die Arbeitsgruppe von Turley, Rickie B. et al. (2006, Posterpräsentation) berichten
von Schwierigkeiten PMEs aus Baumwollfasern im Pichia pastoris System zur Expression zu
bringen und dass dies auch für eine von ihnen identifizierten PMEI gilt. Bisher konnte erst eine
pflanzliche PME aus Feigen, Ficus awkeotsang, mit Hilfe des eukaryotischen Pichia pastoris
Systems rekombinant und aktiv zur Expression gebracht werden(Peng et al., 2005). Ansonsten
wurden noch Erwinia chrysanthemi PMEs rekombinant in Escherichia coli und Bacillus subtilis zur
Expression gebracht(Heikinheimo et al., 1991; Shevchik et al., 1996). Die Expression in Pichia
pastoris hat den Vorteil, dass es zur Glykosilierung des Proteins kommt und dadurch die Stabilität
und biochemischen Eigenschaften den nativen glykosilierten Pflanzenproteinen näher kommen als
dies mit bakteriellen Systemen möglich ist. Sebastian Wolf beschreibt in seiner Diplomarbeit
(2005), dass die Versuche PMEs aus Arabidopsis thaliana rekombinant in Bakterien zur Expression
zu bringen scheiterten, die Expression in Pichia jedoch zu rekombinanten Protein, dass enzymatisch
inaktiv ist, führt.
Es ist anzunehmen, dass für die erfolgreiche Expression bestimmter PMEs spezifische
Glykosilierungen oder zusätzliche Faktoren, die für eine korrekte Modifizierung bzw. Faltung
benötigt werden, vorhanden sein müssen. Bisher wurden von zwei PMEs die Struktur aufgeklärt
und miteinander verglichen. Die zwei beschriebenen PME Strukturen sind relativ ähnlich
aufgebaut(Di Matteo et al., 2005; Hothorn et al., 2004b; Johansson et al., 2002; Markovic et al.,
92
6. Diskussion
2002).
In Abbildung 6.2 sind die Aminosäuresequenzen von unterschiedlichen Typ I PMEs, ZmPME1 und
ZmPME4 aus Mais, NtPPME1 aus Tabak, VANGUARD1 aus Arabidopsis und LePME aus Tomate
gegenübergestellt. Wichtige Sequenzabschnitte sind farblich hervorgehoben. Die vier konservierten
Cysteine der Pro-Domäne sind rot, das putative Prozessierungsmotiv R(R/K)L(L/M) blau und
Aminosäuren, die im Reaktionszentrum liegen, sind grün unterlegt. Interessanterweise besitzen
manche Typ I PMEs das vier Aminosäuren lange Prozessierungsmotiv mehrmals. Vermutlich soll
dadurch die Prozessierung der Pro-Proteine sichergestellt werden. Trotz der Sequenzähnlichkeiten
kann nicht ausgeschlossen werden, dass manche PMEs Besonderheiten in ihrer Struktur aufweisen.
Diese könnten in anderen Systemen während der Expression zu Problemen führen. Die fünf PME
Regionen sind über den Sequenzen markiert(Markovic & Janecek, 2004).
93
6. Diskussion
94
ZmPME1 MAKALLGGLSAILVVAVVVGVVA--TVTRSGKKAGDNFTVPGEASLATSGKSVKSLCAPTLYKESCEKTL 68ZmPME4 MANRVTVASVIAAVGIVAVIGTMAAVTSA-----------DDNDGNMLSSVKVSTVCAFTRYPEKCEQSL 59NtPPME1 MANKKVVIGGIASILVVACVVA-------ACVTLTKNDETSSSGQVTTSTKSVKAMCQPTPYKQTCEKTL 63VGD1 MIGKVVVSVASILLIVGVAIGVVA------------YINKNGDANLSPQMKAVRGICEATSDKASCVKTL 58LePME MANPQQPLLIKTHKQNPIISFKILSFVITLFVALFLVAP-------YQVEIKHSNLCKTAQDSQLCLSYV 63 :* : * . : ZmPME1 SQATN--GTENPKEVFHSVAKVALESVQTAVEQSKSIGEAK--ASDSMTESAREDCKKLLEDAADDLRG- 134ZmPME4 KHVVS--DTSSPEDVFRDALNVALDEVSTAFQRSAHIGKD---AQDKLSRNAMDVCKKLLDDATEDLRG- 124NtPPME1 SSAKN--ASE-PKDFIKVAFEATVTDIRNAIMNTDLIMQA---ASDPKTKDALHACEELFDLAIEDLRTS 127VGD1 EPVK----SDDPNKLIKAFMLATRDAITQSSNFTGKTEGNLGSGISPNNKAVLDYCKKVFMYALEDLST- 124LePME SDLISNEIVTTESDGHSILMKFLVNYVHQMNNAIPVVRKMKNQINDIRQHGALTDCLELLDQSVDFASDS 133 . .. : . . . * ::: : : ZmPME1 MLEMAGGDIKVLFSRSDDLETWLTGVMTFMDTCVDGFV-DEK--LKADMHSVLRNATELSSNALAITNSL 202ZmPME4 MARLKPAD---LVRHVKDLRVWVSGVMTYVYTCADGFE-KPE--LKEAMDKMLQNSTELSSNALAILTRL 189NtPPME1 VSKLESFDLTKIKDIVDDLKTWLSAVVAYEETCLDAFE-KTDGDTGEKMVKLLNTTRELSINGLAMVNSF 196VGD1 IVEEMGEDLNQIGSKIDQLKQWLTGVYNYQTDCLDDIE-EDD--LRKTIGEGIASSKILTSNAIDIFHTV 192LePME IAAIDKRS----RSEHANAQSWLSGVLTNHVTCLDELDSFTKAMINGTNLEELISRAKVALAMLASLTTQ 199 : . : . *::.