In Vivo and in Vitro Biofilm Formation

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In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces Key words: biofilm, dental implant, live/dead staining, surface free energy, surface roughness, Streptococcus sanguinis Abstract Objectives: The aim of the present in vitro and human in vivo study was twofold: first, to evaluate the initial biofilm formation on different titanium implant surfaces by means of two highly sensitive fluorescent techniques and, second, to correlate these findings to different surface properties. Materials and methods: In vivo biofilm formation was induced on purely machined (Pt) and on sand-blasted and acid-etched titanium (Prom) specimens, which were mounted buccally on individual splints and worn by six study participants for 12 h. In vitro bacterial adhesion was also investigated after incubation with Streptococcus sanguinis suspension (371C, 2 h). Adherent bacteria were quantified by the following fluorescence techniques: Resazurin staining in combination with an automated fluorescence reader or live/dead cell labeling and fluorescence microscopy. Surface roughness (Ra) was determined with a perthometer, and surface free energy (SFE) was measured with a goniometer. Results: Prom showed a significantly higher median Ra (0.95 mm) and a significantly lower median SFE (18.3 mJ/m2) than Pt (Ra¼0.15 mm; SFE¼39.6 mJ/m2). The in vitro and in vivo tests showed a significantly higher bacterial adhesion to Prom than to Pt, and the initial biofilm formation on Pt corresponded to the circular surface modifications on the machined substratum. Both observations may be attributed to the predominant influence of surface roughness on bacterial adhesion. No significant differences in the percentage of dead cells among all adhering bacteria were found between Prom (23.7%) and Pt (29.1%). Ectopic solitary epithelial cells from the oral mucosa – strongly adhering to the substratum – were found on each Prom specimen, but not on any of the Pt surfaces. Conclusions: Initial bacterial adhesion to differently textured titanium surfaces is primarily influenced by Ra, whereas the influence of SFE seems to be of only minor importance. Therefore, the micro-structured parts of an implant that are exposed to the oral cavity should be highly polished to prevent plaque accumulation. Both tested fluorometric techniques proved to be highly sensitive and reproducible in the quantification of biofilm formation on titanium implant surfaces. The success of dental implants depends on the osseointegration between the implant and the surrounding bone as well as on an inflammation-free contact healing with the mucosal connective tissue. While the problems in osseous healing of implants appear to be largely solved, the sealing of the implant surface through soft tissuemay be crucial for long-term therapeutic success (Abrahamsson et al. 1998). Microbial adhesion and the accumulation of pathogenic biofilms are considered to play major roles in the pathogenesis of peri-implantitis and

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In vivo and in vitro biofilm formationon two different titanium implantsurfaces

Key words: biofilm, dental implant, live/dead staining, surface free energy, surface roughness,Streptococcus sanguinisAbstractObjectives: The aim of the present in vitro and human in vivo study was twofold: first, toevaluate the initial biofilm formation on different titanium implant surfaces by means oftwo highly sensitive fluorescent techniques and, second, to correlate these findings todifferent surface properties.Materials and methods: In vivo biofilm formation was induced on purely machined (Pt) andon sand-blasted and acid-etched titanium (Prom) specimens, which were mounted buccallyon individual splints and worn by six study participants for 12 h. In vitro bacterial adhesionwas also investigated after incubation with Streptococcus sanguinis suspension (371C, 2 h).Adherent bacteria were quantified by the following fluorescence techniques: Resazurinstaining in combination with an automated fluorescence reader or live/dead cell labelingand fluorescence microscopy. Surface roughness (Ra) was determined with a perthometer,and surface free energy (SFE) was measured with a goniometer.Results: Prom showed a significantly higher median Ra (0.95 mm) and a significantly lowermedian SFE (18.3 mJ/m2) than Pt (Ra¼0.15 mm; SFE¼39.6 mJ/m2). The in vitro and in vivotests showed a significantly higher bacterial adhesion to Prom than to Pt, and the initialbiofilm formation on Pt corresponded to the circular surface modifications on the machinedsubstratum. Both observations may be attributed to the predominant influence of surfaceroughness on bacterial adhesion. No significant differences in the percentage of dead cellsamong all adhering bacteria were found between Prom (23.7%) and Pt (29.1%). Ectopicsolitary epithelial cells from the oral mucosa – strongly adhering to the substratum – werefound on each Prom specimen, but not on any of the Pt surfaces.Conclusions: Initial bacterial adhesion to differently textured titanium surfaces is primarilyinfluenced by Ra, whereas the influence of SFE seems to be of only minor importance.Therefore, the micro-structured parts of an implant that are exposed to the oral cavityshould be highly polished to prevent plaque accumulation. Both tested fluorometrictechniques proved to be highly sensitive and reproducible in the quantification of biofilmformation on titanium implant surfaces.

The success of dental implants depends onthe osseointegration between the implantand the surrounding bone as well as on aninflammation-free contact healing withthe mucosal connective tissue. While theproblems in osseous healing of implantsappear to be largely solved, the sealing ofthe implant surface through soft tissuemaybe crucial for long-term therapeutic success(Abrahamsson et al. 1998). Microbial adhesionand the accumulation of pathogenicbiofilms are considered to play major rolesin the pathogenesis of peri-implantitis andimplant loss (Scarano et al. 2004; Elter et al.2008). Once the clean implant surface isexposed to the oral cavity, it is immediatelycovered by salivary pellicle and colonizedby microorganisms (Elter et al. 2008). Besidessufficient oral hygiene through mechanicaland chemical cleaning, it istherefore most important to develop implantsurfaces around the transmucosal portionthat reduce the number of initiallyadhering bacteria, which in turn minimizesplaque formation and subsequently the inflammation

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of soft tissues (Grossner-Schreiber et al. 2001, 2004).The physico-chemical characteristics ofspecific material surfaces are known tosignificantly influence the bacterial adhesionprocess (Wu-Yuan et al. 1995; An &Friedman 1998; Rasperini et al. 1998;Teughels et al. 2006). Both surface freeenergy (SFE) and surface roughness areknown to play a major role in this process,whereas surface roughness has been suggestedto be the predominant of both parameters(Nakazato et al. 1989; Esposito et al.1998; Quirynen et al. 1999, 2002). Thebony and connective tissue interfaces ofmost dental implant materials are porousor micro-textured to support osseointegration.Therefore, titanium implant surfacesthat are too smooth prevent cell attachment.On the other hand, roughly texturedimplant substrata enhance plaque accumulation,whereas high-polished materialswith reduced surface roughness limit initialbiofilm formation in vivo (An & Friedman1998; Quirynen et al. 1999; Teughels et al.2006). In this context, a value of 0.2 mmhas been generally accepted as the averageroughness threshold below which theamount of bacterial adhesion cannot bereduced any further (Bollen et al. 1997;Grossner-Schreiber et al. 2001; Elter et al.2008). Therefore, to aid the clinical treatmentof bacteria-induced peri-implant destructions,exposed implant threads withrough micro-structure are burnished andpolished (implantoplasty) to prevent excessiveplaque accumulation (Lang et al.2004). The SFE of a solid substratum hasbeen shown to have crucial impact on theinitial adhesion of oral microorganisms(Busscher et al. 1984; Weerkamp et al.1985; Pratt-Terpstra et al. 1988, 1989). Inthe thermodynamic model of microbialadhesion, bacterial strains with high SFEhave a negative interfacial free energy ofadhesion (DFadho0) at substratum surfaceswith high SFE. Therefore, these strains areexpected to preferentially adhere to suchsubstrata (Weerkamp et al. 1985; Pratt-Terpstra et al. 1988, 1989). Surface roughnessand SFE may be easily modified ontitanium dental implants by sand-blasting,plasma nitriding, acid etching, titaniumvacuum plasma spraying, or by applyingvarious chemical coatings (Browne & Gregson1994; Del et al. 2005). As a consequence,a more detailed understanding ofthe role of different implant surface propertiesin bacterial adhesion and an optimizationof these physico-chemicalcharacteristics seems necessary.For this purpose, a large number of experimentalsystems for studying microbialadhesion in vivo and in vitro are available,most of which are based on direct colony

