IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA ...

Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo

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IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA

MICROBIOLÓGICA PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN

PREPARACIONES MULTIVITAMINICAS UTILIZANDO

Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491

YENNY CAROLINA BELTRÁN MENDOZA

LICETH ALEJANDRA CABREJO CÁRDENAS

TRABAJO DE GRADO

Presentado Como requisito parcial para optar por el título de

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C. 2001


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DIRECTOR

JUAN CARLOS ESPARRAGOZA QUÍMICO FARMACÉUTICO

CODIRECTOR P.U.J.

JANETH ARIAS BACTERIOLOGA MSc.

ASESOR

JAZMÍN RIVERA QUIMICO FARMACEÚTICO

ASESOR

AMPARO JARAMILLO BACTERIOLOGA




Bogotá, D.C. 2001


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JURADO

JURADO




Bogotá, D.C. 2001


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CARLOS CORREDOR Ph. D DECANO ACADÉMICO


AURA ROSA MANASCERO MSc DIRECTORA DE CARRERA

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL




Bogotá, D.C. 2001


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"La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus tesis de grado" Artículo 23 de la resolución número 13 de Julio de 1946

AGRADECIMIENTOS


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Agradecemos al Doctor Juan Carlos Esparragoza,

Gerente de Aseguramiento de Calidad quién nos brindó su

apoyo para cumplir con los objetivos planteados en este

proyecto; al personal del departamento de Control de

Calidad de Merck Colombia S.A. especialmente a Jazmín

Rivera quien nos orientó para llevar una metodología en el

desarrollo de este proyecto, a Amparo Jaramillo por

facilitarnos el desarrollo experimental en el área de

microbiología, a Elisita, Marlencita y Amparito por su

colaboración. A todas las personas que de alguna manera

nos brindaron su apoyo, sus conocimientos y su paciencia

para llevar acabo este proyecto.

Yenny y LicethYenny y Liceth


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DEDICATORIA

Hoy quiero darle gracias a Dios por la sabiduría que me ha dado

durante toda la vida, y porque ha sido este don, el que ha permitido que

todos los conocimientos recibidos durante mi carrera hayan sido

aplicados en este trabajo de grado y en mi futura vida profesional. A

mi papi por su amor, su apoyo y si interés por formar en mi una persona

útil para la humanidad y por que hoy se ven los resultados de ese gran

ideal. A mi Mami por su sabiduría, apoyo y comprensión, porque ha

sido un modelo de mujer y madre en mi vida. A mis hermanos a quienes

hoy reto para que luchen por conseguir lo que quieren, por su amor y

apoyo durante el desarrollo de este trabajo. A mi abuelita por su guía

espiritual que ha sido una herramienta valiosa en mi formación .

Javier, gracias por tu amor, por tu comprensión y tu apoyo

incondicional.

Liceth A.


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DEDICATORIADEDICATORIA

A las dos personas que son mi razón de existir, mi Madre y mi hijo. Ya

que de alguna forma con este logro puede corresponder a su amor y a

su apoyo.

Madre, gracias por tu confianza, amor, comprensión y

tolerancia; gracias por escucharme y aconsejarme en los

momentos difíciles de mi vida por que gracias a tu

compañía he conseguido ser una mejor persona, amiga y

madre.

Hijo, aquí se refleja el esfuerzo que he hecho para lograr el

éxito de mi carrera y así poderte brindar un mejor futuro.

Que Dios los bendiga.

Los Amo,


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Yenny

RESUMENRESUMEN

Para la industria farmacéutica es di vital importancia el control

de calidad de cada uno de sus productos, para alcanzar esta

calidad existen herramientas como las buenas prácticas de

manufactura las cuales incluyen un control en cada una de las

etapas de producción y en si al producto terminado. Este

control se basa en métodos analíticos que valoran la cantidad

de principios activos declarados en los envase, por esta razón

se implementó y estandarizó una técnica analítica para la

determinación de Mio-inositol en productos multivitamínicos

empleando Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491.

Se empleo este microorganismo debido a su auxotrofía por

esta vitamina, es decir a que su crecimiento es directamente


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proporcional al logaritmo natural de la concentración de

Mio-inositol.

Se utilizó la prueba estadística t student para determinar la

linealidad de la curva patrón encontrando que para un nivel

de confianza del 95% no se cumple con el parámetro del

intercepto, ya que se presenta variabilidad en el blanco

empleado para ajustar la línea base del espectrofotómetro,

debido a que el microorganismo siempre crece diferente, unas

veces presenta un alto crecimiento y otras veces bajo

crecimiento, pues depende de las condiciones ambientales.

Lo cual indica no se puede obtener una sola curva patrón si

no que por el contrario es necesario que en cada ensayo se

realice una curva patrón. Se determino la selectividad de

Schizosaccharomyces pombe exponiéndola a los diferentes

componentes del producto (Vitaminas del grupo B) ya que

se consideran factores de crecimiento para los


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microorganismos en general. Obteniendo como resultados de

interferencia porcentajes menores al 5%, concluyendo de esta

manera que S. pombe solo dará respuesta debido

únicamente a la presencia de Mio-inositol y no a la presencia

de los demás componentes del producto.

La técnica fue retada con dos lotes diferentes de producto

los cuales mostraron un porcentaje de recuperación alto ,

presentándose coeficientes de variación menores al 3%

indicándonos que con esta técnica podemos obtener datos

confiables para determinar Mio-inositol en producto.

INTRODUCCIÓN

Las vitaminas son compuestos orgánicos requeridos para el crecimiento

normal y el mantenimiento de la vida de los animales, incluido el hombre. Estos


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compuestos son efectivos en pequeñas cantidades, no aportan energía y no son

utilizados como unidades estructurales del organismo, sino que son esenciales para

la transformación de la energía y para la regulación del metabolismo de las

unidades estructurales (Gennaro, A., 1998)

Las vitaminas son diferentes unas de otras en la composición química y en la

función. Solo se asemejan en que no pueden ser sintetizadas por los organismos en

absoluto o por lo menos, no a una velocidad adecuada en los tejidos de animales y

seres humanos. Las funciones que cumplen caen dentro de dos categorías: el

mantenimiento de la estructura normal y el mantenimiento de las funciones

metabólicas normales (Gennaro, A., 1998) Por ejemplo, la D(+)-Biotina está

vinculada a la síntesis de ácidos grasos, fijación de CO2 y metabolismo de los

aminoácidos (Curtis, 1993), mientras que el inositol es precursor del

fosfatidilinositol el cual promueve la transmisión de señales neurales y es un factor

de crecimiento (Davidson, M. 2000)

Las vitaminas se clasifican en dos grupos, liposolubles e hidrosolubles. Las vitaminas

A, D, E y K tienen poco en común en su estructura, pero todas son insolubles en

agua, se disuelven en grasas y pueden ser extraídas con solventes no polares, se

encuentran en las fracciones lipídicas de los tejidos animales. Las vitaminas

hidrosolubles son el ácido ascórbico, inositol y las vitaminas del grupo B, que

poseen funciones biológicas como cofactores enzimáticos y no se almacenan en los

tejidos corporales, razón por la cual deben incluirse en la dieta para mantener los

niveles adecuados (Wilbraham, et al. 1989)

La caracterización de las vitaminas como factores metabólicos esenciales con

estructuras químicas diferentes, exigió su aislamiento en forma pura de fuentes

naturales y su posterior síntesis en el laboratorio. La síntesis química o


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microbiológica comercial, son la fuente principal de las vitaminas empleadas, en la

actualidad, en preparados farmacéuticos, suplementos dietéticos y alimentos

fortificados (Gennaro, A. 1998), en estos preparados la potencia de las vitaminas se

mide por tres tipos principales de métodos: biológicos en los que ratas, ratones,

cobayos y pollos sirven como animales de ensayo; químicos, que usan un color

característico o una reacción sensible específica para los compuestos, existen para

la mayoría de las vitaminas en mezclas sencillas, las separaciones cromatográficas

seguidas de diversas técnicas de detección brindan medios alternativos de

cuantificación. Los Métodos microbiológicos emplean microorganismos que

requieren algunas vitaminas hidrosolubles, son rápidos, específicos y precisos; estos

métodos se utilizan para la fabricación y el control de laboratorio de la producción

de algunas vitaminas (Gennaro, A. 1998)

1. JUSTIFICACIÓN

Para la Industria Farmacéutica es de vital importancia el Control de Calidad de cada

uno de sus productos; para asegurar esta calidad existen las buenas prácticas de

manofactura (BPM), las cuales se refieren tanto a la producción como al Control de


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Calidad; Algunos de los requisitos básicos de éste, son la validación de los métodos

de prueba para valorar el contenido de ingredientes activos que deben cumplir con

la composición autorizada y declarada en los envases (Botero. 2000).

El Control de Calidad de productos terminados se realiza mediante ensayos de tipo

fisicoquímico y microbiológico. El análisis de vitaminas por procedimientos

fisicoquímicos es dispendioso, debido a la concentración excepcionalmente baja en

la que se encuentran en las preparaciones farmacéuticas (Strohecker, R. 1967).

En estos casos, la microbiología juega un papel importante ya que brinda

herramientas que permiten el desarrollo de nuevas alternativas mediante el uso de

microorganismos que requieren ciertos compuestos para su crecimiento; tal es el

caso de Schizosaccharomyces pombe, que necesita Mio-Inositol, como componente

primordial en el medio de cultivo para su desarrollo, por consiguiente y debido a

esta característica, son un medio de cuantificación del contenido de esta vitamina.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL


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Implementar y estandarizar la técnica para la determinación de Mio-inositol

utilizando un método microbiológico basado en el uso del microorganismo

Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491, para su cuantificación en preparaciones

farmacéuticas.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Comparar los parámetros cinéticos de crecimiento de Schizosaccharomyces

pombe mediante el desarrollo de curvas de crecimiento a diferentes

concentraciones de mio-inositol para evaluar su auxotrofía.

• Obtener una curva patrón para determinación de mio-inositol mediante la

evaluación de linealidad por análisis estadístico.

• Cuantificar la concentración Mio-Inositol en un producto multivitamínico

producido por Merck en otros países.

3. MARCO TEÓRICO

3.1. DEFINICIÓN DE INOSITOL

Existen sustancias que actúan en el organismo como vitaminas, pero no cumplen

criterios para ser denominados como ellas. Una de estas sustancias es el Mio-


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inositol que es un azúcar de tipo ciclitol; se encuentra en forma libre o combinada

en los tejidos de los riñones de todas las especies animales y en microorganismos.

Mio-inositol está en forma de fosfolípidos y juega un papel importante en el

metabolismo de las grasas. Naturalmente, se encuentra en el hígado, extracto de

levadura, hojuelas de maíz, frutas, nueces, avena, entre otros (Tolonen, 1990).

FIGURA 1.FIGURA 1. Fórmula Estructural de Mio-inositol ( Colodny, 2001)

Existen ocho diferentes isómeros cis-trans del hexa-hidroxi-ciclohexano. Dentro del

grupo de los ciclitoles se encuentran el Mio-inositol biológicamente activo y

ópticamente inactivo 1L-Mio-inositol-1-fosfato (formado desde glucosa-6-fosfato

en la biosíntesis de inositol), y 1D-Mio-inositol-1-fosfato (Constituyente de

fosfolípidos e inositol polifosfatos) que son activamente biológicos y ópticamente

inactivo (Queen, 1998). Otros nombres que han sido usados para señalar al Mio-

inositol son: inosita, ciclohexanohexanol, bios I, factor antialopecia entre otros

(Hofmann, 1972). Su fórmula empírica es C6 H12O6 y su fórmula estructural es la

siguiente (Queen, 1998).

1 2

3

4

5 6

OH

OH

OH OH OH

OH

MIO - INOSITOL


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1D-MIO-INOSITOL 1-FOSFATO

12

3

4

56

OH

OH

OH

OH OH

P-O

OH

OH

OH

OH

OH

65

4

3

2 1

P - O

1L-MIO-INOSITOL 1-FOSFATO

FIGURA 2.FIGURA 2. Formas Ópticamente activas de Mio-inositol (Colodny,2001)

3.2. FUNCIONES METABÓLICAS Y APLICACIONES CLÍNICAS DEL

INOSITOL

METABOLICAS

El metabolismo de fosfoinosítidos tiene una función en la acción hormonal que

depende del calcio: Alguna señal debe proporcionar la comunicación entre

receptor de la hormona sobre la membrana plasmática y los reservorios

intracelulares de Ca2+. Los receptores de superficie celular, como aquellos para

acetil colina y catecolaminas son activadores de fosfolipasas C cuando están

ocupados con sus respectivos ligandos. La fosfolipasa cataliza la hidrólisis de 4,5-

bifosfato de fosfatidilinositol a trifosfato de inositol y 1,2 diacilglicerol. El trifosfato

de inositol es un liberador eficaz de calcio desde sus sitios de almacenamiento

intracelular como el retículo sarcoplasmático y mitocondrias. Así, la hidrólisis de 4,


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5- bifosfato de fosfatidilinositol conduce a la activación de proteína cinasa C y

promueve un incremento del calcio iónico citoplasmático (Murray, et al. 1994)

Un cambio en las concentraciones de inositol en el sistema nervioso central

puede producir alteraciones en la señalización y eventualmente permitir el

desarrollo de desordenes neurológicos. Se ha evaluado la eficacia del inositol en

tratamientos de depresión, enfermedad de Alzheimers, desordenes compulsivos de

obesidad, autismo, desordenes de estrés y el control del dolor. Recientemente se ha

indicado que el inositol tiene efectos psicoactivos por su interacción con sistemas de

segundos mensajeros ya que regula la concentración de calcio en el citosol y su

movilización en el retículo endoplasmático, la cual puede ser efectiva en el

tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente (Colodny, 2001).