* * * : . . : . :: : ZmPME1 GGILKKMDLGMFS-------------------------------------------KDSRRRLLSSEQDE 227ZmPME4 GELLPQEAKALNATLPGAGHGRRLLGWQMGEAEEVTSGGRGLPAVNDKQLGEIADVANANRKLLSDHAAL 257NtPPME1 GEMITQTTG-------------------------------------------------LSRKLLTTDE-- 215VGD1 VSAMAKLNLKVEDFKNMTG--------GIFAPSDKGAAPVNKGTPPVADDSPVADPDGPARRLLEDIDET 252LePME DEDVFMTVLG------------------------------------------------------------ 209 : ZmPME1 KG--------------------------WPVWMRSPERKLLASGNQ--------PKPNAIVAKDGSGQFK 263ZmPME4 RGRGVLTTGLVGTFDEIQYGRSGVPPSDFPKWMPASQRRLLQLPGF--------QRPNKVVAQDGSGDFK 319NtPPME1 -----------------------------SSFVEASNRKLLQISN---------AKPNAVVAQDGSGQYK 247VGD1 G---------------------------IPTWVSGADRKLMTKAGRGSNDGGARIRATFVVAKDGSGQFK 243LePME ---------------------------KMPSWVSSMDRKLMESSGKD-------IIANAVVAQDGTGDYQ 245 . :: . :*:*: . .. :**:**:*::: Region 1 ZmPME1 SIQQAVDAVPKGHQGRYVIYVKAGLYDEIVMVPKDKVNIFMYGDGPKQSRVTGRKSFAD-GI-TTMKTAT 331ZmPME4 TITEAITAVPNTFEGRFVIYVKAGTYKEYVTVPKNMANIFMYGDGPTQTVVTGDKSNAG-GF-ATFASAT 387NtPPME1 TITDALKAVPKKNTEPFVILIKAGIYKEYVEVEKGMTNVVFIGEGSTKTKITGNKSVKGPGIGSTWHTCT 317VGD1 TVQQAVNACPEKNPGRCIIHIKAGIYREQVIIPKKKNNIFMFGDGARKTVISYNRSVKLSPGTTTSLSGT 365LePME TLAEAVAAAPDKSKTRYVIYVKRGTYKENVEVASNKMNLMIVGDGMYATTITG--SLNVVDGSTTFRSAT 313 :: :*: * *. :* :* * * * * : . *:.: *:* : :: * :* : * Region 2 Region 3 ZmPME1 FSVEASGFICKNMGFHNTAGAERHQAVALRVQGDLAAFYNCRFDAFQDTLYVHARRQFFRNCVVSGTIDF 401ZmPME4 FSAEGNGFICKSMGFVNTAGPEGHQAVAMHVQGDKSVFYNCRFEGYQDTLYVHANRQFFRDCEVLGTVDF 457NtPPME1 VGVSGEGFVARDIGFENTAGPAQEQAVALRVNADKAVIYNCKIDGYQDTLYAHSGRQFYRDCIISGTIDF 387VGD1 VQVESEGFMAKWIGFKNTAGPMGHQAVAIRVNGDRAVIFNCRFDGYQDTLYVNNGRQFYRNIVVSGTVDF 435LePME LAAVGQGFILQDICIQNTAGPAKDQAVALRVGADMSVINRCRIDAYQDTLYAHSQRQFYRDSYVTGTVDF 383 . . ..**: : : : ****. .****::* .* :.: .*:::.:*****.: ***:*: : **:** Region 4 Region 5ZmPME1 IFGNSAAVFQNCLIITRRPMDNQQNSVTAHG-RTDPNMKSGLVIQNCRLVPDQKLFPDRFKIPSYLGRPW 470ZmPME4 IFGNSAALFQNCLMTVRKPGDSQSNMVTAQG-RTDPNMPTGIVLQGCRIVPEQALFPDRLQIATYLGRPW 526NtPPME1 VFGDAAAVFQNCKLIVRRPGDGQNCMVTAQG-RTTSASKGAFVIQNCEIKAEPEFLAAKPQMKAFLGRPW 456VGD1 IFGKSATVIQNSLIVVRKGNKGQFNTVTADGNEKGLAMKIGIVLQNCRIVPDKKLAAERLIVESYLGRPW 505LePME IFGNAAVVFQKCQLVARKPGKYQQNMVTAQG-RTDPNQATGTSIQFCNIIASSDLEPVLKEFPTYLGRPW 452 :**.:*.::*:. : .*: . * ***.* .. . :* *.: .. : . . ::***** ZmPME1 KEFSRLVIMESTIADFVKPEGYMPWNG-DFALKTLYYAEYNNRGPGAGTSKRVN-WPGFHV-IGRKEAEP 537ZmPME4 KEYARTVVMESTIGDLIRPEGWAEWMG-DLGLKTLYYAEYANTGPGAGTSKRVN-WPGYHV-IGQADATA 533NtPPME1 KEYSRTIIMQSFIDGFIDPSGWAPWNITDFGIHTCWYAEYQNRGAGASLDKRVSHWRGYQRGISGDVANS 466VGD1 KKFSTTVIINSEIGDVIRPEGWKIWDG-ESFHKSCRYVEYNNRGPGAITNRRVN-WVKIAR--SAAEVND 511LePME KEYSRTVVMESYLGGLINPAGWAEWDG-DFALKTLYYGEFMNNGPGAGTSKRVK-WPGYHVITDPAKAMP 460 *::: ::::* : ..: * *: * : :: * *: * *.** .:**. * . . ZmPME1 FTAGPFIDG--AMWLKYTGAPHILGFKF- 563ZmPME4 FTAGAFIDG--ASWLQSTGTPNVMGFTKG 620NtPPME1 FTAGVFINPTDNSFLPKADIPYEAGMMKV 555VGD1 FTVANWLGP--INWIQEANVPVTLGL--- 595LePME FTVAKLIQG--GSWLRSTGVAYVDGLYD- 546 **.. : :: :. . *:
6. Diskussion