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counting (Bollen et al. 1996; Drake et al.1999; Barbour et al. 2007) and scanningelectron microscopy (SEM) observations(Gatewood et al. 1993; Drake et al. 1999;Rimondini et al. 2002; Kuula et al. 2004;Del et al. 2005; Barbour et al. 2008). Incontrast to these traditional microbialquantification methods, systems based onbiofluorescence have gained increasing importance,because they have become acceptedas simple, precise, reproducible,and highly sensitive tools for the quantificationof adhering microorganisms (Grivetet al. 1999; Grossner-Schreiber et al. 2001;Gaines et al. 2003; Pier-Francesco et al.2006; Muller et al. 2007; Buergers et al.2008; Hahnel et al. 2008). Newly developedtwo-color live/dead staining techniquescomplement the investigativepossibilities by providing a visual differentiationbetween living and dead bacteria(Boulos et al. 1999; Hannig et al. 2007;Al-Ahmad et al. 2008). In this context,SYTO 9 and propidium iodide staininghas proven superior in comparison withother assays, because it provides a cleardifferentiation between dead and activemicroorganisms without interference ofbackground fluorescence (Decker 2001).In general, fluorescence microscopy approachesoffer the opportunity to visualizebacteria directly on the substrata and in thestate of adherence (Hannig et al. 2007).The present study was conducted toevaluate the in vitro and in vivo microbialadhesion to sand-blasted and acid-etchedPromotes titanium surface in comparisonwith machined pure titanium by means oftwo highly sensitive fluorescence techniques(Resazurin and live/dead staining)and to correlate these findings to differencesin surface roughness, SFE, and surfacemorphology.Materials and methodsCharacterization of titanium surfacesTwo different types of titanium specimensmeasuring 9mm in diameter and 2mm inthicknesswere used. The textured Promotes

titanium surface (Camlog BiotechnologiesAG, Basel, Switzerland) is sand-blasted andacid-etched and is used for the Camlogs

dental implant system (Camlog BiotechnologiesAG). Promotes (Prom) surfaces werecompared with machined pure titaniumspecimens (Pt; Camlog). The surface roughness(Ra) of five specimens of each of thetwo materials on three different sites wasdetermined with a stylus instrument (PerthometerS6P; Perthen, Go¨ ttingen, Germany).The total SFE, its dispersion, and polarcomponents were calculated from automatedcontact angle measurements (OCA15 plus; Dataphysics Instruments, Filderstadt,Germany) as described before (Hahnelet al. 2008). SEM was conducted for three

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specimens of the two titanium materials.The specimens were mounted directly onaluminum stubs and imaged with SEM(magnification _ 600 and _ 8000)(Quanta FEG 400; FEI Company, Eindhoven,the Netherlands).In vivo biofilm formationThree healthy women (A, B, and C) andthree healthy men (D, E, and F) volunteeredto participate in the present study(age 22–38 years, mean: 28 years; all nonsmokers).None of the volunteers had usedantibacterial mouth rinses or systemicantibiotics for 12 months before the startof the study. Oral examination was carriedout by an experienced dentist. All volunteershad physiological salivary flow rates(1–1.5ml/min) and excellent oral hygiene(plaque index and sulcus bleeding indexclose to zero). Informed written consenthad been given by the subjects and thestudy had been approved by the EthicsCommittee of the University of Regensburg(application 08/131). All specimens

were disinfected by ultrasonication in 3%sodium hypochlorite (Pharmacy, UniversityHospital Regensburg, Regensburg,Germany) for 20min and then washed indistilled water. Samples were free of microorganismsafter this treatment as proven bySEM and live/dead staining. For in vivobiofilm formation, the specimens werefixed to individual removable acrylic upperjaw splints (Fig. 1), with which the titaniumspecimens were positioned in thebuccal region of the premolars and firstmolars, so that biofilm growth wasnot disturbed by tongue movements. Eachvolunteer had two Prom and two Pt specimensinserted. Food or beverage consumptionand oral hygiene were forbidden duringcarriage. The splints were worn for 12 h.Then, the plaque-covered specimens wereremoved from the splints and immediatelyprocessed for fluorescence staining.All specimens were transferred to wellplates and washed threefold in phosphatebufferedsaline (PBS) to remove non-adhering

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cells. The Live/Dead BacLight bacterialviability kit (Molecular Probes, Eugene,OR, USA) was used to determine theproportion of live or active cells (fluorescentgreen) and dead or inactive cells (fluorescentred). The live/dead stain wasprepared by diluting 18 ml of staining componentA (SYTO 9) and 18 ml of stainingcomponent B (propidium iodide) in 15mlof distilled water. Five hundred microlitersof the reagent mixture were added to eachwell, and specimens were incubated atroom temperature and in darkness for15 min. Each specimen was carefully positionedon a glass slide covered with componentC (mounting oil) and stored in thedark at 41C until further processing. Fluorescenceemission was determined with afluorescence microscope (BX61; OlympusGmbH, Hamburg, Germany) in combinationwith the image processing softwarecell ^ P (Olympus GmbH). In each specimen,the fluorescent microscopic imagesof five randomly selected sites were capturedwith a digital camera (U-CMAD3;Olympus GmbH) that was connected tothe microscope. Living and dead cells inthe same microscopic field were viewedseparately with different fluorescence filtersets (FITC/F41-054 and Alexa594/F41-027; AHF Analysetechnik, Tu¨ bingen,Germany) and digitally combined to onepicture. The areas covered by dead cells(fluorescent red), viable cells (fluorescentgreen), and total cells were calculated aspercentage of specific standard microscopicfields (420 _ 320 mm¼0.13mm2) withthe image analysis software Optimas 6.2(Meyer Instruments, Houston, TX, USA).In vitro biofilm formationStreptococcus sanguinis (strain 20068;DSMZ, Braunschweig, Germany) wasused in this study for in vitro biofilmformation. After a frozen (_601C) preculturehad been established, the bacteriawere exposed on an agar plate and incubatedat 371C for 48 h. Cultures from asingle colony were cultivated in steriletrypticase soy broth (Trytic-Soy Broth; BDDiagnostics, Sparks, MD, USA) supplementedwith yeast extract (Sigma-Aldrich,St Louis, MO, USA) at 371C for 16 h. Theday before the experiment, 1 ml of eachbacterial suspension had been inoculatedwith 250 ml of sterile trypticase soy broth(BD Diagnostics) and incubated at 371C for12 h. The bacterial suspensions were centrifugedat 896 g at 181C for 5min andwashed twice in PBS (Sigma-Aldrich). Opticaldensity of the suspensions was adjustedto 0.3 at 540 nm.As described before, the oxidation–reduction fluorescence dye Alamar Blue/Resazurin (0.75 g/ml aqua dest) (Sigma-Aldrich) was used to determine the total

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quantity of adhering bacteria (Buergerset al. 2007). Fluorescence intensities wererecorded by an automated multi-detectionreader (Fluostar optima; BMG Labtech,Offenburg, Germany) at wavelengths of530nm excitation and 590nm emission.Unstimulated human saliva was collectedfrom one healthy donor aged 31 years whodid not show any active carious lesionsor periodontal diseases. The saliva wassterilized by means of single-use filtrationdevices with pore sizes 0.45 and 0.2 mm(Vacuflo PV050/2 and PV050/3; Schleicher& Schu¨ ll Microscience GmBH, Dassel,Germany). Incubated at 371C for 120min,the filtered saliva formed a salivary pellicleon all specimens (Hahnel et al. 2008). Afterremoval of saliva, PBS (1ml) was added toeach well (15 specimens for each material)and determined the autofluorescence ofeach specimen. After the removal of thebuffer, 1ml of bacterial suspension wasadded to each well, and the well plateswere incubated with Resazurin (15 ml) at371C for 120min. The mixture of bacterialsuspension and Resazurin was extracted bysuction, the wells were subsequentlywashed twice, and 1ml of PBS was added.Fluorescence intensities after bacterial adhesionwere determined as described above.The fluorescence values of pure PBS (0-control), buffer and Resazurin (dye-control),and pure bacterial solution (bacteria-control)served as control references. High relativefluorescence intensities (RFIs) indicatedhigh streptococcal adhesion.The in vitro pellicle and biofilm formationwas repeated with further five specimensof each material, but without theaddition of Resazurin. After 120-min incubationon an orbital shaker (semi-staticconditions) with S. sanguinis, the proportionof live or active streptococci (fluorescentgreen) and dead or inactivestreptococci (fluorescent red) was determinedwith the Live/Dead BacLight bacterialviability kit (Molecular Probes) asdescribed above (please see ‘In vivo biofilmformation’).Statistical analysisContinuous data were summarized byusing medians and interquartile ranges(25th–75th percentile). Global betweengroupcomparisons were conducted by theBrunner–Langer test for the in vivo testingand by the Kruskal–Wallis rank analysis ofvariance for the in vitro testing. The detectionof differences between Ra and SFE, andthe amount of adhering bacteria on thetested titanium surfaces (n¼2) were detectedby the pair-wise Mann–Whitney Utestin combination with the Bonferroniadjustment (two-sided a¼0.025). Calculationswere done with statistical softwareSPSS 15.0 for Windows (SPSS Corp.,