CLINICAS

El promedio de requerimiento diario de mio-inositol es un gramo. El inositol es

absorbido desde los intestinos, una proporción de este llega a ser azúcar y otra se

queda en el músculo cardiaco, el cerebro y otros órganos. Los niveles de inositol en

plasma son usualmente cercanos a 5 mg por litro. Existe una muy pequeña cantidad

de inositol en la orina de las personas saludables pero en diabéticos estos niveles se

incrementan (Hofmann, 1972).

Experimentos en ratones han demostrado que la deficiencia de mio-inositol, en

ellos causa perdida de cabello, reducción de crecimiento y secreción de leche,

excema, constipación, y defectos congénitos visuales. Para los ratones el inositol es

una vitamina B, por que es un factor dietético esencial para ellos. Otros

experimentos han demostrado además que el inositol tiene un efecto de tipo colina


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en el metabolismo, inhibe la acumulación de grasa en el hígado y otros órganos y

participa en la construcción de membranas celulares (Hofmann, 1972).

El inositol es un ingrediente fundamental de las membranas celulares como se

había mencionado anteriormente, y es necesario para proveer funciones

musculares, cerebrales y nerviosas. El inositol es lipotrófico y trabaja junto con

Vitaminas como la B 6, B12. colina, betaina y metionina para prevenir la

acumulación de grasas en el hígado. El inositol existe como un componente de fibra

llamado ácido fÍtico, el cual ha sido estudiado por sus propiedades anticancerígenas,

ya que dietas abundantes en inositol hexafosfato en fibra esta asociada con la baja

incidencia de ciertos cánceres, además ciertos neurotransmisores tales como

serotina y acetilcolina en el cerebro dependen del inositol (Gegerson, et al. 2000).

3.3. MÉTODOS CUANTITATIVOS PARA DETERMINACIÓN DE MIO-

INOSITOL

La determinación de mono y disacáridos es una de los más frecuentes análisis

requeridos en alimentos y tienen una considerable aplicación en estudios

nutricionales y bioquímicos. Dentro de los métodos convencionales para el análisis

de inositol se encuentran:

Métodos enzimáticosMétodos enzimáticos donde al azúcar que se va a analizar se le realiza un

tratamiento con una enzima apropiada y luego se determina la reacción del

producto, por espectrofotometría (Folkes, et al. 1998).

Métodos cromatográficos:Métodos cromatográficos: La más empleada es la HPLC (Cromatografía

Líquida de alta eficiencia), mediante la cual se determinan azúcares en


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alimentos. Aunque esta técnica es de alta sensibilidad, en preparaciones

farmacéuticas no es tan efectiva pues no alcanza a detectar las pequeñas

cantidades que se encuentran en las formulaciones de este tipo. Es un método

costosos (Folkes, et al. 1998). Otro tipo de cromatografía utilizada para la

cuantificación de mio-inositol es la GLC (Gas Liquid Chromatography), la

reactividad de Mio-inositol, proporciona su separación cromatográfica gaseosa

solo en forma de ésteres volátiles o éteres, como en el caso de otros ciclitoles y/o

azúcares. Mio-inositol ha sido determinado como el correspondiente hexaéter

en hidrolizados de levadura, preparaciones multivitamínicas, fosfolípidos y

tejidos animales, algunos de los otros inositoles importantes biológicamente y

otros ciclitoles tales como el mio-inositol-fosfato, en mezclas con azúcares

fosfatos, pueden ser también determinados por GLC como trimetilsilil éteres

(Davidek. et al. 1990).

Métodos biológicos:Métodos biológicos: Se basan en el consumo de Mio-inositol por hepatocitos

de ratones in vitro, empleando células de hígado las cuales predominan en el

metabolismo de fosfolípidos. Se ha demostrado mediante este método que la

cantidad de inositol es medida por la velocidad de consumo y el inositol

intracelular presente en cantidades que van desde 0.1 a 4.8mM. Estas

cantidades no son empleadas en el ámbito farmacéutico, por lo tanto, este

método no es sensible para estas determinaciones (Chi-po, et al. 1979).

Métodos MicrobiológicosMétodos Microbiológicos Liebig postuló por primera vez en 1871, un factor

de crecimiento requqerido por levaduras, el cual fue nombrado como “Bios” por

Wildiers en 1901y posteriormente, en 1911 Funk lo denomino vitamina . El

Mio-inositol fue el primer constituyente de “Bios” en ser aislado y caracterizado,


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representando así una herramienta para la investigación de ensayos

microbiológicos (Freed, 1966). Se ha estudiado la utilización de inositol en

Saccharomyces carlsbergensis y Schizosaccharomyces pombe, microorganismos auxotróficos

para inositol. Los métodos microbiológicos se basan en principios fotométricos y

espectrofotométricos para determinar una relación directamente proporcional

entre la cantidad de mio-inositol consumida por el microorganismo y su

crecimiento (Yarbrough, et al, 1956).

3.4. LEVADURAS "...ninguna clase de microorganismos ha estado más íntimamente asociada con el progreso y desarrollo de la raza humana como las levaduras” Tanner (Citado por Herrera, 1990).

Las levaduras son microorganismos unicelulares de formas y dimensiones diversas.

Pueden ser esféricas, ovales, elípticas, cilíndricas, cortas o alargadas, con extremos

redondeados o apiculados. Como son polimorfas adoptan distintas formas dentro de

la misma especie y aún en el mismo cultivo, lo cual depende de diversos factores,

especialmente del sustrato en que viven y de la edad de los cultivos. Debido a esta

circunstancia, la forma no siempre debe tomarse como característica taxonómica

(Herrera, 1990).

En muchos casos, al reproducirse las células, quedan unidas formando pequeñas o

largas cadenitas que son los pseudomicelios; asimismo, algunas de ellas pueden

desarrollar largos filamentos que constituyen un micelio verdadero (Herrera,

1990)


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Las dimensiones más comunes de las células varían entre 2 y 4 µm de ancho y 2 a

8µm de largo; sin embargo, se encuentran levaduras alargadas que tienen 10, 15 o

25µm de longitud, y aquellas que constituyen filamentos llegan a tener hasta 50, 70

y más micrómetros.

Las levaduras prosperan normalmente en hábitat con abundante azúcar, algunas

viven en simbiosis con animales, especialmente insectos y unas pocas son patógenas

para animales y hombres. (Brock, et al. 1993)

Las levaduras presentan las partes de una célula completa: Pared celular y

protoplasma; este último comprende la membrana fundamental (plasmalema), el

citoplasma y el núcleo. La pared celularLa pared celular o cápsula de secreción es delgada o gruesa

según la edad de la célula y la especie de levadura; esta formada principalmente de

polisacáridos constituidos por mananos, β-(1---3 y 1—6) glucanos y algo de

quitina (Shematek, et al. 1980); la pared primaria, cuando la célula de la levadura

se divide, casi siempre está compuesta de quitina, pero después, en las células

maduras, son más abundantes los otros des polisacáridos mencionados. El El

citoplasmacitoplasma es transparente y presenta varias estructuras metaplasmáticas, así como

granulaciones. Entre las metaplasmáticas están las mitocondrias, el retículo

endoplasmático y las vacuolas; a las segundas corresponden el glucógeno, los

glóbulos de grasa y los gránulos metacromáticos. El citoplasma esta involucrado en

eventos como el crecimiento polar de las levaduras (Herrera, 1990).

Las mitocondriasLas mitocondrias son corpúsculos refringentes constituidos por lipoídes y

nucleoproteínas que contiene ácido ribonucleíco y desoxírribonucleíco. La actividad

fermentadora de muchas levaduras esta ligada al desarrollo de estos corpúsculos

(Herrera, 1990).


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El retículo endoplasmáticoEl retículo endoplasmático, esta constituido por numerosas membranas tubulares

lisas. La vacuola contiene el jugo celular, formado principalmente por agua con

diversas sustancias de reserva, de secreción y excreción, así como cristales de sales

y de ácidos orgánicos. El glucógeno es casi siempre abundante en las levaduras que

se desarrollan en medios óptimos ricos en glúcidos, se encuentra en vacuolas

especializadas; los glóbulos de grasa se encuentran dispersos en el citoplasma

(Herrera, 1990).

Los gránulos metacromáticosLos gránulos metacromáticos constituidos por la volutina (polimetafosfatos)

representan las sustancias de reserva del citoplasma, principalmente en las

vacuolas, como inclusiones con movimiento browniano. El núcleo está delimitado

por una doble membrana que presenta numerosos poros y que en su interior

contiene el nucleoplasma o jugo celular. La membrana nuclearLa membrana nuclear permanece intacta

durante la mitosis, y juega dos papeles muy importantes: Fusión y secreción de

vesículas y síntesis de polisacáridos de pared, especialmente síntesis de glucanos

(Takeo, 1987). El núcleo varía según el grupo taxonómico (Herrera, 1990).

3.5. GENERALIDADES DE Schizosaccharomyces pombe

En 1983, P. Lindner fue el primero en describir la fisión de Schizosaccharomyces

pombe. Él aisló la levadura desde cerveza africana donde observó células

homotálicas coloreadas de ambos tipos de apareamiento + y -, los cuales al unirse

dan origen a ascas que contienen cuatro ascosporas. Lindner escogió el nombre

Schizosaccharomyces, por un lado, para dar una expresión significativa a la


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diferencia esencial que existe desde el punto de vista morfológico a la relación del

género Saccharomyces, y por otro lado, para tener en cuenta características

comunes tales como la formación de esporas y la capacidad fermentativa

(Hochstenbach, et al. 1997).

3.5.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA (Webster, 1970; Barnnet, et al. 1993)

REINOREINO Hongos

DIVISIÓNDIVISIÓN Eumycota

SUBDIVISIÓNSUBDIVISIÓN Ascomycotina

CLASECLASE Hemiascomycetes

ORDENORDEN Endomycetales

FAMILIAFAMILIA Saccharomycetaceae

SUBFAMILIASUBFAMILIA Schizosaccharomycetoidae

GENEROGENERO Schizosaccharomyces

ESPECIEESPECIE pombe

VARIEDADESVARIEDADES Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces

malidevorans

3.5.2. CICLO DE VIDA CELULAR DE Schizosaccharomyces pombe (Hochstenbach, et al. 1997) Durante el ciclo normal de vida, las células de la levadura son haploides,

principalmente las que solo tienen una copia de cada cromosoma y, así, una copia

de todos los genes. Las células haploides se multiplican asexualmente a través de

mitosis. Nuevamente nacen células en la punta del bastón en forma cilíndrica.


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Cuando han crecido hacia una longitud las células producen septos en la mitad de

las células. El septo divide la célula madre en dos células hijas iguales. En medio

rico las células hijas se separan para comenzar el ciclo celular haploide. Cada ciclo

celular haploide toma acerca de 3 horas.

FIGURA 3.FIGURA 3. Células Haploides de Schizosaccharomyces pombe (Hostenbach, 1997)

Schizosaccharomyces pombe es una levadura dimórfica, ésta puede tomar

morfologías de forma de bastón hasta morfologías pseudohifales, en las cuales las

células hijas permanecen unidas. El crecimiento pseudo-hifal permite que las

células se extiendan más eficazmente y proveer mejor los nutrientes.

FIGURA 4.FIGURA 4. Células pseudohifales de Schizosaccharomyces pombe

(Hostenbach et al, 1997)

Schizosaccharomyces pombe tiene dos tipos de apareamiento opositivos, es decir,

apareamiento + y -. Cuando condiciones ricas son requeridas por condiciones de

inanición, la forma de las células haploides de la levadura del apareamiento de tipo

opuesto se conjugaran en pares contrarios y fusionaran sus puntas.


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FIGURA 5. FIGURA 5. Conjugación de células de S. pombe (Hostenbach et al , 1997)

Subsecuentemente, el núcleo se fusiona para formar células diploides,

llamadasZigotos.

FIGURA 6. FIGURA 6. Formación del Zigoto (Hostenbach et al, 1997)

Usualmente, los zigotos sometidos a meiosis inmediatamente, de esporulación,

formación de esporas, y ascas zigoticas, sufren autolisis de la pared de las ascas

liberando las esporas del asca haploide con las cuales son capaces de sobrevivir a

largos períodos de estrés.


