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Impacto de la degradación de Heparán Sulfato en la regulación de las vías de

diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con Síndrome de Apert

Angela Johanna Muñoz Bolaños

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina, Departamento de Morfología

Bogotá, Colombia

2016

Impacto de la degradación de Heparán Sulfato en la regulación de las vías de

diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con Síndrome de Apert

Angela Johanna Muñoz Bolaños

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Genética Humana

Director:

MD, M.Sc Harvy Mauricio Velasco Parra

Línea de Investigación:

Genética Clínica

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina, Departamento de Morfología

Bogotá, Colombia

2016

A mi esposo Oscar e hija Salomé.

La ciencia es el alma de la prosperidad de las

naciones y la fuente de vida de todo

progreso. Louis Pasteur.

Agradecimientos Inicialmente a Dios por orientarme y guiarme por los caminos de la ciencia. A mi esposo

y a mi hija, quienes han sido mi mayor inspiración y apoyo en todos los momentos de

este recorrido académico y de la vida. A mis padres y hermano por no dejarme rendir y

animarme constantemente.

A mi compañera Diana Ramírez por ser mi andamio en el laboratorio y en los duros

momentos del desarrollo de la tesis. A mi profesor Harvy Mauricio Velasco Parra por su

confianza y por todas las enseñanzas que quedaron reflejadas en forma de experiencia

laboral y académica. A Diana Mayorga, Angela Johanna Espejo y Dra. Lilian Torres por

su seria y comprometida colaboración con el proyecto.

A la Universidad Nacional por acogerme y darme la oportunidad de formarme académica

y personalmente. A mis compañeros y profesores de la Maestría en Genética Humana,

quienes fueron mi sostén y apoyo durante todo este tiempo.

Finalmente, a los pacientes y familiares que participaron en el proyecto; a todo el equipo

de la Fundación Publica de Medicina Xenomica en Galicia en especial al Dr. Angel

Carracedo por su recibimiento y apoyo; a Diana Mayorga, Ángela Johanna Espejo y

Gualberto Hernández por su colaboración a lo largo de estos años.

Resumen y Abstract IX

Resumen La activación de FGFR2 requiere una configuración tridimensional entre ligando, receptor

y Heparán Sulfato (HS). Las mutaciones en la región extracelular de este receptor

(dominios tipo Inmunoglobulina) afectan el balance entre proliferación y diferenciación de

células osteoprogenitoras, llevando a craniosinostosis como la del Síndrome de Apert

(SA). Postulamos que la degradación de HS en tejido perióstico en pacientes con SA

puede modificar el perfil de expresión génica y modular el comportamiento celular. Se

obtuvieron fibroblastos de tres pacientes y un control sano, se cultivaron hasta el 3-5

pase y estimularon con FGF2 por 24 horas y con Idursulfase® (0.025mg/ml) por 48 horas

por triplicado. El ARN total (>50ng/uL) fue obtenido para evaluar la expresión génica

usando el Genechip® Human Gene 2.0 ST Array (Affymetrix). La mayoría de los genes

que evidenciaron cambio después del tratamiento están involucrados en la regulación de

componentes de la Matriz Extracelular. Los procesos moleculares afectados con mayor

impacto fueron diferenciación ósea, proliferación celular y respuesta inflamatoria. Sin

embargo este estudio se centra en los genes asociados a diferenciación ósea. Los

resultados demuestran: A) El tratamiento con Idursulfase® modifica la expresión de

elementos asociados a MEC y al proceso de diferenciación osteoblástica. B) Los datos

contrastan con reportes de modelos previos de SA. Se propone una probable

recuperación parcial del microambiente extracelular después del tratamiento.

Palabras clave: FGFR2, Idursulfase, Craneosinostosis, Heparán Sulfato

X Impacto de la degradación de Heparán Sulfato en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal

Abstract FGFR2 activation requires a tridimensional configuration between ligand, receptor and

heparan sulfate (HS) molecules. Mutations in the extracellular region of this receptor

(immunoglobulin type domains) affect the balance between proliferation and

differentiation of osteoprogenitor cells, leading to craniosynostosis as Apert Syndrome

(SA). We postulate that the degradation of HS in periosteal tissue in patients with SA can

modify the gene expression profile and modulate cell behavior. Fibroblasts cells from

three patients and a healthy control were obtained, grown to 3-5 pass and stimulated with

FGF2 for 24 hours and Idursulfase® (0.025mg / ml) for 48 hours in triplicate. Total RNA

(> 50 ng / uL) was obtained to evaluate gene expression using GeneChip Human Gene

2.0 ST Array (Affymetrix). Most genes showed significant change after treatment are

involved in the regulation of extracellular matrix components. The most impacted

molecular processes were bone differentiation, proliferation, and celullar inflammatory

response. However, this study focuses on genes associated with bone differentiation. The

results show: A) Treatment with Idursulfase® modifies the expression of elements

associated with MEC and the process of osteoblast differentiation. B) The data contrast

with reports of previous SA models. A probable extracellular microenvironment partial

recovery after treatment is proposed.

Keywords: FGFR2, Idursulfase, Craniosynostosis, Heparan Sulfate

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................... IX

Lista de figuras ............................................................................................................... XIII

Lista de tablas ................................................................................................................. XV

Introducción ....................................................................................................................... 1

1. Objetivos ...................................................................................................................... 31.1 Objetivo General .................................................................................................. 31.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 3

1.2.1 Objetivo específico 1 ................................................................................. 31.2.2 Objetivo específico 2 ................................................................................. 31.2.3 Objertivo específico 3 ................................................................................ 3

2. Problema de Investigación y Justificación .............................................................. 4

3. Marco Teórico ............................................................................................................. 6

4. Metodología ............................................................................................................... 184.1 Fase Pre-analítica .............................................................................................. 18

4.1.1 Toma de muestras ................................................................................... 184.1.2 Recolección de Información .................................................................... 194.1.3 Recolección de Datos .............................................................................. 19

4.2 Fase Analítica .................................................................................................... 204.2.1 Consentimiento Informado ....................................................................... 204.2.2 Análisis de mutación en FGFR2 y expresión de isoforma mesenquimal (FGFR2IIIc) .......................................................................................................... 204.2.3 Cultivos celulares ..................................................................................... 204.2.4 Densidad celular y ensayo de linealidad celular ...................................... 214.2.5 Determinación de la citotoxicidad del fármaco Idursulfase® y Ensayo de exposición a cultivos primarios ............................................................................ 214.2.6 Determinación de Inmunofenotipo por Epi-Inmunofluorescencia ............ 224.2.7 Extracción de RNA total ........................................................................... 224.2.8 Ensayos de Microarray ............................................................................ 234.2.9 Análisis de la expresión génica diferencial mediante qRT-PCR .............. 234.2.10 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido. ........................................... 25

4.3 Tratamiento Estadístico ..................................................................................... 25

XII Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA

Título de la tesis o trabajo de investigación

5. Resultados ................................................................................................................ 26

5.1 Identificación del Fenotipo Celular ..................................................................... 265.2 Identificación del Fenotipo Celular ..................................................................... 295.3 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDUS e IDUA en orina, sangre y tejido subperióstico craneal. .............................. 315.4 Evaluación del efecto citotóxico del fármaco Idursulfase® ............................... 335.5 Análisis de expresión diferencial por Microarray ............................................... 345.6 Análisis de expresión diferencial por qRT-PCR ................................................. 45

6. Discusión ................................................................................................................... 476.1 Identificación del Fenotipo Celular ..................................................................... 476.2 Cuantificación de GAGs y Actividad enzimática ................................................ 486.3 Efecto del fármaco Idursulfase® sobre la expresión génica de fibroblastos SA 49

Conclusiones ................................................................................................................... 56

Limitaciones ..................................................................................................................... 57

Perspectivas ..................................................................................................................... 58

A. Anexo: Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación ............................................................................................................. 59

Bibliografía ....................................................................................................................... 64

Lista de figuras XIII

Lista de figuras Pág. Figura 1 Observación microscópica aleatoria de expansión celular en primer pase de cultivo celular primario de fibroblastos de perioistiio de pacientes con SA. Agosto de 2014. Visualización 10X. ................................................................................................... 28

Figura 2 Epi-inmunofluorescencia cultivo 008: se observa tinción positiva color verde (lado izquierdo) para Ac dirigido a APF de superficie celular, al compararse con tinción para núcleo celular DAPI color azul (lado derecho) .......................................................... 28

Figura 3 Electroforesis de amplificación de fragmento de 286pb de la isoforma mesenquimal FGFR2IIIc. Carriles 1, 3, 5, 7 corresponden a muestras de control positivo y pacientes con tratamiento con Idursulfase®. Carriles 2, 4, 6 y 8 corresponden a muestras sin tratamiento. Carril C- corresponde a control negativo ................................. 29

Figura 4 4A: Perfil mutacional de tres cultivos celulares fibroblásticos con la enzima Bgll. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en tres muestras de ADN proveniente de los cultivos celulares evaluados (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima BgII para la detección de la mutación P253R en geles de poliacrilamida al 9%, la muestra del paciente 1 es positivas para la mutación P253R y por lo tanto presenta una banda de bajo peso molecular (±300bp) (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 002-004: muestras cultivo celular, 004 corresponde al cultivo del paciente 1 (AP1); C-: DNA negativo de la mutación. 4B: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en ADN proveniente de muestra de sangre de Paciente 2 (AP2) rotulada como cultivo 008 y controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9% Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 25-12: muestra de DNA de paciente 2; C-: DNA negativo de la mutación. 4C: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en una muestra de ADN proveniente de paciente 3 (AP3) rotulado como cultivo celular 012 y

XIV Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA

Título de la tesis o trabajo de investigación

controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9%, Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; AP12: muestra cultivo celular 012, paciente 3; C-: DNA negativo de la mutación. .............................................. 30

Figura 5 Intensidad de la fluorescencia media (URF) al evaluar seis densidades celulares en los cultivos FIBRO CONTROL y FIBRO APERT durante un periodo de 48 horas. n=6 .......................................................................................................................................... 33

Figura 6 Curvas de supervivencia de los cultivos celulares FIBRO AP y FIBRO CONTROL. Las células se sembraron a una densidad de 30000 (cels/pozo) en cajas de cultivo de 48 pozos. 24 horas después, las líneas celulares FIBRO AP (Izquierda), y FIBRO CONTROL (Derecha) se sometieron a exposición del fármaco Idursulfase® en diferentes concentraciones (0.2, 0.02, 0.002, 0.0002 y 0.00002 mg/ml). Se realizó lectura 48 post-tratamiento por el método de viabilidad con Rezasurina. Este experimento se realizó por duplicado. Como controles se empleó células sin tratamiento; pozos vacíos sin células, y como control positivo (muerte), células sometidas a Taxól (4 x10-1 µM). .. 34

Figura 7 GO TERM (Gene Ontology) - Procesos biológicos (BP) ................................... 45

Figura 8 Resultados de qRT-PCR: Niveles de expresión de genes según qRT-PCR vs los resultados del Array para cada paciente al comparar las condiciones de tratamiento con Idursulfase® versus sin tratamiento. Se enuncia en la parte superior los valores del Fold change resultado del Array para cada paciente al comparar la condición basal y posterior al tratamiento con Idursulfase. ST: Sin tratamiento con Idursulfase®; CT: Con tratamiento. ....................................................................................................................... 46

Lista de tablas XV

Lista de tablas Pág. Tabla 1 Secuencia de primers usados en experimentos de qRT-PCR ............................ 24

Tabla 2 Cultivos usados en el estudio .............................................................................. 27

Tabla 3 Actividad enzimática de IDS e IDUA en tejido de paciente 004 .......................... 31

Tabla 4 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos, cuantificación de Heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido ........................... 32

Tabla 5 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos cuantificación de heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido ........................... 32

Tabla 6 Cuantificación RNA muestras cultivos 004 y 006 ................................................ 34

Tabla 7 Cuantificación RNA muestras cultivos 008 .......................................................... 35

Tabla 8 Cuantificación RNA muestras cultivos 012 .......................................................... 35

Tabla 9 Lista de genes diferencialmente expresados con su respectivo fold change. AP1, -2, -3: Valor de fold change; rojo: regulación a la alta; verde: regulación a la baja .......... 36

Tabla 10 Genes diferencialmente expresados asociados a diferenciación osteoblástica y matriz extracelular ............................................................................................................. 44

1 Introducción

Introducción

El síndrome de Apert (SA) es un desorden autosómico dominante que se caracteriza por

craneosinostosis, anomalías craneofaciales y sindactilia simétrica severa de manos y

pies. Es uno de los síndromes más severos dentro de los que cursan con

craneosinostosis; abarca aproximadamente el 4,5% de estos (1) y tiene una prevalencia

de 1 en 12.4-15.5/millones de nacidos vivos (2) y una incidencia en 1:60.000 recién

nacidos vivos (3). La mayoría de los pacientes con SA tienen una o dos mutaciones

missense que conllevan a la sustitución de aminoácidos contiguos, Ser252Trp (S252W) y

Pro253Arg (P253R) en el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 2

(FGFR2), las cuales afectan una región altamente conservada entre los dominios tipo

inmunoglobulina II y III, llevando a un aumento de la afinidad del receptor por sus

ligandos, los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs, por sus siglas en inglés)

(4,5).

Los FGFs son moléculas de señalización mitogénicas que participan en el control de la

proliferación, diferenciación y supervivencia celular en muchos tejidos y su actividad

depende de la afinidad que tengan con sus receptores (6). Cuando interactúan con

FGFR2IIIc (isoforma mesenquimal) se activan diversas vías de transducción de señales:

Fosfolipasa Cγ (PLCγ), Proteína Kinasa Activada por Mitógenos (MAPK) y Proteína

Kinasa C (PKC) las cuales son muy importantes en los procesos de diferenciación celular

y desarrollo óseo (7,8). Son de interés particular para este estudio los genes de las vías

de señalización asociadas a la diferenciación de estas células, las cuales, según

hallazgos previos, están estrechamente involucradas con la osificación temprana

característica de los pacientes con SA (6,9,10).

Lista de tablas 2

Adicionalmente, se ha descrito un incremento en la concentración de Heparán Sulfato

(HS), concomitante con una disminución de la actividad de las enzimas degradadoras de

glicosaminoglicanos (11), los cuales son requeridos para una óptima señalización de

FGF/FGFR a nivel fisiológico y celular (4,12).

De acuerdo con estos hallazgos moleculares, se plantea realizar un estudio de

intervención in vitro, con y sin tratamiento con Idursulfase® (INN-Idursulfasa, enzima

degradadora de Heparán Sulfato) en cultivo de fibroblastos sub-periósticos de pacientes

con SA con las mutaciones P253R y S252W. Así, se hipotetiza que someter estas

células a tratamiento con este fármaco, reduciría la concentración del glicosaminoglicano

HS en el espacio extracelular y por ende, regularía la señalización corriente abajo de

FGF/FGFR2 asociada a una disminución de los procesos de diferenciación celular

osteoblástica, favoreciendo la resolución de la patología.

El manejo actual de estos pacientes consiste principalmente en intervenciones

quirúrgicas para corregir las anormalidades craneofaciales y de manos y pies. De esta

forma, es urgente encontrar una terapia alternativa que no sea invasiva, que ayude a

resolver molecularmente la enfermedad y que aporte nuevos conocimientos al

entendimiento de los procesos genéticos y de señalización de la patología, generando

avances importantes en la comprensión de las características clínicas y de nuevas

opciones de tratamiento posteriores.

3 Objetivos

1. Objetivos

1.1 Objetivo General Evaluar el impacto de la degradación del glicosaminoglicano Heparán Sulfato en la

señalización corriente abajo de FGF/FGFR2 y la diferenciación osteoblástica, en cultivo

de fibroblastos subperiósticos provenientes de pacientes con Síndrome de Apert,

después de someterlos a tratamiento con y sin Idursulfase®.

1.2 Objetivos Específicos

1.2.1 Objetivo específico 1

Identificar las mutaciones en el gen FGFR2 en plasma de pacientes con Síndrome de Apert.

1.2.2 Objetivo específico 2

Cuantificar los niveles de Heparán Sulfato en orina de pacientes con Síndrome de Apert.

