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Implementación de biocatalizadores en la reducción

enantioselectiva de cetotioacetales

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Químico de la Universidad de Los Andes

Camilo Andrés Gómez Garzón Director: Diego Alexander Gamba Sánchez

Químico M.Sc, Ph.D.

Departamento de Química

Bogotá, 12 de noviembre de 2013

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A mis abuelos, Álvaro Gómez (QEPD) y Teresa Díaz.

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AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer primeramente, y de forma enfática, a mis padres; pues su apoyo fue imprescindible en el desarrollo de mi vida universitaria, en mis peripecias académicas y vocacionales y en la culminación de las mismas. También a mis abuelos, Álvaro Gómez (QEPD) y Teresa Díaz; a mi tío Ricardo Gómez, a mi tía Carmenza Garzón y a todos los miembros de mi familia que de una u otra forma me ayudaron en mi adaptación a Bogotá, ciudad que terminé queriendo más de lo que esperaba. Al Dr. Diego Gamba Sánchez, por su dirección en el desarrollo de este trabajo y por el aprendizaje que logré sobre química orgánica, técnicas de laboratorio y otros varios menesteres científicos. A mis amigos y compañeros de laboratorio, por su apoyo emocional, en el laboratorio y por soportar, de forma poco amena, los olores repugnantes de este trabajo. Al Dr. Andrés González Barrios y a David Páez Melo, por su colaboración con C. vulgaris, aunque no logré con ello lo que esperaba. Y a todos los profesores responsables de mi formación como científico, que me permitió llegar hasta aquí, produciendo lo que es un primer, aunque humilde, material científico auténtico que es también una retribución a la Universidad de los Andes que tanto respeto y a mí mismo. Gracias.

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ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS MO Microorganismo NAD(P)H Dinucleótido de nicotinamida y adenina. P indica fosfato y H, hidruro CAN Nitrato de amonio y cerio (IV) DCM Diclorometano TA/RT Temperatura ambiente / Room temperature ee Exceso enantiomérico eq Equivalente molar C=C Doble enlace entre átomos de carbono GDPP Grupo de diseño de productos y procesos

PTSA Ácido p-toluensulfónico CCD Cromatografía en capa delgada THF Tetrahidrofurano EtOH Etanol cat Catalizador

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LISTA DE FIGURAS Y ESQUEMAS Figura/Esquema Pág

Esquema 1. Clasificación de las enzimas involucradas en la reducción 9

de cetonas proquirales

Esquema 2. Reducción biocatalizada de cetonas proquirales en sistemas autótrofos 12

Esquema 3. Reacción de acetalación/tioacetalación con etilenglicol/1,3-propanoditiol 13

Esquema 4. Transtioacetalación 13

Esquema 5. Ruta sintética general planteada 14

Esquema 6. Síntesis propuesta de ditianos 15

Esquema 7. Biorreducción de acetofenona 15

Esquema 8. Obtención racémica del 1-feniletanol (16) 17

Esquema 9. Mecanismos de transtioacetalación 21

Esquema 10. Obtención racémica de 1-(1,3-ditian-2-il)propan-2-ol (17) 21

Esquema 11. Obtención de 1,3-ditiano-2-carboxilato de etilo (4) por transtioacetalación 23

Esquema 12. Obtención de 1-(1,3-ditian-2-il)but-3-en-1-ona (5) 24

Esquema 13. Obtención de 1,3-ditiano y 2-metil-1,3-ditiano 25

Figura 1. Clasificación de las técnicas biocatalíticas más frecuentes 8 Figura 2. 5Z-7-oxozeaenol 13 Figura 3. Producto de doble adición 24

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CONTENIDO Pág

1. Introducción 7

2. Marco teórico 8 2.1. Biocatálisis en reacciones enantioselectivas 8 2.2. Reducción de cetonas proquirales y la regla de Prelog 9 2.3. Biocatálisis con células enteras 11

2.3.1. Microalgas y cianobacterias 11

2.4. Acetales y tioacetales 12

2.5. 5Z-7-oxozeaenol 13

3. Planteamiento del problema 14

4. Objetivos 16

5. Resultados y discusión 17 5.1. Reducción de acetofenona a 1-feniletanol 17

5.1.1. Reducción racémica 17 5.1.2. Biorreducción 17

5.2. Sínstesis y reducción de 1-(1,3-ditian-2-il)propan-2-ona (2) 19

5.2.1. Síntesis 19 5.2.2. Reducción racémica 21 5.2.3. Biorreducción 22

5.3. Síntesis de 1-(1,3-ditian-2-il)but-3-en-1-ona (5) 23

5.4. Aproximaciones a la obtención de 24

4-(1,3-ditian-2-il)butan-2-ona (8)

6. Conclusiones y perspectivas 26

7. Parte experimental 27

8. Referencias 34

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1. INTRODUCCIÓN1 El desarrollo de nuevas reacciones enantioselectivas es uno de los mayores objetivos en síntesis orgánica debido principalmente a su importancia en la obtención de compuestos con actividad biológica1, donde la configuración de los centros quirales determina, en gran medida, dicha actividad. Con el propósito de aportar al alcance de tal objetivo se han publicado múltiples propuestas de estrategias en catálisis enantioselectiva, como la utilización de catalizadores con centros metálicos2–4, la organocatálisis5,6 y la biocatálisis. Esta última consiste en el uso de enzimas, aisladas o un sistema biológico como catalizador7, y es el área de desarrollo en la que se enfocó el presente trabajo. La implementación biocatalítica planteada en este documento consiste en el uso de células enteras (whole cells) como biocatalizadores, que además de brindar las ventajas que posee la biocatálisis sobre los procedimientos químicos, también es un método económico, efectivo y de fácil implementación en contraste con el uso de enzimas aisladas, que a pesar de su alta eficiencia, representan elevados costos de implementación y requieren el uso de enzimas auxiliares o cofactores. Entre las ventajas de la biocatálisis sobre los métodos químicos se incluyen alta quimioselectividad, altos rendimientos y altos excesos enantioméricos, la posibilidad de reutilización de los catalizadores, producción de desechos no tóxicos, entre otras7–9. El objetivo de este trabajo es la evaluación del uso de biocatalizadores, enfocándose en células vegetales y microalgas, en la reducción enantioselectiva de cetotioacetales con miras a su implementación como proceso intermedio en la síntesis de 5Z-7-oxozeaenol y análogos.

1 R. N. Patel, Coord. Chem. Rev, 2008, 252, 659–701.

2 L. Ma, C. Abney, and W. Lin, Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 1248–56.

3 Z. Du and Z. Shao, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 1337–78.

4 T. Seiser and N. Cramer, Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 2835–40.

5 Z. Peng and N. Takenaka, Chem. Rec., 2013, 13, 28–42.

6 A.-M. Caminade, A. Ouali, M. Keller, and J.-P. Majoral, Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 4113–25.

7 S. E. Milner and A. R. Maguire, ARKIVOC, 2012, 2012, 321–382.

8 R. N. Patel, ACS Catal., 2011, 1, 1056–1074.

9 K. Nakamura, R. Yamanaka, T. Matsuda, and T. Harada, Tetrahedron-Asymmetr., 2003, 14, 2659–2681

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2. MARCO TEÓRICO2 2.1. Biocatálisis en reacciones enantioselectivas La biocatálisis ha sido propuesta como estrategia de síntesis en la obtención de compuestos quirales debido a que al tratarse de procesos mediados por enzimas, suele asociarse a reacciones con alta quimio y enantioselectividad7,9,10. Lo anterior puede explicarse por el papel que desempeñan las enzimas en los sistemas biológicos como catalizadores naturales, pues la obtención de un producto enantioméricamente puro es crucial en los procesos biológicos en los que esté involucrado. Existe una amplia variedad de reacciones descritas con biocatálisis; sin embargo, las reacciones que reciben mayor interés son las que involucran productos con centros asimétricos, pues es en estas donde la biocatálisis significa mayor ahorro de recursos. Entre estas reacciones se incluyen oxidaciones de sulfuros proquirales11,12, oxidaciones de Baeyer-Villeger, reducciones de enlaces dobles entre átomos de carbono, resolución cinética de enantiómeros y, las que son el enfoque principal del presente documento, reducciones de cetonas proquirales7,9,10. Las estrategias de biocatálisis pueden clasificarse en varios grupos según diferentes criterios, como el sistema donde se encuentra la enzima en cuestión (aislada o en células), el origen del biocatalizador, etcétera. En la figura 1 se presenta un esquema de clasificación global de las técnicas biocatalíticas.