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FIGURA 7.FIGURA 7. Formación de ascas zigóticas (Hostenbach et al, 1997)

Cuando las condiciones del ambiente no son favorables para el crecimiento, las

esporas germinan y el ciclo celular de las células haploides comienza de nuevo. Si

los zigotos se encuentran en buenas condiciones favorables, ellos infrecuentemente

bajo meiosis y mitosis entran al ciclo celular diploide.

FIGURA 8.FIGURA 8. Ascosporas (Hostenbach et al, 1997)

Las células diploides de dividen mediante fisión, pero son más largas y más anchas

que las células haploides.

FIGURA 9.FIGURA 9. Células diploides (Hostenbach et al, 1997)


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TABLA 1- Medida de células haploides

FIGURA 10FIGURA 10. . Comparación de tamaño entre células haploides y diploides

(Hostenbach et al, 1997)

Las células diploides continúan el crecimiento mitótico hasta agotar nutrientes.

Luego ellas continúan en meiosis y formación de ascas azigoticas, conteniendo

cuatro ascosporas haploides. La espora germina y comienza el ciclo celular

haploide.

TIPO DE CELULASTIPO DE CELULAS ETAPA/MicrómetrosETAPA/Micrómetros

Cuando Nacen: 7-8µm Haploides

En división: 7-12 µm de largo

3-4 µm de ancho

Cuando nacen: 11-14 µm Diploides

En división: 20-25 µm de largo

4-5 µm de ancho


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FIGURA 11. FIGURA 11. Ascas azigóticas (Hostenbach et al, 1997)

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA:MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA: Colonias crema a color canela,

butirácea.

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA:MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA: Su reproducción es vegetativa por fisión,

no filamentosa, ascos evanescentes, contienen 1 a 4 ascosporas redondas y

ovaladas (Barnett, 1993)

TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO:TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO: Schizosaccharomyces pombe

es un microorganismo mesofílico que crece entre 25– 35ºC con una

temperatura óptima de 32ºC (Barnnet, et al. 1993).

TIEMPOS DE DUPLICACIÓN:TIEMPOS DE DUPLICACIÓN: Las células haploides de S. Pombe crecen con

los siguientes tiempos de generación en Medio Mínimo (Hochstenbach, et al.

1997).

TEMPERATURATEMPERATURA TIEMPO DE GENERACIONTIEMPO DE GENERACION

25°c 4 Horas

29°C 3 Horas 30 minutos

32°C 2 Horas 30 minutos

35.5°C 2 Horas 20 minutos

TABLA 2. TABLA 2. Tiempos de Generación según la temperatura de crecimiento (Hostenbach

et al, 1997)

pHpH: Generalmente los medios de cultivos empleados para el crecimiento de

S. pombe varían de acuerdo a la composición del medio, para medios mínimos

como agar extracto de malta es de pH 5,0 +/- 2 y en medios complejos varia

desde 4.8 hasta 7.0 (Mc Veigh, et al. 1995).


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AUXOTROFÍA:AUXOTROFÍA: Schizosaccharomyces pombe es un microorganismo

auxotrófico natural de inositol. Un factor crítico para el control del ciclo celular

de S. pombe es la cantidad exógena de mio-inositol adicionada al medio,

diferentes concentraciones estimulan el apareamiento y la esporulación en

medios mínimos (Niederberger, et al. 1998), Estudios han encontrado que el

crecimiento óptimo de esta levadura es obtenido al adicionar al medio 8µg/ml

de inositol. (Mc Veigh, et al. 1955). Este microorganismo también presenta

auxotrofía para ácido pantotenoíco, adenina, ácido glutámico, histidina, leucina,

lisina y uracilo (Hochstenbach, et al. 1997)

CULTIVOS LÍQUIDOS: CULTIVOS LÍQUIDOS: Cuando está en fase exponencial,

Schizosaccharomyces pombe crece entre 2x 106 y 1 x 107 células por ml. La

densidad óptica (DO) a 595 nm de un cultivo puede usarse para medir la

concentración de células, donde DO595 nm = 0.1 para aproximadamente 2 x 106

células por ml (Esta longitud de onda mide la dispersión de la luz). La relación

entre la DO y el número de células es lineal a DO 595 = 1 (Hochstenbach, et al.

1997).

3.5.3. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

3.5.3.1. FACTORES ORGÁNICOS DE CRECIMIENTO

Todas las especies de levaduras están reportadas para utilizar glucosa

aeróbicamente y cerca de la mitad de estas la fermentan anaeróbicamente,

probablemente a CO2 y etanol. Por contraste, muchas especies crecen

aeróbicamente sobre disacáridos, solo un poco pueden fermentar estas


- 31 -

aeróbicamente. Por ejemplo, más de las especies de levaduras pueden usar sustratos

tales como maltosa, trehalosa, celobiosa aeróbicamente (Barnnet, et al. 1982)

El transporte de azúcares como la D-glucosa en Schizosaccharomyces pombe se

realiza mediante el transporte de H+, presentándose un recirculamiento de protones

por la ATPasa H+ de la membrana plasmática (Hofer, et al. 1987).

Schizosaccharomyces pombe crece en concentraciones bajas de glucosa en

presencia de etanol de manera diaúxica, fenómeno que se presenta cuando las dos

fuentes de energía están presentes simultáneamente y la enzima necesaria para la

utilización de una de ellas esta sujeta a una represión catabólica, el organismo crece

primero sobre una fuente, habiendo a continuación un pequeño lapso de

tiempo de no crecimiento, para a continuación, volver a crecer utilizando

ahora la segunda fuente de energía (Brock, et al 1993).

Etanol y acetato son secuencialmente producidos desde glucosa y son utilizados en

secuencia. La principal ruta del catabolismo de D-glucosa en levaduras de S. pombe

es la vía glicolítica para la formación de piruvato. S. Pombe es facultativo capaz de

metabolizar aeróbicamente el piruvato por vía fermentativa y respirativa (Tsai, et al.

1992).

S. pombe no crece en cultivos con etanol o acetato como fuente de carbono, sin

embargo la fisión de levaduras utiliza etanol y acetato en presencia de D-glucosa. A

altas concentraciones de D-glucosa, la represión de la respiración resulta en la

producción aeróbica de etanol. La depleción de D-glucosa represa el metabolismo

respiratorio permitiendo la oxidación de etanol con acumulación de acetato (Tsai, et

al. 1987).


- 32 -

El ciclo activo del glioxilato es dependiente de D-glucosa y es fundamental para que

se lleve a cabo la gemación de las levaduras, este proceso puede utilizar acetato o

etanol solo en presencia de este azúcar, el cual es importante para que se lleve a

cabo la germinación de esporas (Blázquez, et al. 1994).

S. pombe crece en presencia de azúcares análogos a la D-glucosa como la 2-Deoxy-

glucosa formando paredes celulares frágiles, generando la muerte celular por lisis,

ya que este análogo inhibe algunas reacciones en la síntesis de polisacáridos

capsulares (Magnet, 1965).

3.5.3.2. IONES INORGÁNICOS CONSIDERADOS COMO

MACRONUTRIENTES

Los iones inorgánicos necesarios en considerables cantidades son el fosfato:fosfato:

requerido para la síntesis de ácidos nucléicos y fosfolípidos, el potasioel potasio requerido por

varias enzimas incluidas en el proceso de síntesis de proteínas; el magnesio,el magnesio,

estabiliza los ribosomas, las membranas celulares, los ácidos nucléicos y también es

empleado para el funcionamiento de algunas enzimas. El calcio,El calcio, ayuda a estabilizar

la pared. El hierroEl hierro es considerado como un macronutriente, ya que juega un papel

fundamental en la respiración celular, siendo un componente clave de los

citocromos y de las proteínas que contienen hierro y azufre implicadas en el

transporte de electrones (Brock, et al. 1993). El sulfato de amonio (NHEl sulfato de amonio (NH44))22 SO SO44 puede

utilizarse como única fuente de nitrógeno para el crecimiento de S. pombe (Mc

Veigh, et al. 1955).

3.5.3.3. MICRONUTRIENTES

Son metales muchos de los cuales forman parte de las enzimas que son catalizadores

celulares.


- 33 -

Cobalto:Cobalto: Necesario para la vitamina B12,

CobreCobre:: Ciertas proteínas, como son las implicadas en la respiración, como

citrocromo c oxidasa. Según un estudio de los requerimientos nutricionales de S.

pombe se requiere en concentraciones de 0,04 ppm. (Mc Veigh, et al. 1955).

ManganesoManganeso: Activador de muchas enzimas, presentes en algunas superóxido

dismutasas.

Molibdeno:Molibdeno: Presente en varias enzimas que tienen flavina, también en

nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxidasa, oxotransferasas y formato

deshidrogenasa (Brock, et al. 1993).

Níquel:Níquel: La mayoría de las deshidrogenasas, coenzima F y biosíntesis de

ureasa lo emplean en cantidades trazas (Eitinger, et al. 2000).

Zinc:Zinc: Cantidades de 0,18ppm están presentes en medios mínimos de S.

pombe debido a su requerimiento para la formación enzimas anhidrasa

carbónica, alcohol deshidrogenasa, RNA y DNA polimerasa.

Hierro:Hierro: Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas con hierro y azufre.

Este micronutriente se requiere en concentraciones de 0,2ppm. (Mc Veigh, et al.

1955).

3.5.3.4. FACTORES DE CRECIMIENTO

Son compuestos orgánicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy

pequeñas cantidades y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento

incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. La mayor parte de las

vitaminas funcionan como coenzimas (Brock, et al. 1993). En el caso de


- 34 -

Schizosaccharomyces pombe son empleados como factores de crecimiento los

siguientes compuestos:

TIAMINA TIAMINA: Empleada para α-descarboxilaciones y trancetolizaciones. La

concentración de esta vitamina en medios de cultivo de S. pombe es de 0,6mg/l. Sin

tiamina el crecimiento de la levadura se reduce en un 50% del crecimiento máximo

que presenta esta levadura (Mc Veigh, et al. 1955).

PIRIDOXINA: PIRIDOXINA: Se requieren cantidades de 0,6mg/l de piridoxina para el

crecimiento de S. pombe, en ausencia de este compuesto el crecimiento se reduce

en un 35% aproximadamente del crecimiento máximo que se presenta, ya que es

necesario para llevar a cabo reacciones de transformación de aminoácidos y

trancetolaciones. (Mc Veigh, et al. 1955).

ÁCIDO NICOTÍNICO ÁCIDO NICOTÍNICO:: Es un componente del NAD y NADP. Nicotinamida y Ácido

nicotínico, son nutricionalmente equivalentes cuando son asimilados para

propósitos de la síntesis de NAD(P).

PANTOTENATO DE CALCIO: PANTOTENATO DE CALCIO: EL crecimiento de S. pombe muestra una relación

lineal, a medida que se va incrementando la concentración de pantotenato de

calcio. Desde 0,0 hasta 0,05µg /ml (Mc Veigh, et al. 1955).

BIOTINA: BIOTINA: Empleada en la biosíntesis de ácidos grasos, B-descarboxilaciones, y

fijación de CO2. El consumo de biotina es estimulado por el transporte de glucosa

mediante sistemas de ATPasa; altos niveles de biotina en el medio reducen la tasa

de catálisis de consumo de biotina (Stolz, et al. 1999). La cantidad de biotina

requerida para el crecimiento máximo de S. pombe es de 0,001µg/ml (Mc Veigh,

et al. 1955).


- 35 -

MIO MIO--INOSITOL:INOSITOL: Muchos trabajos han encontrado que mio-inositol es un

factor de crecimiento para ciertos animales y microorganismos. Este

requerimiento es aparentemente específico para la forma ópticamente inactiva de

mio-inositol. Cuando el mio-inositol es adicionado al medio, la recuperación de

este y de las células de Schizosaccharomyces pombe es de 85-100%, demostrando

así que el inositol no es empleado para reacciones catabólicas, si no que es

utilizado como una molécula intacta( McVeigh, et al. 1955).

El inositol juega un papel general en el metabolismo de fosfolípidos, en la

gemación de levaduras de Schizosaccharomyces pombe. En este organismo, el

inositol puede ser sintetizado a partir de glucosa 6-fosfato en una reacción

catalizada por el enzima fosfato sintetasa. El inositol es utilizado en la síntesis de

fosfatidil inositol, fosfolípidos de membrana y actúa como un regulador en la

síntesis de fosfolípidos por niveles de represión de fosfatidil inositol y

fosfatidilcolina, y de las enzimas dependientes de Inositol 1-fosfato sintetasa, CDP-

diacilglicerol CDP-DG sintasa, Fosfatidilserina sintasa y descarboxilasa. De esta

manera se ha demostrado que existe una vía para síntesis de novo de fosfolípidos

en la fisión de levaduras de S. pombe (Roxann, et al. 1991).