1.2.3 Objertivo específico 3

Identificar los genes directamente regulados a la alta o a la baja en cultivo de fibroblastos periósticos de pacientes con Síndrome de Apert con y sin tratamiento con Idursulfase®, asociados a vías de señalización celular involucradas en diferenciación celular

Problema de Investigación y Justificación 4

2. Problema de Investigación y Justificación

El síndrome de Apert hace parte de las craneostosis sindrómicas catalogadas como

enfermedades raras. Las personas afectadas presentan importantes deficiencias

funcionales y estructurales, algunas de las cuales pueden amenazar la vida de los

pacientes (9). Así, los pacientes pueden presentar diferentes afectaciones

multisistémicas que involucran aspectos físicos, sensoriales y cognoscitivos que,

eventualmente, terminan afectando todos los ámbitos de la vida, especialmente su

inclusión laboral y educativa.

Considerando lo anterior, las personas afectadas requieren del cuidado constante de un

equipo interdisciplinario desde la infancia hasta la vida adulta. Diferentes servicios de

atención médica se involucran en el manejo de la patología (genética, cirugía plástica,

ortopedia, neurocirugía y neuropediatría), dentro de los que el manejo quirúrgico es el

más frecuentemente empleado para la gran mayoría de comorbilidades, sin que esta

resuelva completamente el espectro fenotípico del síndrome (10).

Conociendo y entendiendo más a fondo las vías moleculares de la patología es posible

proponer tratamientos alternativos además del manejo quirúrgico y de soporte, y que

planteen abordajes bioquímicos más finos en su lugar. Toda la información fisiológica y

genética que pueda obtenerse de la patología servirá de soporte para el establecimiento

de nuevas estrategias terapéuticas encaminadas a disminuir o eliminar el impacto de la

mutación presente.

Un ejemplo claro consiste en la modificación farmacológica de los perfiles de heparán

sulfato en los pacientes. Debido a que se ha establecido como característica molecular

del síndrome un aumento en la concentración de glicosaminoglicanos y una disminución

5 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA

concomitante de las enzimas que degradan en tejido óseo (13)(14) y, considerando la

importancia de estas macromoléculas en la interacción entre FGFR2 y sus ligandos,

podría pensarse que esta modificación ayudaría a modular o disminuir la ganancia de

función del receptor mutado.

Más específicamente, se conoce que las cadenas de heparán sulfato controlan el

movimiento y recepción de factores de crecimiento hacia receptores en células blanco

durante el proceso de morfogénesis (14). Este glicosaminoglicano se asocia

directamente con el FGFR2 y sus diferentes ligandos, formando un complejo ternario en

la superficie de la célula (15), el cual desencadena diferentes vías de señalización

dependiendo del estímulo. Cuando se produce una alteración en el receptor, se

incrementa su afinidad por otros ligandos, activando múltiples vías de señalización y

promoviendo una aberrante y prematura osificación (16).

De acuerdo con estos antecedentes, se realizó un estudio en el cual se postuló que la

reducción de las concentraciones de HS por acción de sus enzimas de degradación,

específicamente con Idursulfase®, podría modificar el pool de expresión corriente abajo

de FGFR2. El tipo de ensayo que se plantea, permitirá demostrar la presencia de una

variación en los perfiles de expresión corriente abajo de FGFR2 en tejido de pacientes

con Apert cuando éste es sometido a tratamiento con Idursulfase® y podrá ser el primer

acercamiento hacia una nueva alternativa terapéutica en el manejo de esta patología,

además de brindar novedosas explicaciones hacia el entendimiento de la pleiotropía y la

severidad de la enfermedad.

Marco Teórico 6

3. Marco Teórico

3.1 Estado del Arte

El síndrome de Apert es una de las anomalías craneofaciales que forma parte de los

denominados síndromes de disostosis craneofacial. Aunque las descripciones clínicas de

craneosinostosis datan del tiempo de Hipócrates, en general se acepta que la primera

craneosinostosis referenciada históricamente fue realizada por Mestrius Plutarchus (46-

127AD), quien describió a estos niños como “cabezas de Ôsquill” (esquila), debido al

nombre común de una planta de la familia de las liliáceas con forma de bombilla

alargada. Aproximadamente 1500 años más tarde en “De Humani Corporis”, Andreas

Vesalius caracterizó formas de cráneos específicas asociadas con la ausencia de suturas

craneales (17). La identificación reciente de dos cráneos precolombinos con sinostosis

sagital (fechado en 6000 y 250 antes de Cristo) confirman que la craneosinostosis es un

antiguo trastorno de los seres humanos (18).

El síndrome de Apert fue descrito por primera vez a principios de 1900 por el pediatra

francés Eugène. Este síndrome se caracteriza por una serie de rasgos distintivos que

afectan al cráneo, cara y extremidades. Consecuentemente, también se ha clasificado

como acrocefalosindactilia tipo 1. Si la alteración genética está presente en una persona

afectada, entonces la probabilidad de que la transmita a cada uno de sus hijos es del

50%. Sin embargo, en el caso concreto del síndrome de Apert, la gran mayoría de

personas afectadas con padres sanos son el resultado de una mutación de novo.

Wheaton, en 1894, pudo haber proveído la primera descripción del Síndrome de Apert en

su artículo “Two specimens of congenital cranial deformity in infants associated with

fusion of the fingers and toes” (19); infortunadamente, atribuyó el fenotipo craneal y los

síntomas respiratorios a la sífilis congénita y la sindactilia a la inflamación fetal in utero.


Sin embargo, no fue sino hasta 1906 que este síndrome fue descrito como

Acrocefalosindactilia por el médico pediatra francés Eugene Charles Apert , el cual

describió nueve casos de sindactilia asociados con acrocefalia (20).

La mutación Serina 252 Triptófano (S252W) en ratones se demostró de forma

independiente en dos laboratorios diferentes (21,22). En el ratón, la sutura coronal

normalmente queda patente a lo largo de la vida. El primer modelo de ratón Apert,

implementado por Chen et al., 2003 (21) demostró la fusión de la sutura coronal,

caracterizada por un aumento prematuro de la superposición de los huesos frontal y

parietal seguido por su fusión progresiva aproximadamente al día 4 de vida posnatal. No

se observaron diferencias en la proliferación celular o la diferenciación de los

osteoblastos de la sutura coronal entre los ratones silvestres y los ratones mutantes, por

lo cual se propuso un aumento en el nivel de apoptosis en la sutura mutante como la

causa para la fusión de la sutura (21). En el segundo modelo murino de Apert (Wang et

al., 2005), las suturas de la línea media fueron afectadas diferencialmente y se observó la

fusión de la sutura coronal y lambdoidea aunque no fue caracterizada (22).

En los últimos años se han realizado varios estudios para proporcionar una mejor

comprensión de la etiología y la patogénesis de esta enfermedad. El síndrome de Apert

tiene un modo de transmisión autosómico dominante, y una mutación en el gen que

codifica para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2) es la

principal causa en la mayoría de los pacientes. Sin embargo, el hecho de que la misma

mutación puede producir una amplia gama de expresión fenotípica, hace que el

mecanismo de desarrollo anómalo sea mucho más complejo. Carinci, F. et al., fue uno de

los primeros autores en proponer una nueva explicación a esta amplio espectro

fenotípico (23): la matriz extracelular se compone de proteínas, glicosaminoglicanos, y

citocinas que son secretadas en una forma autocrina y paracrina las cuales son capaces

de modificarla. Lo que se conoce en la actualidad es que los factores de crecimiento de

fibroblastos forman un complejo con el heparán sulfato, un componente de la matriz

extracelular, antes de la unión al FGFR2. Existen datos sobre expresión diferencial de

citoquinas y macromoléculas de dicha matriz en fibroblastos y osteoblastos derivados de

craneosinostosis. Cambios en la composición de la matriz extracelular podrían explicar el

Marco Teórico 8

proceso osteogénico alterado y dar cuenta de las variaciones patológicas en el desarrollo

craneal, además de las mutaciones en FGFR2.

3.2 Craneosinostosis

Durante la etapa prenatal y la infancia, la calvaria debe expandirse para acomodar el

cerebro en crecimiento (24). Este proceso ocurre en estructuras denominadas suturas

craneales, las cuales son definidas como sinartrosis que permiten que los huesos

craneales se unan fuertemente por medio de tejido fibroso, y cuyo crecimiento se

produce a través de la osificación intramembranosa. Su morfogénesis corresponde a un

”complejo de sutura craneal” conformado por la duramadre, los frentes osteogénicos de

los huesos planos de la calvaria, el mesénquima de la sutura y el pericráneo (25). Este

complejo permite la deformación temporal del cráneo durante el parto o la compresión del

mismo durante un trauma, evitando la separación de los huesos craneales, protegiendo

los tejidos blandos subyacentes y sirviendo como sitio de crecimiento de los huesos

craneales a lo largo de los extremos de dos huesos opuestos (26). Cuando una sutura se

cierra tempranamente, el cráneo no puede crecer perpendicularmente a la sutura, en su

lugar, crece de forma paralela a él; este proceso se conoce como ley de Virchow y

predice la forma de la deformidad craneal (27).

La craneosinostosis, por lo tanto, es una condición que se caracteriza por la fusión

prematura de una o más suturas craneales (24,28–30), donde la distorsión secundaria de

la forma del cráneo ocurre debido a la falta de crecimiento perpendicular a la sutura

fusionada y un sobre-crecimiento compensatorio de las suturas no fusionadas (24). Esta

fusión prematura puede afectar significativamente el desarrollo craneal y cerebral,

aumentando el riesgo de presión intracraneal elevada (30). Esta patología también puede

estar asociada a deformidades faciales, anormalidades de la base endocraneal y del

prosencéfalo, patologías oculares y alteraciones cognitivas y de comportamiento (25).

La craneosinostosis es una malformación común que ocurre en aproximadamente 1 de

cada 2.000-2.500 nacidos vivos; puede ser espontánea o sindrómica y puede involucrar

una o múltiples suturas craneales (27). Adicionalmente, las craneosinostosis pueden ser

el resultado de un desarrollo anormal primario o secundario a causas externas como

teratógenos, falta de crecimiento cerebral, compresión intrauterina o desordenes


hematológicos, metabólicos o displasias de huesos (31). La mayoría de las

anormalidades en las suturas son condiciones aisladas (no sindrómicas), pero alrededor

del 15% de éstas, se encuentran asociadas a síndromes y otras anormalidades del

desarrollo (sindrómicas) (31).

Las suturas involucradas en las cranesinostosis son en orden de frecuencia:

• Sagital 40-58%, de etiología desconocida;

• Coronal 20-29%, se estima que un tercio causadas por mutaciones puntuales;

• Metópica 4-10% de etiología desconocida y

• Lamboidea 2-4% igualmente sin etiología conocida.

Cerca del 85% de las craneosinostosis son no sindrómicas, sin embargo, se han

identificado cerca de 200 síndromes genéticos que se manifiestan con craneosinostosis

(OMIM) (25,29). Las mutaciones en FGFR1, FGFR2, FGFR3 y TWIST son las más

comúnmente asociadas (29,32,33).

3.3 Síndrome de Apert

En humanos, el síndrome de Apert o Acrocefalosindactilia tipo I (MIM #101200) es

causado por mutaciones que producen la ganancia de función del Receptor 2 del Factor

de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR2). El SA es una condición congénita caracterizada

por craneosinostosis coronal, hipoplasia del tercio medio facial, sindactilia simétrica de

manos y pies y malformaciones craneofaciales (34–36). Este síndrome es considerado

como una de las formas más severas de craneosinostosis y es causado principalmente

por dos mutaciones en el (FGFR2) (36,37).

3.3.1 Epidemiología Representa el 4,5% de todas las craneosinostosis sindrómicas. Su incidencia se estima

en 1:60.000 recién nacidos vivos, siendo más común en ciertas regiones geográficas

como Asia, con incidencias de 2:10.000 (3). En Colombia no existen estadísticas

formales acerca de la incidencia de este síndrome en la población, sin embargo, en un

reciente estudio realizado por nuestro grupo, en fase de publicación, con 7 pacientes

afectados, se encontró una relación en las mutaciones similar al reportado en la

Marco Teórico 10

población general con un 70% de prevalencia para S252W y el 30% restante para P253R

(38).

Se estima que las enfermedades genéticas en conjunto representan en la actualidad más

de dos tercios de las admisiones pediátricas y el 80% de la carga económica de los

servicios de urgencias pediátricas. En particular las de origen monogénico, como el

síndrome de Apert representan en conjunto el 5,5% de las admisiones de urgencias

pediátricas anuales. Con un promedio de días de hospitalización de 7.1 (6.0–8.2) y un

promedio de costos anuales de $17,218US ($13,234–$21,440US) (39).

3.3.2 Clínica Las características típicas del esqueleto de los pacientes con SA , además de evidenciar

el compromiso de las suturas craneales coronal y metópica en algunas ocasiones,

consiste en sindactilia óseas, sinoniquia y talla baja por defectos de la

osteogénesis/condrogenesis/displasia epifisiaria (34,35,40). También se han reportado

alteraciones a nivel de la base del cráneo observándose alteraciones faciales como

hipertelorismo ocular, proptosis, hipoplasia del tercio medio facial, maloclusión severa

(41,42).

Otros defectos asociados incluyen el compromiso del SNC manifestado por estenosis del

foramen yugular, ventriculomegalia, ausencia parcial o completa del septum pellucidum y

defectos del cuerpo calloso junto con Retardo Mental, presenta hasta en el 52% de los

pacientes (43). Adicional a esto se ha reportado la perdida de la audición secundaria a la

fusión de la cadena de huesecillos del oído interno (44,45).

Las anomalías viscerales están presentes en cerca de la mitad de los pacientes

afectados, de estas las alteraciones cardíacas como la estenosis de arteria pulmonar,

defectos del septo ventricular, ductus arterioso persistente y fibroelastosis endocardial se

encuentran en el 10% de los pacientes y las genitourinarias como riñones poliquísticos,

hidronefrosis, útero bicorne, atresia vaginal y criptorquidia en 9.6% de los pacientes

(43,46,47)


El diagnóstico se realiza clínicamente dados los hallazgos fenotípicos exclusivos al

síndrome. Las imágenes como la Tomografía axial computarizada (TAC) con

reconstrucción 3D y Resonancia magnética nuclear (RMN) cobran relevancia para la

planificación de las cirugías correctivas a realizar (48). El diagnóstico diferencial del

síndrome de Apert se hace con otros síndromes de craneosinostosis y alteración de las

extremidades en grado variable, como el síndrome de Pfeiffer relacionados también con

mutaciones en FGFR2 y los síndromes de Saethre Chotzen y Carpenter. El seguimiento

de estos pacientes es multidisciplinario, requiriéndose manejo por cirujanos plásticos,

neurocirujanos, pediatra, ortodoncista, oftalmólogo, audiólogo, genetista y psicólogo para

el paciente y su familia (28).

El enfoque neuroquirúrgico incluye craneotomía, la cual se recomienda antes de cumplir

el primer año, para descomprimir el cerebro y evitar de esta forma el aumento de la

presión intracraneal (PIC) a medida que el cerebro se expande, lo cual puede conducir a

la muerte del paciente (31). En la infancia tardía se realizan cirugías para el avance del

tercio medio facial que mejora el flujo nasal y disminuye las infecciones respiratorias

secundarias que son frecuentes en estos pacientes, y la cirugía ortognática en la

adolescencia que mejora la oclusión dental y la estética del paciente (49).

Debido al compromiso de las extremidades, se presentan limitaciones funcionales las

cuales pueden ser corregidas mediantes distintas técnicas quirúrgicas, en muchas

ocasiones mediante múltiples intervenciones, lo cual favorece el desempeño personal de

aquellos pacientes que no presentan otras limitaciones de tipo cognitivo (50).

3.3.3 Genética del Síndrome de Apert El SA presenta un patrón de herencia autosómico dominante y se considera que la

mayoría de los casos de esta enfermedad surgen de forma esporádica (51). El defecto

molecular se encuentra en el gen del FGFR2, cuyo locus es 10q26, con un tamaño de

120kb y un total de 18 exones, de los cuales 17 son codificantes (52).

En 1995 Wilkie et al, en un estudio con 40 pacientes con SA se encontró la presencia de

las dos mutaciones relacionadas: S252W y P253R. Ambas mutaciones involucran

cambios en aminoácidos adyacentes a la región de unión del receptor, aunque la

Marco Teórico 12

mutación S252W es más frecuente (70% de los casos) y se relaciona con paladar

hendido (53).

3.3.4 Vía molecular FGF/FGFR La importancia de la vía de los factores de crecimiento de fibroblastos y su receptor

FGF/FGFR en el desarrollo del esqueleto se ha puesto en evidencia con los numerosos

trastornos que resultan de mutaciones en FGFR y que pueden ser clasificados en dos

grandes grupos: condrodisplasias y craneosinostosis (24,29,54).