Figura 1. Clasificación de las técnicas biocatalíticas más frecuentes

10

Matsuda, T.; Yamanaka, R.; Nakamura, K. Tetrahedron-Asymmetr. 2009, 20, 513–557. 11

Kiełbasiński, P. Phosphorus. Sulfur. 2011, 186, 1104–1118. 12

Mahony, G. E. O.; Kelly, P.; Lawrence, S. E. ARKIVOC 2011, 2011, 1–110.

9

2.2. Reducción de cetonas proquirales y la regla de Prelog3 Los alcoholes son considerados como piezas (building blocks) de gran utilidad en síntesis orgánica, ya que pueden utilizarse como precursores de múltiples grupos funcionales y dicha utilidad potencial aumenta cuando se trata de alcoholes quirales, pues son ampliamiente utilizados en la síntesis asimétrica de compuestos con actividad biológica13. La obtención de alcoholes quirales por reducción asimétrica biocatalizada de cetonas ha sido ampliamente estudiada desde hace varias décadas. Actualmente se conocen varios detalles de este tipo de reacciones, como por ejemplo las enzimas involucradas y los factores que afectan la reacción, así como sus valores óptimos; factores como temperatura, tamaño del sustrato, sustituyentes en el sustrato, polaridad del disolvente, presencia de cosustratos, entre otros9. La reducción biocatalizada de una cetona proquiral ocurre por la adición de un hidruro al carbono carbonílico. Dicho hidruro proviene de un cofactor de nicotinamida (NAD(P)H) y es adicionado a la cetona por acción enzimática. La adición puede darse tanto por la cara re de la cetona como por la cara si, así mismo cualquiera de los dos hidruros del cofactor puede ser el que se adicione (el hidruro pro-R o el hidruro pro-S). Según este criterio las enzimas oxidoreductasas de cetonas se clasifican en cuatro tipos, E1, E2, E3 y E4 como lo muestra el siguiente esquema:

Esquema 1. Clasificación de las enzimas involucradas en la reducción de cetonas proquirales. RS y RL son respectivamente los sustituyentes de menor y mayor tamaño de la cetona. Este

esquema fue elaborado basándose en el esquema publicado por Nakamura y colaboradores10.

13 Chartain, M.; Greasham, R.; Moore, J.; Reider, P.; Robinson, D.; Buckland, B. Chin. J. Chem. Eng. 2010, 18, 1029–

1033.

10

Ejemplos de enzimas E1 son la alcohol deshidrogenasa de Pseudomonas sp. y de Lactobacillus kefir; de E2, la glicerol deshidrogenasa de Geotrichum candidum y la dihidroxiacetona reductasa de Mucor javanicus; de E3, la alcohol deshidrogenasa de Moraxella sp. y de hígado de caballo10. Como producto de esta reacción de obtiene el alcohol quiral y NAD(P)+, que corresponde a la forma oxidada del cofactor. Como es de notar, la presencia del cofactor es imprescindible para que la reacción se dé, por ello en las técnicas de biocatálisis con enzimas aisladas se requiere de una concentración inicial de NAD(P)H suficiente para completar la reacción deseada, o bien, la presencia de una enzima auxiliar que renueve el NAD(P)H por reducción del NAD(P)+ y oxidación de un sustrato auxiliar. El mantenimiento del cofactor es entonces uno de los factores que hace de la biocatálisis con enzimas aisladas un proceso de elevado costo, además de las dificultades que supone la adquisición de la enzima. En la siguiente sección se expondrá cómo la biocatálisis con células enteras es una alternativa que supera estas dificultades sacrificando en ciertos casos los rendimientos de reacción en una proporción aún aceptable.4

Uno de los primeros estudios, que es a su vez una de las mayores contribuciones, sobre biocatálisis en la reducción enenatioselectiva de cetonas, fue llevado a cabo por Valdimir Prelog en los años sesenta14. Construyendo modelos sobre geometrías de diamantes de las disposiciones menos impedidas entre una cetona y el cofactor NAD(P)H para llevar a cabo la trasferencia de hidruro, Prelog predijo que el producto más favorecido sería el enantiómero S del alcohol. A pesar de que Prelog no tuvo en cuenta ningún aspecto relacionado con las enzimas involucradas, como la geometría de su sitio activo o sus cambios estructurales durante la reacción, todas las publicaciones sobre reducción biocatalizada de cetonas muestran que efectivamente la mayoría de enzimas estudiadas generan productos con excesos enantioméricos de la forma S, es decir, son evidencia a favor de las conclusiones de Prelog. Se dice entonces que la regla de Prelog postula el favorecimiento biocatalítico de alcoholes S por reducción de cetonas proquirales, las reacciones biocatalizadas donde se forma en mayor proporción el enantiómero R son conocidas como reducciones anti-Prelog15. La aplicación más inmediata postulada en este trabajo para la reducción biocatalícia de cetoditianos es en la síntesis de 5-7Z-oxozeaenol, que se expondrá en la sección 2.5. En ésta se requiere la forma S del alcohol producido a partir del cetoditiano. Lo anterior significa que la regla de Prelog es un indicio teórico que justifica la búsqueda de sistemas biológicos capaces de llevar a cabo este tipo de reacciones bajo la premisa de una posible aplicación aquí planteada.

14 Prelog, V. Pure Appl. Chem. 1964, 9, 119–130.

15 Orden, A. A.; Bisogno, F. R.; Giordano, O. S.; Kurina Sanz, M. J. Mol. Catal. B. Enzym. 2008, 51, 49–55.

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2.3. Biocatálisis con células enteras5 La biocatálisis con células enteras consiste en el uso de enzimas aún en el sistema biológico del que provienen, es decir, evitando su aislamiento o sobreexpresión mediante técnicas de ingeniería genética7. Esto representa un ahorro importante de recursos pues entre los biocatalizadores más utilizados de este tipo se encuentran cultivos celulares, por ejemplo de Saccharomyces cerevisiae (la levadura del pan) o de Escherichia coli y demás bacterias, hongos, plasmodios y algas, que son de fácil mantenimiento en condiciones de laboratorio. Así mismo se reporta el uso de tejidos vegetales, como hortalizas, de amplio acceso comercial (ejemplo: zanahorias, apio y pepino)7,9,10. Un factor importante relacionado con el uso de células enteras en biocatálisis es que al tratarse de células presentes en la mezcla reaccionante, se trata realmente de una mezcla compleja de enzimas que llevan a un resultado neto. Esto en algunos casos se traduce en disminución del rendimiento o aparición de reacciones secundarias. Existen reportes sobre casos en donde se han encontrado enzimas que llevan a cabo la reacción inversa a la deseada, como también la presencia de racemasas y oxidasas estereoespecíficas que disminuyen la cantidad y el exceso enantiomérico del producto. Sin embargo, este hecho ha sido utilizado también para purificar mezclas racémicas por oxidación del estereoisómero no deseado. Por ejemplo Andrade y colaboradores16 lograron obtener, usando células vegetales, 1-feniletanol por bioxidación de una mezcla racémica con más de 98 % ee del isómero R o S según el biocatalizador. En algunos casos el secado de las células con acetona ha demostrado ser eficiente en la remoción de enzimas interferentes. A pesar de lo anterior, la presencia de mezclas complejas de enzimas en las células enteras supone además el mayor ahorro de recursos de esta técnica, pues la célula ya dispone de los cofactores necesarios y enzimas capaces de renovarlo, por lo que generalmente el único adyuvante utilizado en este tipo de biocatálisis son cosustratos, como azúcares o aminoácidos, que las enzimas auxiliares oxidan en la reducción del NAD(P)+. 2.3.1. Microalgas y cianobacterias Varios de los reportes más recientes en el área de biocatálisis con células enteras se enfocan en el uso de microalgas y cianobacterias en la oxidación de sulfuros proquirales17,18 y en la reducción de cetonas aromáticas y de α y β-cetoésteres19,20,21,