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Chicago, IL, USA) and SAS (SAS Institute,Cary, NC, USA).ResultsSurface characterization of titaniumsubstrataThe Kruskal–Wallis rank analysis of variancerevealed significant differences betweenPt and Prom in surface roughness(Ra) and SFE values (Po0.001 for bothcomparisons). Significantly higher medianroughness values were found for Prom(0.95 mm) than for Pt (0.15 mm). The medianSFE of Pt was significantly higher (totalSFE: 39.6 mJ/m2; dispersion component:35.9 mJ/m2; polar component: 3.7 mJ/m2)than the median SFE of Prom (totalSFE: 18.3 mJ/m2; dispersion component:18.1 mJ/m2; polar component: 0.2 mJ/m2).SEM images of Prom discs showed ahomogenous roughened micro-structure(Fig. 2), whereas at a higher magnification,Pt surfaces showed a circular configurationof alternating plane and flattened and roughsurface areas (Fig. 3). The adhesion ofmicroorganisms – both in vitro and invivo – corresponded to these circular surfacemodifications on Pt surfaces, andbacteria were arranged in orbital patterns(Fig. 4). On Promsurfaces,microorganismsin vivo and S. sanguinis in vitro adhesiontests were uniformly distributed in smallaggregates and did not follow any pattern(Fig. 5).In vivo determination of microbial adhesion(live/dead staining)The Brunner–Langer statistical test revealedsignificant differences between the testedmaterials for total cells (P¼0.00478),vital cells (P¼0.00215), and dead cells(P¼0.03322). Calculations from live anddead stainings are given in Figs 6 and 7 andin Table 1. Examples for the in vivo fluorescentmicroscopic images are shown inFigs 8, 4, and 5. In general, the six volunteersshowed significant differences in microbialadhesion (total bacteria, dead, andvital bacteria). The assessment of the fluorescencemicrographs of all volunteersshowed that 1.1% (median) of the surfaceof reference material Pt was covered bymicroorganisms after 12 h in situ. Significantlylarger areas were covered by microorganismson Prom (8.5%) (P¼0.00478).Figure 7 and Table 1 show the percentage ofdead cells among all adhering cells (livingand dead cells). 29.1% of detected microorganismson Pt and 23.7% of those onProm were dead (P¼0.03322).The microorganisms colonized the surfaceas monolayer or isolated aggregates ofcells, or both, which were randomly distributedbut well defined (cf. Fig. 4). Ectopicsolitary epithelial cells from the oralmucosa – strongly adherent to the substratum– were found on each Prom specimen,

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whereas not a single cell was found on Ptsurfaces (cf. Fig. 8).In vitro determination of microbial adhesion(live/dead and Resazurin staining)Calculations from the in vitro live/deadstainings are given in Table 2. Examplesfor the in vitro fluorescent microscopicimages are shown in Figs 9 and 10. Accordingto the in vivo results, a significantlyhigher amount of adhering S. sanguiniswas found on Prom than on Pt. 11.2%(median) of the surface of Prom discs wascovered by streptococci, out of which 0.5%were dead (fluorescent red) and 10.7% vital(fluorescent green). Significantly smaller

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areas were covered by S. sanguinis on Pt(3% in total: 0.4% dead bacteria, 2.7%vital bacteria) (Po0.001).Table 2 shows the results from the invitro Resazurin quantification method asRFIs on the two test titanium materials. In

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general, statistically significant differenceswere found after the Kruskal–Wallis rankanalysis of variance (Po0.001). HigherRFI, representing higher amounts of adheringstreptococci, were found for Prom[median fluorescence intensity: 13489 relativefluorescence units (RFU)] and significantlylower RFI, meaning lower amountsof adhering bacteria, for Pt (9945RFU)(Po0.001).DiscussionThe adhesion of oral microorganisms andthe subsequent formation of pathogenicbiofilms on the surface of dental implantsresult in infections of the peri-implanttissues and finally in implant failure.Peri-implantitis has been reported in 16%of implant patients after 9–14 years (Roos-Jansaker et al. 2006) When peri-implantinflammatory reactions lead to an expositionof micro-structured implant parts tothe oral cavity, the typical and instinctiverecommendation is to debride these partsand obtain a smoother surface (Del et al.2005; Barbour et al. 2007). Scientificknowledge on the fundamental processesof bacterial adhesion to implant surfaces ispoor and therapy recommendations onperi-implantitis are mainly based on empiricalvalues rather than on well-foundedresearch results. Therefore, themain objectiveof the present study was to investigatein vitro and in vivo microbial adhesion totwo different titanium surfaces by means oftwo highly sensitive fluorescence techniques(Resazurin and live/dead staining) andto correlate these findings to specific surfacecharacteristics [surface roughness (Ra)and SFE].S. sanguinis, formerly known as S. sanguis,was used as a test microorganism forthe in vitro part of the study because of itscommon presence in the human oral cavity.Moreover, S. sanguinis is known as apioneer bacterium in the oral biofilm(Grossner-Schreiber et al. 2001; Rimondiniet al. 2002; Mabboux et al. 2004; Del et al.2005). Additionally, Drake et al. (1999)

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showed that hydrophobic titanium surfaceswere preferentially colonized by S. sanguinis(rather hydrophobic). The tested titaniumis the most frequently used materialfor the construction of implant systems inmodern dentistry. Tailor-made modificationsof titanium implant surfaces havebeen invented to optimize the bone bindingpotential of dental implants. In general,these surface modifications lead to increasedRa and variable changes in SFE, which inturn changes the adhesion potential of suchtitanium surfaces (Pier-Francesco et al.2006).In in vitro testing, a significantly highermicrobial quantity of adhering S. sanguiniswas found on Prom than on Pt (Resazurintechnique: 1.4-fold; live/dead staining: 3.7-fold). This phenomenon was even morepronounced in in vivo testing (7.7-foldhigher plaque accumulation on Prom thanon Pt), probably because of the shelteringeffect of rough surfaces against removalforces, which do not occur under semistaticin vitro conditions (Rimondini et al.2002). In general, the higher number ofadhering microorganisms on Prom can beexplained by different surface characteristicssuch as Ra and SFE. Many studies havebeen conducted on the influence of surfacecharacteristics on restorative and prostheticmaterials. In contrast, little informationis available on fundamental interactionsbetween microorganisms and implant surfaces.Additionally, detailed observations ofthe corresponding implant substrata and

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their specific surface properties have oftenbeen disregarded.One reported risk for peri-implantmicrobialadhesion and resulting peri-implantitisis high surface roughness of the transmucosalcomponent of an implant (Quirynenet al. 2002). Current opinion indicates thatlow SFE materials with reduced Ra limitsinitial microbial adhesion (An & Friedman1998; Quirynen et al. 1999). Our medianSFE values of the two tested titaniummaterials are consistent with SFE valuesfound by Grossner-Schreiber et al. (2001)(who reported SFE values of differenttitanium surfaces between 34.3 and38.71mJ/m2 including low polar components)and Mabboux et al. (2004) (SFEvalues of 43.8 and 44.6 mJ/m2 also withlow polar components). In the presentstudy, Prom showed significantly higherRa values, lower SFE values, and a higherin vitro and in vivo microbial adhesionthan Pt. Therefore, the influence of Ra onplaque accumulation appears to be moreimportant than the influence of SFE. Manystudies postulated a predominant influenceof Ra in contrast to SFE, which could beaffirmed by our investigation (Bollen et al.1996, 1997; Quirynen et al. 1999; Pier-Francesco et al. 2006; Teughels et al. 2006).Some in vivo studies indicated a threshold