Los primeros comprometen principalmente los huesos que sufren osificación endocondral

y son resultado de mutaciones en FGFR3, mientras que las craneosinostosis sindrómicas

son atribuibles a mutaciones en FGFR1, FGFR2 y FGFR3 (32,55). Las mutaciones

observadas en estos síndromes sugieren que existen diversos mecanismos patológicos

relacionados con mutaciones puntuales y que los efectos de la vía FGF/FGFR son

pleiotrópicos (55,56).

La familia de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) está compuesta por 23

miembros cuyos efectos de señalización están mediados por la unión a receptores de

alta y baja afinidad (57–59). Los de alta afinidad o aquellos para quien FGF se comporta

como ligando natural, son la familia génica de los FGFR compuesta por cuatro

integrantes FGFR1 a FGFR4. El gen del FGFR1 se ubica en el cromosoma 8, el del

FGFR2 en el 10, FGFR3 en el 4 y FGFR4 en el cromosoma 5 (60–62). Los diferentes

FGFRs tienen una estructura proteica similar que consiste en tres porciones: la primera

de unión a ligando extracelular con tres dominios tipo Inmunoglobulina (IgI, IgII y Ig III) de

los cuales los dominios 2 y 3 constituyen el sitio de unión; un dominio transmembrana

único y una porción citoplasmática con actividad tirosin kinasa (56).

Tres de los cuatro isotipos de FGFR, el 1, 2 y 3, mediante un proceso de splicing

alternativo, usan dos exones (8 y 9) para codificar alternativamente la región C-terminal

del tercer dominio Ig (IIIb y IIIc). Este proceso crea ARNm tejido-específicos de las

isoformas b y c, las cuales se unen a distintos subconjuntos de FGF (60,63). La región

restante del tercer dominio (IIIa) es codificado por el exón 7 para ambas isoformas,

región en la cual ocurren generalmente las mutaciones relacionadas con síndrome de


Apert (64). Mutaciones en estos sitios conducen a cambios en la orientación relativa de

los dominios afectando la vinculación del ligando.

Al ser receptores tirosin kinasa, estos sufren un proceso de dimerización como paso

crítico en su activación y el inicio de la cascada de señalización descendente (65). Sus

mecanismos de regulación constan de retroalimentación negativa que involucran la

internalización del receptor y la degradación del factor de crecimiento, lo cual atenúan la

señalización posterior a su activación (66). En este proceso participan proteínas como la

CBL ubiquitina ligasa y la proteína de acoplamiento FGFR sustrato 2 (FRS2a) las cuales

al encontrarse mutadas pueden alterar el proceso normal de degradación y contribuir a la

diferenciación prematura de osteoblastos evidenciada en la craneosinostosis humana

(55). La cascada intracelular de los FGFR se ha relacionado con diversos procesos como

mitogénesis, diferenciación, apoptosis y migración, sin embargo, esta cascada requiere

de la participación de elementos adicionales al ligando (67).

Los efectos biológicos de los FGFs están mediados por la asociación con proteoglicanos

tipo HS. La activación del receptor está mediada por el HS asociada con el ligando (FGF)

y el ligando con el receptor, pero también se ha observado que el HS probablemente se

asocie a otros receptores de baja afinidad (14,68).

La señalización FGF/FGFR controla la formación del hueso. En las suturas craneales y

las extremidades durante el desarrollo es crucial para la progresión de los fibroblastos

hacia el periostio y la proliferación y diferenciación de las células progenitoras en el

proceso de crecimiento y cierre de las suturas (69,70). En modelos de ratón Knockout

para FGF2 y FGFR2 se encuentra una menor densidad ósea, reducción de la

proliferación de las células progenitores y funciones anormales de los osteoblastos

maduros (3,51), además los ratones mutados para FGFR2 presentan craneosinostosis

por aumento de la diferenciación celular (71). La regulación principal de este proceso

ocurre sobre la ostoeblastogenesis, donde se controla específicamente la proliferación de

células indiferenciadas y la diferenciación de las células mesenquimales estromales de

la medula ósea por lo cual se ha atribuido un efecto anabólico óseo fuerte in vivo (72–

74). Recientemente se ha demostrado que este efecto estimulador de la proliferación

ocurre a edades embrionarias tan tempranas como E13 (Embriones de 13 días) en los

modelos murinos (75).

Marco Teórico 14

En osteoblastos, FGF2 activa una gran cantidad de vías de señalización incluyendo

Proteínas activadas por mitógenos (MAP) las cuales después de ser activadas por la

señal regulatoria extracelular continúan activando cascadas intracelulares tipo quinasas

como ERK, p38, MAP quinasa y Proteína C quinasa (PKC), todas relacionadas con la

proliferación osteoblástica y supervivencia celular por lo cual se ha considerado FGF2

como el ligando más importante en la vía FGF/FGFR relacionada con hueso (76).

3.3.5 FGFR2 en Síndrome de Apert La mutación en el receptor FGFR2 de los pacientes con Apert se localizan en el dominio

extracelular, más precisamente en dos aminoácidos adyacentes Serina 252 y Prolina 253

en la región entre el 2 y 3 dominio Ig codificada por el exón 7 (77). En condiciones

normales, la isoforma FGFR2b es reconocida por los ligandos FGF2, FGF6 y FGF9. La

mutación S252W favorece el splicing alternativo para la isoforma FGFR2c que permite

ser activada por ligandos adicionales como FGF7 y FGF10 (78) mientras que la mutación

P253R confiere una mayor afinidad por FGF10 (7,79). Ambas mutaciones pueden

generar cambios en la conformación de los dominios de unión con lo cual se podría

favorecer la unión de ligandos ectópicos (37). Andersen et al, en 1998 con experimentos

in vitro demostró que las dos mutaciones reportadas generan unión mejorada a FGF2 y

otros muchos FGFs en las suturas craneales, proponiendo que esta mutaciones se

comportan como una ganancia de función del receptor (80). Ibrahimi et al, en 2001

pudieron verificar la presencia de enlaces adicionales del receptor a la porción N-terminal

de FGF2 por la introducción del residuo hidrofóbico del Triptófano en la posición 252, los

cuales pueden resultar en una mayor unión del ligando. Por otra parte la mutación P253R

parece afectar la estabilidad de la unión al receptor en su afinidad y especificidad lo que

podría permitir la activación paracrina o autocrina de FGFR2 (81).

3.3.6 Vía de señalización corriente debajo de FGFR2 – Diferenciación Osteoblástica

La vía intracelular de quinasas es activada por la unión de FGF al receptor, el cual sufre

un proceso de dimerización y fosforilación. En esta vía están involucradas MAP quinasa,

ERK, PI3K, PKC y P38. ERK 1/2 se ha relacionado con la diferenciación celular en las

células precursoras de osteoblastos y controla la diferenciación mediada por FGFR2


(82,83). MAP quinasa, a través de la activación mediada por FGFR2 mutado aumenta la

activación de Runx2, el cual se comporta como un factor transcripción esencial que

interviene en osteoblastogénesis. Del mismo modo la activación de PKC también se ha

encontrado relacionado con la activación de Runx2 en células mesenquimales y

osteoblastos (84).

La vía del fosfatidil inositol 3 fostato quinasa (PI3K) participa en el control de la

osteoblastogenesis mediada por FGF, promoviendo la proliferación de células

progenitoras y su diferenciación de forma similar a ERK 1 y 2 (7,13). Estos resultados

ponen de relieve las múltiples vías de señalización que pueden mediar los efectos

positivos de FGF/FGFR (85).

Otras proteínas relacionadas con la vía de señalización FGF/FGFR es BMP-2 (bone

morphogenic protein 2) la cual se relaciona principalmente con crecimiento endocondral,

encontrándose también regulado a la alta in vivo después de aplicación de FGF2 en

huesos craneales a través de la expresión Runx2 (86).

FGF2 también participa como un determinante crítico de la masa ósea mediante la

modulación de la señalización vía Wnt-B-Catenina en ratones (5,87). Esta vía se ha

relacionado con el cierre de las suturas craneales, ya que la activación de la señalización

causa un cierre prematuro (72,88). Varios estudios han mostrado que en los procesos de

craneosinostosis desencadenados por la activación de FGFR2 mutados se promueve la

diferenciación de los osteoblastos a través del aumento de Runx2 evidenciándose en la

expresión de genes marcadores de osteogénesis (79,84,89). Así, Runx2 puede cooperar

en esta vía controlando la proliferación de osteoblastos y su diferenciación mediante la

regulación de los componentes de la matriz extracelular como los GAG y los

proteoglicanos (13).

Finamente se ha asociado TWIST1 como un factor de transcripción para la diferenciación

celular que interfiere con la señalización FGF durante la formación ósea (90). Se

reconoce su papel en el control de FGFR2 por una interacción directa no claramente

dilucidada contribuyendo así al cierre prematuro de las suturas coronales (90,91).

Marco Teórico 16

3.3.7 Matriz Extracelular

La osificación intramembranosa propia de las suturas craneales depende de la

diferenciación a osteablastos por un proceso de maduración de las células

mesenquimales (92). Este proceso se relaciona con un programa de expresión que

regula la proliferación diferencial y la mineralización de la matriz ósea, donde participan

señales paracrinas, autocrinas y hormonales así como interacciones de receptores y

ligandos con elementos de la matriz extracelular (93).

Los animales defectuosos en la biosíntesis de los GAGs tienen una perdida completa de

la señalización FGF/FGFR (94,95). En el caso particular de FGFR2, se ha demostrado

que las moléculas de MEC tipo HS, son indispensables su interacción con el respectivo

ligando (95,96).

Se ha demostrado in vitro que fibroblastos obtenidos de periostio de pacientes Apert,

presentan un aumento de GAG de tipo Acido hialurónico (HA), Heparan sulfato (HS),

Condroitin sulfato (CS) y Dermatan Sulfato (DS) secundario a estímulos dependientes de

un desequilibrio entre IL 1 y 6 y TGFB-1 (97), observando que los factores locales que

regulan la producción de la MEC son el Factor de crecimiento transformante B (TGF-B),

las interleuquinas (IL) y los FGF.

En otro estudio, Carinci et al, en el mismo tipo de tejidos describió alteraciones en la

producción de moléculas de la MEC con una sobreexpresión de GAGs, especialmente

HS, además de fibronectina y colágeno, junto con una disminución paralela en la

actividad de enzimas como proteasas, glicosidasas y metaloproteasas implicadas en la

degradación de la MEC y en el proceso de remodelamiento craneal (23).

Con estas múltiples se postula que las características clínicas pleiotrópicas en pacientes

con SA, deben explicarse en el contexto de las mutaciones puntuales y de su compleja

interacción con proteínas de MEC, tipo HS (12,14,15,23,58).

3.3.8 Degradación de Heparán Sulfato Los proteoglicanos son proteínas altamente glicosiladas que se encuentran expresadas

predominantemente en osteoblastos e interactúan funcionalmente con ligandos


osteogénicos, como por ejemplo FGF2/bFGF, BMPs, WNTs) (98–100). Los GAGs

unidos a estas proteínas potencian la señalización intracelular por medio de su habilidad

de unir diferentes ligandos y de soportar complejos ternarios extracelulares entre

proteoglicanos, ligandos y receptores (13). Modificaciones químicas en los motivos de

azúcares pueden controlar la especificidad de las interacciones y regular la eficiencia de

la señalización (101,102).

El HS es uno de los principales GAGs de la MEC e interviene en la formación de huesos,

cartílagos, tendones, cornea, piel y tejido conectivo además del líquido sinovial. Es una

molécula negativamente cargada, con una formación extendida que brinda alta

viscosidad a las soluciones y está formado por la unión de α-glucosamina (sulfatada o

acetilada), ácidos idurónico y glucorónico (97,103). La degradación del Heparán Sulfato

(HS) se realiza mediante la acción de enzimas tipo glicosidasas, sulfatasas y una N-

acetiltransferasa. Las tres enzimas que participan en la degradación del heparán sulfato

son: α-L-iduronidasa (EC 3.2.1.76), L-iduronato-2-sulfatasa (EC 3.1.6.13) y Heparán N-

Sulfatasa (EC 3.10.1.1), en una vía común que permite la degradación de otros tipos de

GAGs (104–106). Debido a que la mayoría de los GAGs en el cuerpo están unidos a

proteínas centrales y forman los denominados proteoglicanos o Mucopolisacaridos (107),

alteraciones de estas enzimas producen enfermedades de depósito lisosomal como las

Mucopolisacaridosis (MPS). Para el caso de las MPS tipo I, II y IIIA, se ha observado un

incremento en las concentraciones de varios GAGS, pero especialmente HS, DS y CS.

En el momento existen en el mercado formas sintéticas de α-L-iduronidasa

(ALDURAZIME®), L-iduronato-2-sulfatasa (ELAPRESE®) y la Heparan sulfatasa

(Medicamento en fase II, bajo el Brand de SHIRE Inc.) las cuales vamos a emplear en

este estudio, para incrementar la degradación de HS.

Metodología 18

4. Metodología

4.1 Fase Pre-analítica Este es un estudio de intervención, de tipo experimental, diseñado para proporcionar

evidencia contundente que juzgue la existencia de una relación de causalidad entre una

exposición y un efecto. Este estudio en particular, utilizó muestras de tejido fibroblástico

subperióstico de 3 pacientes con Síndrome de Apert con las mutaciones P253R y

S252W, las cuales fueron expuestas a Idursulfase® con el fin de degradar Heparán

Sulfato (HS) y comprobar si existía alguna repercusión positiva sobre la evolución

fenotípica de la enfermedad, específicamente en lo relacionado a la osificación prematura

de la sutura craneal coronal. Se decidió usar un tamaño de muestra a conveniencia.

4.1.1 Toma de muestras Previa aprobación por comité de ética institucional y firma del consentimiento

informado por los tutores de los pacientes se procedió a la toma de muestra de sangre

y del material óseo. La toma de la muestra de calota se realizó al momento de la

cirugía de corrección de craneosinostosis o en un tiempo quirúrgico secundario. Se

abordó por incisión coronal hasta el plano subgaleal, se detectó la zona de sinostosis

y se marcó un rectángulo que involucro suficiente tejido y se tuvo el cuidado de tomar

periostio adherido a hueso justo en la sutura sinostosada con un craneótomo. La

muestra fue recolectada en un tubo falcón estéril que contenía 5 ml de MEM, con

suero fetal bovino y antibiótico y se envió al laboratorio, mientras se continuó con la

cirugía planeada en forma rutinaria, esta información es tomada del cirujano

colaborador en el proyecto, el Dr. Rolando Prada en el Hospital infantil universitario

San Jose.


4.1.2 Recolección de Información La información recolectada para el diseño y ejecución del proyecto, fue extraída de

diferentes recursos bibliográficos provenientes de variadas bases de datos, tales

como PubMed, Science Direct, Free Medical Journals y Medline. Una vez generada la

búsqueda con diferentes palabras claves, como por ejemplo Apert Syndrome,

Heparan Sulfate, Glycosaminoglycans, FGFR2, FGF y osteoblastic differentiation,

entre otras, se procedió a filtrar la información de acuerdo a la pertinencia del

“abstract” para el proyecto. Finalmente, después de la lectura de los artículos

escogidos, se determinó cuáles eran relevantes y cuáles se incluirían en el marco

teórico y en la metodología del proyecto.

4.1.3 Recolección de Datos Los datos generados a partir de los cultivos celulares fueron obtenidos de fuentes

primarias de información, usando métodos experimentales tales como PCR y RFLP

para identificación de las mutaciones en el gen FGFR2, espectrofotometría para

cuantificación de glicosaminoglicanes, ensayos de linealidad celular y para

determinación de citotoxicidad y exposición a Idursulfase® de los cultivos celulares,

extracción de RNA total, inmunofluorescencia para identificación de la línea celular

(fibroblastos), microarrays de expresión para determinar la existencia de genes a la

alta o baja, ubicados corriente abajo de la vía de señalización de FGF/FGFR2 y genes

de matriz extracelular. Finalmente se utilizó la técnica de qRT-PCR para verificación

de datos del microarray. Así, diferentes variables de interés se manipularon bajo

condiciones controladas, realizando tres réplicas biológicas por cada experimento,

esperando encontrar diferencias significativas entre el tejido tratado y el no tratado.

Adicionalmente, otros datos, tales como la información personal de los participantes

del estudio fueron recolectados por medio de entrevistas con sus padres o tutores.