La composición de los fosfolípidos de membrana de S. pombe es afectada por la

disponibilidad de precursores de fosfolípidos. En particular cantidades relativas

de fosfatidilinositol (PI), principal fosfolípido aniónico, y fosfatidil serina (PS)

varia en respuesta a la concentración exógena de inositol. Así, cuando la

concentración de inositol es baja, el contenido de PI decrece mientras el contenido

de PS incrementa. El precursor para la síntesis de PI y PS es CDP-diacilglicerol. Este


- 36 -

liponucleotido es un importante intermediario en la síntesis de fosfolípidos en

levaduras (Gaynor, et al. 1992)

Se ha demostrado que la concentración de Inositol P6 en S. pombe es regulada

por estrés, y que la enzima (1,4,5) P3 6-quinasa de esta levadura es una quinasa

multifuncional que fosforila Inositol (1,4,5) P3 a Inositol (1,4,5,6) P4 y Inositol

(1,3,,4,5,)P4 , estos compuestos son importantes en la señalización celular

especialmente el Inositol (1,4,5) P3 ya que incrementa la concentración de iones

Ca2+. Cuando se presenta una disrupción en la formación de Inositol (4,5) P2 5-

fosfatasa genera aberraciones en la formación de vacuolas, morfología en la

membrana plasmática, sensibilidad osmótica y crecimiento (Ongusaha, et al.

1998) y además es considerado un activador de los receptores de superficie

celular (Ongusaha, et al. 1997).

Los fosfolípidos de inositol son vitales para el control de las funciones celulares

participando como feromonas que controlan el apareamiento de las células de S.

pombe durante el ciclo celular, específicamente por la acumulación de

diacilglicerol y fosfolipasa C (Stuart, et al. 1995).

3.5.4. METABOLISMO DEL MIO-INOSITOL EN LEVADURAS

3.5.4.1. REACCIONES DE SÍNTESIS DE FOSFOLÍPIDOS EN LEVADURAS

(Carman, et al. 1989)

A partir de Glucosa:A partir de Glucosa:

Las reacciones de síntesis de inositol a partir de glucosa se realizan en la siguiente

secuencia:

SUSTRATOSUSTRATO ENZIMAENZIMA PRODUCTOPRODUCTO


- 37 -

Glucosa 6Glucosa 6--FosfatoFosfato Inositol 1Inositol 1--p Sintasap Sintasa Inositol 1Inositol 1--fosfatofosfato

Inositol 1Inositol 1--fosfatofosfato PiPi InosiInositoltol

InositolInositol

Fosfatidil Inositol SintasaFosfatidil Inositol Sintasa

Fosfatidilinositol + CMPFosfatidilinositol + CMP

FosfatidilinositolFosfatidilinositol GlicerolGlicerol--3p CMP3p CMP

Fosfatidilglicerol FosfatoFosfatidilglicerol Fosfato

Fosfatidilglicerol FosfatoFosfatidilglicerol Fosfato Fosfatidilglicerol fosfatasaFosfatidilglicerol fosfatasa FosfatidilglicerolFosfatidilglicerol

FosfatidilglicerolFosfatidilglicerol Cardiolipin SCardiolipin Sintasaintasa CardiolipinCardiolipin

A partir de glicerol:A partir de glicerol:

Las reacciones de síntesis de inositol a partir de glicerol se da en la siguiente

secuencia:


Glicerol 3PGlicerol 3P + Acil coA+ Acil coA Glicerol 3Glicerol 3--p Aciltransferasap Aciltransferasa AcilglicerolAcilglicerol--33--PP

11--Acilglicerol 3P +Acilglicerol 3P + AcilcoA AcilcoA Ácido FosfatidicoÁcido Fosfatidico Ácido fosfatidicoÁcido fosfatidico CTP Ppi CTP Ppi

CDP CDP--DG sintasaDG sintasa

CDPCDP--DiacilglicerolDiacilglicerol

CDPCDP--Diacilglicerol + Diacilglicerol + InositolInositol

Fosfatidil inositol SintasaFosfatidil inositol Sintasa

Fosfatidil inositol + Fosfatidil inositol + CMPCMP

3.5.4.2. REACCIONES DE DEGRADACIÓN DEL MIO- INOSITOL

(Genome, 2000).

Las reacciones que ocurren para la degradación de mio-inositol ocurren en el

siguiente orden:



- 38 -

MioMio--inositolinositol MioMio--Inositol Inositol

22--dehidrogenasadehidrogenasa

2,4,6/3,52,4,6/3,5--

pentahidroxiciclohexanopentahidroxiciclohexano

2, 4, 6 / 3, 5 2, 4, 6 / 3, 5 --penpentahidroxitahidroxi--

ciclohexanociclohexano

DD--2,32,3--dicetodiceto--44--deoxideoxi--epiepi--inositolinositol

.D.D--2,32,3--dicetodiceto--44--deoxideoxi--epiepi--

inositolinositol

22--DeoxyDeoxy--55--cetoceto--DD--acido acido

glucónicoglucónico

22--DeoxyDeoxy--55--cetoceto--DD--acido acido


22--desoxídesoxí--55--CetoCeto--DD--Acido Acido

glucónico 6glucónico 6--FosfatoFosfato

22--DesoxíDesoxí--55--CetoCeto--DD--Acido Acido


Fructuosa Fructuosa

bifosfato aldolasabifosfato aldolasa

Dihidroxiacetona fosfato 6Dihidroxiacetona fosfato 6--fosfatofosfato

Dihidroxiacetona fosfatoDihidroxiacetona fosfato TriosaTriosa--fosfatofosfato

isomerasa isomerasa

GliceraldehídoGliceraldehído--3P3P

El Gliceraldehído-3P obtenido al final de la degradación se integra al ciclo de las

pentosas fosfato.

3.5.4.3. METABOLISMO DEL INOSITOL TRIFOSFATO EN

Schizosaccharomyces pombe

El inositol -1,4,5-trifosfato es liberado por la fosfolipasa c a partir del fosfatidil-

inositol-5,6-difosfato. Es hidrosoluble y pasa al citoplasma. Si el inositol trifosfato

no se fija a una de sus proteínas receptoras, es rápidamente degradado por

hidrólisis de sus radicales fosfato, indispensables para su actividad biológica.


- 39 -

MEMBRANA CELULARMEMBRANA CELULAR INTERIOR DE LA CÉLULASINTERIOR DE LA CÉLULAS

ATPATP ADPADP

ÁCIDO FOSFATIDICO

CDP-DIACILGLICEROL

FOSFATIDIL INOSITOL

FOSFATIDIL-INOSITOL 5P

FOISFATIDIL-INOSITOL 4,5,DIFOSFATO

DIACILGLICEROL

ATPATP

ATP A D PA D P

A D PA D P

CTPCTP

C D PC D P

ACCIÓN DE SEGUNDO MENSAJERO

INOSITOL

INOSITOL1-FOSFATO

INOSITOL1,4 DIFOSFATO

INOSITOL-1,4,5,- TRIFOSFATO

FOSFOLIPASA C

GLICEROL ÁCDO ARAQUIDÓNICO ÁCIDO GRASO

PG

INOSITOL FOSFOMONOESTEARASA

4- FOSFOINOSITOL FOSFOMONOESTEARASA

5-FOSFOINOSITOL FOSFOMONOESTEARASA

FIGURA 12FIGURA 12.. Metabolismo degradativo del Inositol-trifosfato (Borel et al , 1989)

Una enzima específica, la 5-fosfoinositol-fosfomonoestearasa, quita el fosfato en 5.

Una segunda fosfomo-noestearasa específica quita el residuo fosfato en 4 y deja el

inositol-1-fosfato que es a su vez desfosforilado en inositol por una fosfatasa. El

Inositol así liberado es rápidamente reutilizado para volver a formar fosfatidil-

inositol. El diacil glicerol reacciona con el ATP (diacilglicerol quinasa), formando

un ácido fosfatídico que es activado a su vez por una reacción con CTP, lo que da el

CDP-diacil-glicerol, que reacciona con el inositol para volver a formar el fosfatidil-

inositol (Figura 12) (Borel, et al. 1989).


- 40 -

4. DISEÑO EXPERIMENTAL

4.1. PROCEDIMIENTO (Rieth. 1999)

4.1.1. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES REACTIVAS


- 41 -

Solución De Solución De Cloruro de Sodio:Cloruro de Sodio: Pesar 9,00 gramos de cloruro de sodio y llevar a

volumen de 1000ml con agua desmineralizada. Esterilizar en autoclave por 15

minutos a 121ºC.

Medio de conservación:Medio de conservación: Disolver en 200 ml de agua desmineralizada 20 g de

extracto de malta, 0,4 de extracto de levadura y 4 g de agar-agar. Calentar en baño

maría hasta disolución completa ; Ajustar el pH con ácido láctico a 5,0. Se dividió

en porciones de diez mililitros en tubos tapa rosca, esterilizar 15 minutos a 121ºC, y

dejar solidificar en posición oblicua.

Medio de inoculación:Medio de inoculación: Utilizar dos tubos de 10 ml de agar extracto de malta de

Merck solidificado en forma oblicua, y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.

Medio de prueba:Medio de prueba: Preparar según la técnica de Merck Alemania, las siguientes

soluciones nutritivas preparadas por separado.

• Solución nutritiva 1Solución nutritiva 1: Disolver en 100 ml de agua las siguientes sustancias bajo

calentamiento, en la secuencia descrita: 4 g de sulfato de amonio, 3 g de di-

hidrogeno fosfato de potasio 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidratado.

• Solución nutritiva 2Solución nutritiva 2: Disolver en 100 ml de agua 20 mg de Tiamina clorhidrato,

Piridoxina clorhidrato, Ácido nicotínico, Pantotenato de calcio.

• Solución nutritiva 3Solución nutritiva 3: Disolver 20 mg de biotina en 80 ml de agua adicionando

gota a gota hidróxido sódico 0,1 N hasta observar la completa disolución de la

biotina y diluir con agua hasta 100 ml.

• Solución nutritiva 4Solución nutritiva 4: Disolver 100 mg de extracto de levadura en 100 ml de

agua.

• Solución nutritiva 5Solución nutritiva 5: Disolver bajo calentamiento 200 mg de ácido bórico, 54

mg de sulfato de zinc heptahidratado, 58 mg de sulfato de cobre


- 42 -

pentahidratado, 60 mg de sulfato de manganeso monohidratado, 38 mg de

Heptamolibdato de amonio tetrahidratado en 100ml de agua. Realizar una

dilución 1:100

• Solución nutritivaSolución nutritiva 6: 6: Disolver 0,5 g de cloruro de calcio dihidratado en 100ml

de agua.

Medir los siguientes volúmenes de soluciones nutritivas en un balón aforado de

1000 ml colocando 200 mililitros de agua:

100 ml de solución nutritiva 1




10 ml de solución nutritiva 5.

Ajustar el pH a 4,8 con solución volumétrica de ácido clorhídrico 1N o con solución

volumétrica de Hidróxido de sodio 0,1N, posteriormente adicionar la solución

nutritiva 6 agitando fuertemente, diluir con agua hasta 1000ml.

Disolver 20,0 g de glucosa monohidrato en 500ml de medio básico y diluir con agua

hasta 900ml. Esterilizar 15 minutos a 121°C. Mantener en nevera máximo 6 meses a

+/- 4°C.

4.1.2. MICROORGANISMO DE PRUEBA

Se utilizó Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491, levadura dependiente de Mio-

inositol para crecimiento. Para la conservación de la levadura, se realizaron

transferencias cada dos semanas a nuevo medio de conservación el

microorganismo. Incubar 20 horas a 32ºC y refrigerar a 4ºC.


- 43 -

4.1.3. PREPARACIÓN SOLUCIÓN DE ESTÁNDAR DE MIO-INOSITOL

Pesar 25,25 mg de Mio-inositol de pureza 99,0% y se disolvieron en 100ml de agua

desmineralizada estéril en balón aforado para obtener un estándar de referencia de

concentración 250 µg de mio-inositol/ml. A partir de la solución de referencia se

preparan cinco soluciones de calibración de cconcentraciones 4, 6, 8, 10 y 12 µg de

Mio-inositol/ml (Anexo 1).

4.1.4. PREPARACIÓN DEL CULTIVO DE INOCULACIÓN

A partir de un tubo del cultivo de conservación transferir una asada de

Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491 a dos tubos del medio de inoculación,

incubar durante 16h a 32ºC y recoger las células de levadura con solución salina

0,9%, separar las células centrifugando durante 2 minutos a 3000 rpm,

resuspender el sedimento agitando circularmente con 10 ml de solución de cloruro

de sodio y centrifugar de nuevo. Después de repetir dos veces este proceso, tomar el

último sedimento en 20 ml de solución salina 0,9% y diluirlo de tal manera que al

medir en el espectofotómetro a 660nm se obtenga un 10% de transmitancia, se

realizó recuento en cámara de neubauer de la suspensión ajustada para determinar

la concentración aproximada de células por ml, utilizando una pipeta pasteur se

llenó la cámara con la suspensión ajustada y se contó al microscopio con el objetivo

de 10X el número de células en cinco cuadrados del cuadro central de las dos

cuadrículas de recuento, los datos obtenidos para cada cuadrícula fueron

promediados y se aplico la siguiente fórmula:


- 44 -

CÉLULAS/ CÉLULAS/ µµl DE SUSPENSIÓN l DE SUSPENSIÓN =. Células contadas . superficie (5cuadrados) * Profundidad cámara * dilución

Superficie de cinco cuadros= 0,2 mm2

Profundidad de la cámara = 0,1mm

4.1.5. DESARROLLO DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE

Schizosaccharomyces pombe

Para determinar las características de crecimiento (velocidad de crecimiento y

tiempo de duplicación) de Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491, el

microorganismo fue cultivado en el medio de prueba tratado con diferentes

concentraciones de Mio-inositol.