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Ra of 0.2 mm, below which no furtherreduction of bacterial accumulation couldbe expected (Bollen et al. 1996, 1997). Theenhanced bacterial adhesion on Prom supportedthis thesis. According to Verran &Boyd (2001), Prom (median Ra¼0.95 mm)can be described as micro-rough and Pt(median Ra¼0.15 mm) as nano-rough. Microorganismson rough surfaces are assumedto be more protected against shear forces,

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and initial colonization has been shown tostart from surface irregularities (Nyvad &Fejerskov 1987; Bollen et al. 1997; Hannig1999; Quirynen et al. 1999). Surprisingly, ahigher retention of S. sanguinis on roughsurface areas was also shown in the semistaticin vitro part of our study, in which nosignificant shear forces can be expected.Additionally, rough andmicro-textured surfacesnot only seem to accumulate moreplaque, but this plaque also contains morepathogenic flora (Bollen et al. 1996).In summary, it was clearly shown thatrough surfaces enhance bacterial adhesionboth in vivo and in vitro and that theinfluence of Ra outweighs the influenceof SFE. As a consequence, all micro-structuredparts that are exposed to the oralcavity and its microorganisms should behighly polished to generate an anti-adherentor plaque-reducing effect. The relevanceof this procedure was affirmed bythe in vitro and in vivo results of this study.The amount of adhering bacteria in vivoshowed high intra-individual and interindividualvariability, which was alsoshown by Hannig et al. (2007) even aftershorter incubation times. However, all sixvolunteers showed the same differences inmicrobial load on the two tested titaniumsurfaces (Prom vs. Pt) (Prom4Pt). Additionally,these differences correlated well tothe in vitro results,which in turnproved thesignificance of our in vitro adhesion model.For the first time, in vivo and in vitrobacterial adhesion on dental implants wasinvestigated by means of live/dead stainingto study the influence of different surfacetextures on the viability of adhering bacteria.Fluorometric techniques in adhesionstudies offer the opportunity to quantita-tively investigate a high number of specimensin a short period of time and, at thesame time, to study detailed morphologicalaspects by microscopic techniques. Nostatistical differences were found betweenProm and Pt with regard to the percentageof dead and vital bacteria. Therefore, differencesin surface characteristics such as Ra

or SFE – which differed significantly betweenProm and Pt – may not influencethe viability of oral biofilms. Interestingly,a high percentage of dead bacteria amongthe adhering cells (Pt: 29.1% and Prom:23.7%) could be already found after 12 h ofin vivo incubation. Our findings correspondto the results of Hannig et al.(2007), who found about 40% of deadbacteria after different intra-oral incubationtimes. In conclusion, the role of deadbiological material in the formation processof (oral) biofilms may have been underestimatedin the past and should be furtherinvestigated. In general, the informationobtained from fluorescence techniques is

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mainly quantitative in nature. Therefore,the species composition of the microbialcommunities on the tested specimens wasnot determined. In contrast to previouslyconducted molecular methods, no conclusionson biofilm composition could bedrawn (Amann et al. 1995).In vitro models are frequently used instudies on microbial adhesion on specificsubstrata, because they are reproducible andcost-effective. Additionally, the interpretationof results is simplified by the userdefinedinclusion and exclusion of specificinfluencing factors. In comparison, in vivomodels offer the opportunity to evaluatematerials in realistic clinical conditions, presentingcomposite plaque, co-adhering microorganisms,salivary pellicle, and removalforces by salivary flow and chewing activities(Rimondini et al. 2002). With thebenefit of hindsight, our in vitro results arein strong accordance with our in vivo results.Therefore, our semi-static in vitro model incombination with the Resazurin and thelive/dead techniques represent realistic andreproducible models for testing the bacterialadhesion on dental implants.Adherent solitary epithelial cells fromthe oral mucosa were found on eachProm specimen, whereas not a single cellwas found on Pt surfaces. This secondaryfinding showed that material surface characteristics,which have a pivotal influenceon plaque accumulation, also influence theformation of epithelial attachment. Theeffect of Ra and SFE on attachment, orientation,and proliferation of human gingivalfibroblasts has been demonstrated in variousother studies (Kononen et al. 1992; Mustafaet al. 1998; Lauer et al. 2001; Rimondini etal. 2002). Although this hypothesis was nottested in our study, the high number ofectopic epithelial cells on Prom – stronglyadherent to the surface – seems to suggestthat Prom may be a promising materialcapable of enhancing cell attachment formationand osseointegration.Biological contamination is difficult toremove from structured implant surfaces,e.g. by the use of plastic curettes or sonic/ultrasonic scalers (Schwarz et al. 2009).Thus, in addition to making dental implantswith high bone binding potentials, it isimportant to develop implant surfaces thatreduce the number of initially adheringbacteria. At this point in time, these tworequests for the construction of implantmaterials unfortunately contradict eachother. In general, manufacturers’ modificationsof implant surfaces and the treatmentrecommendations on exposed implant structuresshould be based on research results.Therefore, further investigations are neededinto the essential proceedings of bacterialadhesion on implant surfaces. As titanium

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itself does not show any antibacterial activity,anti-adhesive coatings or alloys to providebactericidal surfaces may be analternative to conventional invasive periimplantitistherapies.ConclusionsWithin the limitations of the present study,our findings indicate that in vitro andin vivo adhesion of bacteria to differentlytextured titanium surfaces is primarily influencedby surface roughness. In contrast,the influence of SFE is of lesser importance.Therefore, any micro-structuredpart that is exposed to the oral cavityshould be highly polished to generate ananti-adherent and plaque-reducing effect.A high percentage of dead cells among theadhering bacteria could be observed on alltitanium specimens. This observation affirmsthe pivotal role of dead biologicalmaterial in the formation process of (oral)biofilms. At last, the two fluorometrictechniques (Resazurin and live/dead staining)used in the present study proved to bereproducible, sensitive, and precise tools tostudy in vivo and in vitro initial biofilmformation on titanium implant surfaces.Acknowledgements: We are gratefulto the Camlog Biotechnologies AG(Basel, Switzerland) for the supply oftitanium specimens. The authorsdeclare that they have no conflict ofinterest.

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En vivo e in vitro la formación de biopelículasen dos implantes de titanio diferentesuperficies

Palabras clave: biofilm, implantes dentales, vivo / muerto de tinción, la energía libre superficial, rugosidad de la superficie,Streptococcus sanguinisResumenObjetivos: El objetivo de la presente in vitro y humanos en el estudio in vivo fue doble: en primer lugar,evaluar la formación de biopelículas inicial sobre diferentes superficies de titanio del implante por medio dedos técnicas fluorescentes de alta sensibilidad y, en segundo lugar, para correlacionar estos hallazgos condiferentes propiedades superficiales.Materiales y métodos: En la formación de biopelículas in vivo se indujo en puramente mecanizada (Pt) yel chorro de arena y al ácido de titanio (Prom) ejemplares, los cuales fueron montados bucalde férulas individuales y usado por los seis participantes en el estudio de las 12 h. En adhesión bacteriana in vitroTambién se investigó después de la incubación con Streptococcus suspensión sanguinis (371C, 2 h).Bacterias adheridas se cuantificaron las siguientes técnicas de fluorescencia: resazurinatinción en combinación con un lector automático de fluorescencia o en vivo / muerto marcación celulary microscopía de fluorescencia. La rugosidad superficial (Ra) se determinó con un Perthometer,y la superficie libre de la energía (SFE) se midió con un goniómetro.Resultados: Prom mostraron una significativamente mayor mediana Ra (0,95 mm) y una significativamente menormediana de SFE (18,3 MJ/m2) que Pt (Ra ¼ 0,15 mm; SFE ¼ 39,6 MJ/m2). El in vitro e in vivolas pruebas mostraron una adherencia significativamente mayor que las bacterias a prom a Pt, y la inicialla formación de biopelículas sobre Pt correspondían a las modificaciones de la superficie circulares en el mecanizadosustrato. Ambas observaciones se puede atribuir a la influencia predominante de superficierugosidad en la adhesión bacteriana. No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de células muertasentre todas las bacterias adheridas se encuentran entre los de baile (23,7%) y Pt (29,1%). Ectópicosolitarios células epiteliales de la mucosa oral, fuertemente adheridos al sustrato-fueronencontrado en cada muestra de baile, pero no en cualquiera de las superficies de Pt.Conclusiones: adhesión inicial bacteriana a las superficies de titanio diferente textura es principalmente

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influenciado por Ra, mientras que la influencia de SFE parece ser de importancia sólo menor.Por lo tanto, las partes micro-estructurados de un implante que están expuestos a la cavidad oraldebe ser altamente pulido para evitar la acumulación de placa. Tanto probado fluorométricotécnicas demostró ser altamente sensible y reproducible en la cuantificación de biofilmformación sobre superficies de los implantes de titanio.