16 Andrade, L. H.; Utsunomiya, R. S.; Omori, A. T.; M. Porto, A. L.; Comasseto, J. V. J. Mol. Catal. B Enzym. 2006, 38,

84–90. 17

Yoshida, T.; Kito, M.; Tsujii, M.; Nagasawa, T. Biotechnol. Lett. 2001, 23, 1217. 18

Daligault, F.; Nugier-Chauvin, C.; Patin, H. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 1474–1477. 19

Kaoru, K. I.; Tadashi, N.; Ryusuke, A. Biotechnol. Lett. 2012, 34, 2083–2086. 20

Yang, Z.-H.; Luo, L.; Chang, X.; Zhou, W.; Chen, G.-H.; Zhao, Y.; Wang, Y.-J. J Ind. Microbiol. Biotechnol 2012, 39, 835–841. 21

Havel, J.; Weuster-Botz, D. Eng. Life. Sci. 2006, 6, 175–179.

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en los cuales se reportan altos valores de porcentaje de rendimiento y excesos enantioméricos. La particularidad del uso de este tipo de organismos consiste en su autotrofía por fotosíntesis. En la fotosíntesis se producen azúcares a partir de dióxido de carbono, agua y luz. En las reacciones de fotosíntesis los factores de nicotinamida son reducidos a NADP(H) que puede ser utilizado por las oxidorreductasas para la biorreducción de los compuestos carbonílicos, es decir, la fotosíntesis representa un sistema de renovación de cofactores por convergencia de las dos rutas metabólicas (la fotosíntesis y la biorreducción). Se ha demostrado que los organismos fotosintéticos llevan a cabo biorreducciones con mayor rendimiento en condiciones de autotrofía que condiciones de heterotrofía. Además también se ha demostrado un incremento significativo del rendimiento con la adición de cosustratos.

Esquema 2. Reducción biocatalizada de cetonas proquirales en sistemas autótrofos. Esquema

adaptado del publicado por Nakamura y colaboradores9

2.4. Acetales y tioacetales La reducción selectiva de una función química en una molécula que posee más de una función susceptible a la reducción implica necesariamente la protección selectiva de la función que no se desea reducir. Éste es el caso de la reducción de cetoaldehídos, donde la reducción selectiva al carbonilo cetónico requiere necesariamente una protección del carbonilo del aldehído. Esta protección puede hacerse mediante acetalación o tioacetalación del carbonilo mediante la reacción con un alcohol (2 eq de OH) o un tiol respectivamente (2 eq de SH). En materia de protección del carbonilo los tioacetales presentan ventajas sobre los acetales, pues son más estables en medio ácido e igualmente estables en medio básico, además de que su formación suele darse con más facilidad por el mayor carácter nucleofícilo del azufre con respecto al

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oxígeno22. Los carbonilos protegidos mediante tioacetalación suelen desprotegerse después de la reacción de interés mediante CAN, HgCl2/CdCO3 o pueden reducirse completamente con níquel Raney22.

Esquema 3. Reacción de cetalación/tiocetalación con etilenglicol/1,3-propanoditiol. Debido a que algunos cetoacetales son comercialmente accesibles, una obtención más sencilla del tiocetal respectivo consiste en la transtiocetalación, es decir, el cambio de grupo funcional. Esta reacción es llevada a cabo por catálisis con ácidos próticos o de Lewis débiles, como trifloruro de boro o catalizada con yodo molecular23.

Esquema 4. Transtiocetalación. El tiocetal de seis miembros es llamado también ditiano, en este caso un 1,3-ditiano.

2.5. 5Z-7-oxozeaenol Como se mencionó anteriormente, la aplicación inmediata ya planteada de la

biorreducción de cetotiocetales es la generación de alcoholes secundarios quirales,

reacción involucrada en la síntesis de 5Z-7-oxozeaenol; un antiinflamatorio inhibidor

de las MAP-quinasas ERK2 y TAK124, que es a su vez una molécula objetivo en el

Laboratorio de Síntesis Orgánica, Bio y Organocatálisis. 6

Figura 2. 5Z-7-oxozeaenol. El centro quiral resaltado en azul se obtendría con una reacción de Alpin-Borano, éste podría obtenerse también por biocatálisis con una reducción tipo Prelog.

22 Sykes, P. Guidebook to Mechanism in Organic Chemistry; 6th ed.; Pearson Education Limited: Edimburg Gate,

1996; pp. 203–245. 23

Firouzabadi, H.; Iranpoor, N. J. Org. Chem. 2001, 66, 7527–7529. 24

Ninomiya-Tsuji, J.; Kajino, T.; Ono, K.; Ohtomo, T.; Matsumoto, M.; Shiina, M.; Mihara, M.; Tsuchiya, M.; Matsumoto, K. J. Biol. Chem. 2003, 278, 18485–18490.

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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA7 Los reportes sobre biocatálisis con células enteras han mostrado a esta estrategia sintética como una forma eficiente de realizar reacciones obteniendo altos rendimientos y excesos enantiomericos, así como gran quimioselectividad en diversas transformaciones. Aún en los casos donde la conversión o el rendimiento son moderados, la biocatálisis sigue representando una herramienta útil debido a su fácil implementación, que no involucra residuos tóxicos ni reactivos de difícil adquisición. Es por esto que el uso de biocatalizadores es una alternativa que debe contemplarse a la hora de realizar reacciones que requieran quimio y estereoselectividad.

Un caso de este tipo de reacciones es la reducción de cetotioacetales proquirales, que

pueden reducirse en el carbonilo cetónico para la generación de alcoholes secundarios

quirales. Este tipo de reacción está involucrada, como ya se ejemplificó, en la síntesis

de 5Z-7-oxozeaenol llevándose a cabo comúnmente la reducción usando Alpin-Borano.

Se plantea el uso de tioacetales en lugar de acetales debido a las condiciones más fuertes de reacción que estos requieren para su rompimiento. Confiriendo mayor estabilidad a la molécula resultante para su uso en posteriores reacciones.

La estrategia general propuesta comienza con la síntesis de ditianos por transtioacetalación, o bien con la protección directa sobre el aldehído. En cualquiera de los dos casos utilizando 1,3-propanoditiol para la formación del ditiano.

Posteriormente se pretende también la evaluación del uso de biocatalizadores en la reducción enantioselectiva de los compuestos previamente sintetizados, puesto que este tipo de compuestos han sido escasamente reportados como sustratos en procesos biocatalíticos: únicamente con S. cerevisiae25 y Aspergillus niger26 (ambos, hongos). En contraste se conoce con gran detalle el desempeño de los biocatalizadores en la reducción de cetonas, aldehídos y α y β-cetoésteres7,9,10.