Transferir a 12 frascos schott 190 ml del medio de prueba y a cada dos frascos

adicionar10 ml de la solución estándar correspondiente a las concentraciones 4, 6,

8, 10 y 12 µg de mio-inositol/. Como blanco utilizar el medio de ensayo diluido

con 10 ml de agua desmineralizada. Esterilizar a 105ºC durante 10 minutos y

después del enfriamiento a temperatura ambiente, inocular todos los frascos con un

ml de suspensión de levadura previamente ajustada a 10%T, realizar por

duplicado.

Incubar durante 96 horas a 32ºC, tomando muestras cada tres horas para realizar

lectura espectrofotométrica a 535 nm de longitud de onda; ajustar el cero con el

medio libre de vitamina y de inóculo.

4.1.6 DESARROLLO DE LA CURVA PATRÓN


- 45 -

Realizar una curva relacionando el crecimiento de Schizosaccharomyces pombe

medo como absorbancia, con diferentes concentraciones de Mio-inositol en el

medio de prueba.

Adicionar 19 ml de medio de prueba a cada tubo y 1ml del estándar a cada serie de

tres tubos; los tubos blanco no llevan solución estándar si no 1 ml de agua

desmineralizada, esterilizar 10 minutos a 105°C.

Después del enfriamiento a temperatura ambiente, inocular cada tubo con 0,1ml de

la suspensión de levadura ajustada, excepto el tubo blanco sin inóculo. Incubar

todos los tubos durante 48 horas a 32 °C

Empleando el vortex, agitar los tubos y a cada uno adicionarle 3 ml de alcohol

etílico al 95% (Mc Veigh, 1955), dejar en reposo hasta que liberen todo el CO2

producido durante la incubación. Agitar nuevamente y tomar las lecturas de

turbidez en espectrofotómetro a 535 nm de longitud de onda. Utilizar el tubo

blanco sin inoculo para ajustar el cero y medir el valor de turbidez del tubo blanco

inoculado, tomar este como blanco para ajustar el cero y medir los valores de

turbidez de la curva patrón.

Promediar los valores de turbidez de cada una de las concentraciones y elaborar

una curva graficando los promedios de crecimiento microbiano como absorbancia

en las ordenadas y el valor de las concentraciones en abscisas.

A partir de esta grafica determinar el modelo de crecimiento y si es necesario

transformar alguna de las variables para convertirla hacia un modelo lineal y

evaluar parámetros de intercepto, pendiente, y coeficiente de correlación, datos

necesarios para determinar la concentración de Mio-inositol en producto.

Comprobar la linealidad de la curva mediante test estadísticos de acuerdo a las

hipótesis planteadas bajo un nivel de confianza del 95% .


- 46 -

Hipótesis para la pendiente: Hipótesis para la pendiente:

Ho: Pendiente =0

Hi: Pendiente ≠ 0

Hipótesis para el interceptoHipótesis para el intercepto

Ho: Intercepto =0

Hi: Intercepto ≠ 0

Hipótesis para el coeficiente de corHipótesis para el coeficiente de correlaciónrelación

Ho: Existe asociación entre las variables X y Y

Hi: No existe asociación entre las variables X y Y

4.4. EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DE LA TÉCNICA

La selectividad se define como la capacidad del método analítico para dar una

respuesta debida únicamente a la presencia del analito, sin la interferencia de

sustancias que pueden encontrarse en la matriz de la muestra; precursores

sintéticos, excipientes, enantiómeros, y productos de degradación.

La evaluación de la selectividad que tiene la técnica para determinar Mio-Inositol,

se realizó utilizando placebo que fue fabricado haciendo la mezcla de los

excipientes del recubrimiento, excipientes del núcleo y principios activos presentes

en el producto.

Se preparó el medio de prueba tal como se describió anteriormente, la curva patrón

y cada uno de los principios activos, placebo cubierta, placebo núcleo, se trabajaron

en las mismas condiciones y a la dilución que se trabaja en producto.

Para hallar los porcentajes de interferencia de los principios activos y excipientes

por separado y en conjunto se utilizó la siguiente fórmula:


- 47 -

Absorbancia de Analito para interferenciaAbsorbancia de Analito para interferencia x 100 x 100 Absorbancia de Estándar [8mg/20ml]Absorbancia de Estándar [8mg/20ml]

4.5. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL

EN PRODUCTO

Pesar cinco grageas cuyo contenido de mio-inositol es de 20 mg de mio-inositol/

gragea y disolver en 100 ml de agua desmineralizada estéril para obtener una

solución de concentración 1 mg de mio-inositol/ml; llevar a calentamiento en baño

María a 50ºC durante 30 minutos. A partir del sobrenadante de esta solución,

realizar diluciones en serie hasta obtener una solución de concentración supuesta

de 8µg de mio-inositol/ml (Anexo 2), de esta solución tomar 1ml y adicionarlo a

19 ml del medio de prueba previamente esterilizado. Inocular 0,1 ml de la

suspensión de levadura ajustada a 10%T e incubar 48 horas a 32ºC. Tomar los

valores de turbidez obtenidos de la preparación por triplicado de la dilución y

promediar. Mediante la ecuación de la recta obtenida de la curva patrón, obtener

las concentraciones reales de Mio-inositol en el producto despejando X:

Y = bX + aY = bX + a

Donde Y = Absorbancia, X = Ln de la concentración de inositol, b es la pendiente de

la recta y al intercepto con el eje Y.

El Valor hallado de X corresponde al Ln de la concentración real de inositol en la

dilución ensayada. Se efectúa la conversión al valor de concentración aplicando ex.

Con el valor hallado de X se aplica la siguiente fórmula para obtener el contenido

de mio-inositol por gragea:

CONTENIDO DE INOSCONTENIDO DE INOSITOL/ GRAGEA =ITOL/ GRAGEA = X X x 25 25


- 48 -

El valor obtenido mediante el análisis anterior es dividido por el valor del contenido

supuesto de Mio-inositol en el producto para obtener el porcentaje de recuperación.

% RECUPERADO = % RECUPERADO = Contenido Inositol/Gragea Contenido Inositol/Gragea x 100 x 100 C Contenido declarado/ Grageaontenido declarado/ Gragea

5. RESULTADOS

5.1. CURVA DE CRECIMIENTO DE Schizosaccharomyces pombe 5.1.1. CRECIMIENTO EN AUSENCIA DE MIO-INOSITOL

CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm)CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm) TIEMPOTIEMPO REPLICA 1 REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 2 PROMEDIO PROMEDIO

0 0,010 0,016 0,013

3 0,031 0,038 0,035

6 0,067 0,097 0,082

9 0,086 0,107 0,097

12 0,093 0,113 0,103

15 0,096 0,114 0,105


- 49 -

18 0,096 0,112 0,104

21 0,096 0,114 0,105

24 0,095 0,116 0,105

27 0,092 0,117 0,104

30 0,090 0,116 0,103

33 0,095 0,116 0,105

36 0,100 0,110 0,105

39 0,092 0,108 0,100

42 0,089 0,098 0,094

45 0,073 0,088 0,080

48 0,064 0,081 0,073

51 0,059 0,069 0,064

54 0,059 0,061 0,060

57 0,059 0,065 0,062

60 0,060 0,070 0,065

63 0,059 0,070 0,065

66 0,061 0,088 0,075

69 0,076 0,106 0,091

72 0,087 0,114 0,100

75 0,096 0,131 0,114

78 0,097 0131 0,114

81 0,097 0,128 0,112

84 0,098 0,130 0,114

87 0,098 0,130 0,114

90 0,106 0,142 0,124

93 0,116 0,140 0,128

96 0,118 0,141 0,129

5.1.2. CRECIMIENTO EN PRESENCIA DE 4µµg DE MIO-INOSITOL/20ml

CRECMINIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )CRECMINIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )

TIEMPOTIEMPO REPLICA 1 REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 2 PROMEDIO PROMEDIO 0 0,012 0,012 0,012

3 0,037 0,035 0,036

6 0,099 0,088 0,094

9 0,152 0,163 0,158

12 0,212 0,271 0,242

15 0,301 0,309 0,305

18 0,384 0,394 0,389

21 0,474 0,451 0,463

24 0,503 0,486 0,495


- 50 -

27 0,552 0,532 0,542

30 0,572 0,554 0,563

33 0,589 0,559 0,574

36 0,597 0,565 0,581

39 0,608 0,572 0,590

42 0,602 0,573 0,588

45 0,602 0,573 0,588

48 0,607 0,580 0,594

51 0,591 0,573 0,582

54 0,591 0,583 0,587

57 0,595 0,573 0,584

60 0,598 0,578 0,588

63 0,600 0,589 0,595

66 0,593 0,592 0,593

69 0,589 0.592 0,591

72 0,586 0.589 0,588

75 0,600 0,602 0,601

78 0,600 0,600 0,600

81 0,603 0,596 0,600

84 0,595 0,596 0,596

87 0,600 0,599 0,600

90 0,600 0,600 0,600

93 0,605 0,600 0,603

96 0,595 0,600 0,598

5.1.3. CRECIMIENTO EN PRESENCIA DE 6µµg DE MIO-INOSITOL/20ml

CRECMINIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )CRECMINIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )


3 0,058 0,061 0,060

6 0,140 0,145 0,143

9 0,285 0,281 0,283

12 0,446 0,451 0,449

15 0,596 0,607 0,602

18 0,687 0,709 0,698

21 0,762 0,775 0,769


- 51 -

24 0,779 0,795 0,787

27 0,811 0,833 0,822

30 0,837 0,870 0,854

33 0,846 0,900 0,873

36 0,846 0,909 0,878

39 0,840 0,924 0,882

42 0,843 0,929 0,886

45 0,846 0,924 0,885

48 0,846 0,920 0,883

51 0,840 0,900 0,870

54 0,840 0,909 0,875

57 0,846 0,902 0,874

60 0,848 0,900 0,874

63 0,843 0,893 0,868

66 0,836 0,898 0,867

69 0,831 0,900 0,866

72 0,836 0,909 0,873

75 0,836 0,912 0,874

78 0,836 0,927 0,882

81 0,838 0,909 0,874

84 0,838 0,909 0,874

87 0,838 0,938 0,888

90 0,838 0,940 0,889

93 0,843 0,945 0,894

96 0,831 0,947 0,889

5.1.4. CRECIMIENTO EN PRESENCIA DE 8 µµg DE MIO-INOSITOL/20ml

CRECIMIENTO MICROBIACRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535 nm)NO (Absorbancia a 535 nm) TIEMPOTIEMPO REPLICA 1REPLICA 1 REPLICA 2REPLICA 2 PROMEDIOPROMEDIO

0 0,022 0,024 0,023

3 0,061 0,054 0,058

6 0,160 0,139 0,150

9 0,333 0,284 0,309

12 0,485 0,454 0,470

15 0,731 0,600 0,666

18 0,856 0,695 0,776

21 0,909 0,805 0,857


- 52 -

24 0,982 0,880 0,931

27 1,037 0,955 0,996

30 1,073 0,991 1,032

33 1,097 1,000 1,049

36 1,097 1,013 1,055

39 1,106 1,040 1,073

42 1,108 1,024 1,066

45 1,103 1,026 1,065

48 1,088 1,024 1,056

51 1,088 1,032 1,060

54 1,080 1,026 1,053

57 1,094 1,026 1,060

60 1,100 1,031 1,066

63 1,109 1,014 1,062

66 1,100 1,019 1,060

69 1,100 1,004 1,052

72 1,106 1,040 1,073

75 1,120 1,034 1,077

78 1,119 1,032 1,076

81 1,118 1,032 1,075

84 1,120 1,013 1,067

87 1,119 1,026 1,073

90 1,112 1,032 1,072

93 1,109 1,032 1,071

96 1,113 1,029 1,071


CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535 nm)CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535 nm)


3 0,034 0,032 0,033

6 0,089 0,073 0,081

9 0,196 0,191 0,194

12 0,348 0,348 0,348

15 0,615 0,564 0,590

18 0,772 0,686 0,729

21 0,865 0,755 0,810

24 0,930 0,834 0,882


- 53 -

27 0,981 0,885 0,933

30 1,040 0,940 0,990

33 1,096 0,969 1,033

36 1,120 0,981 1,051

39 1,145 0,993 1,069

42 1,163 0,985 1,074

45 1,174 0,997 1,086

48 1,177 0,989 1,083

51 1,184 0,989 1,087

54 1,184 0,997 1,091

57 1,184 0,997 1,091

60 1,177 0,985 1,081

63 1,188 0,977 1,083

66 1,188 0,989 1,089

69 1,191 0,985 1,088

72 1,191 0,989 1,090

75 1,167 1,000 1,084

78 1,169 0,997 1,083

81 1,160 1,000 1,080

84 1,156 0,997 1,077

87 1,169 0,997 1,083

90 1,163 0,997 1,080

93 1,170 0,999 1,085

96 1,167 0,999 1,083



TIEMPOTIEMPO REPLREPLICA 1 ICA 1 REPLICA 2 REPLICA 2 PROMEDIO PROMEDIO

0 0,009 0,012 0,011

3 0,035 0,028 0,032

6 0,080 0,083 0,082

9 0,206 0,187 0,197

12 0,329 0,334 0,332

15 0,571 0,568 0,570

18 0,786 0,732 0,759

21 0,916 0,851 0,884


- 54 -

24 0,985 0,920 0,953

27 1,083 1,006 1,045

30 1,110 1,040 1,075

33 1,126 1,080 1,103

36 1,130 1,105 1,118

39 1,144 1,133 1,139

42 1,153 1,139 1,146

45 1,144 1,130 1,137

48 1,153 1,131 1,142

51 1,149 1,147 1,148

54 1,153 1,160 1,157

57 1,163 1,160 1,162

60 1164 1,165 1,165

63 1,160 1,128 1,144

66 1,163 1,142 1,153

69 1,167 1,140 1,154

72 1,181 1,140 1,161

75 1,183 1,167 1,175

78 1,180 1,182 1,181

81 1,172 1,189 1,181

84 1,160 1,168 1,164

87 1,163 1,160 1,162

90 1,163 1,182 1,173

93 1,160 1,176 1,168

96 1,160 1,178 1,169

5.1.7. CURVAS DE CRECIMIENTO DE Schizosaccharomyces pombe A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE MIO-INOSITOL.