El éxito de los implantes dentales dependela oseointegración entre el implantey el hueso circundante, así como en unala inflamación sin contacto con la curaciónel tejido conectivo mucosa. Mientras que elproblemas en la cicatrización ósea de los implantesparecen ser solucionado en gran parte, el sellado dela superficie del implante a través tissuemay suaveser crucial para el éxito a largo plazo terapéutica(Abrahamsson et al., 1998). Adherencia microbianay la acumulación de patógenosbiopelículas se considera que desempeñan un papel importanteen la patogénesis de la periimplantitis y lapérdida de los implantes (Scarano et al 2004;. Elter et al.2008). Una vez que la superficie del implante limpio esexpuesto a la cavidad oral, es inmediatamentecubierto por película salival y colonizadospor microorganismos (Elter et al. 2008). Además dehigiene suficiente oral a través de mecánicay limpieza química, espor lo tanto, lo más importante para el desarrollo de implantessuperficies alrededor de la porción transmucosaque reducir el número de inicialmentebacterias adheridas, que a su vez minimizaformación de placas y, posteriormente, la inflamaciónde los tejidos blandos (Grossner-Schreiber y col. 2001, 2004).Las características físico-químicas delsuperficies específicas materiales son conocidos porinfluyen significativamente en la adhesión bacterianaproceso (Wu-Yuan et al 1995;. Una yFriedman, 1998; Rasperini et al. 1998;Teughels et al. 2006). Tanto la superficie libreenergía (SFE) y rugosidad de la superficie sonsabe que juega un papel importante en este proceso,mientras que la rugosidad superficial ha sugerido

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siendo el predominante de ambos parámetros. (Nakazato et al 1989; Esposito et al.1998; Quirynen et al. 1999, 2002). Laóseas y conectivo interfaces de tejido demateriales para implantes dentales son más porososo micro-textura para apoyar la osteointegración.Por lo tanto, las superficies de los implantes de titanioque son demasiado suaves impedir la adhesión celular.Por otro lado, aproximadamente texturasubstratos de implantes mejorar la acumulación de placa,mientras que los materiales de alto pulidocon superficie reducida límite rugosidad inicialla formación de biopelículas en vivo (An & Friedman1998; Quirynen et al. 1999; Teughels et al.2006). En este contexto, un valor de 0,2 mmha sido generalmente aceptada como la mediaumbral por debajo del cual la rugosidadcantidad de adhesión bacteriana no puede serreducir más (Bollen et al 1997.;Grossner-Schreiber et al. 2001; Elter et al.2008). Por lo tanto, para ayudar al tratamiento clínicode bacterias inducidas periimplantarios destrucciones,expuestos roscas del implante conaproximada de micro-estructura se bruñido ypulido (implantoplasty) para evitar excesivala acumulación de placa (Lang et al.2004). El SFE de un sustrato sólido tieneSe ha demostrado que tienen un impacto crucial en eladhesión inicial de los microorganismos orales(Busscher et al 1984;. Weerkamp et al.1985; Pratt-Terpstra et al. 1988, 1989). Enel modelo termodinámico de origen microbianoadhesión, las cepas bacterianas con alta SFEtener un efecto negativo de la energía libre interfacialadhesión (DFadho0) en las superficies del sustratocon un alto SFE. Por lo tanto, estas cepas sonespera que se adhieran preferentemente a talessubstratos (Weerkamp et al, 1985;. Pratt-Terpstra et al. 1988, 1989). Rugosidad de la superficiey SFE puede ser fácilmente modificada elLos implantes dentales de titanio por chorro de arena, lanitruración por plasma, grabado ácido, titanio

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vacío pulverización de plasma, o aplicandodiversos revestimientos químicos (Browne y Gregson1994; Del et al. 2005). Como consecuencia,una comprensión más detallada deel papel de diferentes propiedades superficiales de implantesen la adhesión bacteriana y la optimización de unade estas propiedades físico-químicascaracterísticas parece necesario.Para este propósito, un gran número de experimentalLos sistemas para el estudio microbianaadherencia in vivo e in vitro están disponibles,mayoría de los cuales se basan en directo de las coloniascontar (Bollen et al 1996;. Drake et al.1999; Barbour et al. 2007) y la exploraciónmicroscopía electrónica de barrido (SEM) las observaciones(Gatewood et al 1993;. Drake et al 1999.;Rimondini et al. 2002; Kuula et al. 2004;Del et al. 2005; Barbour et al. 2008). Encontraste con estos microbiana tradicionalmétodos de cuantificación, los sistemas basados enbiofluorescence han adquirido una importancia cada vez mayor,debido a que han sido aceptadostan simple, precisa y reproducible,herramientas y altamente sensibles para la cuantificaciónde microorganismos que se adhieren (Grivetet al. 1999; Grossner-Schreiber et al. 2001;Gaines et al. 2003, Pier-Francesco et al.2006, Muller et al. 2007; Buerger et al.2008; Hahnel et al. 2008). El recién desarrolladode dos colores en vivo / muerto técnicas de tincióncomplementar la investigaciónposibilidades de proporcionar una diferenciación visualentre las bacterias vivas y muertas(Boulos et al 1999;.. Hannig et al 2007;Al-Ahmad et al. 2008). En este contexto,SYTO 9 y la tinción con yoduro de propidioha demostrado ser superior en comparación conotros ensayos, ya que proporciona una claradiferenciación entre muertos y activamicroorganismos sin la interferencia defluorescencia de fondo (Decker, 2001).En los enfoques generales, microscopía de fluorescencia

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ofrecen la oportunidad de visualizarbacterias directamente sobre el sustrato y en elsituación de las adhesiones (Hanning y cols. de 2007).El presente estudio se llevó a cabo paraevaluar in vitro e in vivo en microbianala adhesión a chorro de arena y grabado al ácido-Promueve superficie de titanio en comparacióncon titanio mecanizado puro por medio dedos técnicas de fluorescencia de alta sensibilidad(Resazurina y manchas en vivo / muerto)y correlacionar estos resultados a las diferenciasen la rugosidad superficial, SFE, y la superficiemorfología.Materiales y métodosCaracterización de superficies de titanioDos diferentes tipos de muestras de titaniola medición de 9 mm de diámetro y 2 mm dethicknesswere utilizado. La textura Promuevede titanio de superficie (Biotecnologías CAMLOGAG, Basilea, Suiza) es con chorro de arena yal ácido y se utiliza para los Camlogssistema de implantes dentales (Biotecnologías CAMLOGAG). Promueve (de baile) fueron las superficiesen comparación con el titanio puro mecanizadaespecímenes (PT; Camlog). La rugosidad de la superficie(Ra) de cinco muestras de cada uno de losdos materiales en tres sitios diferentes fuedeterminó con un instrumento óptico (PerthometerS6P; Perthen, Go ¨ Göttingen, Alemania).El total de la SFE, su dispersión, y polarescomponentes se calcularon a partir automatizadopóngase en contacto con las mediciones angulares (OCA15 más; Instrumentos Dataphysics, Filderstadt,Alemania) como se ha descrito antes (Hahnelet al. 2008). SEM se llevó a cabo por tresmuestras de los dos materiales de titanio.Las muestras se monta directamente sobretalones de aluminio y con imágenes de SEM(Ampliación _ 600 _ y 8000)(Quanta FEG 400, FEI Company, Eindhoven,los Países Bajos).En la formación de biopelículas in vivo