Metodología 20

4.2 Fase Analítica

4.2.1 Consentimiento Informado Previa aprobación del consentimiento informado por el Comité de Ética Institucional de

la Universidad Nacional y de la Fundación universitaria de ciencias de la salud FUCS,

se procedió a la firma del mismo por el paciente, los padres o tutores del paciente

menor de edad y el asentimiento del menor según fue el caso y se procedió a la toma

de muestra de sangre, orina y de tejido subperióstico en algún tiempo quirúrgico que

involucraba la corrección de la craneosinostosis. El formato del documento se

encuentra adjunto en el Anexo A.

4.2.2 Análisis de mutación en FGFR2 y expresión de isoforma mesenquimal (FGFR2IIIc)

Se realizó extracción de ADN a partir sangre periférica usando el kit Ultraclean

Isolation Kit® Mobio. Posteriormente se realizó PCR al cDNA de los pacientes, usando

los primers descritos por Fanganiello et al., para la amplificación de un fragmento de

386 pb del gen FGFR2 y que determina la presencia de la isoforma FGFR2IIIc (Primer

forward: 5′-agtgtggtcccatctgacaag-3′ y Primer Reverse: 5′-atagaattacccgccaagcac-3′)

(108). Las condiciones de amplificación incluyeron 35 ciclos de amplificación y una

temperatura de anillaje de 58ºC. Los productos fueron revelados en un gel de agarosa

al 2,0% usando un marcador de peso molecular de 100pb (Thermo Scientific® Life

Technologies). La presencia de las mutaciones S252W y P253R en el gen FGFR2

fueron evaluadas mediante RFLP usando las enzimas Bgl II y MboI, respectivamente.

Los productos de la reacción fueron observados en un gel de poliacrilamida al 9%

utilizando un marcador de peso molecular de 25 pb (Thermo Scientific® Life

Technologies).

4.2.3 Cultivos celulares Se continuó con la realización del cultivo celular de los fibroblastos subperiósticos de 3

individuos con SA. El explante obtenido de cada paciente fue disgregado en

segmentos de aproximadamente 2 a 3mm, colocado en medio de cultivo DMEM®

suplementado con suero fetal bovino al 10% más antibiótico Peniclina/Estreptomicina

al 1% a 37ºC y 5% de CO2, el crecimiento de los fibroblastos fue monitoreado


mediante observación del cultivo celular en microscopio invertido. Una vez se obtuvo

confluencia de 70-80% se realizó subcultivos (máximo 5) con el fin de obtener la

concentración de células necesaria para los experimentos. Toda la población celular

obtenida fue usada para los ensayos diseñados en el experimento.

4.2.4 Densidad celular y ensayo de linealidad celular Con el fin de conocer cuál era la densidad óptima para realizar los experimentos se

realizó un ensayo de densidad y linealidad celular. Para esto las células fueron

sembradas en cajas de micro titulación de 96 pozos en densidades desde 500 a

30,000 células por pozo, en volumen de 100 µL, durante 24 h y 48h. Las células

fueron sometidas a tinción con Resarzurina (4.4 µm) y la producción de color fue

evidenciada por lectura a una longitud de onda de 530nmex y 590nmex en un lector

de placas TECAN GENios para poder establecer el rango, en relación lineal, entre la

densidad celular y la absorbancia, cercano a 530nm que, en adelante, se empleó

como la densidad celular de trabajo.

4.2.5 Determinación de la citotoxicidad del fármaco Idursulfase® y Ensayo de exposición a cultivos primarios

En placas de cultivo de 48 pozos se sembraron 30.000 cels/pozo en un volumen de

200µL/pozo de DMEM suplementado, con un tiempo de incubación de 24h. Luego se

prepararon cinco diluciones con Idursulfase® del rango de 2*10-1 mg/ml hasta 2*10-4

mg/ml de las cuales se agregaron 200µL en pozos individuales. Como control de

crecimiento se usaron células sin tratamiento, como blanco se usó un pozo con medio

de cultivo sin células y como control positivo Taxol (1µM). La viabilidad celular fue

evaluada a las 24 y 48 pos-tratamiento mediante el ensayo Resarzurina (4.4 µm). A

partir de esto se determinaron las curvas de concentración y los porcentaje de

supervivencia, se construyó la curva dosis-respuesta y se calcularon las

concentraciones inhibitorias 50 (IC-50) del tratamiento para cada cultivo celular,

empleando una regresión no lineal en el programa estadístico GraphPad-Prism 6*

(GraphPad Software, USA). Cada tratamiento se realizó por triplicado y al menos dos

experimentos independientes con resultados consistentes, en semanas diferentes.

Metodología 22

Con el fin de imitar el estado de activación del receptor de activación del FGFR2

mutado, se sembraron en cajas de 6 pozos 80.000 células por pozo en 1.600 µL de

medio DMEM suplementado con FGF2 (0,069ng/uL) durante 24 horas, posterior a

esto se retiró el medio de cultivo de los pozos que serían destinados a tratamiento con

Idursulfase® y se les agregó DMEM suplementado más Idursulfase® a una

concentración de 0.025mg/ml según lo reportado en la literatura (109), dado que no

existieron diferencias con las diferentes concentraciones usadas en el ensayo anterior.

A los pozos usados para control sólo se les agregó DMEM suplementado. Las células

fueron incubadas durante 48 horas para proceder a la extracción de RNA total.

4.2.6 Determinación de Inmunofenotipo por Epi-Inmunofluorescencia

Se tomó una alícuota de 40.000 cels/pozo de cada cultivo celular, se sembró en

placas de 12 pozos que contenían láminas cubreobjetos y se incubó durante 24 horas

en medio DMEM suplementado con SFB 10%. Pasadas 24 horas, las células se

fijaron con Paraformaldehído 4% (vol/vol) y se permeabilizaron con Tritón X-100 al

0,5% (vol/vol). Se adicionó una solución de Cloruro de Amonio (NH4Cl) 50mM mas

Glicina 0,1 M por 30 minutos a temperatura ambiente y se agregó 4’,6-diamidino-2-

phenylindol (DAPI) 0.1µg/mL durante 30 minutos, protegido de la luz. Finalmente, se

incubaron con un anticuerpo primario monoclonal Anti-Fibroblast activation protein

alpha (5 µg/mL; AB28244: Abcam ®) durante 1 hora a 37°C protegido de la luz. Para

su visualización, las láminas cubreobjetos con las células teñidas fueron montadas en

un microscopio invertido de escaneo láser confocal Nikon C1, Software EZ-C1.

4.2.7 Extracción de RNA total El RNA total de cada uno de los cultivos pos tratamiento se extrajo usando el kit de

extracción, RNeasy® Mini Kit (74104: Quiagen ®) según condiciones del fabricante.

Posteriormente se cuantificó con el Quibit® RNA Assay Kit (Q32852: Invitrogen®) y se

almacenó a -80°C hasta iniciar el proceso de retrotranscripción. La pureza e integridad

del RNA usado fueron evaluadas usando el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent

Technologies, Palo Alto, USA).


4.2.8 Ensayos de Microarray Dado el alcance sobre transcriptoma (~46.000 transcritos) se eligió para este estudio

el Array GeneChip Human Gene ST 2.0 (Whole transcriptome, Affymetrix®). El

proceso metodológico se llevó a cabo de acuerdo a instrucciones del fabricante

(GeneChip Whole Transcript PLUS reagent Kit). El cDNA sense fue fragmentado y

marcado con biotina empleando TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) y usando

el kit GeneChip WT Terminal labeling. Aproximadamente 5.5 µg de DNA target

marcado fue hibridizado al GeneChip a 45°C por 16 horas. Los arrays hibridizados

fueron lavados y teñidos en la estación de fluídica para GeneChip 450 y escaneados

en el Escáner GCS3000 (Affymetrix). Los valores de señal fueron computados

usando el software GeneChip™ Comand Console®.

Los datos crudos fueron extraídos automáticamente usando el protocolo de extracción

de datos incluido en el software. Después de importar los archivos CEL, los datos

fueron resumidos y normalizados usando el método de RMA implementado en el

software Affymetrix® Expression Console™ Software (EC). Se exportaron los

resultados usando el análisis de RMA de nivel de gen y se realizó el protocolo para la

determinación de genes diferencialmente expresados (DEG). La significancia

estadística de los datos de expresión fue determinada usando “fold change”. Para

cada set DEG, el análisis jerárquico de clusters fue realizado usando “Complete

Linkage and Euclidean distance” como medidas de similitud. El análisis de

enriquecimiento de genes y de anotación funcional fue realizado usando DAVID

(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp). A cada término le fue asignado un score

(EASA), que consiste en el p-value modificado por el Test Exacto de Fisher. Si el

valor era menor a 0.05 fue clasificado como enriquecimiento.

4.2.9 Análisis de la expresión génica diferencial mediante qRT-PCR

A partir de una cantidad cercana a los 200 ng de ARN total se realizó el proceso de

retrotranscripción con el kit SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen®) y el

cADN resultante se usó para el desarrollo de una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-

PCR) para la determinación de los cambios en la expresión génica de 10 genes de

Metodología 24

interés identificados en el análisis de Microarray relacionados con los procesos biológicos

y moleculares de mayor importancia en lo reportado previamente en la fisiopatología de

la enfermedad. Los primers fueron diseñados usando el programa Primer 3 (versión

0.4.0) (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) (Tabla 1). GADPH fue usado como gen

referencia para normalizar los datos de los genes evaluados debido a que fue el gen de

referencia más estable entre los valorados para este estudio en particular. Los primers

también fueron diseñados como se explicó previamente. Las reacciones fueron

realizadas en el equipo Lighcycler 96 (Roche) utilizando SyberGreen Master Mix (Applied

Biosystems). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado y con mínimo dos

réplicas por ensayo para estimar la variación. Los niveles de expresión se determinaron

mediante cuantificación relativa utilizando el método ΔCt (110). Los datos fueron

expresados como las veces de expresión de las células tratadas en relación a las células

sin tratamiento.

Tabla 1 Secuencia de primers usados en experimentos de qRT-PCR

GEN PRIMER FORWARD PRIMER REVERSE

SFRP2 ACGGCATCGAATACCAGAAC GCTGGATGGTCTCGTCTAGG

FGFBP3 AGGCACTGCAGTCTCCAACT TAATTGCACCACTGCTCCAG

MMP1 GGTCTCTGAGGGTCAAGCAG AGTTCATGAGCTGCAACACG

BMP4 TGGAATGACTGGATTGTG ATGGTTGGTTGAGTTGAG

CCL4 GTATGACCTGGAACTGAAC CTGAGTATGGAGGAGATGT

CDH3 AACCTCCACAGCCACCATAG GTCTCTCAGGATGCGGTAGC

HHIP TGATTTCACAGGCTCAGTGC TGGGATGTCTATCCACAGCA

PCDH10 GTTCCTGGCATGGACTCTGT TAAGGCGCTCGCGTATTAGT

PTPRB TGGGAACAAAACGTTCACAA TGCATCAAGCTGTTCCTCAC

COL1A1 TGACCTCAAGATGTGCCACT ACCAGACATGCCTCTTGTCC

GADPH CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA CCTTGACGGTGCCATGGAATTTGC


4.2.10 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido.

Para la cuantificación de la actividad enzimática de Alfa L Iduronidasa (IDUA) e

Iduronato 2 Sulfatasa (IDS) se realizarán los protocolos establecidos para estudios de

MPS tipo I y II. Estas mediciones se harán en sangre periférica y en los cultivos sin

tratamiento. Se realiza la cuantificación de GAGs en orina de los pacientes mediante

la metodología de ensayo espectrofotométrico usando dye dimethylmethylene blue.

Además se realiza una electroforesis de MPS en dos dimensiones para diferenciar los

diferentes GAGS. Muestra: 3 muestras de orina fraccionadas en un periodo de ocho

horas. Lugar: Centro de investigaciones en Bioquímica (CIBI). Universidad de los

Andes. Bogotá – Colombia.

4.3 Tratamiento Estadístico Todos los análisis de datos y visualización de los genes expresados diferencialmente

fueron realizados usando R 3.1.2 (www.r-project.org). Los genes obtenidos en las

anotaciones funcionales fueron agrupados en clusters y se seleccionaron aquellos que

presentaron un fold change de ⏐2⏐ y un p valor significativo. Las correcciones del p valor

para la significancia estadística de los hallazgos fue realizada con los test de Bonferroni,

Benjamini y FDR.

Resultados 26

5. Resultados

5.1 Identificación del Fenotipo Celular Después de cultivar el explante de tejido perióstico de los pacientes con SA para obtener

el cultivo primario, se procedió a congelar una parte del mismo con el fin de preservar la

muestra en este estadio. Los cultivos realizados y su evolución se resumen en la tabla 2.

Al observarse al microscopio una confluencia del 70-80%, los células presentaban una

morfología fibroblastoide, con una distribución homogénea sobre la superficie del frasco

para cultivo celular T-25 (Figura 1) y no se encontró ningún tipo de aglutinamiento celular.

Para alcanzar este nivel de confluencia fueron necesarias aproximadamente 4-6

semanas. Después del quinto a décimo pase las células empezaban rápidamente su

proceso de senescencia y su viabilidad disminuía significativamente. Cuando los

cultivos primarios eran descongelados, la velocidad de crecimiento y el tiempo de

viabilidad celular disminuían ampliamente comparados con los cultivos que no habían

sido congelados. Por otra parte, la tinción con el anticuerpo AFP evidenció una tinción

homogénea en la superficie celular, producida por la presencia de la proteína de

activación anti-fibroblasto en el cultivo, sin encontrarse otro grupo celular presente

(Figura 2).


Tabla 2 Cultivos usados en el estudio

NUMERO CULTIVO CELULAR ASIGNADO

FECHA ESTABLECIMIENTO CULTIVO

FECHA DE PRIMER PASE

OBSERVACIONES

1 08/08/14 16/08/14 Se descarta. Muestra invalida posterior a tripsinización.

2 18/08/14 02/09/14

3 09/08/14 16/10/14

4 30/08/14 02/09/14

Usado en experimentos, corresponde a paciente 1. Proceso de congelamiento y descongelamiento invalido. No se cuenta con muestra

5 17/08/14 20/10/14 No fue posible obtener densidad celular deseada.

6 19/12/14 24/12/14

Usado como control basal de los experimentos. Proceso de congelamiento y descongelamiento invalido. No se cuenta con muestra

7 No establecido --------------- Muestra no prolifera a 4 semanas de observación

8 07/04/15 19/04/15 Usado en experimentos, corresponde a paciente 2

9 No establecido --------------- Corresponde a controles sanos que se requiere para calibración de metodología de mediciones bioquímicas sobre tejido. Muestras no proliferan a 4 semanas de observación

10 No establecido ---------------

11 No establecido ---------------

12 24/11/15 01/12/15 Corresponde a paciente 3

13 13/12/15 06/01/16

Corresponde a control sano, muestra de cráneo de adulto, que se requiere para calibración de metodología de mediciones bioquímicas sobre tejido.

14 10/01/16 28/01/16

Corresponde a control sano, muestra de cráneo de niño, que se requiere para calibración de metodología de mediciones bioquímicas sobre tejido.

Resultados 28

Figura 1 Observación microscópica aleatoria de expansión celular en primer pase de cultivo celular primario de fibroblastos de perioistiio de pacientes con SA. Agosto de 2014. Visualización 10X.

Figura 2 Epi-inmunofluorescencia cultivo 008: se observa tinción positiva color verde (lado izquierdo) para Ac dirigido a APF de superficie celular, al compararse con tinción para núcleo celular DAPI color azul (lado derecho)


Finalmente, se determinó la existencia de la isoforma FGFRIIIc del receptor en las

células subperiósticas cultivadas, al realizar una PCR convencional con primers

específicos para la misma (Figura 3).

Figura 3 Electroforesis de amplificación de fragmento de 286pb de la isoforma mesenquimal FGFR2IIIc. Carriles 1, 3, 5, 7 corresponden a muestras de control positivo y pacientes con tratamiento con Idursulfase®. Carriles 2, 4, 6 y 8 corresponden a muestras sin tratamiento. Carril C- corresponde a control negativo

5.2 Identificación del Fenotipo Celular Los perfiles de restricción obtenido por la técnica RFPL comprobó la presencia de las dos

mutaciones más reportadas para SA. En este caso, de los 3 pacientes que participaron

en el estudio, 2 (66%) presentaron la mutación S252W y 1 (33%) la mutación P253R

(figura 4).