Esquema 5. Ruta sintética general planteada. §El cetoditiano puede requerir reacciones previas antes de ensayarse la bioreducción

Por el criterio de la regla de Prelog se espera encontrar un biocatalizador que favorezca la formación del producto S, que tiene aplicación en la síntesis de 5Z-7-oxozeaenol.

Ditianos cuya síntesis ha sido planeada con anticipación a este trabajo con miras a ensayar su biorreducción se presentan en el esquema 6.

25 Bongardt, T.; Dreeßen, S.; Tiedemann, R.; Schaumann, E. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 4549–4551.

26 Bracher, F.; Litz, T. Org. Prep. Proced. Int. 1995, 27, 555–559.

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Esquema 6. Síntesis propuesta de ditianos

La aparición del producto de doble adición en la reacción de Grignard en la síntesis de 5 se discute en la sección de resultados y discusión. Así mismo en el esquema no se muestra un

método de control sobre la posible doble adición en el caso de 14, cuya síntesis no se llevó a cabo.

La evaluación de la biorreducción sobre los compuestos 1, 5, 8, 11 y 14 permitiría evaluar la influencia del sustrato sobre la actividad de la(s) enzima(s) en cada biocatalizador, por ejemplo la longitud de la cadena carbonada entre el ditiano y el carbonilo o la selectividad cuando otros grupos reducibles están presentes (como carbonilo y C=C).

Debido que aquí se plantea una implementación de novo de algunos biocatalizadores, y por lo tanto se desconocen las condiciones óptimas de reducción (tiempo de reacción, cosustratos e iluminación), estos biocatalizadores serán primeramente ensayados en la reducción de la acetofenona, que se encuentra bien descrita para la mayoría de biocatalizadores implicados en biorreducción.

Esquema 7. Biorreducción de acetofenona

Se planea el ensayo de dos grupos de biocatalizadores debido a la facilidad e innovación que su uso implica: células vegetales y microalgas, ya que sobre estos

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organismos se refieren las publicaciones más recientes sobre obtención de alcoholes quirales, y las últimas además permiten gran versatilidad en su estéreo y quimioselectividad según las condiciones de reacción y crecimiento27. Se propone el uso de Chlorella vulgaris y Chlamydomonas reinhardtii, la primera ya reportada en la obtención de alcoholes quirales19,20,27 y la segunda sin ningún reporte existente en biocatálisis. Ambos organismos son cultivados actualmente en el laboratorio del GDPP del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los Andes.

4. OBJETIVOS8 4.1. Objetivo General Evaluar el desempeño de biocatalizadores de células enteras en la reducción enantioselectiva de los cetotioacetales sintetizados.

4.2. Objetivos específicos

Estandarizar las condiciones óptimas de reacción de cada biocatalizador usando como modelo la reducción de acetofenona.

Sintetizar los compuestos 1, 5, 8, 11 y 14

Ensayar la reducción de 1, 5, 8, 11 y 14 con los biocatalizadores en las condiciones óptimas establecidas.

Determinar el rendimiento y exceso enantiomérico de los alcoholes correspondientes a la biorreducción de 1, 5, 8, 11 y 14.

27 Ishihara, K.; Yamaguchi, H.; Dachi, N.; Hamada, H.; Nakajima, N. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000, 64, 2099–2103.

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5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN9 5.1. Reducción de acetofenona a 1-feniletanol 5.1.1. Reducción racémica Con el fin de obtener un patrón adecuado para la caracterización y aislamiento de los alcoholes obtenidos en las biorreducciones de todos los compuestos carbonílicos, incluyendo la acetofenona, estos fueron reducidos primeramente de forma racémica con borohidruro de sodio (NaBH4). Para el caso de la acetofenona la reducción se llevó a cabo utilizando ácido bórico (H3BO3) como activador bajo condiciones libres de disolvente. Se obtuvo conversión completa tras 30 min de reacción, aislando el producto deseado con un rendimiento del 90 % únicamente con extracción líquido-líquido.

Esquema 8. Obtención racémica del 1-feniletanol (16)

En la literatura se reporta que estas condiciones de reacción pueden ser utilizadas para la reducción de múltiples cetonas, no sólo aromáticas, obteniéndose rendimientos cuantitativos en la mayoría de los casos28. Adicionalmente el ácido bórico puede ser reemplazado por PTSA o ácido benzoico sin alterar el rendimiento de la reacción28. Esta reducción también se reporta como quimioselectiva hacia carbonilos cetónicos aún en presencia de ésteres y enlaces dobles28, por lo que es potencial candidata para la reducción racémica de cetoditianos líquidos con otros grupos otros susceptibles a reducirse. 5.1.2. Biorreducción La biorreducción de acetofenona (véase esquema 7) se ensayó con tres sistemas modelo de biocatálisis: S. cerevisiae (como levadura), C. vulgaris (como microalga) y Daucus carota (zanahoria, como vegetal). Levaduras: Para el caso de S. cerevisiae se experimentó con tres sistemas de biocatálisis, cuya descripción y resultados se resumen en la siguiente tabla:

28 Cho, B. T.; Kang, S. K.; Kim, M. S.; Ryu, S. R.; An, D. K. Tetrahedron 2006, 62, 8164–8168.

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Tabla 1. Sistemas de biorreducción con S. cereviciae10

No se aisló el producto en ninguno de los tres sistemas ya que, bajo criterio de observación en CCD, no hubo conversión apreciable tras 96 h de reacción. Reportes de conversión incompleta con S. cerevisiae para la reducción de la acetofenona existen para estas tres metodologías. Estos resultados pueden explicarse como producto de la alta toxicidad que las cetonas aromáticas representan para la levadura30. El sistema de fase microacuosa trata de solventar este problema al aislar a la levadura en una fase acuosa para que lleve a cabo la reducción en lo que es una homología a los sistemas de transferencia de fase en síntesis orgánica, sin embargo; aún con esta técnica no se obtuvo resultado. Las biorreducciones de cetonas aromáticas con S. cereviciae están reportadas con excelentes rendimientos únicamente al inmovilizar las células en películas de alginato31, que brindan mayor protección que el sistema bifásico. Esto da evidencia que si bien la levadura posee enzimas capaces de reducir la acetofenona, es necesario garantizar la viabilidad de las células durante el proceso, cosa que no se logró con las tres técnicas exploradas. Microalgas: Se llevaron a cabo dos reacciones piloto para este biocatalizador en las condiciones establecidas en la sección de metodología (Experimental), sin embargo, no fue posible proseguir con la experimentación con microalgas debido a dificultades en su cultivo, por lo que en este documento no se reportan resultados de este biocatalizador. Zanahoria: La reacción con zanahorias se llevó a cabo mediante dos metodologías diferentes en las que sólo se varió el modo de adición de la acetofenona a la mezcla reaccionante. Por un lado la acetofenona fue adicionada directamente mientras que en la otra metodología, ésta se adicionó en forma de una solución en etanol. Los resultados obtenidos tras dos días de reacción se presentan a continuación:

29 Liu, X.; Zhu, T.; Sun, P.; Xu, J. Synth. Commun. 2001, 1521–1526.

30 Yang, Z.; Zeng, R.; Chang, X. Food Technol. Biotechnol. 2008, 46, 322–327. 31 Milagre, H. M. S.; Milagre, C. D. F.; Moran, P. J. S.; Santana, M. H. A.; Rodrigues, J. A. R. Enzym. Microb. Technol. 2005, 37, 121–125.