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Tres mujeres sanas (A, B y C) ytres hombres sanos (D, E y F) se ofrecieron voluntariamentea participar en el presente estudio(Edad 22-38 años, media: 28 años, todos los no fumadores).Ninguno de los voluntarios había utilizadoenjuagues bucales antibacterianos sistémicos oantibióticos durante 12 meses antes del iniciodel estudio. El examen oral se llevó aa cabo por un dentista experimentado. Todos los voluntariostenía fisiológicas tasas de flujo salival(1-1.5ml/min) y una excelente higiene bucal(Índice de placa y el índice de sangrado del surcocerca de cero). El consentimiento informado por escritohabía sido dada por los sujetos y losestudio había sido aprobado por la ÉticaComité de la Universidad de Ratisbona(Solicitud 08/131). Todas las muestras se desinfectaron por ultrasonidos en 3%de hipoclorito de sodio (Farmacia de la UniversidadHospital de Regensburg, Ratisbona,Alemania) durante 20 minutos y luego se lavó enagua destilada. Las muestras estaban libres de microorganismosdespués de este tratamiento como lo demuestraSEM y vivo / muerto tinción. Por in vivola formación de biopelículas, las muestras fueronfijo a acrílico removible individuo superiorférulas mandíbula (Fig. 1), con el que el titaniolas muestras se coloca en elregión bucal de los premolares y el primermolares, de manera que el crecimiento de biopelículas fueno perturbado por movimientos de la lengua. Cadavoluntario tenía dos de baile y dos muestras de Ptinsertada. Los alimentos o bebidas de consumoy la higiene oral se les prohibió durante elcarro. Las tablillas fueron usados durante 12 horas.A continuación, las muestras fueron cubiertas de placaretirado de las férulas e inmediatamenteprocesado para la tinción de fluorescencia.Todas las muestras se transfirieron a bienplatos y lavar tres veces en phosphatebufferedsalino (PBS) para eliminar no adherente

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células. El BacLight bacteriana Live / Deadla viabilidad de kit (Molecular Probes, Eugene,O, EE.UU.) se utiliza para determinar elproporción de células vivas o activa (fluorescenteverde) y las células muertas o inactivas (fluorescenterojo). La mancha en vivo / muerto erapreparado por dilución de 18 ml de componente tinciónUn (SYTO 9) y 18 ml de tincióncomponente B (yoduro de propidio) en 15mlde agua destilada. Quinientos microlitrosde la mezcla de reactivos se añadieron a cadaasí, y las muestras fueron incubadas atemperatura ambiente y en la oscuridad durante15 min. Cada muestra se colocó con cuidadosobre un portaobjetos de vidrio cubierto con componenteC (aceite de montaje) y se almacena en eloscuridad a 41 º C hasta su posterior procesamiento. Fluorescenciaemisión se determinó con unmicroscopio de fluorescencia (BX61, OlympusGmbH, Hamburgo, Alemania), en combinacióncon el software de procesamiento de imagencell ^ P (Olympus GmbH). En cada muestra,las imágenes microscópicas fluorescentesde los cinco sitios seleccionados al azar fueron capturadoscon una cámara digital (U-CMAD3;Olympus GmbH) que se conecta ael microscopio. Las células vivas y muertas enel campo microscópico mismo se han visitadopor separado con el filtro de fluorescencia diferentesconjuntos (FITC/F41-054 y / Alexa594F41-027, ICA Analysetechnik, Tu ¨ Bingen,Alemania) y digitalmente combinado para unimagen. Las áreas cubiertas por las células muertas(Fluorescente de color rojo), las células viables (fluorescenteverde), y las células totales se calcularon comoporcentaje de la norma específica del microscopiocampos (420 _ 320 mm ¼ 0.13mm2) conel software de análisis de imágenes Optimas 6.2(Meyer Instruments, Houston, TX, EE.UU.).En la formación de biopelículas in vitroStreptococcus sanguinis (cepa 20068;DSMZ, Braunschweig, Alemania) fue

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utilizado en este estudio in vitro de biopelículasformación. Después de un congelado (_601C) precultivose habían establecido, las bacteriasfueron expuestos en una placa de agar y se incubarona 371C durante 48 h. Los cultivos de unasola colonia se cultiva en estérilescaldo de soja tripticasa (Trytic-Caldo de soja; BDDiagnóstico, Sparks, MD, EE.UU.) suplementadocon extracto de levadura (Sigma-Aldrich,St Louis, MO, EE.UU.) a 371C durante 16 h. Ladías antes del experimento, 1 ml de cadasuspensión bacteriana se habían inoculadocon 250 ml de caldo estéril de soja tripticasa(BD Diagnostics) y se incubó a 371C para12 h. Las suspensiones bacterianas se centrifugarona 896 g en 181 quater durante 5 minutos ylavó dos veces en PBS (Sigma-Aldrich). Ópticodensidad de las suspensiones se ajustóa 0,3 a 540 nm.Como se ha descrito antes, la oxidación-reducción de la fluorescencia del colorante Alamar Blue /Resazurina (0,75 g / ml de agua destilada) (Sigma-Aldrich) se utiliza para determinar el totalcantidad de bacterias que se adhieren (Buergeret al. 2007). Intensidad de fluorescencia seregistrados por un sistema automatizado de detección de multi-lector (Fluostar óptimos; BMG Labtech,Offenburg, Alemania) a longitudes de onda deExcitación de 530 nm y 590 nm de emisión.La saliva humana no estimulada se recogióde un donante sano de 31 años queno mostró lesiones cariosas activaso las enfermedades periodontales. La saliva fueesterilizado por medio de un solo uso filtracióndispositivos con tamaños de poro de 0,45 y 0,2 mm(Vacuflo PV050 / 2 y PV050 / 3; SchleicherY Schu ¨ ll Microscience GmBH, Dassel,Alemania). Incubaron a 371C durante 120 minutos,la saliva filtró formó una película salivalen todas las muestras (Hahnel et al. 2008). Después deeliminación de la saliva, PBS (1 ml) se añadió acada pocillo (15 muestras para cada material)

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y se determinó la autofluorescencia decada muestra. Después de la eliminación deltampón, 1 ml de suspensión bacteriana eraañadió a cada pocillo, y las placasSe incubaron con resazurina (15 ml) a371C de 120 minutos. La mezcla de bacteriassuspensión y resazurina se extrajo porsucción, los pocillos fueron posteriormentese lava dos veces, y 1 ml de PBS se añadió.Intensidades de fluorescencia después de la adhesión bacterianaSe determinaron como se ha descrito anteriormente.Los valores de fluorescencia de pura PBS (0 -de control), tampón y resazurina (colorante de control),y solución pura bacteriana (bacterias de control)sirvió como referencias de control. Relativa altala intensidad de fluorescencia (IFR) indicóadhesión de estreptococos alta.La película in vitro y la formación de biopelículasSe repitió con otros cinco especímenesde cada material, pero sin elAdemás de resazurina. Después de la incubación 120-minen un agitador orbital (semi-estáticacondiciones) con S. sanguinis, la proporciónde vida activa o estreptococos (fluorescentesverde) y de los muertos o inactivosestreptococos (fluorescente de color rojo) se determinócon la BacLight bacteriana Live / Deadkit de viabilidad (Molecular Probes) comose ha descrito anteriormente (por favor vea 'En vivo biofilmformación ").El análisis estadísticoLos datos continuos fueron resumidos porcon mediana y rango intercuartílico(25a-75o percentil). Global betweengroupcomparaciones se realizaron por elBrunner-Langer prueba para el ensayo in vivoy por el análisis rango de Kruskal-Wallis devarianza para el ensayo in vitro. La detecciónde las diferencias entre Ra y SFE, yla cantidad de bacterias adheridas en elprobadas las superficies de titanio (n = 2) se detectaronpor el par de sabios Utest de Mann-Whitney