AUSENCIA DE MIO-INOSITOL

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

PRESENCIA DE 4 µg DE MIO-INOSITOL/20 ml

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 6 9 12 15 18 21 2427 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 7275 78 81 84 87 90 93 96 99

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O

MIC

RO

BIA

NO

(Abs

orba

ncia

a

535

nm)


- 55 -


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 3 6 9 121518212427303336394245485154576063666972757881848790939699

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O

MIC

RO

BIA

NO

(Abs

orba

ncia

a

535

nm)

FIGURA 13.FIGURA 13. Curvas de crecimiento de s. pombe

CONCENTRACIÓN DE MIOCONCENTRACIÓN DE MIO--INOSITOLINOSITOL AUSENCIAAUSENCIA 4 4 µµg/20 mlg/20 ml 6 6 µµg/20 mlg/20 ml 8 8 µµg/20 mlg/20 ml 10 10 µµg/20 mlg/20 ml 12 12 µµg/20 mlg/20 ml

Velocidad Crecimiento (Horas -1)

0,002 0,017 0,024 0,030 0,032 0,034

Intercepto 0,059 0,034 0,105 0,085 0,010 -0,005

Coeficiente de correlación

0,683 0,971 0,941 0,958 0,967 0,965

Tiempo de duplicación (minutos)

436,243 41,468 28,464 22,915 21,996 20,220

TABLA 3.TABLA 3. Parámetros de crecimiento de Schizosaccharomyces pombe


- 56 -

FIGURA 14. Gráfico comparativo del crecimiento de schizosaccharomyces pombe a diferentes concentraciones de mio-inositol

Al comparar el comportamiento de Schizosaccharomyces pombe cuando crece a

diferentes concentraciones de Mio-inositol, se observa que en ausencia de esta

vitamina, S. pombe no alcanza un desarrollo óptimo pues a la hora nueve se

detiene el crecimiento, como lo demuestra la gráfica, posiblemente debido a la falta

de inositol; Mientras en las demás curvas la fase exponencial continúa hasta la hora

39 donde se estabiliza. El máximo crecimiento microbiano observado para cada

curva demuestra que a medida que aumenta la concentración de inositol hay un

aumento proporcional de la población microbiana medida en absorbancia, esto se

demuestra en el incremento de la velocidad de crecimiento y en la disminución del

tiempo de duplicación (Tabla 3).

CURVAS DE CRECIMIENTO Schizosaccharomyces pombe A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE MIO-INOSITOL

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99

TIEMPO (HORAS)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Den

sida

d Ó

ptic

a a

535

nm)

BLANCO INOCULADO ESTÁNDAR 4 mcg/ml ESTANDAR 10 mcg/ml

ESTANDAR 12 mcg/ml ESTANDAR 6 mcg/ml ESTANDAR 8 mcg/ml


- 57 -

5.2. CURVAS PATRÓN 5.2.1. MODELO DE CRECIMIENTO DE Schizosaccharomyces pombe

Al graficar los datos obtenidos con las siete réplicas de la curva patrón se observó una

relación exponencial entre las concentraciones de mio-inositol y el crecimiento del

microorganismo como se observa en la figura 15.

MODELO DE CRECIMIENTO DE LAS CURVAS PATRÓN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 2 4 6 8 10 12 14

CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL µg/2 0 ml

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

nci

a a

535n

m)

Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 4 Réplica 5 Réplica 6 Réplica 7

FIGURA 15FIGURA 15.. Tendencia de crecimiento de S. pombe

Debido a que la relación entre las variables es exponencial fue necesario

transformar matemáticamente una de ellas aplicándole el Ln a la concentración de

Mio-inositol para linealizar curva, y así obtener por medio de la regresión de

mínimos cuadrados la ecuación de la recta, que permitirá extrapolar la absorbancia

correspondiente a la concentración de la muestra.

5.2.2. REPLICA N°15.2.2. REPLICA N°1


- 58 -

CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm)CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm)

Concentración Concentración de miode mio--inositol inositol

((µµg/20ml)g/20ml)

Ln De Ln De concentración de concentración de

miomio--inositol inositol ((µµg/20ml)g/20ml)

LECTURA 1LECTURA 1 LECTURA 2LECTURA 2 PROMEDIOPROMEDIO Coeficiente Coeficiente

de Variación de Variación (%)(%)

4,102 1,411 0,301 0,320 0,311 4,33

6,154 1,817 0,451 0,475 0,463 3,67

8,205 2,105 0,653 0,616 0,635 4,12

10,256 2,328 0,727 0,724 0,726 0,29

12,308 2,510 0,721 0,736 0,729 1,46

REPLICA No. 1 - CURVA PATRÓN PARA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL

0.311

0.463

0.635

0.7290.726

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000 1.250 1.500 1.750 2.000 2.250 2.500 2.750

Ln DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL (µµg/20 ml)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

5.2.3. RÉPLICA N°25.2.3. RÉPLICA N°2

CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )




miomio--inositol inositol ((µµg/20ml)g/20ml)

LECTURA 1 LECTURA 1 LECTURA 2 LECTURA 2 LECTURLECTURA 3 A 3 PROMEDIO PROMEDIO Coeficiente Coeficiente

de Variación de Variación (%)(%)

4,043 1,397 0,492 0,472 0,472 0,479 2,412

6,065 1,803 0,636 0,578 0,687 0,636 8,607


- 59 -

8,086 2,090 0,785 0,755 0,864 0,785 7,027

10,108 2,313 0,896 0,819 0,845 0,896 4,590

12,130 2,496 0,847 0,945 0,864 0,847 5,915

REPLICA No.2 - CURVA PATRÓN PARA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL

0.479

0.636

0.785

0.8960.847

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 2.200 2.400 2.600

Ln DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL (µµg/20 ml)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

5.2.4. REPLICA 3 5.2.4. REPLICA 3

CRECIMIENTO MICROBIANO(Absorbancia a 535nm)CRECIMIENTO MICROBIANO(Absorbancia a 535nm)

Concentración de mio-inositol (µµg/20ml)

Ln De concentración de

mio-inositol (µµg/20ml) LECTURA 1 LECTURA 2 PROMEDIO

Coeficiente de Variación (%)

3,247 1,178 0,230 0,250 0,230 5,893


- 60 -

4,871 1,583 0,477 0,499 0,477 3,188

6,494 1,871 0,568 0,570 0,568 0,249

8,118 2,094 0,553 0,582 0,553 3,613

9,742 2,276 0,647 0,683 0,647 3,828

REPLICA 3 CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL

0.553

0.568

0.230

0.477

0.647

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500

Ln DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL (µµg/20ml)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a53

5nm

)

5.2.5 REPLICA 4 5.2.5 REPLICA 4

CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a535nm)CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a535nm)



Ln de Ln de concentración concentración

de miode mio--inositol inositol


LECTURA 1 LECTURA 1 LECTURA 2 LECTURA 2 LECTURA 3 LECTURA 3 PROMEDIO PROMEDIO Coeficiente de Coeficiente de Variación (%)Variación (%)

3,829 1,343 0,315 0,315 0,317 0,316 0,366

5,744 1,748 0,399 0,379 0,400 0,393 3,017


- 61 -

7,659 2,036 0,553 0,533 0,496 0,527 5,484

9,573 2,259 0,585 0,580 0,578 0,581 0,621

11,488 2,441 0,701 0,744 0,650 0,698 6,738


0.316

0.393

0.5270.581

0.698

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 2.200 2.400 2.600

Ln DE CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL (µµg/20 ml)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

5.2.6 REPLICA N°5

CRECIMIENTOCRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm) MICROBIANO (Absorbancia a 535nm)


(mg/20ml)(mg/20ml)

Ln De Ln De concentración concentración de miode mio--inositol inositol

(mg/20ml)(mg/20ml)

ENSAYO 1 ENSAYO 1 ENSAYO 2 ENSAYO 2 PROMEDIO PROMEDIO PROMEDIO PROMEDIO CoeficiCoeficiente de ente de Variación (%)Variación (%)

0,372 0,351 0,362 0,405 0,351 0,378 4,107 1,413 0,382 0,318 0,350

0,363 8,278

0,562 0,561 0,562 6,160 1,818 0,566 0,568 0,567

0,553 5,833


- 62 -

0,574 0,488 0,531 0,666 0,712 0,689 0,716 0,689 0,703 8,821 2,177 0,711 0,660 0,686

0,692 3,565

0,762 0,759 0,761 0,795 0,776 0,786 10,267 2,329 0,720 0,794 0,757

0,768 3,633

0,804 0,777 0,791 0,870 0,830 0,850 12,320 2,511 0,784 0,772 0,778

0,806 4,693

REPLICA No. 5 - CURVA PATRÓN PARA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL

0.363

0.692

0.7680.806

0.553

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000 1.250 1.500 1.750 2.000 2.250 2.500 2.750


CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

5.2.7 REPLICA N°6

CRECIMIENTO MICROBIANO(Absorbancia a 535nm )CRECIMIENTO MICROBIANO(Absorbancia a 535nm )


(mg/20ml)(mg/20ml)


miomio--inositol inositol (mg/20ml)(mg/20ml)


4,016 1,390 0,169 0,166 0,162 0,166 2,120

6,024 1,796 0,342 0,318 0,330 0,330 3,636

8,032 2,083 0,477 0,471 0,464 0,471 1,382


- 63 -

10,040 2,307 0,556 0,552 0,548 0,552 0,725

12,048 2,489 0,650 0,646 0,654 0,650 0,615


0.166

0.330

0.471

0.552

0.650

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 2.200 2.400 2.600


CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

5.2.8 REPLICA N°7

CRECIMIENTO MICCRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm)ROBIANO (Absorbancia a 535nm)


(mg/20ml)(mg/20ml)

Ln De Ln De concentración concentración de miode mio--inositol inositol

(mg/20ml)(mg/20ml)


4,048 1,398 0,178 0,176 0,172 0,175 1,742

6,072 1,804 0,280 0,286 0,302 0,289 3,931

8,096 2,091 0,423 0,427 0,447 0,432 2,974


- 64 -

10,120 2,315 0,632 0,619 0,611 0,621 1,708

12,144 2,497 0,525 0,549 0,535 0,536 2,248

REPLICA No. 7- CURVA PATRÓN PARA DETERMINACIÓN DEMIO-INOSITOL

0.175

0.289

0.432

0.5360.621

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

1.000 1.500 2.000 2.500 3.000

Ln DE CONCENTRACIÓN DE INOSITOL (µµg/20 ml)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

5.2.9. COMPARACIÓN DE LAS RÉPLICAS


- 65 -

G R A F I C O C O M P A R A T I V O D E L A L I N E A L I Z A C I Ó N D E L A S C U R V A S

PATRÓN

0

0 . 1

0 . 2

0 . 3

0 . 4

0 . 5

0 . 6

0 . 7

0 . 8

0 . 9

1

0 . 0 0 0 0 . 5 0 0 1 . 0 0 0 1 . 5 0 0 2 . 0 0 0 2 . 5 0 0 3 . 0 0 0

Ln DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL mg/20ml

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35nm

)

Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 4 Réplica 5 Réplica 6 Réplica 7

FIGURA 16. Comparativo de la linealización de las curvas patrón

Estimador Réplica

1

Réplica

2

Replica

3

Replica

4

Replica

5

Replica

6

Replica

7

b 0,412 0,388 0,356 0,412 0,363 0,438 0,393

a -0,266 -0,053 -0,135 -0,208 -0,202 -0,447 -0,348

r 0,984 0,987 0,957 0,996 0,973 0,999 0,944

TABLA 4. TABLA 4. Comparación de los parámetros de regresión de las réplicas

Comparando los parámetros de regresión de las curvas patrón (Figura 16)

resumidos en la Tabla 4, se puede observar que los valores de la pendiente (b) se

mantienen en un rango muy estrecho, es decir, que la técnica es sensible, ya que

demuestra que a medida que aumenta la concentración, aumenta

proporcionalmente el crecimiento del microorganismo.


