IN Cell Analyzer 1000 を用いた神経上皮細胞 …...・Hoechst 3258 （ i nv troge...
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Application Note IN Cell Analyzer 1000 はじめに IN Cell Analyzer 1000 は生細胞、固定細胞を迅速かつ簡便に 多色蛍光イメージングし、取得イメージから得られる生化学的情 報を迅速に数値化する High Content Analysis を目的に開発さ れたシステムです。近年では解析ソフトウェアの機能向上により、 従来ではフローサイトメーターで行われているポピュレーション解析 にもHigh Content Analysis の手法が用いられています。蛍光顕 微鏡をベースとした測定であるため、接着細胞であってもマイク ロタイタープレートから剥離する必要がなく、限られた細胞数で迅 速に解析することができます。 今回は、High Content Analysis の手法を用いたポピュレーショ ン解析例として、マウス胎児由来の神経上皮細胞を用いたLIF （Leukemia Inhibitory Factor）および Chemical X の添加によ る分化誘導の評価を行いました。 実験内容 使用した製品 ・IN Cell Analyzer 1000 ・IN Cell Investigator Software ・画像数値化：Developer toolbox ・数値グラフ化：Spotofire DecisionSite サンプルおよび試薬 ・マウス胎生 14.5 日胎仔終脳由来神経上皮細胞 ・DMEM/F-12（Sigma 社、D2906） + N2 supplement + bFGF, EGF （各 10 ng/ml） ・Hoechst 33258 （invitrogen 社、H1398） ・Monoclonal Anti-MAP2 antibody produced in mouse （Sigma 社、M4403） ・Fluorescein（FITC） AffiniPure Donkey Anti Mouse IgG （H+L） （Jackson ImmunoResearch Laboratories 社、715-095-151） ・Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein（GFAP） （Dako 社、Z0334） ・Donkey anti-Rabbit IgG, Cy3 conjugate （Millipore 社、 AP182C） マウス胎生 14.5 日胎仔終脳由来神経上皮細胞をN2 supplement、 bFGF およびEGF （各 10 ng/ml ）を含むDMEM/F-12 培地で培養後、 LIF（Leukemia Inhibitory Factor）、Chemical X、2.5 ng/ml LIF + Chemical X の3 条件により、2 日間処理を行いました。（図1） 細胞固定後、一次抗体として1/200 希釈anti-MAP2 抗体および 1/1000 希釈anti-GFAP 抗体、二次抗体として1/200 希釈FITC 標識 抗体および1/400 希釈Cy3 標識抗体を用いた免疫染色を行いました。 調製したサンプルは、IN Cell Analyzer 1000 による画像取り込み 後、画像解析ソフトウェによる解析を行いました。（図 2-4） IN Cell Analyzer 1000 を用いた 神経上皮細胞分化のポピュレーション解析 71-3236-11 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 図 1 アッセイプレートフォーマット Plate1 ：LIF、80 ng/ml から1/2 希釈 Plate2 ：Chemical X、50 nM から1/2 希釈 Plate3 ：2.5 ng/ml LIF （固定） + Chemical X、 50 nM から1/2 希釈 3 ウェルずつ同濃度で測定。 ウェルH10 ～ H12 が最も添加物質の濃度 が高い測定ウェルであり、以下、行方向 （G → F → E、、、、A）に32 段階で 1/2 希釈。 ウェルA1 ～ A3 がコントロール（添加なし）測 定サンプル。
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Application Note IN Cell Analyzer 1000
はじめに
IN Cell Analyzer 1000は生細胞、固定細胞を迅速かつ簡便に多色蛍光イメージングし、取得イメージから得られる生化学的情
報を迅速に数値化する High Content Analysis を目的に開発されたシステムです。近年では解析ソフトウェアの機能向上により、
従来ではフローサイトメーターで行われているポピュレーション解析
にもHigh Content Analysisの手法が用いられています。蛍光顕微鏡をベースとした測定であるため、接着細胞であってもマイク
ロタイタープレートから剥離する必要がなく、限られた細胞数で迅
速に解析することができます。
今回は、High Content Analysisの手法を用いたポピュレーション解析例として、マウス胎児由来の神経上皮細胞を用いたLIF（Leukemia Inhibitory Factor）およびChemical Xの添加による分化誘導の評価を行いました。
実験内容
使用した製品
・IN Cell Analyzer 1000・IN Cell Investigator Software・画像数値化：Developer toolbox・数値グラフ化：Spotofire DecisionSite
サンプルおよび試薬