6.5 Die Typ I PMEs besitzen eine Invertase- und PME-Inhibitoren homologe N-terminale Pro-Domäne
Ein Charakteristika der Typ I PMEs ist das Vorhandensein einer so genannten Pro-Domäne. Dieser
Bereich weist starke Homologien mit den bisher beschriebenen Invertase- und Pektin
Methylesterase Inhibitoren sowie den PMEI-verwandten Proteinen auf(Hothorn et al., 2004b;
Rausch & Greiner, 2004). Die Funktionen dieser Pro-Domänen sind noch nicht vollständig
aufgeklärt. Es wurden mehrere biologische Aufgaben postuliert: Chaperon-, Inhibitor- und
„Targeting“-Funktionen(Micheli, 2001). Sebastian Wolf konnte in seiner Diplomarbeit (2005)
zeigen, dass die Pro-Domäne einer Arabidopsis thaliana PME in der Lage ist, PMEs
unterschiedlicher Herkunft zu inhibieren. Bosch et al. (2005, 2006) konnten ebenfalls zeigen, dass
die Pro-Domäne der Tabak NtPPME1 autoinhibitorisch auf die Kerndomäne wirkt. Zusätzlich
konnten sie nachweisen, dass die Pro-Domäne der NtPPME1 auch als Adressat für die Lokalisation
benötigt wird. Die Pro-Domäne kann also mehrere Funktionen ausüben. Eine Funktion als
Chaperon konnte jedoch noch nicht nachgewiesen werden.
In Arabidopsis thaliana können 66 PME Gene nachgewiesen werden. Von diesen gehören 43 zu
den Typ I PMEs und 23 zu den Typ II PMEs. Bisher wurde postuliert, dass Typ I PMEs im
Vergleich zu Typ II PMEs nur zwei bis drei Introns und eine lange Pro-Domäne besitzen und das
die Typ II PMEs fünf bis sechs Introns und nur eine kurze bzw. keine Pro-Domäne
aufweisen(Micheli, 2001). Im Zellwandraum lassen sich nur Typ I PMEs ohne Pro-Domäne
nachweisen(Bordenave et al., 1996; Bordenave & Goldberg, 1993; Markovic & Jornvall, 1986).
Durch Vergleiche der AS-Sequenzen unterschiedlicher Zellwand extrahierter PMEs mit den AS-
Sequenzen der offenen Leseraster wurde postuliert, dass die AS-Sequenz R(R/K)L(L/M) als
Prozessierungsmotiv dient(Bordenave et al., 1996). Dieses ist dem Prozessierungsmotiv RRKRR,
dass in manchen tierischen intramolekularen Chaperonen vorkommt, sehr ähnlich(Seidah &
Chretien, 1994). Von den 43 Typ I PMEs besitzen 30 ein putatives Prozessierungsmotiv. Von
95
Abbildung 6.2„ClustalW“ Vergleich unterschiedlicher Typ I Pektin MethylesterasenDie Signalpeptide sind in grün und die vier konservierten Cysteine sind in rot dargestellt. Die putativen Prozessierungsmotive sind blau und im aktiven Zentrum liegende Aminosäuren sind grün unterlegt. * identische AS; : konservierte Substitution; . semi-konservierte Substitution
6. Diskussion
diesen weisen 8 zwei putative R(R/K)L(L/M) Motive auf. Bei den restlichen 13 Typ I PMEs lassen
sich keine putativen Prozessierungsmotive nachweisen. Die Typ I PMEs ohne erkennbares Motiv
besitzen desweiteren keine eindeutige PMEI-Domäne. Manche Typ I PMEs besitzen zwei, im Falle
von At3g14300 sogar drei aufeinanderfolgende PMEI-Domänen. Von den identifizierten Mais
PMEs besitzt die PME4 drei und die PME1 zwei putative Prozessierungsmotive. Warum manche
Arabidopsis PMEs mehrere PMEI- Domänen und/bzw. Prozessierungsmotive aufweisen ist nicht
bekannt. Möglicherweise sollen sie eine Prozessierung der betreffenden Proteine sicherstellen. Das
vorhandensein von mehreren PMEI-Domänen könnte man durch unterschiedliche Funktionen der
einzelnen Regionen erklären. Sie könnten für das “Targeting”, Komplexbildung während der
Sekretion, zuverlässigen Inhibition der PME-Domäne oder als Chaperon in Frage kommen.