Entrada Sistema Descripción Observaciones adicionales

Conversión y rendimiento

i Fase orgánica con levadura seca29

Contacto directo de la levadura con la acetofenona en pentano

Se utiliza levadura liofilizada Despreciable

ii

Fase orgánica con levadura

activada29,30

Contacto directo de la levadura con la acetofenona en pentano

Se utiliza levadura previeamente activada por incubación en medio nutritivo

Despreciable

iii

Fase microacuosa29

Contacto indirecto de la levadura con la acetofenona en un sistema bifásico

La levadura se encuentra en la fase aucuosa y el reactivo y el producto, en la fase orgánica

Despreciable

19

Tabla 2. Sistemas de biorreducción con D. carota11

Los reportes consultados de biorreducción con zanahorias y otras plantas adicionan el sustrato directamente a una mezcla de cortes de la planta en agua32,33, en este caso logró mejorarse el rendimiento con la predisolución de la acetofenona, esto puede explicarse como un fenómeno cinético de disolución y reacción. En el caso de la adición directa no se observó total disolución de la acetofenona en la mezcla reaccionante hasta seis horas después de la adición, mientras que con la predisolución en etanol toda la acetofenona ya se encontraba en fase acuosoa y por ende en mayor contacto con las enzimas que realizan la reducción. En ambos casos la purificación por cromotografía de columna fue necesaria pues se observó la extracción de pigmentos coloreados provenientes de la zanahoria. Teniendo en cuenta estos resultado, la técnica de predisolución se empleó en la biorreducción de ditianos. Respecto al exceso enantiomérico, éste no se vio afectado por la metodología de adición aunque fue 7 % menor a lo reportado en la literatura32, y a su vez corresponde a la regla de Prelog. 5.2. Síntesis y reducción de 1-(1,3-ditian-2-il)propan-2-ona (2) 5.2.1. Síntesis Para la obtención de este ditiano se ensayaron dos vías de transtioacetalación a partir del dimetilacetal como precursor (véase esquema 6): La utilización de yodo molecular (I2) como catalizador23 y de trifloruro de boroeterato (BF3∙Et2O)34.

32 Blanchard, N.; van de Weghe, P. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 2348–2353.

33 Lakshmi, C. S. Green Chem. 2011, 1, 117–122. 34 Gardell, S. Preparation of imidazole derivatives and methods of use. US Patent WO2005US08904, 2005.

Entrada Metodología Conversión Rendimiento ee (S) i Adición directa 100 % 45 % 85 %

ii En etanol 74 % 56 % (corregido) 85 %

20

Tabla 3. Síntesis de 2

La transtioacetalación catalizada por ácidos próticos, como HCl y PTSA, y por ácidos de Lewis, como el BF3∙Et2O, está bien reportada en la literatura25,35,36, sin embargo, las publicaciones existentes no reportan rendimientos superiores al 75 %. La técnica con empleo de BF3∙Et2O aquí utilizada fue usada por Bayer Pharmaceuticals34 y consiste en el mantenimiento de la reacción en reflujo con exceso de BF3∙Et2O (2 eq) en lugar de cantidades catalíticas como se reporta previamente. El rendimiento obtenido fue el mismo que el registrado por Bayer Pharmaceuticals y es hasta ahora el mejor rendimiento reportado para esta reacción. 12 Por otro lado se ensayó la catálisis con yodo molecular, debido a que en 2001 Firouzabadi y colaboradores23 reportaron por primera vez la transtioacetalación y tioacetalación con este catalizador por reportes previos de hidrólisis de tioacetales y tritianos con yodo37 y tioacetalaciones con yodo38. Firouzabadi y colaboradores reportan rendimientos entre 70 y 96 % para cetonas y acetales aromáticos y alifáticos, pero no reportan resultados con cetoaldehídos protegidos, por lo que el ensayo aquí reportado constituye una aplicación de novo de tal reacción. La reacción se realizó en dos de los disolventes reportados como eficientes, DCM y cloroformo, y los resultados fueron consistentes con el comportamiento reportado, obteniéndose un rendimiento levemente mejor con cloroformo que con DCM, sin embargo ambos rendimientos son insuficientes en comparación al obtenido con BF3∙Et2O e incluso a lo reportado con ácidos en cantidades catalíticas.

35 David, B.; Schuber, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1673–1676. 36 Anthonsen, T.; Hoff, B.; Hofslokken, N.; Skattebol, L.; Sundby, E. Acta Chem. Scand. 1999, 53, 360–365. 37 Chattopadhyaya, J. B.; Rao, A. V. R. Tetrahedron Lett. 1973, 14, 3735–3736. 38 Samajdar, S.; Basu, M. K.; Becker, F. F.; Banik, B. K. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 4425–4427.

Entrada Metodología Condiciones Conversión Rendimiento i Catalizada con yodo 0.5 h en CHCl3 a TA 100 % 47 %

ii Catalizada con yodo 0.5 h en DCM a TA 100 % 40 %

iii Con BF3.Et2O 0.5 h en CHCl3 en reflujo 100 % 94 %

21

Esquema 9. Mecanismos de transtioacetalación

Adicional a las caracterización espectroscópica, también se registró el punto de fusión, que correspondió a lo esperado para el producto (105 – 106 °C)39.

5.2.2. Reducción racémica13 Debido a que 2 se trata de un sólido, se eligió una técnica de reducción con NaBH4 en disolución de THF y etanol25 con la que se obtuvo rendimiento cuantitativo.

Esquema 10. Obtención racémica de 1-(1,3-ditian-2-il)propan-2-ol (17)

39 Hofsløkken, N. U.; Skattebøl, L. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1999, 1, 3085–3088.

22

5.2.3. Biorreducción14 La biorreducción de acetales40 y cetodiatianos25,36 con S. cerevisiae se ha reportado desde hace más de una década en la síntesis total de otros compuestos, por lo que este biocatalizador no fue evaluado para los ditianos y se prefirió evaluar en primer lugar biocatalizadores no reportados previamente en esta reacción, se utilizó D. carota (zanahoria), Apium graveolens (apio) y Zingiber officinale (jengibre) debido a que ya han sido utilizados como biorreductores de cetonas proquirales con buenos resultados16,41. 15 Se utilizó una extrapolación de la metodología de disolución en etanol previamente descrita para la acetofenona, pero sustituyendo el etanol por una mezcla equivolumétrica de etanol y THF, puesto que 2 es altamente soluble en THF.

Tabla 4. Síntesis de 17 por biorreducción de 2

De los tres biocatalizadores ensayados, sólo con D. carota ocurrió la reacción esperada con conversión completa tras 48 h. Si bien D. carota es el organismo vegetal reportado con mejores resultados en biorreducciones de cetonas32, Z. officinale y A. graveolens también poseen reportes de éxito en esta reacción y además con buenos resultados de rendimiento y exceso enantiomérico16,41, adicionalmente A. graveolens y D. carota tienen una relación filogenética al pertenecer a la familia Apiaceae. Lo anterior significa que la oxidorreductasa de D. carota posee cambios estructurales únicos (al menos en su orden) que le permiten la reducción de carbonilos cetónicos en cetoditianos. Una explicación alternativa consistiría en la presencia de una o varias enzimas que sólo se encuentran en D. carota (entre los tres biocatalizadores ensayados) que permiten la reducción del cetoditiano. La prolongación en el tiempo de reacción par Z. officinale y A. graveolans se hizo imposible por evidente degradación del biocatalizador tras cinco días, que podría llegar incluso a afectar el rendimiento y el aislamiento del producto. Esta constituye una desventaja de la biocatálisis con células enteras frente a las enzimas aisladas o frente a métodos químicos.

40 Besse, P.; Ciblat, S.; Canet, J. Tetrahedron-Asymmetr. 1999, 6, 2213–2224. 41 Maczka, W. K.; Mironowicz, A. Tetrahedron-Asymmetr. 2002, 13, 2299–2302.