Resultados 30

Figura 4 4A: Perfil mutacional de tres cultivos celulares fibroblásticos con la enzima Bgll. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en tres muestras de ADN proveniente de los cultivos celulares evaluados (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima BgII para la detección de la mutación P253R en geles de poliacrilamida al 9%, la muestra del paciente 1 es positivas para la mutación P253R y por lo tanto presenta una banda de bajo peso molecular (±300bp) (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 002-004: muestras cultivo celular, 004 corresponde al cultivo del paciente 1 (AP1); C-: DNA negativo de la mutación. 4B: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en ADN proveniente de muestra de sangre de Paciente 2 (AP2) rotulada como cultivo 008 y controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9% Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 25-12: muestra de DNA de paciente 2; C-: DNA negativo de la mutación. 4C: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en una muestra de ADN proveniente de paciente 3 (AP3) rotulado como cultivo celular 012 y controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI

MP CP+ AP12 CN-

Patrón electroforético compatible con mutación S252W, banda de 476pb.

4A

4B

4C


para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9%, Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; AP12: muestra cultivo celular 012, paciente 3; C-: DNA negativo de la mutación.

5.3 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDUS e IDUA en orina, sangre y tejido subperióstico craneal.

Se realizó la cuantificación de HS y de las enzimas degradadoras de glicosaminoglicanes

para todos los pacientes. La muestra del primer paciente, de sexo masculino (004) de

una año de edad consistió en tejido celular ya que no se contaba con muestras de sangre

y orina porque el paciente falleció inmediatamente después de la intervención quirúrgica.

Se calibran resultados con fibroblastos gingivales (FG) de línea celular como control sano

(Tabla 3).

Tabla 3 Actividad enzimática de IDS e IDUA en tejido de paciente 004

Enzima Resultado Control FG Alfa-L-Iduronidasa 15.5 12.04 Iduronato Sulfatasa 6.92 13.05

La muestra paciente 008 de 3 años de edad y sexo femenino consistió en sangre y orina

para determinar la cuantificación enzimática en leucocitos y la cuantificación de

mucopolisacáridos en orina (Tabla 4), las cuales presentan una ligera elevación Alfa-L-

Iduronidasa en sangre y normalidad en la cuantificación de mucopolisacáridos. No se

logró obtener suficiente cantidad celular para el ensayo de la actividad enzimática en

fibroblastos.

Resultados 32

Tabla 4 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos, cuantificación de Heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido

Enzima Resultado Valor de referencia

Alfa-L-Iduronidasa 19.4 4-16nmol/mg-Proteína/hora

Iduronato Sulfatasa 18.28 9.5-35.2 nmol/mg-Proteína/hora

Muestra Creatinuria mg/dL Unidades CPR/gramo de creatinina

ALCIAN BLUE mg de GAG/mol de creatinina

1 56.8 209.37 15.96 2 23.55 78.63 14.69 3 15.45 52.15 17.17

Valor referencia Hasta 228 Hasta 19.8

Finalmente, los resultados en sangre total y orina para estos mismos análisis en el

paciente 3 (012), de 8 años de edad y sexo masculino, resultaron normales (Tabla 5). No

se logró obtener suficiente cantidad celular para el ensayo de la actividad enzimática en

fibroblastos.

Tabla 5 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos cuantificación de heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido

Enzima Resultado Valor de referencia

Alfa-L-Iduronidasa 13.8 4-16nmol/mg-Proteína/hora

Iduronato Sulfatasa 32.02 9.5-35.2 nmol/mg-Proteína/hora

Muestra Creatinuria mg/dL Unidades CPR/gramo de creatinina

ALCIAN BLUE mg de GAG/mol de creatinina

1 130.42 91.81 8.58 2 102.1 58.37 6.01 3 17.66 7.52 7.87

Valor referencia Hasta 161 Hasta 9.1


5.4 Evaluación del efecto citotóxico del fármaco Idursulfase®

Con el fin de estandarizar la concentración celular necesaria para trabajar en los

experimentos de exposición al fármaco Idursulfase®, se realizó un ensayo de linealidad

celular, por medio del cual se determinó un incremento directamente proporcional en la

reducción de Resazurina al aumentar la densidad celular sembrada por pozo. La figura 5,

indica un fuerte grado de correlación existente (R2 >0.98), indicando un ajuste alto al

modelo de regresión lineal, entre las variables de número de células sembradas y la

respuesta en unidades relativas de fluorescencia (URF). Esta regresión no es

dependiente de la carga mutacional del cultivo. De otra parte, con microscopio invertido

se estableció que la densidad de 30.000 células/pozo presenta un estado de confluencia

cercano al 80%, 72 horas después de la inoculación (24 horas de incubación previa a la

adición del fármaco más 48 horas de exposición), razón por la cual esta es la densidad

escogida para realizar experimentos subsecuentes, debido a que es necesario mitigar la

variación de los resultados por desprendimiento de la monocapa celular (figura 5).

Figura 5 Intensidad de la fluorescencia media (URF) al evaluar seis densidades celulares en los cultivos FIBRO CONTROL y FIBRO APERT durante un periodo de 48 horas. n=6

Después de las 48 horas de tratamiento con Idursulfase®, la viabilidad y el crecimiento

del cultivo celular no se vieron afectados; al contrario, después de este tiempo, el cultivo

fibroblástico aumentó su tasa de crecimiento y la viabilidad se mantuvo. En contraste, el

efecto del Taxol produjo una tasa de mortalidad celular del 90% (figura 6).

Resultados 34

Figura 6 Curvas de supervivencia de los cultivos celulares FIBRO AP y FIBRO CONTROL. Las células se sembraron a una densidad de 30000 (cels/pozo) en cajas de cultivo de 48 pozos. 24 horas después, las líneas celulares FIBRO AP (Izquierda), y FIBRO CONTROL (Derecha) se sometieron a exposición del fármaco Idursulfase® en diferentes concentraciones (0.2, 0.02, 0.002, 0.0002 y 0.00002 mg/ml). Se realizó lectura 48 post-tratamiento por el método de viabilidad con Rezasurina. Este experimento se realizó por duplicado. Como controles se empleó células sin tratamiento; pozos vacíos sin células, y como control positivo (muerte), células sometidas a Taxól (4 x10-1 µM).

5.5 Análisis de expresión diferencial por Microarray Se obtuvo con éxito RNA total a partir de las células fibroblásticas de pacientes con SA,

en condiciones basales y al ser expuestas al fármaco. Las mediciones se encuentran por

encima de 50ng/µL, dentro del rango necesario aceptado para comenzar el ensayo de

hibridación para el microarray. Se evaluaron 3 réplicas biológicas por paciente sin

tratamiento y con el tratamiento (Idursulfase®) (Tablas 6, 7 y 8)

Tabla 6 Cuantificación RNA muestras cultivos 004 y 006

Muestra Concent. Acidos Nucleicos Unidad A260 A280 260/280 260/230

004 rb1 st 264,8 ng/µl 6,621 3,175 2,09 1,04 004 rb1 e 338,7 ng/µl 8,469 4,076 2,08 1,27 004 rb2 st 327,2 ng/µl 8,181 3,949 2,07 2,01 004 rb2 e 342,7 ng/µl 8,568 4,144 2,07 1,7 004 rb3 st 195,5 ng/µl 4,887 2,349 2,08 0,57 004 rb3 e 196,4 ng/µl 4,909 2,388 2,06 1,83 006 rb1 st 135,9 ng/µl 3,399 1,59 2,14 0,2 006 rb1 e 113,8 ng/µl 2,845 1,372 2,07 0,58 006 rb2 st 161,9 ng/µl 4,047 1,926 2,1 0,3 006 rb2 e 128 ng/µl 3,201 1,533 2,09 0,41 006 rb3 st 184,6 ng/µl 4,616 2,24 2,06 1,4 006 rb3 e 185,2 ng/µl 4,631 2,22 2,09 0,49

050100

FIBROAP

050100

FIBROCONTROL


Tabla 7 Cuantificación RNA muestras cultivos 008

Muestra Concent. Acido Nucleico Unidad A260 A280 260/280 260/230

008 rb1 st 230,7 ng/µl 3,275 2,278 2,12 0,15 008 rb1 e 181,3 ng/µl 4,514 2,308 2,12 0,54 008 rb2 st 104,1 ng/µl 3,546 1,63 2,07 0,89 008 rb2 e 156,5 ng/µl 4,809 1,674 2,14 0,07 008 rb3 st 144,3 ng/µl 2,879 1,896 2,07 1,61 008 rb3e 124,9 ng/µl 2,965 4,042 2,22 0,05

Tabla 8 Cuantificación RNA muestras cultivos 012

Muestra Concent. Acido Nucleico Unidad A260 A280 260/280 260/230

012 rb1 st 63,35 ng/µl 8,475 1,028 5,68 0,47 012 rb1 e 229,23 ng/µl 6,423 2,54 2,07 1,07 012 rb2 st 136,23 ng/µl 4,123 1341 2,08 0,5 012 rb2 e 75,28 ng/µl 3,762 3,76 2,06 1,19 012 rb3 st 63,49 ng/µl 8,412 2,789 2,09 1,09 012 rb3 e 138,77 ng/µl 7,31 3,341 2,16 0,26

Una vez se obtuvieron los datos iniciales del micrroarray, al comparar la expresión génica

pos-tratamiento con Idursulfase® contra la expresión génica de las células sin

tratamiento, se encontraron 220 genes diferencialmente expresados en total: 101 a la alta

y 119 a la baja.

Posteriormente fue realizado el proceso de anotación por medio de la herramienta

bioinformática DAVID (versión 7.0), a partir de la cual los genes fueron agrupados en

clústeres de acuerdo a su función biológica. Con este nuevo filtro se encontraron 218

genes (a partir de los 220) con una función biológica conocida (Tabla 9), agrupados en

los siguientes categorías funcionales:

• Biogénesis o componentes de matriz extracelular (52 genes),

• Señalización intracelular (49 genes),

• Respuesta inflamatoria (21 genes),

• Regulación de la proliferación celular y apoptosis (21 genes),

Resultados 36

• Diferenciación celular (14 genes) y

• Moléculas de unión a glicosaminoglicanos (4 genes).

Resulta importante resaltar que algunos de los genes comparten clústeres y que, debido

al enfoque de este trabajo, se hará énfasis en el análisis de los genes asociados a

diferenciación celular y los que impacten directamente a esta categoría. En la Tabla 10

se relacionan los genes implicados en el proceso de diferenciación osteoblástica y que

cumplen funciones cruciales para el desarrollo de la craneosinostosis.

Tabla 9 Lista de genes diferencialmente expresados con su respectivo fold change. AP1, -2, -3: Valor de fold change; rojo: regulación a la alta; verde: regulación a la baja

Numero acceso Símbolo Nombre del gen AP1 AP2 AP3 p value

NM_001005484

OR4F5 Olfactory receptor, family 4, subfamily F, member 5

2,76 2,07 2,43 2,98E-04

NM_014357 LCE2B Late cornified envelope 2B 2,18 2,12 2,96 1,41E-04

NM_002966 S100A10 S100 calcium binding protein A10

2,58 2,07 2,40 2,46E-03

NM_001164586

IGFN1 Immunoglobulin-like and fibronectin type III domain containing 1

3,54 2,49 2,20 2,49E-03

NM_001178096

F3 Coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor)

18,20 7,96 5,43 3,70E-03

NM_001001827

OR2T35 Olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 11

2,87 2,26 2,74 7,81E-03

NM_024114 TRIM48 Tripartite motif containing 48 2,19 2,43 2,67 3,04E-02

NM_001004458

OR1S1 Olfactory receptor, family 1, subfamily S, member 1

2,10 2,35 2,21 1,02E-02

NM_002422 MMP3 Matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase)

2,38 2,43 2,43 2,71E-03

ENST00000553087

KRT6C Keratin 6C 2,24 2,04 2,36 1,02E-02

NM_002935 RNASE3 Ribonuclease, rnase A family, 3 2,57 2,47 2,60 1,99E-02

NM_003013 SFRP2 Homo sapiens secreted frizzled-related protein 2 (SFRP2

17,33 16,81 7,12 2,71E-13

NM_001145938

MMP1 Matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)

5,84 3,97 2,14 1,57E-20

NM_003554 OR1E2 Olfactory receptor, family 1, subfamily E, member 2

2,66 2,02 2,59 2,46E-04

NM_133475 ANKRD24 Ankyrin repeat domain 24 2,34 2,78 2,08 3,50E-04

NM_145276 ZNF563 Zinc finger protein 563 2,74 2,57 2,68 7,05E-03

NM_003014 SFRP4 Secreted frizzled-related protein 4

2,78 2,54 2,75 5,60E-04


NM_005924 MEOX2 Mesenchyme homeobox 3,94 2,94 2,16 1,85E-08

NM_001079 CFC1B Cripto, FRL-1, cryptic family 1B 2,36 2,09 2,27 1,57E-07


530

NM_001142351

ST6GAL2 ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 2

2,31 2,04 2,21 2,46E-04

ENST00000429538

PAX8 Paired box 8 2,07 2,06 2,91 3,50E-06

ENST00000437310

OR5H14 Olfactory receptor, family 5, subfamily H, member 14

2,96 2,76 2,87 2,46E-03

NM_003716 CADPS Ca++-dependent secretion activator

2,41 2,73 3,32 2,49E-03

NM_001302770

CSN2 Casein beta 2,58 2,94 2,91 9,63E-09

NM_019105 TNXB Tenascin XB 2,06 3,77 3,03 0,0082787

ENST00000466254

TRBC2 T cell receptor beta constant 2 2,12 2,12 2,46 0,00381862

ENST00000408906

OR2A5 Olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 14

2,46 2,97 3,36 0,00620194

ENST00000390348

TRGV1 T cell receptor gamma variable 1

2,81 2,19 2,26 0,02531844

NM_000598 IGFBP3 Insulin-like growth factor binding protein 3

3,25 2,71 3,12 0,00643311

NM_006682 FGL2 Fibrinogen-like 2 2,92 3,38 2,31 0,00693147

NM_022573 TSPY2 Testis specific protein, Y-linked 2

2,01 2,70 2,56 0,00745442

AF111708 MSTO1 Misato 1, mitochondrial distribution and morphology regulator

2,19 2,28 2,49 0,00888039

ENST00000369175

FAM72C Family with sequence similarity 72, member C

2,71 2,16 2,33 0,02727223

NM_001100 ACTA1 Actin, alpha 1, skeletal muscle 2,19 2,17 2,64 0,00174779

NM_001135241

AKR1C2 Aldo-keto reductase family 1, member C2

2,21 4,03 2,68 0,00800633

NM_024114 TRIM48 Tripartite motif containing 48 2,11 3,56 2,42 1,59E-04

NM_001004739

OR5L2 Olfactory receptor, family 5, subfamily L, member 2

3,16 3,25 2,71 0,00165787

XR_432738 PRSS23 Protease, serine, 23 2,62 2,92 2,98 0,0034415

NM_001004740

OR5M1 Olfactory receptor, family 5, subfamily M, member 1

2,31 2,64 2,10 0,04752524

NM_176890 TAS2R50 Taste receptor, type 2, member 50

2,01 2,70 2,09 3,30E-04

ENST00000390585

IGHD2-8 Immunoglobulin heavy diversity 2-8

2,14 2,56 2,26 8,68E-04

ENST00000390598

IGHV3-7 Immunoglobulin heavy variable 3-7

2,53 2,24 2,31 0,03039373

ENST00000469461

CATSPER2// LOC101930343

Cation channel, sperm associated 2//uncharacterized LOC101930343

2,27 2,49 2,10 0,04445651

NM_002986 CCL11 Chemokine (C-C motif) ligand 11

2,11 2,32 2,16 9,63E-04

NM_001165252

KRTAP2-3 Keratin associated protein 2-3 2,78 3,06 2,33 0,02978834

NM_033059 KRTAP4-11 Keratin associated protein 4-11 2,91 3,12 2,13 0,00129305

NM_021013 KRT34 Keratin 34 2,58 2,22 2,35 0,00348018

Resultados 38

NM_002522 NPTX1 Neuronal pentraxin I 2,44 2,05 2,88 0,0108257

NM_001143818

SERPINB2 Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 2

2,39 3,01 3,32 0,01240639

NM_001190441

LGALS16 Lectin, galactoside-binding, soluble, 16

2,08 2,86 2,04 0,0129595

NM_001289158

EMR3 Egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 3

2,38 2,72 2,20 0,02707838

NM_181621 KRTAP13-2 Keratin associated protein 13-2 2,36 2,18 2,30 0,0496378

NM_001080440

OTOL1 Otolin 1 2,47 3,06 3,35 1,49E-05

ENST00000296575

HHIP Hedgehog interacting protein 2,48 2,56 3,22 0,00217683

NM_144644 SPATA4 Spermatogenesis associated 4 2,65 2,66 2,53 0,00298018

NM_003536 HIST1H3H Histone cluster 1, h3h 2,51 3,02 2,64 0,01008408

ENST00000377050

UBD Ubiquitin D 3,15 3,04 3,37 0,01157834

NM_006900 IFNA13 Interferon, alpha 13 2,35 2,43 2,04 0,00981119

NM_176891 IFNE Interferon, epsilon 2,59 2,38 2,44 0,00633825

ENST00000529915

LPXN Leupaxin 2,64 2,09 2,90 0,00755223

NM_001882 CRHBP Corticotropin releasing hormone binding protein

3,75 2,39 2,92 0,01082954

NM_001099850

LOC391003 PRAME family member-like 3,05 3,02 2,26 0,01981219

ENST00000369851

GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 3

3,09 3,01 2,78 0,03396304

NM_178354 LCE1F Late cornified envelope 1F 2,15 2,69 2,17 1,86E-03

NM_020950 KIAA1614 Kiaa1614 3,03 2,33 2,12 7,01E-03

NM_001146344

PRAMEF11 PRAME family member 11 2,88 2,40 2,76 1,37E-07

NM_001289158

ADGRE3 Adhesion G Protein-Coupled Receptor E3

2,62 3,03 2,33 1,86E-03

NM_001001827

OR2T35 Olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 35

2,48 3,00 2,48 1,04E-04

ENST00000523376

CALCB Calcitonin-related polypeptide beta

2,88 2,16 2,73 1,68E-04

NM_024081 PRRG4 Proline rich Gla (G-carboxyglutamic acid) 4 (transmembrane)