- 66 -

Si extendemos las líneas de tendencia hasta el origen, se observa que el valor del

intercepto (a) es muy variable, esto se debe a que la absorción del blanco utilizado

para ajustar la curva genera un error porque siempre es diferente el crecimiento del

microorganismo en ausencia de mio.inositol.

Los coeficientes de correlación demuestran que la asociación entre los logaritmos

naturales de las concentraciones de mio-inositol y las respuestas de crecimiento del

microorganismo, es muy similar entre las réplicas.

5.2.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

5.2.10.1 TEST DE SIGNIFICANCIA ESTADÍSTICA

5.2.10.1.1.COEFICIENTE DE CORRELACIÓN

a.Hipótesisa.Hipótesis

Ho: Ho: No existe asociación entre X,Y

Hi: Hi: Existe asociación entre X,Y

b. Estadística de pruebab. Estadística de prueba

t = r n-2

1-r2

c. Regla de decisiónc. Regla de decisión

Para un nivel de confianza del 95% se rechaza Ho si t calculado es mayor que 2,3534.

5.2.10.1.2. PENDIENTE

a.Hipótesisa.Hipótesis


- 67 -

11 HoHo: b=0

12 Hi:Hi: b�0

b.Estadística de pruebab.Estadística de prueba

t= b /sb

Sb = Estimación de la varianza de b

Sb = . S2xy .

∑xi2 -(∑xi)2 n S2 xy = ∑yi2 - (a∑yi) -(b∑xyi)

n-2

c.Regla de decisión: c.Regla de decisión:

Para un nivel de confianza del 95% se rechaza Ho si el valor de t calculado es

mayor que 2,3534

5.2.10.1.3. INTERCEPTO

a.a. HipotesisHipotesis

Ho: a=0

Hi: a=0

b.b. Estadística de prEstadística de pruebaueba

t= a/Sa

Sa: Estimación de la varianza del intercepto

Sa= S2 b ∑xi2

n

c.c. Regla de decisiónRegla de decisión

Para un nivel de confianza del 95% se rechaza Ho si el valor calculado de t es

menor que el 2,3534.


- 68 -

EstimadorEstimador RéplicaRéplica

1 1

Réplica Réplica

22

RepliReplicaca

3 3

ReplicaReplica

44

Replica Replica

55

ReplicaReplica

66

Replica Replica

77

n 5 5 5 5 5 5 5

b 0,412 0,388 0,356 0,412 0,363 0,438 0,393

a -0,266 -0,053 -0,135 -0,208 -0,202 -0,447 -0,348

∑∑xi 10,171 10,099 90,002 10,248 9,827 10,065 10,105

∑∑yi 2,864 3,652 2,530 3,182 2,553 2,169 2,053

r 0,984 0,987 0,957 0,996 0,973 0,999 0,944

∑∑xy 6,137 7,688 4,823 6,837 5,290 4,696 4,445

∑∑xi2 21,443 21,500 10,959 21,770 20,066 21,014 21,175

∑∑yi2 1,773 2,784 1,384 2,156 1,408 1,086 0,974

Tabla 5.Tabla 5. Estimadores de regresión lineal de las curvas patrón para análisis estadístico 5.2.10.2. RESULTADOS DE SIGNIFICANCIA ESTADÍSTICA

VALOR t CALCULADO

TESTTEST Replica 1Replica 1 Replica 2 Replica 2 Replica 3Replica 3 Replica 4Replica 4 Replica 5Replica 5 Replica 6Replica 6 Replica 7Replica 7

INTERCEPTO --3,0103,010 --0,7130,713 --1,1651,165 --4,8724,872 --2,0302,030 --18,68818,688 --2,3582,358

PENDIENTE 9,6479,647 10,41810,418 5,6685,668 20,19920,199 7,3157,315 37,46037,460 4,9734,973

COEFICIENTE

CORRELACIÓN 9,6809,680 10,39310,393 5,6795,679 20,61920,619 7,3207,320 38,69138,691 4,9754,975

TABLA 6. TABLA 6. Resultados de pruebas t de student para los parámetros de linealidad

5.2.10.2.1. INTERCEPTO

Debido a que el t calculado es mayor que 2,3534 (t tabulado), se rechaza la

hipótesis nula y se concluye que el valor del intercepto es significativamente


- 69 -

diferente de cero, es decir, la respuesta del blanco es muy variable, por lo tanto,

cada ensayo debe realizarse con una curva patrón bajo las mismas condiciones.

5.2.10.2.2. PENDIENTE

Para todas las réplicas, el t calculado es mayor que 2,3534 (t tabulado) por lo tanto

se rechaza la hipótesis nula y se concluye que la pendiente es significativamente

diferente de cero. La implicación práctica es que obtendrán mejores predicciones y

estimaciones de X si se utiliza la ecuación de regresión de la muestra que relaciona

las variables X e Y. El hecho de que b sea positiva indica que la relación entre X e Y

es una relación lineal directa.

5.2.10.2.3. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN

Para todas las réplicas, el t calculado es mayor que 2,3534 (t tabulado) por lo tanto

se rechaza la hipótesis nula y se concluye que existe asociación entre las variables X

e Y.


- 70 -

5.3. EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DE LA TÉCNICA


CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DE MIODE MIO--INOSITOL INOSITOL

µµg/20 ml)g/20 ml) LECTURA 1 LECTURA 1 LECTURA 2 LECTURA 2 LECTURA 3 LECTURA 3 PROMEDIO PROMEDIO

4 0,352 0,348 0,373 0,358

6 0,512 0,583 0,547 0,547

8 0,648 0,667 0,636 0,650

10 0,711 0,700 0,714 0,708

CRECIMIENTO MICROBIANO Absorbancia a 535 nmCRECIMIENTO MICROBIANO Absorbancia a 535 nm

LECTURA 1LECTURA 1 LECTURA 2LECTURA 2 LECTURA 3LECTURA 3 PROMEDIOPROMEDIO COEFICIENTE COEFICIENTE

DE DE VARIACIÓNVARIACIÓN

% % INTERFERENCIAINTERFERENCIA

PIRIDOXINAPIRIDOXINA 0,0170,017 0,0160,016 0,0190,019 0,0170,017 8,8138,813 2,6102,610

TIAMINA TIAMINA 0,0400,040 0,0400,040 0,0380,038 0,0390,039 2,9362,936 6,0006,000

RIBOFLAVINARIBOFLAVINA 0,0350,035 0,0310,031 0,0330,033 0,0330,033 6,0616,061 5,0005,000

BIOTINA BIOTINA 0,0060,006 0,0070,007 0,0080,008 0,0070,007 14,.28614,.286 1,0701,070

CIANOCOBALAMINA CIANOCOBALAMINA 0,0190,019 0,0170,017 0,0160,016 0,0170,017 8,8138,813 2,6102,610

NICOTINAMIDA NICOTINAMIDA 0,0320,032 0,0330,033 0,0300,030 0,0320,032 4,8244,824 4,9204,920

ALFAALFA--TOCOFEROL TOCOFEROL 0,0080,008 0,0100,010 0,0070,007 0,0080,008 18,33018,330 1,2301,230

PLACEBO CUPLACEBO CUBIERTA BIERTA 0,0100,010 0,0140,014 0,0130,013 0,0120,012 16,87816,878 2,4602,460

PLACEBO NÚCLEOPLACEBO NÚCLEO 0,0150,015 0,0190,019 0,0170,017 0,0170,017 11,76511,765 2,6002,600

EXCIPIENTES + EXCIPIENTES + PRINCIPIOS ACTIVOSPRINCIPIOS ACTIVOS 0,0140,014 0,0150,015 0,0210,021 0,0170,017 22,71622,716 2,6102,610

TABLA 7. Datos de % de interferencia de excipientes y principios activos

Basados en el criterio de aceptación formulado en el protocolo de validación de

técnicas analíticas de MCSA, para ensayos microbiológicos no se incluye como

interferencia una respuesta menor al 5% de la respuesta obtenida del analito de

interés, por lo tanto no se observa una verdadera interferencia por parte de los

principios activos y excipientes cuando fueron analizados por separado, ni cuando

fueron analizados en conjunto, aún cuando tiamina riboflavina mostraron crecimiento

superior al 5% de lo obtenido con el estándar, como se observa en la tabla 7 y en la

figura 17. Esto indica que las concentraciones de principios activos y excipientes

presentes en la dilución del producto no influyen marcadamente en el crecimiento de


- 71 -

Schizosaccharomyces pombe; aunque tiamina y piridoxina sean factores que

estimulan el crecimiento de esta levadura (McVeigh, 1955). S. pombe no depende

de Riboflavina, sin embargo, los resultados demuestran que la utiliza como factor

para incrementar su crecimiento.

CRECIMIENTO DE Schiz osaccharomyces pombe FREN T E

A PRINCIPIOS ACT IVOS Y EX CIPIENTES

0.0390.017

100%

0.0330.007

0.0170.0320.0080.012

0.0170.017

0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700

1

3

5

7

9

11

CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535 nm)

MEZCLA EXCIPIENTES Y PRINCIPIOS ACTIVOS SIN INOSITOL 2,6%

PLACEBO NÚCLEO 2,6%

PLACEBO CUBIERTA 2,5%

ALFA-TOCOFEROL 1,2%

NICOTINAMIDA 4,9%

CIANOCOBALAMINA 2,6%

BIOTINA 1,1%

RIBOFLAVINA 5,0%

TIAMINA 6,0%

PIRIDOXINA 2,6% ESTÁNDAR MIO-INOSITOL 8µµ g/m l

FIGURA 17.FIGURA 17. Gráfico comparativo de crecimiento de Schizosaccharomyces pombe

frente a los componentes del producto


- 72 -

5.4. DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN PRODUCTO 5.4.1. LOTE 1

CURVA PATRÓN PARA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL

0.311

0.463

0.6350.729

0.726

y = 0.4125x - 0.2667r = 0.984

00.1

0.20.3

0.40.5

0.60.7

0.80.9

1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75

Ln DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL

(µµg/20 ml)

CR

EC

IMIE

NT

O M

ICR

OB

IAN

O

(Abs

orba

ncia

a 5

35 n

m)

DATOS INICIALESDATOS INICIALES

Cantidad Pesada Cantidad Pesada

Contenido Contenido Teórico de MioTeórico de Mio--Inositol (mg/5 Inositol (mg/5

grageas)grageas)

Dilución Dilución InicialInicial

Dilución 1Dilución 1 Dilución FinalDilución Final Concentración Concentración

finalfinal

Muestra 1 2,3154g 100mg 100ml 25ml/100ml 3,2ml/100ml 8mg/ml

Muestra 2 2,3154g 100mg 100ml 25ml/100ml 3,2ml/100ml 8mg/ml

DATOS OBTENIDOSDATOS OBTENIDOS Crecimiento Microbiano (Absorbancia a 535nm)Crecimiento Microbiano (Absorbancia a 535nm)

Lectura 1Lectura 1 Lectura 2Lectura 2 Lectura 3Lectura 3 PromedioPromedio Coeficiente de Coeficiente de variación (%)variación (%)

Muestra 1 0,615 0,618 0,593 0,609 2,24

Muestra 2 0,615 0,605 0,581 0,600 2,91

CONTENIDO DETERMINADOCONTENIDO DETERMINADO

X Calculado (Ln X Calculado (Ln concentración real)concentración real)

eex x mg/mlmg/ml % Recuperado% Recuperado Contenido MioContenido Mio--inositol mg/ inositol mg/ grageagragea

Contenido Contenido MioMio--inositol inositol mg/ 5 grageasmg/ 5 grageas

Muestra 1 2,1238 8,363 104,53 20,91 104,55

Muestra 2 2,1028 8,190 102,36 20,47 102,35

PROMEDIO GLOBAL 8,276 103,44 20,69 103,45

COEFICIENTE DE VARIACIÓN GLOBAL (%)

1,485 1,483 1,504 1,504

PARÁMETROS PARÁMETROS DETERMINADOS CON LA DETERMINADOS CON LA

CURVA PATRÓNCURVA PATRÓN

Coeficiente de correlación

0,984

Pendiente 0,412

Intercepto -0,266


- 73 -

5.4.2. LOTE 25.4.2. LOTE 2

CURVA PATRÓN PARA DETERMINACIÓN DEMIO-INOSITOL

0 .175

0 .289

0 .432

0 .536

0 .621

y = 0.3932x - 0.3837r = 0.944

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

1 1 .25 1.5 1 .75 2 2 .25 2.5 2 .75

Ln DE CONCENTRACIÓN DE INOSITOL (µµ g/20 ml)