Desweiteren ist nicht geklärt, welche Funktionen die PMEI-verwandten Domänen der als Typ I
PME klassifizierten Proteine, die kein R(R/K)L(L/M) Motiv aufweisen, haben. In Abbildung 6.3 ist
ein Alignment der vier Mais PMEI-RPs, den zwei Arabidopsis PMEIs, der Kiwi PMEI und dem
Tabak Invertase Inhibitor NtCIF dargestellt. Hothorn et al. versuchten anhand von
Sequenzcharakteristika der bekannten Inhibitoren Unterschiede in Invertase- und PME-Inhibitoren
aufzuzeigen und damit eine Klassifizierung von Kandidatenproteinen zu ermöglichen(Hothorn et
al., 2004b). In Abbildung 6.3 sind den AS-Sequenzen Sekundärstrukturen, wie von den Autoren
beschrieben, zugeordnet worden. In ihren Untersuchungen kommen sie zu dem Schluß, dass die N-
terminale Extension, die α1-Schlaufe, für die Bindung und Interaktion von PMEs kritisch ist.
Neuere Untersuchungen von Di Mateo et al. weisen jedoch darauf hin, dass bei AtPMEI1 die N-
terminale Extension vom Proteinkomplex wegweist und scheinbar keinen Kontakt mit dem
Zielenzym besitzt. Durch Proteinchimären zwischen dem NtCIF-Proteinkern und der N-terminalen
Extension von AtPMEI1 konnte zusätzlich gezeigt werden, dass im Proteinkern ebenfalls wichtige
Binde und Interaktionsmotive liegen müssen bzw. können(Di Matteo et al., 2005).
96
6. Diskussion
97
Abbildung 6.3Sequenzvergleich unterschiedlicher PMEI-RPsDargestellt sind Arabidopsis thaliana AtPMEI1 und AtPMEI2, Actinidia chinensis AcPMEI, Nicotiana tobaccum NtCIF und die vier Zea mays PMEI-RPs. Die vier konservierten Cysteine sind rot unterlegt. Der Bereich, der die N-terminale Domäne mit dem Proteinkern verbindet ist grau unterlegt. Weitere an der Bindung zwischen Proteinkern und N-terminaler Extension beteiligte Bereiche sind grün unterleg (nach Hothorn et al.,2004 und Di Matteo et al.,2005). Signalpeptide sind in grün dargestellt. Über den Sequenzen sind nach Hothorn et al. die entsprechenden Untereinheiten dargestellt (α1 bis α7; α3 vermutlich nur bei Invertase Inhibitoren)
α1 ----- α2AtPMEI1 MAANLRNNAFLSSLMFLLLIGSSYA-------------ITSSEMSTICDKTLNPSFCLKF 47AtPMEI2 MAAYLTNRVLMSSLMFFVMTGSLNA--------------QVADIKAICGKAKNQSFCTSY 46AcPMEI ---------------------------------------ENHLISEICPKTRNPSLCLQA 21ZmPMEI-RP1 MAGARALLIVLAAAVAVLA------------ARPASAGGGAAAVAEICMKTPSPDLCTRT 48ZmPMEI-RP2 MAGTRALYLLVAAVAALLATPAAVDA---------------ATLAEICRGTAFPDICTST 45ZmPMEI-RP3 MGQAS-RLVLLAVVALLSAGLLPQALG-KGRGGRGHGGAVNPQVAGICSRTPFPEVCTST 58ZmPMEI-RP4 MGQAYPRLVLLALVALLSAGLFPQALG-NGKGKVHGGGAVNPLVAGICSRAPFPEVCTAT 59NtCIF MKNLIFLTMFLTILLQTNA---------------------NNLVETTCKNTPNYQLCLKT 39 .: ** : ..*
(α3)- α4 ---- α5 AtPMEI1 L---NTKFASPNLQALAKTTLDSTQARATQTLKKLQSIIDGGVDPRSKLAYRSCVDEYES 104AtPMEI2 MK-SNPKTSGADLQTLANITFGSAQTSASEGFRKIQSLVKTATNPTMKKAYTSCVQHYKS 105AcPMEI LE-SDPRSASKDLKGLGQFSIDIAQASAKQTSKIIASLTNQATDPKLKGRYETCSENYAD 80ZmPMEI-RP1 AGKHANKYKVVDAVTVLEMQVDAFKKRVKAARRLAKEEVKTAATPEARRALNLCKTYYLD 108ZmPMEI-RP2 VGSEAQSAGVLDAMAVLRMQVDAFNKRTEAARAHVKEAAVTAS-PKARTVLDLCNNLYLD 104ZmPMEI-RP3 AGRHASKYPVIDNLAVLNMQVDAFAKRTAQARKHVARSARTIP-PQQTQALTFCDTMYMN 117ZmPMEI-RP4 AGRHASKYPVIDNLAVLNMQVAAFAKRTAQARKHVAVAARTIP-PPQAQALRTCDTMYMN 118NtCIF LL-SDKRSATGDITTLALIMVDAIKAKANQAAVTISKLRHSNPPAAWKGPLKNCAFSYKV 98 : : . . . * * * . -- α6 ------ α7 AtPMEI1 AIGNLEEAFEHLASGDGMGMNMKVSAALDGADTCLDDVKRLRSVDSSVVNNSKTIKNLCG 164AtPMEI2 AISSLNDAKQSLASGDGKGLNIKVSAAMEGPSTCEQDMADFK-VDPSAVKNSGDFQNICG 164AcPMEI AIDSLGQAKQFLTSGDYNSLNIYASAAFDGAGTCEDSFEGPPNIPTQLHQADLKLEDLCD 140ZmPMEI-RP1 AADNLGACKRAIGFRDAVTIRATMSMVAQDTQNCDEEFRKAV-SKNPMEDHNRSLIEMSE 167ZmPMEI-RP2 VEDNLGACRRAIGFKDAVTIRATMGMAAQDMQNCDEQFRQIG-EKNPMEQFDASLVEMSE 163ZmPMEI-RP3 TQDTIGAAQRAITFKDTGTAKIMLQLAVQDFDSCDRPFTQAG-VPNPMGKFDKELNQMAN 176ZmPMEI-RP4 TQDAIGAAQRAIAFKDTGTAKIMLQLAVQDFDSCDRPFTHAG-VPNPMGKFDKELSQMAN 177NtCIF ILTASLPEAIEALTKGDPKFAEDGMVGSSGDAQECEEYFKGSK---SPFSALNIAVHELS 155 . . : . . : * . . :. .* . . . : ::. AtPMEI1 IALVISNMLPRN--- 176AtPMEI2 IVLVISNMM------ 173AcPMEI IVLVISNLLPGS--- 152ZmPMEI-RP1 ICRTLSNMIPYEHVH 182ZmPMEI-RP2 NCRSLSNMI------ 172ZmPMEI-RP3 NCMALANMI------ 185ZmPMEI-RP4 NCMTLANMI------ 186NtCIF DVGRAIVRNLL----- 166 ::*::