Entrada Biocatalizador Conversión Rendimiento ee (S) i A. graveolens Despreciable - -

ii Z. officinale Despreciable - -

iii D. carota 100 % 70 % 48 %

23

El resultado obtenido con D. carota muestra que este biocatalizador puede reducir el grupo cetónico de 2 en sentido Prelog, obteniendo un exceso enantiomérico bajo del enantiómero S junto con un rendimiento aceptable, que posiblemente pueda mejorarse variando procedimientos experimentales y condiciones de reacción, como la presencia de un cosustratos. Si bien se puede concluir que D. carota funciona en la catálisis de la reducción de 2 en sentido Prelog, no puede concluirse a cerca de su selectividad ni de cómo puede variarse el exceso enantiomérico en la biorreducción de cetoditianos, pues hace falta la caracterización completa de este biocatalizador para la reacción. El ensayo de la biorreducción de los sustratos propuestos en el esquema 6 funcionaría para este fin, pues permitiría evaluar la influencia en el rendimiento y en la enantioselectividad del tamaño de la cadena carbonada y de la presencia de otras funciones en la molécula. Encontrar otros biocatalizadores de la reducción de cetoditianos es necesario no sólo por obtener una caracterización completa de otros sistemas biocatalíticos, sino porque también se sabe que S. cerevisiae no es selectiva a la reducción del carbonilo y reduce preferiblemente otras funciones como dobles enlaces si están presentes36, como ocurre con 5. 5.3. Síntesis de 1-(1,3-ditian-2-il)but-3-en-1-ona (5)16 La síntesis de 5 se llevó a cabo en dos pasos. Primero se realizó la transtioacetalación dietoxiacetato de etilo con la metodología patentada por Bayer Pharmaceuticals34:

Esquema 11. Obtención de 1,3-ditiano-2-carboxilato de etilo (4) por transtioacetalación.

La reacción se hizo por duplicado, obteniendo en ambos casos con un rendimiento de 40 %, considerablemente inferior a la transtioacetalación anterior y a lo que figura en la patente de Bayer Pharmaceuticals34 para esta reacción. Sin embargo, es importante destacar que existe otra patente para esta misma reacción, de Andys Pharmaceuticals Inc42, con un procedimiento muy similar en la que se reporta un rendimiento de 37 %. De modo que es posible que se haya omitido un factor experimental en este trabajo que no figurara en la patente consultada, o bien, un error de reporte de ésta. Se atribuye el bajo rendimiento a la formación de varios productos secundarios observados en CCD.

42 Zhou, Y.; Li, l.; Webber, S.; Dragovich, P.; Murphy, D.; Zhao, Jingjing Ruebsam, Frank Zhou, Y.; Webber, Stephen Dragovich, P. Pyridazinone Compounds. US Patent WO2008082725, 2008.

24

El segundo paso para la obtención de 3 fue una reacción de Grignard sobre la función éster de 2 usando cloruro de alil magnesio:

Esquema 12. Obtención de 1-(1,3-ditian-2-il)but-3-en-1-ona (5)

Se extrapoló la metodología reportada para la adición del cloruro de alil magnesio sobre el dietoxiacetato de etilo43 debido a que no existen reportes de la obtención de 5 a partir de 4 en la literatura. Esta reacción se realizó por duplicado, debido a que en el primer caso en el que se utilizaron 1.5 eq de cloruro de alil magnesio la CCD reveló la aparición de una nueva mancha que se supuso era el producto, pero al aislarse se confirmó por espectroscopía que correspondía al producto de la doble adición.

Figura 3. Producto de doble adición

Esto significa que el reactivo de Grignard estaba reaccionando con 5. Para evitar esto la reacción se repitió utilizando sólo 1.1 eq de cloruro de alil magnesio; sin embargo, el producto de la doble adición volvió a registrarse en CCD al mismo tiempo que aún permanecía una mancha con el Rf de 4. Al aislarse esta segunda mancha y analizarse por técnicas espectroscópicas se concluyó que pertenecía a una mezcla de 5 y 4. Tanto 5 como su obtención mediante la reacción especificada en el esquema 11 no se encuentran reportadas en la literatura, por lo que este trabajo representa el primer registro para esta reacción aunque no se presenta rendimiento, debido a que el producto no ha sido aún purificado y no se lograron establecer aún las condiciones óptimas para obtener únicamente el producto de una adición. 17

Igualmente no se ensayó la biorreducción de este producto debido a que no se encuentra un valor de [α] reportado y al momento de obtener este producto no se contaba con el detector para utilizar en la cromatografía quiral disponible para la separación de los enantiómeros y cálculo del exceso enantiomérico.

43 Adamczyk, M.; Johnson, D. D.; Mattingly, P. G.; Pan, Y.; Reddy, R. E. Synth. Commun. 2002, 32, 3199 3205.

25

5.4. Aproximaciones a la obtención de 4-(1,3-ditian-2-il)butan-2-ona (8)18 Para la obtención de 8 se ensayó la obtención de 1,3-ditiano y 2-metil-1,3-ditiano mediante la catálisis con yodo molecular y BF3∙Et2O (reacción de Corey–Seebach)44,45.

Esquema 13. Obtención de 1,3-ditiano y 2-metil-1,3-ditiano

En ninguna de las dos reacciones se obtuvo el producto deseado. Nuevamente ésta es una aplicación de novo de la catálisis con yodo, por lo que la no obtención de producto por esta vía debe confirmarse con más repeticiones y variando factores experimentales como cantidades de reactivos, tipos de disolvente y la forma del aldehído, que en el caso de R = H, puede ser usado como formalina (solución acuosa) o paraformaldehído (polímero sólido). La reacción de Corey–Seebach se reporta con rendimiento de 65 %44, por lo que el no funcionamiento de esta reacción no es justificable y debe reensayarse. Existen otras formas de obtención de este producto con un rendimiento de 94 % por vías diferentes que no constituyen tioacetalación ni transtioacetalación, como la reacción del diyodometano con 1,3-propanoditiol46. 19

44 Floreancig, P. E.; Gustafson, T. P.; Kurchan, A. N.; Kutateladze, A. G. Tetrahedron 2006, 62, 6574–6580. 45 Dickschat, J. S.; Wickel, S.; Bolten, C. J.; Nawrath, T.; Schulz, S.; Wittmann, C. Eur. J. Org. Chem. 2010, 14, 2687–2695. 46 Ranu, B. C.; Jana, R. Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1811–1818.

26

6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS El presente trabajo constituye una primera aproximación hacia lo que puede considerarse como la extensión de un área poco estudiada dentro del campo de la biocatálisis en las reacciones orgánicas: la reducción de cetotioacetales. Se encontró a D. carota como un sistema biocatalítico de células enteras, no reportado anteriormente, capaz de reducir de forma parcialmente enantioselectivael carbonilo de un cetotioacetal. Este resultado, así como lo observado durante las síntesis realizadas establecen nuevas líneas de desarrollo para trabajos futuros. En cuanto a las síntesis de los ditianos debe explorarse la selectividad que tiene la catálisis con yodo en la transtioacetalación de acetales con grupos extractores de carga y deben encontrarse también las condiciones óptimas de la reacción de Grignard sobre dobles enlaces en cetoditianos. También es necesario obtener valores más exactos de ee de las biorreducciones aquí reportadas y del producto 5 cuya rotación específica no se encuentra aún registrada, esto mediante cromatografía quiral. En lo referente a la biocatálisis, se hace imperativo continuar la búsqueda de más sistemas de células enteras capaces de llevar a cabo la biorreducción aquí estudiada, esto con el fin de encontrar biocatalizadores que brinden mayor rendimiento, esteroselectividad y además, adiciones anti-Prelog, con lo que podría llegar a acoplarse la biorreducción de cetoditianos a síntesis totales de compuestos quirales. Adicional al descubrimiento de nuevos biocatalizadores para esta reacción, también deben caracterizarse en función de los factores prácticos y respecto al sustrato, debería empezarse entonces con estudios sobre de D. carota como se propuso inicialmente, de la cual sólo se conoce sobre cetotioacetales, por este trabajo, que puede catalizar la reducción del carbonilo en sentido Prelog.