2,88 2,16 2,73 2,40E-09

NM_033180 OR51B2 Olfactory receptor, family 51, subfamily B, member 2

3,04 3,10 2,82 3,77E-05

ENST00000454832

SIK3-IT1 SIK3 intronic transcript 1 (non-protein coding)

2,30 3,03 2,32 4,28E-05

NM_002935 RNASE3 Ribonuclease, rnase A family, 3 3,19 2,59 2,15 1,22E-04



NM_001017920

DAPL1 Death associated protein-like 1 2,58 2,24 2,38 6,61E-05

NM_001163561

C2orf61 Chromosome 2 open reading frame 61

2,36 2,38 2,57 5,67E-06


ENST00000371328

FAM209A//FAM209B

Family with sequence similarity 209, member B

2,26 3,19 2,88 6,14E-04

ENST00000390302

IGLV2-33 Immunoglobulin lambda variable 2-33 (non-functional)

2,91 2,50 2,72 0,00191333

XM_005261590

GSTT2 Glutathione S-transferase theta 2

2,47 2,21 2,68 0,00207512

NM_001040448

DEFB131 Defensin, beta 131 2,46 3,02 2,31 7,94E-04

NM_054023 SCGB3A2 Secretoglobin, family 3A, member 2

2,59 2,11 3,02 5,04E-08

NM_001143957

GPR63 G protein-coupled receptor 63 2,55 2,77 2,74 5,45E-07

NM_001024678

LRRC24 Leucine rich repeat containing 24

3,20 2,13 3,05 2,74E-03

NM_005949 MT1F Metallothionein 1F 2,48 2,03 2,99 2,74E-04

NM_022661 SPANXC SPANX family, member C 2,89 2,53 2,97 4,96E-06

NR_024560 MAPT-IT1 MAPT intronic transcript 1 (non-protein coding)

2,32 2,35 2,29 7,49E-08

AK092813 IFIT1 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1

2,67 2,32 2,81 3,08E-06

NM_001005285

OR2AT4 Olfactory receptor, family 2, subfamily AT, member 4

2,91 2,54 2,63 8,43E-05

ENST00000390442

TRAV12-3 T cell receptor alpha variable 12-3

2,22 3,02 2,37 1,52E-10

ENST00000390598

IGHV3-7 Immunoglobulin heavy variable 3-7

2,45 3,07 2,77 2,96E-10

ENST00000390304

IGLV3-27 Immunoglobulin lambda variable 3-27

2,96 2,80 2,80 4,51E-06

NM_001270483

TST Thiosulfate sulfurtransferase (rhodanese)

2,30 2,24 3,04 5,67E-06

ENST00000507053

DDX46 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 46

2,66 2,80 3,14 9,12E-10

AK294939 DDX39B DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 39B//small nucleolar RNA, C/D box 84

2,48 2,65 2,36 6,06E-09

NM_001013736


2,61 2,71 2,32 4,35E-08

NM_000618 IGF1 Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)

10,09 6,80 5,40 5,19E-06

NM_002006 FGF2 Fibroblast growth factor 2 2,54 2,55 2,57 0,00104216

NM_001258038

SPRY1 Sprouty homolog 1, antagonist of FGF signaling

4,43 3,67 4,38 0,01456281

NM_004464 FGF5 Fibroblast growth factor 5 5,26 3,74 5,25 0,01154194

NM_002016 FLG Filaggrin -14,52

-6,99 -2,70 0,00105033

NM_001109754

PTPRB Protein tyrosine phosphatase, receptor type, B

-5,06 -3,62 -3,10 3,77E-15

NM_178134 CYP4Z1 Cytochrome P450, family 4, subfamily Z, polypeptide 1

-3,91 -3,08 3,90 2,74E-12

ENST00000371438

RUNX2 Runt-related transcription factor 2

-2,09 -2,63 -3,26 0,0110733

NM_001267585

FBXW10 F-box and WD repeat domain containing 10

-2,09 -2,06 -2,33 0,01154194

NM_001202 BMP4 Bone morphogenetic protein 4 - -3,36 -2,10 5,69E-11

Resultados 40

12,63

NM_152429 FGFBP3 Fibroblast growth factor binding protein 3

-3,20 -2,72 -2,07 2,74E-12

NM_001009611

PRAMEF4 PRAME family member 4 -2,01 -3,67 -3,59 0,00115843

NM_002900 RBP3 Retinol binding protein 3, interstitial

-2,47 -2,93 -2,22 0,00115843

NM_001271983


-2,51 -3,00 -2,89 1,34E-04

NM_001005288

OR51I1 Olfactory receptor, family 51, subfamily I, member 1

-3,26 -2,01 -2,28 1,36E-04

NM_001206631

TRIM64C Tripartite motif containing 64C -3,48 -2,09 -3,40 1,41E-04

NM_001193471

FOLH1 Folate hydrolase (prostate-specific membrane antigen) 1

-2,35 -2,12 -2,14 1,41E-04

NM_025208 PDGFD Platelet derived growth factor D -3,65 -2,39 -3,15 1,47E-04

NM_001135 ACAN Aggrecan -2,29 -2,18 -2,12 1,49E-04

NM_012360 OR1F1 Olfactory receptor, family 1, subfamily F, member 1

-2,21 -2,15 -2,41 1,50E-04

NM_001286075

ATP2A1 Atpase, Ca++ transporting, cardiac muscle, fast twitch 1

-2,06 -2,64 -2,54 1,53E-04

NM_001793 CDH3 Cadherin 3, type 1, P-cadherin (placental)

-2,29 -3,64 -2,11 5,08E-12

NM_001267585

FBXW10 F-box and WD repeat domain containing 10

-2,01 -3,18 -2,51 1,61E-04

NM_005623 CCL8 Chemokine (C-C motif) ligand 8 -2,21 -2,14 -2,21 0,00115843

NM_002984 CCL4 Chemokine (C-C motif) ligand 4 -2,10 -2,14 -2,16 3,34E-09

NM_138286 ZNF681 Zinc finger protein 681 -2,70 -2,76 -2,39 1,05E-08

uc002qeu.1 LILRA5 Leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily A (with TM domain), member 5

-2,88 -2,96 -2,54 3,49E-09

NM_198694 KRTAP10-5 Keratin associated protein 10-5 -2,03 -2,62 -2,05 3,49E-09

NM_001084393

DDTL D-dopachrome tautomerase-like -2,52 -2,42 -2,03 1,52E-08

NM_177478 FTMT Ferritin mitochondrial -3,36 -2,32 -2,40 2,45E-08

NM_001190470

MTRNR2L2 MT-RNR2-like 2 -2,96 -2,81 -2,76 8,74E-09

NM_032532 FNDC1 Fibronectin type III domain containing 1

-2,36 -2,32 -2,40 8,95E-08

NM_001170692

CAGE1 Cancer antigen 1 -3,17 -2,26 -2,34 6,31E-08

ENST00000415525

MICA MHC class I polypeptide-related sequence A

-3,03 -2,68 -2,78 4,07E-08

NM_001039361

PRAMEF10 PRAME family member 10 -2,56 -2,42 2,57 4,95E-07

BC021276 IGHD Immunoglobulin heavy constant delta

-2,25 -2,71 -3,12 8,32E-08

NR_002931 CLEC4GP1 C-type lectin domain family 4, member G pseudogene 1

-2,92 -2,98 -2,38 9,17E-07


NM_014219 KIR2DL2 Killer cell immunoglobulin-like receptor, two domains, long cytoplasmic tail, 2

-2,70 -3,09 -2,95 1,63E-07


ENST00000511306

POTEC POTE ankyrin domain family, member C

-2,56 -2,26 -2,71 3,20E-06

NR_036685 KRT19P2 Keratin 19 pseudogene 2 -2,24 -2,31 -2,32 2,88E-06

NM_000104 CYP1B1 Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1

-2,49 -2,10 -2,55 3,83E-06

ENST00000387419

MT-TD Mitochondrially encoded trna aspartic acid

-2,32 -2,16 -2,27 3,02E-06

NM_001001963

OR2L8 Olfactory receptor, family 2, subfamily L, member 8

-3,06 -2,33 -2,26 2,55E-05

XR_246241 CYP4A1 Cytochrome P450, family 4, subfamily A, polypeptide 1

-2,12 -2,13 -2,84 1,16E-05

NM_052941 GBP4 Guanylate binding protein 4 -2,22 -2,35 -2,25 4,52E-05

ENST00000369175


-3,05 -2,88 -2,15 8,06E-06

NM_001201536

TAF1A TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase I, A, 48kda

-3,01 -2,32 -3,02 3,04E-05

ENST00000316529

OR56B4 Olfactory receptor, family 56, subfamily B, member 4

-2,86 -3,04 -2,75 6,58E-05

NM_207645 C11orf87 Chromosome 11 open reading frame 87

-2,72 -2,20 -2,23 3,46E-05

NM_006982 ALX1 ALX homeobox 1 -2,81 -2,11 -2,82 8,58E-05

NM_004093 EFNB2 Ephrin-B2 -2,36 -2,18 -2,30 1,15E-04

NM_006456 ST6GALNAC2

ST6 (alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 2

-2,34 -2,22 -2,55 6,46E-06

NM_005951 MT1H Metallothionein 1H -2,26 -2,08 -2,09 7,96E-05

NM_001220488

CDH13 Cadherin 13 -2,50 -2,61 -2,14 1,83E-04



NM_001165252

KRTAP2-3 Keratin associated protein 2-3 -2,32 -2,25 -2,56 2,62E-04

NM_001242907

TCEB3CL2 Transcription elongation factor B polypeptide 3C-like 2

-2,42 -2,24 -2,46 3,15E-04

AK303593 BST2 Bone marrow stromal cell antigen 2

-2,47 -2,22 -2,15 9,52E-05


NM_001163561


-2,14 -2,86 -2,10 3,72E-04

ENST00000392701

GALNT3 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3

-2,88 -2,73 -2,22 2,05E-04

ENST00000446716

ATG9A Autophagy related 9A -2,21 -2,22 -2,23 6,25E-04


NM_003392 WNT5A Wingless-type MMTV integration site family, member 5A

-2,18 -2,38 -2,28 2,75E-04

NM_032961 PCDH10 Protocadherin 10 -2,52 -2,97 -3,03 1,69E-08

NM_001253727

RXFP1 Relaxin/insulin-like family peptide receptor 1

-2,47 -2,27 -3,11 0,00195225

Resultados 42

NM_000908 NPR3 Natriuretic peptide receptor 3 -3,12 -2,96 -2,16 0,00200613

ENST00000507053

DDX46 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 46

-3,06 -2,36 -3,06 0,00104385

ENST00000394409

PPP2R2B Protein phosphatase 2, regulatory subunit B, beta

-2,42 -2,14 -2,11 0,00227964

ENST00000314332

HIST1H2BG//HIST1H2BF //HIST1H2BE//HIST1H2BI// HIST1H2BC

Histone cluster 1, h2bg -2,14 -2,55 -2,54 0,00229002

NM_001293626

LOC93432 Maltase-glucoamylase (alpha-glucosidase)

-2,26 -2,40 -2,62 7,75E-04

NM_004840 ARHGEF6 Rac/Cdc42 guanine nucleotide exchange factor (GEF) 6

-3,00 -2,76 -3,01 0,0030292

NM_015869 PPARG Peroxisome proliferator-activated receptor gamma

-2,34 -2,45 -2,29 0,00149306

NM_000037 ANK1 Ankyrin 1, erythrocytic -2,25 -2,70 -2,80 0,00326132

NM_001190476

MTRNR2L4 MT-RNR2-like 4 -2,09 -2,39 -2,20 0,00372433

NM_144690 ZNF582 Zinc finger protein 582 -3,49 -3,89 -3,34 0,00392593

NM_018476 BEX1 Brain expressed, X-linked 1 -2,85 -2,39 -3,02 7,76E-04

BC064619 CD24 CD24 molecule -2,66 -2,26 -2,74 1,29E-04

NM_015849 CELA2B Chymotrypsin-like elastase family, member 2B

-2,54 -2,38 -2,29 1,08E-04

NM_001282588

SLAMF7 SLAM family member 7 -2,22 -2,19 -2,82 2,13E-04

NM_021186 ZP4 Zona pellucida glycoprotein 4 -2,45 -2,25 -2,33 1,13E-04

NM_001005186

OR6Q1 Olfactory receptor, family 6, subfamily Q, member 1

-2,10 -2,20 -2,29 3,97E-05

ENST00000451616

PGA5 Pepsinogen 5, group I (pepsinogen A)

-3,12 -2,86 -2,43 1,20E-04

NM_001005324

OR10V1 Olfactory receptor, family 10, subfamily V, member 1

-2,28 -2,55 -2,41 1,23E-04

ENST00000390438

TRAV8-4 T cell receptor alpha variable 8-4

-2,31 -2,43 -2,73 1,44E-04

NM_001204416

RGS6 Regulator of G-protein signaling 6

-2,59 -3,07 -2,98 6,93E-04

ENST00000556551

PTGR2 Prostaglandin reductase 2 -2,31 -4,04 -2,03 5,17E-05

AK097435 TP53TG3//TP53TG3C// TP53TG3B

TP53 target 3//TP53 target 3C//TP53 target 3B

-3,01 -2,19 -2,80 3,05E-04

NM_020995 HPR Haptoglobin-related protein -3,08 -2,60 -3,02 1,54E-04

ENST00000564671

TERF2IP Telomeric repeat binding factor 2, interacting protein

-3,24 -2,64 -3,10 1,54E-04

NM_001100112

MYH2 Myosin, heavy chain 2, skeletal muscle, adult

-2,62 -2,86 -2,34 4,54E-04

ENST00000329882

CSH1//CSHL1//GH1

Chorionic somatomammotropin hormone 1 (placental lactogen)//chorionic somatomammotropin hormone-like 1//growth hormone 1

-2,24 -2,63 -2,13 2,33E-04


ENST00000382349

ONECUT3 One cut homeobox 3 -3,01 -2,63 -3,28 1,57E-04

NM_000554 CRX Cone-rod homeobox -2,58 -2,85 -2,15 1,94E-04

NR_002931 CLEC4GP1 C-type lectin domain family 4, member G

-3,15 -2,19 -2,83 3,83E-04

NM_000762 CYP2A6 Cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6

-2,20 -2,67 -2,34 2,04E-04

AL833447 ZNF285 Zinc finger protein 285 -2,20 -3,21 -2,97 2,00E-04

NM_014219 KIR2DL2 Killer cell immunoglobulin-like receptor, two domains, long cytoplasmic tail, 2