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en combinación con el de Bonferronide ajuste (a doble cara de un ¼ 0,025). Los cálculosse realizaron con el software estadísticoSPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc.,Chicago, IL, EE.UU.) y SAS (SAS Institute,Cary, NC, EE.UU.).ResultadosCaracterización superficial de titaniosustratosEl rango de Kruskal-Wallis de análisis de varianzareveló diferencias significativas entrePt y de baile en la rugosidad de la superficie(Ra) y los valores de SFE (Po0.001 tanto paralas comparaciones). Significativamente más alto promediovalores de rugosidad se encontraron resultados para baile(0,95 mm) que para Pt (0,15 mm). La mediana de laSFE de Pt fue significativamente mayor (totalSFE: 39,6 MJ/m2; componente de dispersión:35,9 MJ/m2; componente polar: 3,7 MJ/m2)que la mediana de la SFE de baile (en totalSFE: 18,3 MJ/m2; componente de dispersión:18,1 MJ/m2; componente polar: 0,2 MJ/m2).Imágenes SEM de discos Prom mostró unahomogénea rugosa micro-estructura(Fig. 2), mientras que a un aumento mayor,Superficies Pt mostró una configuración circularalterna de avión y aplanada y ásperoáreas de superficie (Fig. 3). La adhesión demicroorganismos, tanto in vitro como inin vivo - correspondió a estos superficie circularmodificaciones en las superficies de Pt, ylas bacterias se organizan en patrones orbitales(Fig. 4). En Promsurfaces, los microorganismosin vivo y S. sanguinis en la adhesión in vitropruebas se distribuye uniformemente en pequeñaagregados y no siguen ningún patrón(Fig. 5).En la determinación in vivo de adherencia microbiana(Vivo / muerto tinción)La prueba de Brunner-Langer estadístico revelódiferencias significativas entre la probadamateriales para las células totales (P = 0,00478), los

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células vitales (P = 0.00215) y las células muertas(P = 0,03322). Cálculos de vivo ycoloraciones muertas se dan en las figuras 6 y 7 yen la Tabla 1. Ejemplos para la in vivo fluorescenteimágenes microscópicas se muestran en laLas figuras 8, 4, y 5. En general, los seis voluntariosmostraron diferencias significativas en microbianaadhesión (bacterias totales, muertos, ybacterias vitales). La evaluación de la fluorescenciamicrografías de todos los voluntariosmostró que 1,1% (medio) de la superficiede material de referencia Pt estaba cubierta pormicroorganismos después de 12 horas in situ. Es significativo queáreas más grandes estaban cubiertos por microorganismosen el baile (8,5%) (p = 0,00478).Figura 7 y la Tabla 1 muestran el porcentaje delas células muertas de entre todas las células adheridas (que viveny las células muertas). 29,1% de los microorganismos detectadossobre Pt y el 23,7% de los queBaile estaban muertos (p = 0,03322).Los microorganismos colonizado la superficiecomo monocapa o agregados aislados delas células, o ambos, que fueron distribuidos al azarpero bien definidos (ver fig. 4). Ectópicosolitarios células epiteliales de la vía oralmucosa - fuertemente adherente al sustrato- Se encontraron en cada muestra de baile,mientras que no una sola célula se encuentra en Ptsuperficies (véase la Fig. 8).En la determinación in vitro de la adherencia microbiana(Tinción en vivo / muerto y resazurina)Los cálculos de la in vitro en vivo / muertocoloraciones se dan en la Tabla 2. Ejemplospara la in vitro microscópico fluorescenteimágenes se muestran en las figuras 9 y 10. Conformea los resultados in vivo, una significativamayor cantidad de adherirse S. sanguinisSe encontró que el baile sobre Pt. 11,2%(Mediana) de la superficie de los discos de baile eracubierto por estreptococos, de los cuales 0,5%estaban muertos (fluorescente de color rojo) y vital del 10,7%(Verde fluorescente). Significativamente menor

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áreas fueron cubiertas por S. sanguinis sobre Pt(3% en total: 0,4% bacterias muertas, 2,7%bacterias vitales) (Po0.001).La Tabla 2 muestra los resultados de la enresazurina in vitro como método de cuantificaciónIFR sobre los dos materiales de titanio de ensayo. Endiferencias estadísticamente significativas en general,fueron encontrados después de la fila de Kruskal-WallisEl análisis de la varianza (Po0.001). MayorRFI, lo que representa una mayor cantidad de adhesiónestreptococos, se encontraron de fiesta[Intensidad media de fluorescencia: 13489 relativaunidades de fluorescencia (RFU)] y de manera significativabajar RFI, es decir, cantidades más bajasde bacterias adheridas, para Pt (9945RFU)(Po0.001).DiscusiónLa adhesión de los microorganismos orales yla subsiguiente formación de microorganismos patógenosbiopelículas en la superficie de los implantes dentalesresultado de las infecciones de la peri-implantetejidos y, finalmente, en el fracaso del implante.La periimplantitis ha sido reportado en 16%de pacientes con implantes después de 9-14 años (Roos-Jansaker et al. 2006) Cuando peri-implantereacciones inflamatorias conducir a una exposiciónde las partes de un implante de micro-estructuradas parala cavidad oral, el típico e instintivorecomendación es para desbridar estas partesy obtener una superficie lisa (Del et al.2005; Barbour et al. 2007). Científicoconocimientos sobre los procesos fundamentalesde adhesión bacteriana a la superficie del implante esrecomendaciones pobres y terapia sobreperiimplantitis se basan principalmente en empíricaLos valores más que en bien fundadaresultados de la investigación. Por lo tanto, themain objetivo

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del presente estudio fue investigarin vitro e in vivo para la adherencia microbianados superficies de titanio por medio de diferentesdos técnicas de fluorescencia de alta sensibilidad(Resazurina y manchas en vivo / muerto) ycorrelacionar estos hallazgos a la superficie específicacaracterísticas [rugosidad superficial (Ra)y SFE].S. sanguinis, antes conocida como S. sanguis,se utilizó como un microorganismo de ensayo parala parte en el estudio in vitro de debido a supresencia común en la cavidad oral humana.Además, S. sanguinis se conoce como unpionero de bacteria en el biofilm oral,(Grossner-Schreiber et al 2001;. Rimondiniet al. 2002; Mabboux et al. 2004; Del et al.2005). Además, Drake et al. (1999) mostró que las superficies hidrofóbicas de titaniofueron preferentemente colonizado por S. sanguinis(En lugar hidrófobo). El titanio probadoes el material más utilizadopara la construcción de sistemas de implantes enla odontología moderna. A medida de las modificacionesde superficies de titanio del implante tienehan inventado para optimizar la unión del huesopotencial de los implantes dentales. En general,estas modificaciones de la superficie conducir a un aumentoRa y cambios variables en SFE, que enconvertir los cambios del potencial de adhesión de talesde titanio superficies (Pier-Francesco et al.2006).En los ensayos in vitro, un significativamente mayorcantidad microbiana de adherirse S. sanguinisSe encontró que el baile sobre Pt (resazurinatécnica: de 1,4 veces, en vivo / muerto tinción: 3.7veces). Este fenómeno fue aún máspronunciado en el ensayo in vivo (7,7 vecesmayor acumulación de placa en la que el bailesobre Pt), probablemente debido a la refugio

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efecto de superficies rugosas contra remociónfuerzas, que no se producen bajo semiestáticoen condiciones in vitro (Rimondini et al.2002). En general, el mayor número deadherirse los microorganismos en prom puede serexplicarse por las características superficiales diferentestales como Ra y SFE. Muchos estudios hanhan realizado sobre la influencia de la superficiecaracterísticas de restauración y prótesismateriales. En contraste, poca informaciónestá disponible en las interacciones fundamentalesentre los microorganismos y las superficies de los implantes.Adicionalmente, observaciones detalladas delos sustratos de implantes correspondientes ysus propiedades superficiales específicos tienen a menudosido tenida en cuenta.Uno de ellos mencionó el riesgo de peri-implantmicrobialla adhesión y la que resulta la periimplantitises rugosidad de la superficie elevada de la transmucosacomponente de un implante (Quirynenet al. 2002). La opinión actual indica quemateriales de bajo SFE con la reducción de los límites de Raadherencia microbiana inicial (An & Friedman1998; Quirynen et al. 1999). Nuestro medioSFE valores del titanio dos comprobadamateriales son consistentes con los valores SFEencontrado por Grossner-Schreiber et al. (2001)(Que reportaron los valores de los diferentes SFElas superficies de titanio entre 34,3 y38.71mJ/m2 incluyendo componentes de bajo polares)y Mabboux et al. (2004) (SFEvalores de 43,8 y 44,6 MJ/m2 también concomponentes de bajo polares). En el presenteestudio, Prom mostró significativamente mayorRa valores, los valores más bajos SFE, y un mayorin vitro e in vivo en la adhesión microbianaque pinta. Por lo tanto, la influencia de Ra sobrela acumulación de placa que parece ser másimportante que la influencia de SFE. MuchosLos estudios postulan una influencia predominantede Ra en contraste con SFE, que podría serafirmada por nuestra investigación (Bollen et al.