27

7. PARTE EXPERIMENTAL

Physical Data and Spectroscopic Measurements

1H NMR spectra were recorded on a BRUKER AVANCE 300 (300 MHz) instruments and EFT-90 ANASAZI (90 MHz) instruments, Inc. (90 MHz). The chemical shifts are expressed in parts per million (ppm) referenced to TMS. Data are reported as follows: δ, chemical shift; multiplicity (recorded as br, broad; s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quadruplet; quint, quintuplet and m, multiplet), coupling constants (J in Hertz, Hz), integration and assignment (aromatic, ar). The assignment of the signals was based on a simulation of the spectra in Chem Bio Draw Ultra 12.0.

13C NMR spectra were recorded on the same instrument at 75 MHz and 22.5 MHz. The chemical shift are expressed in parts per millon (ppm), referenced to TMS.

Infrared spectra (IR) were obtained on a THERMO NICOLET-NEXUS (FT-IR) using KBr pellet and are reported in terms of frequency of absorption (ν, cm-1).

Mass spectra (MS) were obtained on a GC/MS coupling with a SHIMADZU-QP2105 chromatograph. Ionization was obtained by electron impact (EI). Mass spectrum data are reported as m/z.

Optical rotatory power measures were obtained in a RUDOLPH RESEARCH ANALYTICAL AUTOPOL 1 AUTOMATIC POLARIMETER.

Melting point measure was carried out in an ELECTROTHERMAL IA9000.

Chromatography

Flash chromatography was performed using silica gel 60, 40-63 mesh. Thin Layer Chromatography (TLC) was performed on precoated plates of silica gel 60F 254.

Visualization was performed with an UV light then vanillin, ceric ammonium molybdate (CAM) or Phosphomolybdic Acid (PMA), depending of the product; followed by heating as developing agents.

Vainillin solution was prepared in 95% ethanol (250 mL) with vainillin (15 g), concentrated sulfuric acid (2.5 mL).

Phosphomolibdic acid was prepared using phosphomolibdic acid (15 g) in ethanol (250 mL).

CAM solution was prepared in sulfuric acid solution aq 10 % (400 mL) with ammonium molybdate (10 g) and ceric ammonium sulfate (4.0 g).

28

Nomenclature

IUPAC nomenclature was used for all compounds (determined by Chem Bio Draw Ultra 12.0). For the description of NMR spectra, the numbering used follows the chain extension as described on the formula, not the IUPAC numbering.

Synthesis and bioreductions

Recemic reduction of acetophenone (15)

(S)-1-phenilethanol (16)

C6H10O M = 122.07 g/mol

An equimolar mixture of acetophenone, NaBH4 and H3BO3 (2 mmol of each) was ground (with no solvent) with a porcelain mortar and pestle until TLC showed complete disappearance of the starting material (approximately 30 min). The mixture was quenched with a saturated aqueous solution of NaHCO3, followed by the isolation of the alcohol by extraction with DCM and evaporation28. The isolated product corresponded to 90 % of yield.

1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 90 MHz. 7.24 (s, 5H, CH-1-6), 4.75 (m, 1H, CH-7), 3.47 (s, 1H, OH), 1.11-1.40 (d, 3H, J = 26.1 Hz, CH3-8). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 22.5 MHz. 145 (C-6), 128 (C-2,4), 127 (C-3), 125 (C-1,5), 70 (C-7), 25 (C-8). IR (ν, cm-1) 3361 (O-H), 2973, 2358, 1602 (overtones), 1449, 1077, 898, 699. MS (EI) 122.05 [M]+.

Bioreduction of acetophenone (15) with carrots

(S)-1-phenilethanol (16)

C6H10O M = 122.07 g/mol

29

Acetophenone (0.2 mL, 2 mmol) was added to a suspension of freshly cut carrot root (100 g) in 600 mL of water, and the reaction mixture was incubated in an orbital shaker at RT for the time necessary to obtain the appropriate conversion. Finally, this suspension was filtered off, and carrot root was washed three times with water. Filtrates were extracted with ethyl acetate (3 x 125 mL). The organic phase was dried over anhydrous Na2SO4 and then evaporated in vacuum32. The final product was purified by flash chromatography using a mixture pentane/ethyl acetate 5:2 as mobile phase. The yield for this reaction was 45 %. In the pre-dissolved variant for this reaction, with 56 % yield, the acetophenone was previously dissolved in 10 mL EtOH and then added to the water with cut carrots. It is important to note that the reaction container should be large enough for efficient agitation. Both methodologies gave 85 % ee. 1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 90 MHz. 7.24 (s, 5H, CH-1-6), 4.75 (m, 1H, CH-7), 3.47 (s, 1H, OH), 1.11-1.40 (d, 3H, J = 26.1 Hz, CH3-8). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 22.5 MHz. 145 (C-6), 128 (C-2,4), 127 (C-3), 125 (C-1,5), 70 (C-7), 25 (C-8). IR (ν, cm-1) 3361 (O-H), 2973, 2358, 1602 (overtones), 1449, 1077, 898, 699. MS (EI) 122.05 [M]+.

Synthesis of 1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-one (2) catalyzed with iodine

1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-one (2)

C7H10O

M = 176.30 g/mol

To a solution of the acetal 1 (0.67 mL, 5 mmol) and 1,3-propanedithiol (0.5-0.6 mL, 5-6 mmol), in CHCl3 (25 mL, or DCM as well) was added iodine (0.13 g, 0.5 mmol), and the resulting mixture was stirred at room temperature. After completion of the reaction (TLC with pentane/ethyl acetate, 5:2) the reaction was quenched with aqueous solutions of Na2S2O3 (0.1 M, 25 mL) and NaOH (10%, 25 mL), respectively. Then CHCl3 was added to the resulting reaction mixture. The organic layer was separated and washed with H2O and decanted. The organic layer was dried over anhydrous MgSO4 and filtered23. Evaporation of the solvent in vacuum gave a colored solid that was dissolved in DCM and purified by silica gel column chromatography using DCM/ciclohexane 3:1 as mobile phase, obtaining 47 % yield.

30

1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 90 MHz. 5.48 (t, 1H, J = 6.8 Hz, CH-4), 2.87 (m, 6H, CH2-3,5,6), 2.20 (s, 3H, CH3-1), 2.00 (m, 2H, CH2-6). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 22.5 MHz. 240 (C-2), 45 (C-3), 37 (C-4), 30 (C-1), 28 (C-5,7), 23 (C-6). IR (υ, cm-1) 3406, 2963, 2915, 2877, 2823, 1714 (C=O), 1359, 1157, 905, 749 (S-C), 571. MS (EI) 176.05 [M]+.