-2,18 -2,22 -2,43 1,95E-04

NM_024795 TM4SF20 Transmembrane 4 L six family member 20

-2,45 -2,37 -3,07 2,02E-04

ENST00000371328

FAM209A//FAM209B

Family with sequence similarity 209, member A//family with sequence similarity 209, member B

-2,95 -2,71 -3,19 8,60E-05

ENST00000390306

IGLV2-23 Immunoglobulin lambda variable 2-23

-2,04 -2,81 -2,66 2,20E-04

NM_001136213

POTEH POTE ankyrin domain family, member H

-3,01 -2,82 -2,38 2,14E-04

NM_001199978

PLSCR2 Phospholipid scramblase 2 -2,67 -2,69 -3,16 2,07E-04

NM_139248 LIPH Lipase, member H -2,64 -2,82 -2,25 9,14E-05

NM_005546 ITK IL2-inducible T-cell kinase -2,16 -2,45 -2,64 2,21E-04

NM_025218 ULBP1 UL16 binding protein 1 -2,17 -2,33 -2,16 2,44E-04

NM_001080538

AKR1B15 Aldo-keto reductase family 1, member B15

-2,01 -2,35 -2,20 1,80E-04

NM_001190487

MTRNR2L6 MT-RNR2-like 6 -3,05 -2,91 -2,36 2,81E-04

NM_000238 KCNH2 Potassium voltage-gated channel, subfamily H (eag-related), member 2

-2,38 -2,10 -2,21 2,84E-04

ENST00000378120

BLACE B-cell acute lymphoblastic leukemia expressed

-2,06 -2,92 -2,09 0,00179338

NM_001001874

TPD52L3 Tumor protein D52-like 3 -2,21 -2,11 -2,44 3,02E-04

NM_001293798

DUX4 Double homeobox 4 -2,72 -2,21 -2,15 3,18E-04

NM_001168647

CNKSR2 Connector enhancer of kinase suppressor of Ras 2

-3,00 -2,29 -3,08 3,12E-04

NM_001077188

HS6ST2 Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2

-2,66 -2,75 -2,57 0,00192307

NM_001009609

SPANXN3 SPANX family, member N3 -3,20 -3,17 -3,13 3,29E-04

NM_004825 CDY2A Chromodomain protein, Y-linked, 2A

-2,50 -3,01 -2,51 5,65E-04

ENST00000451062

FAM197Y9 Family with sequence similarity 197, Y-linked, member 9

-2,88 -2,72 -2,68 5,63E-04

XR_427902 LOC166994 Integral membrane glycoprotein-like

-2,31 -2,92 -2,48 1,52E-08

NM_004465 FGF10 Fibroblast growth factor 10 -2,20 -3,01 -2,19 8,74E-09

NM_003862 FGF18 Fibroblast growth factor 18 -2,95 -2,43 -2,36 6,74E-07

Resultados 44

NM_001200 BMP2 Bone morphogenetic protein 2 -3,16 -2,83 -3,48 5,67E-06

NM_002607 PDGFRA Platelet-derived growth factor receptor alpha

-2,06 -2,81 -2,60 9,01E-06

NM_005559 LAMA1 Laminina alpha 1 -2,58 -2,94 -2,93 1,25E-06

ENST00000267843

FGF7 Fibroblast growth factor 7 -2,40 -2,49 -2,20 0,0110733

NM_000095 COMP Cartilage oligomeric matrix protein

-2,26 -2,74 -2,25 0,01154194

NM_002609 PDGFRB Platelet-derived growth factor receptor beta

-3,12 -2,96 -3,07 1,63E-04

XM_005245820

ALPL Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney

-2,81 -3,39 -2,65 5,67E-06

NM_001040194

AGTRAP Angiotensin II receptor-associated protein

-2,06 -2,09 -2,09 1,52E-03

NM_001078 VCAM1 Vascular cell adhesion molecule 1

-4,20 -4,85 -4,27 0,00392593

Tabla 10 Genes diferencialmente expresados asociados a diferenciación osteoblástica y matriz extracelular

Categoría funcional GO Genes asociados p value

Proceso biológico:

2,61E-06

DIFERENCIACION CELULAR (15 genes):

BMP4, BMP2, IGF1, PTHLH, RUNX2, IGFBP3, SPRY1, FGF10, FGF2, FGF7, FGF18, WNT5A, ALPL,

HHIP, SFRP2

Componente celular:

MATRIZ EXTRACELULAR

1,97E-44

(52 genes): ASPN, PXDN, COL21A1, MMP9, MMP3, MMP1, OGN, DSPP, HMCN1, CTGF, COL12A1, COL11A1, SPON1,

EGFL6, ZP4, COL22A1, ANXA2P3, MMP12, , BGN, VCAM1, ADAMTS3, MFAP4, ADAMTS2, OTOL1, MFAP5, WNT5A, COL28A1, SPOCK1, DCN, VIT,

TIMP3, CPZ, LAMB3, SMOC1, COMP, RPTN, ACAN, PCHD10, BMP4, HAPLN1, COL4A1, TNXB,

C2ORF61, HSPG2, ECM1, LAMA1, FBLN1, CDH3, CDH13

Finalmente, después de la anotación funcional arrojada por DAVID se obtuvo una tabla

asociada a Gene Ontology sobre los términos con p value más representativos

encontrados (Figura 7).


Figura 7 GO TERM (Gene Ontology) - Procesos biológicos (BP)

5.6 Análisis de expresión diferencial por qRT-PCR Se evaluaron algunos de los genes expresados diferencialmente en el array, con mayor

score de enriquecimiento y fold change, usando la técnica de qRT-PCR: COL1A1,

SFRP2, BMP4, PTPRB y HHIP. Los resultados corroboraron lo encontrado en el

Microarray para 4 de los 5 genes escogidos: regulados a la baja BMP4, COL1A1, PTPRB

y a la alta HHIP (solo pacientes 2 y 3). Adicionalmente se midió la expresión de RUNX2,

la cual coincidió con los resultados del array para los pacientes 1 y 2, mostrando infra-

regulación (figura 8).

Resultados 46

Figura 8 Resultados de qRT-PCR: Niveles de expresión de genes según qRT-PCR vs

los resultados del Array para cada paciente al comparar las condiciones de tratamiento

con Idursulfase® versus sin tratamiento. Se enuncia en la parte superior los valores del

Fold change resultado del Array para cada paciente al comparar la condición basal y

posterior al tratamiento con Idursulfase. ST: Sin tratamiento con Idursulfase®; CT: Con

tratamiento.

-2,09-2,66-3,26

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

AP1 AP2 AP3

BMP4

ST

CT

-12,63 -3,36 -2,10

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

AP1 AP2 AP3

HHIP

ST

CT

2,48 2,56 3,22

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

AP1 AP2 AP3

SFRP2

ST

CT

17,33 16,81 7,12

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

AP1 AP2 AP3

COL1A1

ST

CT

0.88

0.44

1.19

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

AP1 AP2 AP3

RUNX2

ST

CT

Discusión 47

6. Discusión

6.1 Identificación del Fenotipo Celular En este estudio se pretende determinar si la acción del fármaco Idursulfase® genera un

cambio en el perfil de expresión génica de fibroblastos periósticos de sutura coronal

extraídos de pacientes con Síndrome de Apert.

De esta forma, lo primero que se corroboró para obtener resultados concluyentes, fue el

tipo celular que se había obtenido en los cultivos, por lo cual se realizó una

caracterización del fenotipo, con el fin de comprobar si las células correspondían a

fibrobastos o a células mesenquimales, debido a que al microscopio, ambas poseen

morfología fibroblastoide. Se utilizó medio DMEM alto en D-Glucosa (4500 mg/mL), lo

cual garantizaba un mejor desempeño y mayor densidad poblacional de fibrobastos

(111).

Lo siguiente que se corroboró fue que durante el tiempo de cultivo existiera la formación

de algún tipo de aglutinamiento celular, lo cual no sucedió en los cultivos de este estudio,

debido a que este tipo de agrupamiento celular es presentado principalmente por las

células mesenquimales (112). Otra característica exhibida por las células cultivadas,

particular de los fibroblastos, fue su lento crecimiento y su rápido proceso de senescencia

(111,113).

Posteriormente se utilizó la técnica de epi-inmunofluorescencia, usando el anticuerpo

Anti-Fibroblast activation protein alpha, específico de fibroblastos y células

mesenquimales, por medio de la cual se pudo evidenciar el origen fibroblastoide de las

células.

Discusión 48

Finalmente, utilizando la técnica de PCR se pudo determinar la presencia de la isoforma

mesenquimal del receptor (FGFR2IIIc) en cDNA obtenido de los fibroblastos; esta

isoforma se transcribe en el mesodermo paraxial y lateral, en el primordio de la

extremidad y el mesénquima de arco branquial y, más tarde, en el músculo y otros tejidos

mesenquimales, incluyendo la periferia de los modelos de cartílago formadoras de hueso

(114). Tiene una afinidad por FGFs diferente a la isoforma epitelial (FGF2IIIb),

reconociendo, bajo condiciones fisiológicas, a FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF21 y

FGF23 (57).

De acuerdo con los argumentos expuestos previamente, se puede tener la certeza de

estar trabajando con fibroblastos de periostio de sutura coronal, los cuales serán

utilizados para realizar diferentes experimentos que determinen su expresión diferencial

después de la exposición al fármaco.

6.2 Cuantificación de GAGs y Actividad enzimática Se realizó la cuantificación de GAGs en orina de pacientes, los cuales no se encontraban

bajo tratamiento con Idursulfase®, para tener una idea general del estado catabólico de

estas moléculas en los pacientes con SA. De acuerdo con Carinci et al., el tejido óseo de

pacientes con SA, presenta un incremento en la cantidad de HS, asociado a una

reducción de la actividad de enzimas que degradan GAGs (11). Los resultados de estos

análisis contradicen estos hallazgos previos, debido a que mostraron una cuantificación

normal de GAGs en los dos pacientes a los que se les pudo realizar el estudio, dado que

el primer paciente (004) falleció después de la intervención quirúrgica. Por otra parte, los

ensayos de actividad enzimática de los pacientes 004 y 008 mostraron un aumento leve

en la actividad de la alfa-L-Iduronidasa. Sin embargo, se debe resaltar que la actividad de

esta enzima, en el paciente 004, se realizó sobre el cultivo celular debido a que no se

contaba con muestra de sangre, calibrándose con los resultados de fibroblastos sin la

mutación, lo cual no permite la comparación entre ensayos. No se logró obtener

suficiente cantidad celular para el ensayo de la actividad enzimática en fibroblastos para

las otras dos muestras.


6.3 Efecto del fármaco Idursulfase® sobre la expresión génica de fibroblastos SA

Los resultados de la evaluación del efecto citotóxico del fármaco Idursulfase® permitieron

mostrar que el modelo in vitro es válido para la evaluación de la acción del fármaco sobre

los perfiles de expresión génica, dado que este no presentó ningún tipo de toxicidad que

pudiera detener o ralentizar el crecimiento o viabilidad celular de los fibroblastos. Con

esto definido, se analizaron los datos arrojados por el Microarray, encontrando 15 genes

diferencialmente expresados asociados a diferenciación osteoblástica, proceso

fundamental en el desarrollo de la osificación temprana y aberrante de la sutura coronal

en el SA.

Utilizando la técnica de qRT-PCR se determinó que cuatro de los cinco genes evaluados,

coincidían con la expresión génica obtenida por medio del microarray, aunque no en el

mismo nivel. Se encontró que BMP4, COL1A1, HHIP y SFRP2 mostraban el mismo

comportamiento por medio de las dos técnicas, lo cual proporciona evidencia clara con

respecto a la expresión diferencial de estos genes en los fibroblastos mutados después

del tratamiento con Idursulfase®. A los 11 genes restantes solo se les midió el cambio en

sus niveles de expresión por medio del microarray.

Runx2 (runt related gene 2) es uno de los factores de transcripción más importantes y

necesarios para el proceso de osteogénesis, y es el responsable de la activación de

genes marcadores de diferenciación osteoblástica (115). Por ejemplo, Runx2

desencadena la expresión de osteocalcina por el mecanismo de unión al elemento en cis

(elemento específico de osteoblastos 2; OSE2 o sitio de unión a Runx) de la región

promotora del gen osteocalcina (116,117). Existen otros genes marcadores de

osteogenesis, como por ejempo ALP, COL-I, sialoproteínas de hueso (BSP),

osteopontina y (OPN), que tienen elementos tipo OSE2 y que están reguladas de una

manera similar por Runx2. Este mecanismo hace hincapié en la posición vital de Runx2

en el estudio de desarrollo de los huesos (116), específicamente de la diferenciación

celular de osteoblastos (118).

En algunos estudios, la deficiencia de Runx2 en ratones evidenció la falta completa de

formación de hueso, debido a la ausencia total de los osteoblastos (119,120). Los

Discusión 50

resultados de este estudio mostraron una disminución en la expresión de Runx2 en las

células fibroblásticas de pacientes con SA después del tratamiento con Idursulfase®, lo

que podría indicar una concomitante disminución de los genes activados por este factor

de transcripción, como es el caso del gen Col1A1, el cual se encontró disminuido en su

expresión después de analizar los resultados de la qRT-PCR.

Debido a que el fármaco degrada moléculas de HS y que éstas están asociadas a

procesos de regulación de vías de señalización que promueven la proliferación y

diferenciación celular, se piensa que este es el mecanismo molecular por el cual el

fármaco disminuye la expresión de RUNX2. En un estudio de Teplyuk et al. donde se

usaron células nulas para RUNX2 con expresión adenoviral del mismo factor de

transcripción, se demostró que este gen regula selectivamente la expresión de

proteoglicanos, aumentando los niveles de expresión de FGFR2, FGFR3, sindecanes, -1,

-2 y -3, versican -1 y exostosin -1 (13). De esta forma, RUNX2 modula el repertorio de

FGFRs, así como a los proteoglicanos que modulan la unión de FGFs a sus receptores.

Los datos encontrados en este estudio indicarían que la disminución en la expresión de

RUNX2 podría afectar la modulación de estos componentes, disminuyendo su

concentración en el espacio extracelular y, por lo tanto, funcionando como un feedback

negativo en el proceso de diferenciación celular. Nuevamente, en el estudio de Teplyuk

et al., encontraron que RUNX2 también controla las enzimas modificadoras de GAGs

(13), indicando que la disminución de su expresión tendría consecuencias sobre la

concentración y distribución de patrones de sulfatación sobre la cadena que compone los

GAGs, modulando su habilidad de unirse selectivamente a diferentes ligandos, como por

ejemplo FGF2, BMPs o WNTs .

BMP4 y BMP2 (Bone Morphogenetic Proteins) son citoquinas de señalización

extracelular con múltiples funciones, que juegan un rol primordial en la diferenciación

específica hacia el linaje osteoblástico y la formación posterior de hueso endocondral e

intramembranoso al inducirla por medio de BMP7 y BMP9 (121). Ambas citoquinas

pueden activar p38 y ERK-MAPK, pero no JNK, moléculas de señalización intracelular

estrechamente asociadas a procesos de diferenciación celular (122). Un estudio llevado

a cabo en modelos murinos, realizado por Holmes et al., sugirió que el aumento de

señales extracelulares provenientes del mesénquima de la sutura mutada (donde


predominan BMP4 y FGF2) aumentaría la osteogénesis en esta zona, disminuyendo la

proliferación celular y aumentando la diferenciación osteoblástica (51).

Recientes estudios en conejos han mostrado que niveles elevados de BMP2 causan

fusión prematura de las suturas craneales (123) y debido a que la señalización de BMP

ocurre corriente abajo de la de FGF durante el crecimiento del cráneo, la manipulación de

la vía BMP podría ser una terapia efectiva para el tratamiento de las craneosinostosis

(124). BMP2 promueve la diferenciación osteoblástica al inducir la expresión de AKT, la

cual mejora la función y la actividad transcripcional de RUNX2 (125). Por otra parte, la

actividad de las moléculas de BMP se encuentra regulada extracelularmente por un

complejo compuesto por moléculas secretadas y de superficie celular, entre ellas Noggin

y moléculas de HS (124,126–128). Con respecto a esto, Coussens et al. demostraron

que Glipican 1 y Glipican 2 (proteoglicanos de HS situados en membrana celular) se

encuentran expresados en las suturas craneales en condiciones fisiológicas, y que su

concentración disminuye durante la fusión prematura de las suturas en niños con

craneosinostosis (129).