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1996, 1997; Quirynen et al. 1999, Pier-Francesco et al. 2006; Teughels et al. 2006).Algunos estudios in vivo indican un umbral Ra de 0,2 mm, por debajo del cual no másreducción de la acumulación bacteriana podríaSe espera (Bollen et al. 1996, 1997). Lamayor adherencia bacteriana en apoyo de baileesta tesis. De acuerdo con Verran yBoyd (2001), Baile (mediana Ra ¼ 0,95 mm)puede ser descrito como micro-rugosa y Pt(Mediana de RÃ ¼ 0,15 mm) como nano-áspero. Microorganismosen superficies rugosas se suponea ser más protegido contra las fuerzas de cizallamiento,y la colonización inicial se ha demostrado quepartir de irregularidades de la superficie (y NyvadFejerskov 1987; Bollen et al. 1997; Hannig1999; Quirynen et al. 1999). Sorprendentemente, ununa mayor retención de S. sanguinis en brutoáreas de superficie se muestra también en la semiestáticoen la parte de nuestro estudio in vitro, en los que noimportantes fuerzas de cizallamiento se puede esperar.Adicionalmente, en bruto andmicro superficies de texturano sólo parece acumular másla placa, pero esta placa también contiene másflora patógena (Bollen et al, 1996).En resumen, se ha demostrado claramente quesuperficies rugosas mejorar la adhesión bacterianatanto in vivo como in vitro y que elinfluencia de Ra supera la influenciadel SFE. Como consecuencia, todos los micro-estructuradapartes que están expuestas a la vía oralcavidad y sus microorganismos deben seraltamente pulido para generar un anticuerpo anti-adherenteo placa efecto de reducción. La relevanciade este procedimiento fue confirmada porla in vitro e in vivo los resultados de este estudio.La cantidad de bacterias que se adhieren en vivomostró alta intra-individual e interindividualvariabilidad, que también fue

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mostrado por Hannig et al. (2007), incluso después decortos tiempos de incubación. Sin embargo, los seisvoluntarios mostraron las mismas diferencias encarga microbiana en el titanio dos comprobadasuperficies (Prom vs PT) (Prom4Pt). Además,estas diferencias se correlacionan bien conlos resultados in vitro, que en la turnprovedimportancia de nuestro modelo en la adhesión in vitro.Por primera vez, in vivo e in vitrola adhesión bacteriana sobre los implantes dentales fueinvestigado por medio de Live / Dead tinciónpara estudiar la influencia de la superficie diferentetexturas sobre la viabilidad de las bacterias adheridas.Técnicas fluorométricos en la adhesiónLos estudios ofrecen la oportunidad de cuan-tivamente investigar un gran número de especímenesen un corto período de tiempo y, en elmismo tiempo, para estudiar detallada morfológicaaspectos de las técnicas microscópicas. Nose encontraron diferencias estadísticas entre losProm y Pt con respecto al porcentajede bacterias muertas y vital. Por lo tanto, las diferenciasen las características superficiales tales como Rao SFE - que difieren significativamente entreBaile y Pt - no puede influir enla viabilidad de las biopelículas orales. Curiosamente,un alto porcentaje de bacterias muertas entrelas células adheridas (Pt: 29,1% y el baile:23,7%) ya pudo haber sido encontrado después de 12 horas deen incubación in vivo. Nuestros hallazgos se correspondena los resultados de Hanning y col.(2007), que se encuentra alrededor del 40% de los muertoslas bacterias después de diferentes intra-oral de incubaciónveces. En conclusión, el papel de los muertosmaterial biológico en el proceso de formaciónde (oral) biofilms puede haber sido subestimadoen el pasado y debe ser aún másinvestigado. En general, la informaciónobtenido a partir de técnicas de fluorescencia essobre todo de naturaleza cuantitativa. Por lo tanto,la composición de especies de la microbianacomunidades en las muestras analizadas fue

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no determinado. En contraste con anterioridadllevadas a cabo métodos moleculares, no hay conclusionesen la composición de la biopelícula puede serelaborado (Amann et al., 1995).En modelos in vitro se utilizan frecuentemente enestudios sobre la adherencia microbiana específica sobresubstratos, porque son reproducibles yrentable. Además, la interpretaciónde los resultados se simplifica por el UserDefinedinclusión y exclusión de determinadalos factores que influyen. En comparación, en vivomodelos ofrecen la oportunidad de evaluarmateriales en condiciones clínicas realistas, presentandoplaca compuesta, co-adherentes microorganismos,película salival, y la eliminaciónlas fuerzas de flujo salival y las actividades de mascar(Rimondini et al., 2002). Con elbeneficio de la retrospectiva, los resultados obtenidos in vitro sonde acuerdo con nuestra fuerte resultados in vivo.Por lo tanto, nuestro modelo semi-estático in vitro encombinación con la resazurina y eltécnicas en vivo / muerto representan realista ymodelos reproducibles para probar la bacterianaadherencia en implantes dentales.Adheridas las células epiteliales de solitariosla mucosa oral se encuentra en cadaLa muestra de baile, mientras que no es una sola célulaSe encontró en las superficies de Pt. Esta secundariamostró que la búsqueda de características de la superficie de materiales,que tienen una influencia fundamentalen la acumulación de placa, también influyen en laformación de la inserción epitelial. Laefecto de Ra y SFE en el apego, la orientación,y la proliferación de gingival humanofibroblastos se ha demostrado en variosotros estudios (Kononen et al 1992; Mustafa.et al. 1998; Lauer et al. 2001; Rimondini etcol. 2002). Aunque esta hipótesis no fueprobados en nuestro estudio, el elevado número deectópicos en las células epiteliales de baile, fuertementeadherente a la superficie - parece sugerirProm que puede ser un material prometedor

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capaz de mejorar la formación de la unión celulary la osteointegración.La contaminación biológica es difícil deeliminar de la superficie del implante estructuradas,por ejemplo por el uso de curetas de plástico o sónica /raspadores ultrasónicos (Schwarz et al. 2009).Así, además de hacer implantes dentalescon los potenciales de unión del hueso de alta, esimportante el desarrollo de superficies de los implantes quereducir el número de adherir inicialmentebacterias. En este punto en el tiempo, estos dossolicitudes para la construcción de implantemateriales por desgracia se contradicenotro. En general, los fabricantes modificacionesde las superficies de los implantes y el tratamientorecomendaciones sobre las estructuras de implantes expuestosdebe basarse en resultados de la investigación.Por lo tanto, las investigaciones se necesitan másen los procedimientos esenciales de bacteriasla adherencia en la superficie del implante. Como titaniopor sí mismo no muestran ninguna actividad antibacteriana,antiadhesivos revestimientos o aleaciones para proporcionarsuperficies bactericidas puede ser unalternativa a la periimplantitis invasiva convencionalterapias.ConclusionesDentro de las limitaciones del presente estudio,nuestros hallazgos indican que in vitro een la adhesión in vivo de las bacterias a diferentesuperficies texturadas de titanio está influenciado principalmentepor la rugosidad superficial. En contraste,la influencia de SFE es de menor importancia.Por lo tanto, cualquier micro-estructuradaparte que está expuesta a la cavidad oraldebe ser altamente pulido para generar unefecto anti-adherente y la placa reductoras.Un alto porcentaje de células muertas entre elbacterias adheridas se pudo observar en todoespecímenes de titanio. Esta observación confirmael papel fundamental de los muertos biológicamaterial en el proceso de formación de (oral)biopelículas. Por último, los dos fluorométrico

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técnicas (resazurina y en vivo / muerto tinción)utilizados en el presente estudio demostró serreproducibles, sensibles, y las herramientas precisas paraestudio in vivo e in vitro en biopelícula inicialformación sobre superficies de los implantes de titanio.Agradecimientos: Agradecemosa la Camlog Biotecnologías AG(Basilea, Suiza) para el suministro deespecímenes de titanio. Los autoresdeclaran que no tienen ningún conflicto deinterés