6. Diskussion
6.6 Mit Mais PMEI-RPs lassen sich weder Invertase- noch Pektin Methylesterase-Aktivitäten inhibieren
Die vier putativen Mais PMEIs, PMEI-verwandte Proteine im folgenden genannt, weisen ähnliche
Sequenzmotive wie Invertaseinhibitoren auf. Eine Einteilung in Invertase- bzw. PME- Inhibitoren
anhand von Sequenzmerkmalen ist somit bis zum heutigen Zeitpunkt nicht möglich (s.o.). Die
biologische Funktion muss folglich durch biochemische Charakterisierungen der putativen PME-
bzw. Invertase Inhibitoren nachgewiesen werden. Ein besonderes Merkmal von beiden
Inhibitorengruppen ist das Vorhandensein von vier Cysteinen, die an der Ausbildung von zwei
essentiellen Disulfidbindungen beteiligt sind(Rausch & Greiner, 2004). Die rekombinanten Proteine
wurden nach ihrer Aufreinigung auf das Vorhandensein von Disulfidbindungen und ihre
inhibitorischen Eigenschaften getestet. Es wurden verschiedene Invertase- und PME-, sowie ß1,3-
Glucanase- und Inulase Proben auf eine inhibitorische Wirkung der vier putativen Inhibitoren
untersucht. Um einen möglichen Interaktionspartner nachzuweisen wurden Proben aus Pollen,
gekeimten Pollen, Narbengewebe und Samenanlagen gewonnen. In keinem der durchgeführten
Experimenten ließ sich mit den rekombinanten PMEI-RPs eine Inhibiton bzw. Aktivierung der
Enzymproben nachweisen. In Arabidopsis thaliana konnte Sebastian Wolf (persönliche Mitteilung)
ebenfalls PMEI-RPs nachweisen, die anscheinend weder PMEs noch Invertasen zu hemmen
scheinen. Möglicherweise fehlen den rekombinant exprimierten Proteinen wichtige Modifikationen,
die für ihre Funktion wichtig sind. In silica Untersuchungen auf Glykosilierungs- und andere
modifizierbaren Stellen zeigen, dass es vermutlich keine Modifizierungen gibt. Mittels einer Lektin
Chromatographie wird das Fehlen von Glykosilierungen der nativen PMEI-RPs bestätigt. Mit Hilfe
einer Sephadex G100 Fine LC und einer Superdex 200 FPLC Auftrennung konnten Fraktionen mit
den nativen PMEI-RPs, sowie den Zielenzymen erhalten werden. In keiner der Durchführungen
konnte eine Bindung der PMEI-RPs an andere Proteine beobachtet werden. Auch mit den nativen
PMEI-RPs ließ sich die biologische Funktion nicht identifizieren. Festzuhalten ist, dass die
verwendeten Enzymproben mehrere PMEs, Invertasen, PMEI-RPs und weitere Proteine enthalten;
eine Inhibition könnte aufgrund enzymatisch aktiverer bzw. stärker exprimierter PMEs im
Hintergrund untergehen. Gestützt wird dies durch die dosisabhängige Inhibition bzw. Aktivierung
von FPLC Proben. In einer einzigen Versuchsdurchführung konnte mit den nativen PMEI-RP
Fraktionen eine dosisabhängige Inhibition der PME Aktivität nachgewiesen werden. Das
Experiment wurde am gleichen und am folgenden Tag mit den Fraktionen insgesamt dreimal
reproduziert. Drei Tage später konnte jedoch unter identischen Versuchsbedingungen eine
98
6. Diskussion
dosisabhängige Aktivierung der PME-Aktivität nachgewiesen werden. Da dieses Phänomen nur mit
Proben einer einzelnen chromatographischen Auftrennung reproduziert werden konnte, wurde es als
Kuriosum akzeptiert.