Synthesis of 1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-one (2) with BF3∙Et2O

1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-one (2)

C7H10O

M = 176.30 g/mol

A mixture of BF3∙Et2O (0.7 mL, 6 mmol) in 2.5 mL of CHCl3 was heated to reflux temperature, then 0.3 mL of 1,3-propanedithiol (3 mmol) was added dropwise followed by the addition of 0.4 mL of the acetal (3 mmol) in 0.5 mL of CHCl3. The reaction was maintained at reflux temperature for 30 min. After this time the mixture was cooled to RT and washed two times with distillated water, one time with a saturated solution of NaHCO3 and with distillated water once again. The organic layer was dried over anhydrous MgSO4, filtrated and concentrated under vacuum34. The resulting product was purified by silica gel column chromatography using a DCM/ciclohexane 3:1 mixture as mobile phase. The yield for this reaction was 94 %. 1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 90 MHz. 5.48 (t, 1H, J = 6.8 Hz, CH-4), 2.87 (m, 6H, CH2-3,5,6), 2.20 (s, 3H, CH3-1), 2.00 (m, 2H, CH2-6). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 22.5 MHz. 240 (C-2), 45 (C-3), 37 (C-4), 30 (C-1), 28 (C-5,7), 23 (C-6). IR (υ, cm-1) 3406, 2963, 2915, 2877, 2823, 1714 (C=O), 1359, 1157, 905, 749 (S-C), 571. MS (EI) 176.05 [M]+.

31

Racemic reductionn of 1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-one (2)

1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-ol (17)

C7H10O

M = 178.32 g/mol

The dithiane 2 (0.114 g, 0.6 mmol) was dissolved in 1 mL of a 1:1 THF/EtOH mixture (methanol can be used instead ethanol). This mixture was cooled to 0 °C and 1.1 eq of NaBH4 were added in portions under nitrogen atmosphere. The mixture was allowed to reach RT with constant stirring and it was kept stirring 30 min. After this time the reaction was quenched with 1 mL of saturated NH4Cl and extracted three times (with 5 mL each time) with ethyl ether. The organic layers were mixed and dried over anhydrous Na2SO4, filtrated en concentrated under vacuum25. The resulting product was purified by silica gel column chromatography using a DCM/ciclohexane 1:9 mixture as mobile phase, giving quantitative yield.

1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 90 MHz. 4.15 (q, 1H, J = 7.7 Hz, CH-2), 2.86 (t, 1H, J = 3.9 Hz, CH-4), 2.04 (m, 8H, CH2-3,5-7), 2.26-2.19 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CH3-1). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 22.5 MHz. 65 (C-2), 47 (C-4), 44 (C-3), 30 (C-5,7), 25 (C-6) ; 24 (C-1) IR (υ, cm-1) 3396 (O-H), 2963, 2926, 2900, 1422, 1130, 940, 764 (S-C) MS (EI) 119 [M - 59]+.

Bioreduction of 1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-one (2)

(S)-1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-ol (17)

C7H10O

M = 178.32 g/mol

Dithiane 2 (300 mg, 1.7 mmol) was dissolved in 1 mL (THF/EtOH 1:1) and then added to a suspension of freshly cut carrot root (140 g) in 700 mL of water, the reaction mixture was incubated in an orbital shaker at RT for 48 h. Finally, this suspension was then filtered off, and carrot root was washed three times with water. Filtrates were extracted with ethyl acetate (3 x 125 mL). The organic phase was dried over anhydrous Na2SO4 and then evaporated in vacuum32. The final product was purified by flash

32

chromatography using DCM as mobile phase. It is important to note that the reaction container should be large enough for efficient agitation. It was registered 70 % yield and 48 % ee.

1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 90 MHz. 4.15 (q, 1H, J = 7.7 Hz, CH-2), 2.86 (t, 1H, J = 3.9 Hz, CH-4), 2.20-1.79 (m, 8H, CH2-3,5-7), 2.26-2.19 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CH3-1). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 22.5 MHz. 65 (C-2), 47 (C-4), 44 (C-3), 30 (C-5,7), 25 (C-6) ; 24 (C-1) IR (υ, cm-1) 3396 (O-H), 2963, 2926, 2900, 1422, 1130, 940, 764 (S-C) MS (EI) 119 [M - 59]+. Synthesis of ethyl 1,3-dithiane-2-carboxylate (4)

(S)-1-(1,3-dithian-2-yl)propan-2-ol (4)

C7H12O2S2

M = 192.30 g/mol

A mixture of BF3∙Et2O (0.7 mL, 6 mmol) in 2.5 mL of CHCl3 was heated to reflux temperature, then 0.3 mL of 1,3-propanedithiol (3 mmol) was added dropwise followed by the addition of 0.4 mL of the acetal (3 mmol) in 0.5 mL of CHCl3. The reaction was maintained at reflux temperature for 30 min. After this time the mixture was cooled to RT and washed two times with distillated water, one time with a saturated solution of NaHCO3 and with distillated water once again. The organic layer was dried over anhydrous MgSO4, filtrated and concentrated under vacuum34 to obtain 40 % yield. 1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 300 MHz. 4.32 (s, 1H, CH-4), 3.43 (ddd, J = 16.0, 11.3, 2.6 Hz, 2H, CH2-6), 2.73 – 2.45 (m, 4H, CH2-3,4), 2.27 – 1.90 (m, 2H, CH2-2), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3-7). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 75 MHz. 169.79 (C-5), 61.67 (C-6), 40.04 (C-4), 25.97 (C-1,3), 25.01 (C-2), 14.04 (C-7), IR (υ, cm-1) 2979, 2931, 2358, 1729 (C=O), 1422, 1286, 1141, 1026, 913, 726 (C-S).

MS (EI) 192.05 [M]+.

33

Synthesis of 1-(1,3-dithian-2-yl)but-3-en-1-one (5)

1-(1,3-dithian-2-yl)but-3-en-1-one (5 & 18)

C8H12OS2

M = 188.31 g/mol

&

C11H18OS2 M = 230.39 g/mol

In a 100 mL oven dried round bottom flask equipped with stir bar and nitrogen inlet, dithiane (0.222 g, 1.15 mmol) was dissolved in THF (4 mL) and cooled to -78 °C. To this mixture, ethyl magnesium chloride (2.0 M soln in THF, 0.75 mL, 1.5 eq) was added under nitrogen via syringe slowly over a 10 min period. The resulting pale yellow reaction mixture was stirred for 2 h and quenched with 20% aqueous NH4Cl solution (1 mL) at -78 °C. The mixture was allowed to warm to room temperature and diluted with ethyl acetate (5 mL) and water (5 mL). Organic layer was separated and the aqueous layer was extracted with ethyl acetate (5 mL). The combined organic layers were dried over anhydrous Na2SO4 and the solvent was removed on a rotary evaporator. The crude compound was purified by silica gel column chromatography with mixture pentane/ethyl acetate 9:1 as mobile phase43. 18 was obtained as an unexpected product. There are no yields calculated for this reaction.

Compound 5

1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 300 MHz. 6.13-5.75 (m, 1H, CH-7), 5.26-5.17 (m, 2H, CH2-8), 4.26 (s, 1H, CH-4), 3.26 (ddd, J = 14.1, 11.2, 3.0 Hz, 2H, CH2-6), 2.78 – 2.47 (m, 4H, CH2-1,3), 2.40 – 1.94 (m, 2H, CH2-2). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 75 MHz. 130.37 (C-7), 119.50 (C-8), 67.86 (C-4), 45.04 (C-6), 26.01 (C-1,3), 25.05 (C-2). Compound 18 1H NMR (δ, ppm) CDCl3, 300 MHz. 5.40 – 5.09 (m, 2H, CH-2,6), 4.38 – 4.06 (m, 4H, CH2-1,7), 3.77 (s, 2H, CH-8, OH), 2.78 – 2.47 (m, 4H, CH2-9,11), 1.44 – 1.15 (m, 6H, CH2-3,5,10 ). 13C NMR (δ, ppm) CDCl3, 75 MHz. 169.80 (C-2,6), 119.53 (C-1,7), 77.65 (C-4), 61.72 (C-8), 45.84 (C-3,5), 40.09 (C-9,11), 26.01 (C-10).

34

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