DATOS INICIALESDATOS INICIALES

Cantidad Cantidad Pesada Pesada

Contenido Teórico Contenido Teórico de Miode Mio--Inositol Inositol (mg/5 grageas)(mg/5 grageas)

Dilución InicialDilución Inicial Dilución 1Dilución 1 Dilución FinalDilución Final Concentración Concentración finalfinal

Muestra 1 2,3623 100mg 100ml 25ml/100ml 3,2ml/100ml 8mg/ml



DATOS OBTENIDOS Crecimiento Microbiano (Absorbancia a 535 nm) Crecimiento Microbiano (Absorbancia a 535 nm)

Lectura 1Lectura 1 Lectura 2Lectura 2 Lectura 3Lectura 3 PromedioPromedio Coeficiente de Coeficiente de

vvariaciónariación

Muestra 1 0,460 0,441 0,469 0,467 1,26

Muestra 2 0,462 0,428 0,452 0,447 3,90

Muestra 3 0,443 0,451 0,479 0,458 4,13

CONTENIDO DETERMINADOCONTENIDO DETERMINADO

X Calculado (Ln X Calculado (Ln concentración concentración

real)real) eex x mg/mlmg/ml % Recuperado% Recuperado

Contenido Contenido MioMio--inositol inositol mg/ grageamg/ gragea

ContenidContenido o MioMio--inositol inositol

mg/ 5 grageasmg/ 5 grageas

Muestra 1 2,1654 8,718 108,90 21,80 109,00

Muestra 2 2,1154 8,292 102,40 22,31 111,55

Muestra 3 2,1425 8,521 105,20 21,30 106,50

PROMEDIO GLOBAL 8,510 105,50 21,80 109,02

COEFICIENTE DE VARIACIÓN GLOBAL (%)

2,502 3,090 2,316 2,316

PARÁMETROS PARÁMETROS DETERMINADOS CON LA DETERMINADOS CON LA

CURVA PATRÓNCURVA PATRÓN

Coeficiente de correlación 0,944

Pendiente 0,393

Intercepto -0,384


- 74 -

CONTENIDO DE MIO-INOSITOL EN PRODUCTO

20,0

20,7

21.8

90 100 110

1

2

3

FIGURA 18. Comparativo de la Recuperación de Mio-inositol en tres lotes

La técnica microbiológica fue retada enfrentándola a dos lotes diferentes de un

producto multivitamínico que contiene entre otras vitaminas, mio-inositol.

Comparando los resultados obtenidos con las especificaciones (18,0 - 22,0 mg de

mio-inositol/gragea) se observa que los resultados de los dos de los lotes se

encuentran dentro del rango permitido para cumplir con lo registrado en la

etiqueta (Figura 18) y que el coeficiente de variación entre las replicas de cada lote

no supera el 3%, lo cual indica que no existe variabilidad significativa para la

determinación de mio-inositol en el producto.

LOTE 1

LOTE 2

CONCENTRACIÓN TEÓRICA


- 75 -

6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El crecimiento de Schizosaccharomyces pombe demostró que esta levadura es

auxotrófica para mio-inositol confirmando lo descrito por Niederberger et al. en

1998, cuando afirmó que el crecimiento de S. pombe depende de la cantidad

exógena de mio-inositol y que estimula el apareamiento y la esporulación de esta

levadura.

Los resultados obtenidos en este estudio muestran un crecimiento óptimo cuando la

levadura se expone a 12 µg de mio-inositol como se observa en la Figura 14; en

contraste con lo encontrado por McVeigh et al en 1955, quien afirma que el

crecimiento óptimo de la levadura S. pombe se observa cuando esta se encuentra en

presencia de 8 µg de inositol.

También se encontró que la cinética de crecimiento de la levadura no presenta una

fase de adaptación muy marcada y su crecimiento exponencial comienza

aproximadamente a las tres horas de iniciarse la incubación y termina entre las 39

horas.

Las condiciones de mantenimiento de la levadura, establecidas en la técnica

alemana (Rieth, 1999), son adecuadas tanto para el crecimiento como para la

adaptación de la levadura antes de la transferencia al medio de prueba. El tiempo

empleado para obtener el inóculo del microorganismo fue de 16 horas; de acuerdo

a los resultados obtenidos en las curvas de crecimiento, este tiempo es óptimo pues a


- 76 -

las quince horas, se encuentra en plena fase exponencial como se observa en la

figura 14. Esto asegura que el 100% de las células resuspendidas para inocular el

medio de prueba son viables.

Debido a su metabolismo fermentativo, nuestra levadura produjo una gran cantidad

de espuma como consecuencia de la formación CO2, este factor interviene en la

medición exacta de la turbidez. Para eliminar esta interferencia, se adicionó etanol

al 95% basándonos en lo reportado por McVeigh et al. (1955), donde se emplea

etanol como antiespumante y antifloculante, este último fenómeno está asociado a

propiedades electrocinéticas de la pared en presencia de iones bivalentes y

polivalentes (McVeigh et al. 1955); en nuestro caso, el Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+ y

Fe2+ fueron adicionados en forma de sulfatos al medio de prueba incrementando la

tendencia de la levadura a flocular; también se sugiere la existencia de una

envoltura gelatinosa y mucoide que se adhiere fuertemente a las células de la

levadura y que incrementa la aglutinación de estas, dificultando una suspensión

homogénea de células individuales, la adición de etanol concentrado tiende a

disolver esta envoltura (McVeigh et al 1955). La tendencia a flocular disminuye

notablemente cuando las células son lavadas y suspendidas en presencia de iones

Na+ contenidos en la solución salina (McVeigh et al 1955), por esta razón el

inóculo es ajustado en esta solución. Según lo recomendado por McVeigh et al en

1955, se empleó etanol antes de la lectura y se observó que los datos obtenidos

mejoran, ya que los coeficiente de variación entre las tres lecturas de cada

concentración disminuyen del 56% a menos del 8%.


- 77 -

Como se observa en la Figura 15, dentro del rango de concentraciones evaluado, la

curva patrón muestra comportamiento exponencial, por lo tanto se debe hacer una

curva patrón en cada análisis graficando absorbancia vs logaritmo natural de la

concentración.

De acuerdo a los resultados obtenidos al realizar la prueba estadística se demostró

que la técnica es significativamente lineal, sin embargo, debido a la susceptibilidad

de la técnica, a las variables del cultivo, a la pobre precisión y a la inhibición o

estimulación de crecimiento por condiciones externas (Gregory, J. F., 1983), es

preferible obtener una curva patrón cada vez que se realiza un ensayo manteniendo

siempre las mismas condiciones.

El producto en el cual se aplicó la prueba para determinación de contenido de mio-

inositol, contiene además de esta, otras vitaminas del grupo B que según Waller y

Lichstein (1965) son utilizadas como factores de crecimiento por una variedad de

microorganismos entre los cuales se incluyen Saccharomyces cerevisiae,

Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis y la mayoría de especies del género

Lactobacillus. Los resultados obtenidos demuestran que cuando este

microorganismo se encuentra en presencia de los diferentes principios activos del

producto no muestra un crecimiento óptimo al ser comparado con el crecimiento

frente al inositol (Tabla 7), ya que el máximo obtenido fue del 6% frente al estándar,

en el caso de tiamina, y para los demás principios activos fue mucho menor al 5%

(Figura 17). Se observa además, que al realizar una prueba con una mezcla de

excipientes y principios activos, excepto mio-inositol se obtuvo un crecimiento del

2,6% con respecto al obtenido frente al estándar, lo que indica que en presencia de


- 78 -

todos los componentes del producto, se disminuye la interferencia causada por

tiamina y riboflavina.

El medio de prueba contiene las vitaminas biotina, tiamina y piridoxina en

concentraciones necesarias para que el microorganismo se desarrolle óptimamente.

Al mismo tiempo, estas vitaminas están presentes en el producto y al igual que mio-

inositol son hidrosolubles, por tanto, en la dilución final (8 µg de mio-inositol)

están presentes, pero en concentraciones muy bajas, de manera que no aumentan

significativamente su concentración total en el medio.


- 79 -

CONCLUSIONES CONCLUSIONES

Schizosaccharomyces pombe es el microorganismo idóneo para determinar mio-

inositol en productos farmacéuticos debido a su comprobada auxotrofía por esta

vitamina y a la selectividad demostrada frente a otras vitaminas presentes en el

producto, ya que esta levadura tiene la capacidad de discriminar el mio-inositol de

otros compuestos.

La técnica alemana utilizada para la implementación y estándarización de la

determinación de mio-inositol es idónea, pues tiene en cuenta los factores para el

mantenimiento del microorganismo como pH, temperatura y tiempo de incubación

y los requerimientos nutricionales de crecimiento de la levadura, demostrando así,

que es un procedimiento apto para la determinación de inositol en producto.

Aunque las anteriores condiciones de la técnica se mantuvieron en todos los

ensayos, se estandarizó la adición de alcohol antes de cada lectura, ya que la técnica

original no contemplaba la variabilidad que presentan los datos en el momento de

la lectura.

Los ensayos realizados, demostraron que en el rango de concentraciones de 4 a 12

de manera que se estandarizaron pH, temperatura y tiempos de incubación,

concentración de células, longitud de onda para lecturas de turbidez, µg/20 ml, la


- 80 -

curva patrón es lineal, por consiguiente, la concentración de la dilución de

producto se puede manejar en el punto medio que corresponde a 8 µg/20 ml.

Debido a la variabilidad natural en el crecimiento de Schizosaccharomyces pombe,

se deben analizar tres muestras diferentes, cada una por triplicado, por lote, para

obtener resultados confiables. En caso de obtener coeficientes de variación

superiores al 5% el ensayo debe repetirse.

El comportamiento demostrado por S. pombe en las curvas de crecimiento permite

acortar el tiempo de incubación de la prueba de 48 a 39 horas, ya que a las 48

horas (Rieth, 1999) se encuentra en fase estacionaria, lo que significa que las

células no son 100% viables, causando un factor de error en la lectura, además, las

mediciones de turbidez deben realizarse en la fase post-exponencial o pre-

estacionaria (Freed, 1966) donde se ha terminado el sustrato limitante del

crecimiento y no cuando la precipitación de células muertas puede generar

interferencia.


- 81 -

ANEXO 1 ANEXO 1 –– PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ESTÁNDAR DE MIO PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ESTÁNDAR DE MIO--

INOSITOLINOSITOL

8µg/ml 10µg/ml 12µg/ml 6µg/ml 4µg/ml

1,6ml 2,4 ml 3,2 ml 4,0 ml 4,8 ml

250250µµg / mlg / ml Agua Desmineralizada EstérilAgua Desmineralizada Estéril

ESTANDAR DE ESTANDAR DE MIOMIO--INOSITOLINOSITOL

CONCENTRACIÓN FINALCONCENTRACIÓN FINAL


- 82 -

ANEXO 2 ANEXO 2 –– CONTENIDO CONTENIDO DE EXCIPIENTES EMPLEADOS EN LAS PRUEBAS DE DE EXCIPIENTES EMPLEADOS EN LAS PRUEBAS DE

SELECTIVIDADSELECTIVIDAD

PLACEBO

Cantidad Toeórica en 5

grageas Cantidad Pesada

Cantidad de Volumén a que se lleva Dilución 1 Dilución 2

Concentración final (µµg/20ml)

PLACEBO CUBIERTA 1,1818g 1,1881g 100ml 25/100 3,2/100 95,48

PLACEBO NUCLEO 0,6937g 0,7525g 100ml 25/100 3,2/100 6,0184

PRINCIPIOS ACTIVOS

Cantidad Toeórica en

5 grageas Cantidad Pesada

Cantidad de

Volumén a que se lleva Dilución 1 Dilución 2

Concentración final (µµg/20ml)

Piridoxina 20mg 20,0mg 100ml 25/100 3,2/100 0,0160

Tiamina 25mg 25,0mg 100ml 25/100 3,2/100 0,0020

Rivoflavina 20mg 19,9mg 100ml 25/100 3,2/100 1,5920

Biotina 0.5mg 0,5mg 100ml 25/100 3,2/100 0,0040

Cianocobalamina 40mg 0,49mg 100ml 25/100 3,2/100 0,0039

Ácido Nicotínico 75mg 75,3mg 100ml 25/100 3,2/100 6,2400

Vitamina E 25mg 24,8mg 100ml 25/100 3,2/100 1,9840


- 83 -

ANEXO 3ANEXO 3-- PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DEL PRODUCTO PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DEL PRODUCTO

5 grageas5 grageas

100ml Agua desmineralizada estéril100ml Agua desmineralizada estéril

Disolución 30 minutos a 50°C

25ml25ml

3.2ml 3.2ml

88µµg/20mlg/20ml

0, 25mg/ml 0, 25mg/ml


- 84 -

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