Durch die semiquantitative RT-PCR sowie die MALDI und ESI TOF MS Untersuchungen wird
angenommen, dass im Maispollen die Typ II PME2 eine stark transkribierte und translatierte Pektin
Methylesterase Isoform ist. Eine in vivo-Inhibition der PME2 durch die vier putativen PMEI-RPs
erscheint aufgrund der fehlenden in vitro Hemmung als unwahrscheinlich.
6.7 Es konnten keine Interaktions/Bindepartner der vier PMEI-RPs nachgewiesen werden
Die bisher in der Literatur am Zuckerstoffwechsel beteiligten beschriebenen Inhibitoren, bilden
unter physiologischen Bedingungen meist einen stabilen 1:1 Komplex, der sich durch
unterschiedliche Methoden nachweisen lässt(Di Matteo et al., 2005; Hothorn et al., 2004b; York et
al., 2004). Es wurden mehrere Verfahren zum Nachweis von PMEI-RP-Protein-Komplexen
herangezogen und versucht einen Interaktionspartner zu identifizieren. Zu den verwendeten
Methoden gehören Co-Immunopräzipitation mit Anti-PMEI-RP1 und Anti-PMEI-RP3 Antikörpern,
„Far-Western Blot“ (PMEI-RP „Overlay“), Quervernetzungen mit unterschiedlichen
„Crosslinkern“, Lektin Chromatographie und verschiedene Gelfiltrationssäulen (s.o.). Durch
Gelfiltrationen konnte für Invertasen, Petkin Methylesterasen und Glucanasen gezeigt werden, dass
die Inhibitoren zusammen mit den Zielproteinen eluieren. Zusätzlich konnten je nach Protein auch
Dimere und Monomere nachgewiesen werden. Um sicherzustellen, dass alle möglichen
Interaktionspartner identifiziert werden können, wurden Proben aus Pollensäcken, Pollen,
Narbengewebe und den Samenanlagen verwendet. In keinem der durchgeführten Experimenten
konnte eine Interaktion mit anderen Proteinen nachgewiesen werden. Möglicherweise werden für
die spezifischen Proteininteraktionen bestimmte Voraussetzungen benötigt, die nur in Vivo
anzutreffen sind. Diese Theorie wird jedoch durch die Quervernetzungen mit „Crosslinkern“
geschwächt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass durch das Quervernetzen die
Antikörperbindungsstellen maskiert wurden und sich deshalb nicht nachweisen lassen. Obwohl vier
unterschiedliche PMEI-RPs untersucht wurden, konnte für keinen der vier putativen Inhibitoren ein
Bindepartner nachgewiesen werden.
99
6. Diskussion
6.8 PMEI-RP1 und PMEI-RP3 werden in die Zellwand sekretiert und lokalisieren an der Pollenschlauchspitze
Die Versuche, Mais PMEI-RPs biochemisch zu charakterisieren und ihnen so eine spezifische
Funktion zuzuweisen, verliefen ergebnislos. Aus diesem Grund wurden die kodierenden PMEI-RP
Sequenzen vollständig mit Signalpeptid in den Vektor pHD32::YFP kloniert. Dieser Vektor besitzt
den Promotor pLAT52, der im Vergleich zum CaMV35 Promotor, in Pollen aktiv ist und für die C-
terminale Fusion ein gelb fluoreszierendes Reporterprotein. Mit Hilfe der so erhaltenen Vektoren
sollten die Kandidatengene und deren Proteinfunktionen im Mais- bzw. Tabakpollen zellbiologisch
charakterisiert werden. Die Ergebnisse wurden aufgrund zahlreicher Probleme mit dem
Maispollensystem ausschließlich durch das heterologe Tabakpollensystem erhalten. Für die
PMEI-RP1 und PMEI-RP3 YFP Fusionsproteine konnte die Sekretion in den Zellwandraum
dokumentiert werden. Dies bestätigt die in Silica Vorhersage, dass es sich bei den
Kandidatenproteinen um zellwandlokalisierte Proteine handelt. Die Lokalisationen von PMEI-RP1
und PMEI-RP3 sind sehr ähnlich. PMEI-RP1 bildet im Vergleich zu PMEI-RP3 weniger ~ 0,5µm
große Partikel im Pollenschlauchlumen. PMEI-RP1::YFP lässt sich in der Zellwand des
Pollenschlauches und an der Membraninnenseite der Pollenschlauchspitze nachweisen (Abb. 5.22).