・ マウス胎生14.5日胎仔終脳由来神経上皮細胞・ DMEM/F-12（Sigma社、D2906） + N2 supplement + bFGF, EGF （各10 ng/ml）・ Hoechst 33258 （invitrogen社、H1398）・ Monoclonal Anti-MAP2 antibody produced in mouse （Sigma社、M4403） ・ Fluorescein（FITC） AffiniPure Donkey Anti Mouse IgG （H+L） （Jackson ImmunoResearch Laboratories社、715-095-151）・ Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein（GFAP） （Dako社、Z0334） ・ Donkey anti-Rabbit IgG, Cy3 conjugate （Millipore 社、
AP182C）
マウス胎生14.5日胎仔終脳由来神経上皮細胞をN2 supplement、
bFGFおよびEGF （各10 ng/ml）を含むDMEM/F-12培地で培養後、
LIF（Leukemia Inhibitory Factor）、Chemical X、2.5 ng/ml LIF + Chemical Xの3条件により、2日間処理を行いました。（図1）細胞固定後、一次抗体として1/200希釈anti-MAP2抗体および
1/1000希釈anti-GFAP抗体、二次抗体として1/200希釈FITC標識抗体および1/400希釈Cy3標識抗体を用いた免疫染色を行いました。調製したサンプルは、IN Cell Analyzer 1000による画像取り込み後、画像解析ソフトウェによる解析を行いました。（図2-4）
IN Cell Analyzer 1000を用いた神経上皮細胞分化のポピュレーション解析
71-3236-11
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
図1 アッセイプレートフォーマット
Plate1 ： LIF、80 ng/mlから1/2希釈Plate2 ： Chemical X、50 nMから1/2 希釈Plate3 ： 2.5 ng/ml LIF（固定） + Chemical X、 50 nMから1/2 希釈
3ウェルずつ同濃度で測定。ウェルH10～H12が最も添加物質の濃度が高い測定ウェルであり、以下、行方向
（G→F→E、、、、A）に32段階で1/2希釈。ウェルA1～A3がコントロール（添加なし）測定サンプル。
● 2 Application Note 71-3236-11
Plate1 : LIF 添加
Plate2 : Chemical X添加
Control（ウェル：A1）
Control（ウェル：A1）
LIF0.08 pg/ml（ウェル：D6）
Chemical X0.05 pM（ウェル：D6）
LIF80 ng/ml（ウェル：H12）
Chemical X50 nM（ウェル：H12）
核（Hoechst 33258）
神経細胞（FITC標識 anti-MAP2）
グリア細胞（Cy3標識 anti-GFAP）
Fused
核（Hoechst 33258）
神経細胞（FITC標識 anti-MAP2）
グリア細胞（Cy3標識 anti-GFAP）
Fused
結果
撮影画像および解析結果
3●Application Note 71-3236-11
Plate1 : LIF
Plate3 : 2.5 ng/ml LIF + Chemical X添加
Plate3 : 2.5 ng/ml LIF + Chemical XPlate2 : Chemical X
Control（ウェル：A1）
Chemical X0.05 pM（ウェル：D6）
Chemical X50 nM（ウェル：H12）
核（Hoechst 33258）
神経細胞（FITC標識 anti-MAP2）
グリア細胞（Cy3標識 anti-GFAP）
Fused
図2 IN Cell Analyzer 1000による撮影画像
図3 各種薬剤が与える神経細胞分化への影響X軸：FITC蛍光強度（MAP2：●＞250＞●）、Y軸：Cy3蛍光強度（GFAP：●＞240＞●）。各プロットは3ウェル分の総細胞数による。薬剤添加濃度は図1を参照してください。
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図4 各種薬剤による神経分化マーカー発現および細胞形態変化への影響（Spotfire DecisionSite）A plate1：LIF添加B plate2：Chemical X添加C plate3：2.5 ng/ml LIF、Chemical X添加横軸
①細胞数、②FITC蛍光強度、③Cy3蛍光強度、④突起を持つ細胞数、⑤突起本数（合計）、⑥突起面積（合計）、⑦突起長さ（合計）、⑧突起Cy3蛍光強度（合計）、⑨突起本数（平均）、⑩突起面積（平均）、⑪突起長さ（平均）、⑫突起Cy3蛍光強度（平均）。
まとめ
今回、IN Cell Analyzer 1000を用いて、各種薬剤が与える神経表皮細胞の分化誘導に対する影響を解析しました。その結果、LIF、Chemical Xの各濃度におけるニューロン（MAP2）、グリア（GFAP）への分化誘導効率の違いが確認されました。特に、GFAP陽性細胞を誘導することが知られているLIFでは、0.625 ng/ml以上の
濃度におけるGFAPの発現上昇が認められました。画像解析をベースにしたHigh Content Analysis技術では、接着細胞を剥がすことなくポピュレーション解析が行えるほか、マーカー発現量だ
けでなく形態変化を含めた多角的な解析が可能です。これによ
り、単に分化誘導の評価を行うだけではなく、機能評価もあわ
せた解析を行うことができます。
A
B
C
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫
処理濃度
Low
High
処理濃度
Low
High
処理濃度
Low
High
小 大