Teilweise lässt sich auch eine Querbänderung in der Zellwand nachweisen (Abb. 5.21). Ein
Phänotyp konnte nicht beobachtet werden. Die Pollen sind in ihrer Morphologie und im
Längenwachstum mit wildtyp Pollen vergleichbar. Auch mit den PMEI-RP3::YFP Fusionsprotein
lässt sich im Tabakpollen kein Phänotyp nachweisen. Bei transient transformierten Tabakpollen
lassen sich jedoch ungefähr 0,5µm große Partikel nachweisen. Entweder handelt es sich um
unspezifische PMEI-RP3::YFP Aggregate oder aber um Kompartimente in denen das
Fusionsprotein mit möglicherweise anderen Proteinen zwischengelagert ist. Für Vesikel (50-
100nm) sind diese ~500nm Partikel zu groß. Da PMEI-RP3 und PMEI-RP4 in ihrer AS-Sequenz
sehr ähnlich sind (76% Homologie) und PMEI-RP4 aufgrund der abgelaufenen Promotionszeit
nicht mehr zellbiologisch untersucht werden konnte, werden die Ergebnisse für PMEI-RP3 auf
PMEI-RP4 übertragen.
100
6. Diskussion
6.9 PMEI-RP2 lokalisiert im heterologen Tabakpollensystem im sekretorischen Weg, lässt sich aber nicht in der Zellwand bzw. an der Pollenschlauchspitze nachweisen
Im Vergleich zu den transient transformierten PMEI-RP1 und PMEI-RP2 Reporterfusionsproteinen
lässt sich bei den PMEI-RP2::YFP Transformanten ein phänotyp beobachten. Transient
transformierter Tabakpollen ist in seiner Fähigkeit auszukeimen bzw. zu wachsen stark
eingeschränkt. Die meisten der Pollentransformanten sind nicht in der Lage auszukeimen oder
hören kurz nach dem Auskeimen auf zu wachsen. Trotz dieses Phänotyps können ~ 20% der
transient transformierten Pollen relativ normal auskeimen und wachsen. Möglicherweise hängt dies
mit der eingebrachten DNS-Menge in den transformierten Pollen zusammen. Die Lokalisation
erscheint auf den ersten Blick wie die der PMEI-RP1 und PMEI-RP3 Reporterfusionsproteine.
Jedoch ist bei den PMEI-RP2::YFP Transformanten die Pollenschlauchspitze ausgespart und es
lässt sich kein Signal in der Zellwand bzw. an der Membraninnenseite nachweisen. Möglicherweise
fehlen im Tabakpollen Interaktionspartner, die eine Sekretion unmöglich machen.
Die bis zum heutigen Zeitpunkt beschriebenen PMEIs, sowie die Pro-Domäne von NtPPME1 und
von Arabidopsis thaliana inhibieren Pektin Methylesterasen. Wenn man annimmt, dass es sich bei
den untersuchten PMEI-RPs wirklich um PME Inhibitoren handelt, würde man erwarten, dass die
Zellwand und die Pollenschlauchspitze durch die Überexpression der Kandidatenproteine
aufgeweicht werden und eine breitere Form aufweisen bzw. platzen. PMEs wären möglicherweise
nicht in der Lage die Pollenzellwand zu festigen und es käme durch den Turgor zum Platzen der
Spitze. Die PMEI-RP2 Transformanten weisen Ähnlichkeiten mit den NtPPME1 minus Pro-
Domäne Transformanten auf. Eine Möglichkeit dies zu erklären ist: PMEI-RP2 könnte in der Lage
sein bestimmte Typ II PMEs zu aktivieren oder bestimmte PMEIs bzw. Pro-Domänen von Typ I
PMEs zu binden. Durch die Bindung an vorhandene PMEIs bzw. Pro-Domänen könnten diese
Inaktiviert werden und so zu einer Steigerung der PME Aktivität führen. Würde das bereits im
Golgi und den sekretorischen Vesikeln passieren, käme es zum Arretieren des Pollens. Für PGIPs,
Polygalacturonase-inhibierende Proteine konnte 2004 erstmals von Kemp et al. gezeigt werden,
dass je nach pH Wert und möglicherweise noch weiteren Faktoren PGIPs aktivierend wirken
können. Vorangegangene Studien hatten bis zum damaligen Zeitpunkt gezeigt, dass PGIPs
entweder inhibierend oder aber keinen Effekt auf Endo-Polygalacturonasen von Pilzen haben.
Ähnlich zu den Erfahrungen, die in unserem Labor (AG Rausch) mit PMEI-RPs aus Mais und
Arabidopsis gemacht wurden. Mit dieser Betrachtung ließe sich auch das oben erwähnte Kuriosum
101
6. Diskussion
der dosisabhängigen Aktivierung bzw. Inhibition von Gelfiltrationsfraktionen erklären.
6.10 Das Typ II PME Fusionsprotein PME2::RFP lässt sich in der Zellwand und im Pollenschlauch als diffuses Signal nachweisen
Die proteinkodierende Sequenz der Typ II PME2 wurde für zellbiologische Untersuchungen in den
Vektor pHD223::RFP kloniert. Dieser Vektor besitzt wie der pHD32::YFP Vektor den pLAT52
Promotor und für die C-terminale Fusion ein rot fluoreszierendes Reporterprotein. Das
Fusionsprotein lässt sich im Pollenschlauch, die Vakuole ist ausgespart, und in der Zellwand
nachweisen. Ein Phänotyp lässt sich, im Vergleich zur Publizierten NtPPME1 ohne Pro-Domäne
und VANGUARD1 PME, nicht nachweisen. Entweder ist das Fusionsprotein inaktiv, oder es wird
durch Tabak PMEI-RPs inaktiviert. Erwarten würde man einen Phänotyp wie ihn die
VANGUARD1::GFP oder die „NtPPME1 ohne Pro-Domäne“ Transformanten aufweisen.
Möglicherweise werden aber auch Modifikationen benötigt, die nur im Maissystem vorhanden sind.
6.11 Ausblicke
Neben den vier beschriebenen PMEI-RPs konnten noch drei weitere Mais PMEI-RPs identifiziert
werden(AX214333, AX214336, AX214357). Für AX214333 konnte Bate et al. (2004) zeigen, dass
es sich um einen Invertase Inhibitor, ZM-INVINH1, handelt. Dieser kann während der frühen
Samenentwicklung in Bereichen um den Embryo nachgewiesen werden. Als Zielproteine wurden
mehrere Invertasen genannt. ZM-INVINH1 ist der erste in Monokotyledonen beschriebene
Invertaseinhibitor. Ausser diesen sieben PMEI-RP Sequenzen konnten in Mais keine weiteren
Kandidaten identifiziert werden.
Erst in den letzten Jahren konnten unterschiedliche Aspekte des Pollenschlauchwachstums und der
Führung aufgeklärt werden. In den letzten zwei Jahren erschienen mehrere Publikationen, in denen
die Bedeutung von PMEs während dieses Prozesses untersucht wurden(Bosch et al., 2005; Bosch &
Hepler, 2005; Jiang et al., 2005). Die herabgesetzte Expression von VANGUARD1 PME in
Arabidopsis und der NtPPME1 in Tabak führt zu einem verkümmerten bzw. gestörten
Pollenschlauchwachstum bei dem der Durchmesser etwas breiter wird oder aber die Spitze platzt.
Durch das Fehlen dieser PMEs könnten die Zellwände länger brauchen um sich zu verfestigen.
Während sich die Zellwand verfestigt würde der Turgor den Pollenschlauch ausdehnen. Die gesamt
PME-Aktivität ist während dieser Prozesse ähnlich. Vermutlich besitzen die unterschiedlichen
PMEs spezifische Reaktionsbedingungen, die nur in bestimmten Bereichen der
102
6. Diskussion
Pollenschlauchzellwand vorliegen. Dieser Sachverhalt würde auch die Schwierigkeiten beim
charakterisieren dieser Proteingruppen erklären. Solange es nicht möglich ist einzelne Zielproteine
bzw. Inhibitoren zu erhalten, sind Enzymassays nicht optimal durchzuführen. Andere Isoformen
bzw. andere Proteine könnten die spezifischen Interaktionen stören, unterbinden oder zu falschen
Interaktionen führen. Auch die unterschiedlichen Verteilungen von Pektinen in der
Pollenschlauchzellwand legen nahe, dass neue Pektinkomponenten und modifizierende Enzyme in
zyklischen Rhythmen in die Pollenschlauchspitze sekretiert werden(Lenartowska et al., 2001;
Stepka et al., 2000). Eine Bänderung konnte auch für PMEI-RP1::YFP nachgewiesen werden.
Desweiteren ist AtPMEI1 in der Lage, PME-Proben aus Maiskeimlingen, nicht aber aus Maispollen
zu inhibieren. Der PME Inhibitor aus Kiwi ist im Vergleich dazu in der Lage Proben aus
Maispollen und Maiskeimlingen zu inhibieren.
Die genauen Vorgänge aller an diesem Prozess beteiligten Proteine während der Pollenentwicklung
zu verstehen, könnte helfen, daraus abgeleitete biotechnologische Anwendungen für die
Agrarwirtschaft zu entwickeln. So ließen sich Maispflanzen erzeugen, bei denen der Pollen nur auf
den gewünschten gentechnisch manipulierten Pflanzen auskeimen bzw. wachsen und Samen bilden
kann. Auf diese Weise könnte eine Verunreinigung anderer wt Maissorten mit gentechnisch
veränderten Arten verhindert und eine Koexistenz beider Anbauformen verbessert werden.
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8 Danksagung
Mein Dank gilt insbesondere Herrn Prof. Dr. Thomas Rausch für die Überlassung dieses
interessanten Themas.
Herrn Prof. Dr. Rüdiger Hell danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Bedanken möchte ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für ihre Hilfe und
Unterstützung, durch die das Gelingen dieser Arbeit erst ermöglicht wurde.
Ich danke allen, die mich bei der Anfertigung diese Arbeit unterstützt haben und mir mit Rat
und Tat zur Seite standen.
Besonders danke ich meinen Eltern für die langjährige Unterstützung in allen Lebenslagen.
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