En el SA se ha observado evidencia de una disminución de los niveles de moléculas

antagonistas de la vía BMP, lo que estaría asociado a un aumento de la actividad de

BPM4 en osteoblastos y a una sobre-diferenciación celular (130,131). Nuestros datos

reportan una regulación a la baja de estos genes luego del tratamiento con Idursulfase®,

proponiendo así una disminución de la expresión de BMP4, molécula con un importante

rol en los procesos de osificación.

La señalización canónica WNT, así como RUNX2, también actúa regulando la

diferenciación osteogénica. Sin embargo, RUNX2 es el primer factor de transcripción

requerido para la determinación del linaje osteoblástico, mientras que WNT compromete

definitivamente a las células progenitoras hacia osteoblastos en estadios posteriores,

bloqueando así su diferenciación en condrocitos (118).

La señalización WNT juega roles críticos en el desarrollo, crecimiento y homeostasis del

sistema esquelético; la unión de WNT a complejos receptores activa vías de señalización

canónicas dependientes de β-Catenina o vías no canónicas independientes de β-

Discusión 52

Catenina (132,133). Los resultados hallados en este estudio indican una disminución en

la expresión de WNT5 después del tratamiento con Idursulfase® a fibroblastos de

pacientes con SA. WNT5 (subfamilia WNT) hace parte de las moléculas WNT

independientes de β-Catenina (vía no canónica) y activa otras vías de señalización, tales

como WNT/Ca2+ y WNT/PCP (planar cell polarity) (134). De acuerdo a estos

antecedentes, en un estudio realizado por Nemoto et al. se demostró que la

diferenciación osteoblástica mediada por BMP-2 está asociada a una mayor expresión de

Wnt5a y ROR2 in vivo e in vitro, y que el silenciamiento de la expresión génica de Wnt5a

y ROR2 resulta en la supresión de fosfatasa alcalina (ALP) y de osteocalcina (OCN), lo

que sugiere que la señalización mediada por Wnt5a y ROR2 es un determinante

fundamental para la diferenciación osteoblástica mediada por BMP-2 (135).

Estudios de Okamoto et al. también mostraron que la falta de WNT5 en células de linaje

osteoblástico deteriora la vía de señalización WNT/β-Catenina, debido a que reduce la

expresión de Lrp5 y Lrp6 (low density lipoprotein receptor-related protein -5 y -6),

receptores que se unen individualmente al receptor Frizzled para formar un único

complejo receptor de WNT y que generan la acumulación de β-Catenina y su posterior

translocación al núcleo para iniciar la transcripción de los genes blanco (136). De

acuerdo con los estudios citados, el fármaco Idursulfase® estaría contribuyendo a la

resolución del fenotipo de la craneosinostosis mediante dos vías: la primera, por medio

de la disminución de la expresión de WNT5 y, por lo tanto, la concomitante disminución

de la mineralización de matriz extracelular, y la segunda, al deteriorar la vía de

señalización canónica de WNT, aumentando la acumulación de β-Catenina y su actividad

transcripcional.

Igf1 es importante para una gran variedad de procesos de crecimiento y diferenciación en

distintos tejidos. Específicamente, Igf1 es capaz de modular el crecimiento óseo a través

de mecanismos endocrinos/paracrinos y autocrinos, activando corriente abajo del

receptor las vías de señalización PI3K y ERK/MAPK, las cuales son necesarias para

controlar la diferenciación celular (137). Algunos síndromes por deficiencia de insulina,

como por ejemplo la diabetes mellitus tipo 1 y el Síndrome de Laron, causadas por

deficiencias de Igf1, exhiben en los pacientes densidad mineral ósea reducida y aumento

del riesgo de fracturas.(138).


Por el contrario, la expresión aumentada de Igf1 estimula el crecimiento del hueso

trabecular y cortical y la mineralización de la matriz celular (139). La maduración de los

osteoblastos se puede dividir en proliferación, maduración y mineralización de matriz

(140). Un estudio de Zhang et al. en osteoblastos de calvaria demostró que el

tratamiento con Igf1 mejoraba la fase temprana de la proliferación celular, mientras que

inhibía la expresión génica de osteocalcina, un marcador de diferenciación celular en

osteoblastos (141). Los datos de expresión diferencial de este estudio mostraron un

aumento en la expresión de Igf1 en los fibroblastos de sutura craneal después del

tratamiento con Idursulfase®, lo cual indicaría un aumento de la proliferación celular

temprana y una disminución del proceso de diferenciación celular, determinado por la

supra-regulación de osteocalcina y, por lo tanto, reduciendo la mineralización extracelular

y previniendo la osificación temprana de la sutura.

IGFBP3 hace parte de la familia de proteínas de unión a factores de crecimiento tipo

insulina, la cual cumple un rol integral en la modificación de los efectos de los IGFs en

una gran variedad de tipos celulares (142). Sin embargo, IGFBP3 también puede realizar

otras funciones, independientes de las típicas atribuidas a esta familia, dependiendo del

contexto celular, como por ejemplo la inhibición del crecimiento celular y la estimulación

de la apoptosis y la diferenciación celular (143).

En un estudio de Li et al. se demostró la interacción y co-localización de IGFBP3 y VDR

(Vitamin D Receptor) en el núcleo; además mostraron que IGFBP3 inhibe la regulación

transcripcional de VDR mediada por 1,25(OH)2D3, la expresión de osteocalcina y la

actividad de ALP en células osteoblásticas (144). En condiciones fisiológicas, VDR se

une a 1,25(OH)2D3 para regular la expresión de genes blanco, entre los que se

encuentran genes asociados a diferenciación osteoblástica, por medio del detenimiento

del ciclo celular, la consecuente maduración de la matriz extracelular y, por último, la

mineralización del hueso (145).

De acuerdo con la evidencia presentada previamente, el aumento de la expresión de

IGFBP3 en las células fibroblásticas de pacientes con SA después del tratamiento con

Idursulfase® promovería indirectamente una disminución de la mineralización de la

matriz extracelular mediada por la desregulación de VDR, proceso moderado por la

Discusión 54

reducción de la actividad de ALP, de la expresión de osteocalcina y de otros genes

asociados a diferenciación celular, lo cual ayudaría a disminuir la osificación temprana

presentada en estos pacientes. Así mismo, se pudo comprobar una disminución en la

expresión de ALP (importante marcador de osteogénesis) después del tratamiento con

Idursulfase®, aportando evidencia contundente acerca de la desaceleración del proceso

de diferenciación osteoblástica.

Corriente abajo de FGFR2, la cascada de señalización intracelular se encuentra

controlada fuertemente por proteínas reguladoras especializadas, como por ejemplo las

proteínas SPRY (Sprouty), encargadas de operar como reguladoras negativas

intracelulares de FGFRs, entre otros receptores, interactuando estrechamente con GRB2

para inhibir la vía RAS/MAPK y para regular la vía PI3K/AKT (146). Estas proteínas se

encuentran ubicadas de forma ubicua tanto en el embrión en desarrollo, como en adultos

(147,148). Después del tratamiento con Idursulfase®, las células SA sobre-expresaron el

gen SPRY1, lo que podría implicar la regulación negativa de vías de señalización

intracelular asociadas a diferenciación celular.

FGFR2IIIc se encuentra predominantemente en tejido mesenquimal y neural y es

activado por ligandos derivados de epitelio tales como FGFs -2, -4, -8, -9, -18 y -20. Por

el contrario, FGFR2IIIb se encuentra expresado normalmente por células epiteliales y es

activado por FGFs derivados de tejido mesenquimal: -3, -7, -10 y -22 (149–151). Cuando

alguna de las mutaciones causantes del Síndrome de Apert está presente en estos

receptores, la consecuencia radica en la modificación de su afinidad por los ligandos,

generando mayor afinidad por unos o pérdida de la especificidad (80,81,152,153).

En el caso particular de FGF10, un estudio de Hajihosseini et al. comprobó en ratones

FGF10-/-, FGF10+/- y FGFR2IIIc+/S252W el rescate de los defectos asociados al

esternón, craneofaciales, y vicerales observados en los controles FGFR2IIIc+/S252W,

demostrando la importancia del rol de FGF10 en la fisiopatología de la craneosinostosis y

otras patologías asociadas al SA (71). En los resultados de expresión diferencial

obtenidos después del tratamiento con Idursulfase®, se encontró una disminución en la

expresión de FGF10, lo que podría significar un elemento más a favor de la

desaceleración de la diferenciación celular de fibroblastos de sutura en pacientes con SA,

dado que esta disminución restauraría los niveles normales de señalización corriente


abajo de FGFR2, aumentando los niveles de fosforilación de la p38 y disminuyendo los

de p44/p42.

Los altos niveles de FGF están asociados con la diferenciación osteogénica. En otras

palabras, en las suturas normales hay expresión diferencial de FGF con altos niveles

encontrados en la región diferenciada y bajos niveles en resto de la sutura. En el

momento de la fusión de la sutura, se pueden observan niveles incrementados de FGF2

(154). Los datos arrojados por el Microarray en este estudio mostraron un aumento en la

expresión de FGF2, pero es atribuible al hecho de que se usó este factor de crecimiento

para estimular el cultivo celular antes de la extracción de RNA. Sin embargo, otros FGFs

mostraron una disminución en la expresión después del tratamiento con Idursulfase®,

como es el caso de FGF7 y FGF18.

Conclusiones 56

Conclusiones En este estudio se presenta un perfil de expresión génica diferencial estadísticamente

significativo en un modelo celular que expresa la isoforma mesenquimal del receptor

FGFR2 (FGFR2IIIc) en un grupo de pacientes con SA después de tratamiento con

Idursulfase®. Los hallazgos indican que el efecto del tratamiento se asocia con una

expresión diferencial génica relacionada particularmente con matriz extracelular y con

procesos de señalización celular, lo que podría tener un impacto determinante en el

desarrollo del tejido subperióstico craneal, dado que son estos procesos los que guían

factores como la diferenciación celular, entre otros, llevándolo a un aumento de la

mineralización y a la generación de una respuesta inflamatoria elevada. Estos resultados

están asociados a la presencia de redes génicas y procesos celulares implicados en la

modificación o recuperación parcial de los algunos procesos patológicos del SA.

57 Limitaciones

Limitaciones Durante el desarrollo del proyecto, la mayor dificultad se presentó durante la consecución

de pacientes para la obtención de las muestras necesarias. El primer paciente

lamentablemente falleció y no fue posible obtener muestra de sangre ni orina, siendo

necesario cuantificar los GAGs y medir la actividad enzimática a partir de cultivo celular

del paciente. De igual forma, muchos pacientes que habían aceptado participar en el

estudio no pudieron hacerlo debido a la cancelación repentina de sus cirugías

correctivas, lo cual representaba el aplazamiento indefinido del procedimiento.

Por otro lado, el manejo de los cultivos celulares fibroblásticos también implicó un reto

importante. Los fibroblastos tienden a crecer a una tasa baja y llegan a la etapa de

senescencia con rapidez, por lo cual se dificultó el mantenimiento, congelamiento y

descongelamiento de los mismos. Muy pocos cultivos primarios conservados a -80ºC

fueron descongelados con éxito, debido a las características de estas células, por lo que

las oportunidades para realizar los experimentos se vieron reducidas drásticamente,

pudiendo realizar sólo los experimentos más representativos para el estudio.

58 Perpectivas

Perspectivas

• En el conocimiento del campo de estudio:

Este estudio permitirá aportar más evidencia sobre la importancia de los GAGs en los

procesos de interacción entre el FGFR2 y su ligando en el SA.

Por otro lado nos acercará a la creación de nuevas hipótesis sobre la fisiopatología de

este síndrome.

Este estudio, pionero a nivel mundial, intentará proponer al HS, como un blanco

terapéutico en el manejo del SA, iniciando en un modelo de tipo in vitro, que deberá ser

replicado y validado en modelo animal.

• Productividad, competitividad e impacto regional:

Este trabajo nos permitirá ingresar en la dinámica de investigaciones in vitro en este

tema, convirtiéndonos en pioneros regionales y acercando nuestra investigación a

espacios traslacionales, donde en un futuro cercano podamos aplicar estos resultados al

ámbito clínico.

• En la calidad de vida de la población:

Con el conocimiento sobre las vías moleculares relacionadas a la fisiopatología de del

síndrome de Apert, en un futuro se podrán establecer nuevos abordajes diagnósticos, de

seguimiento y terapéuticos precisos, empleando elementos moleculares para la toma de

estas decisiones.

59 Anexo A: Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación

A. Anexo: Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación

EXPLICACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN AL PACIENTE Y SU FAMILIA

OBJETIVO- ¿QUÉ BUSCA ESTE ESTUDIO?

El síndrome de Apert es una enfermedad genética causado por mutaciones en el gen FGFR2, sin embargo existe aún una gran cantidad de interrogantes sobre cómo se presenta el daño en las células afectadas de la región cráneal. Adicional a esto, no existe en la actualidad una terapia farmacológica que permita disminuir o eliminar la sintomatología de la enfermedad. Este estudio busca explorar algunas vías moleculares que intervienen en el desarrollo de esta patología y por otro lado, proponer un abordaje farmacológico para mejorar el ambiente celular de ese tejido afectado

PROCEDIMIENTO-¿QUÉ LE PEDIMOS?

Su hijo, o menor a cargo, tiene características que hace pensar que puede cursar con el Síndrome de Apert, el cual estamos estudiando.

Si permite su participación en este estudio, se procederá a tomar una muestra de sangre (7cc en el brazo) y unas muestras de orina, cuando el pacientes este hospitalizado y usando las vías venosas por donde ingresa el suero. Además se tomará un fragmento de tejido óseo craneal, que sea descartado en el momento en que se esté corrigiendo quirúrgicamente el defecto en su hijo. Por lo tanto, todas estas muestras se tomaran al mismo tiempo en que se está siendo manejando hospitalariamente al paciente.

Las muestras serán enviadas posteriormente al Instituto de Genética de la Universidad Nacional para la realización de los estudios. Luego de ello, con las muestras de sangre, orina y tejido de hueso, continuaremos hacia la búsqueda de la mutación P253R en el gen FGRF2 y posterior a ello el análisis


de varios procesos moleculares en dicha muestras.

El riesgo de la toma de esta muestra de sangre y orina es mínimo y no se han descrito situaciones adversas que afecten la salud su hijo como consecuencia de este procedimiento.

RIESGOS E INCOMODIDADES: La participación en este estudio representa riesgo mínimo para la salud eintegridadde suhijo yaque seemplearanmuestrade tejidosque se tomanenprocedimientosprogramadopara el manejo de la condición clínica presente en el paciente y las molestias y efectos adversos estaránrepresentados exclusivamente por la toma de muestras, y como se explicó arriba los riesgos son pocos ypuedenincluirdolorleve,infecciones,sangradoy/ohematomas(morados).

BENEFICIOS ADICIONALES: Este estudio tiene para usted el (los) siguiente(s) beneficio(s) adicional(es): 1.Detección de la mutación P253R del gen FGFR2 en su hijo o menor a cargo, en el caso que la tuviese. 2.Proporcionar más información a la comunidad científica, sobre los mecanismos de desarrollo de estaenfermedad 3. Colaborar en el proceso de propuesta de desarrollo de terapias en este tipo decraneosinostosis(Defectocraneal)

MANEJODERESULTADOS:Losresultadosdelaspruebasseránfacilitadosaustedsiasílodesea.

OTRA INFORMACIÓN PERTINENTE: En el curso del estudio se le suministrará a usted cualquier tipo deinformación nueva, derivada de éste, que pueda modificar su participación en el mismo. Las muestras einformaciónqueustedaportóseránempleadasparaeldesarrollodeESTAinvestigación.

Soloenalgunoscasos,lainformaciónymuestrassuministradasporustedsepuedenemplearenotrosestudiosclínicosodecienciasbásicas.SIEMPRESELEPEDIRÁunaautorizaciónporescritoencasodequeustedautoricequesuinformaciónolainformaciónymuestrasDELMENORASUCARGO,seanempleadasenotrosestudios.Por ello le solicitamos que revise el formato de AUTORIZACIÓN donde usted puede aprobar o rechazar elempleodelainformaciónymuestrasenlascircunstanciasallímencionadas.

Ustedpodrá,enelmomentoquelodesee,retirarlasmuestrasdelalmacenamiento.

Siustedcreequehasufridounalesiónrelacionadaconlainvestigaciónodeseacualquierinformaciónadicional,porfavorllamealosteléfonosmencionadosmásadelante.INVITACIONAPARTICIPACIONENELPROYECTO.

Ustedysuhijoomenoracargo,estásiendoinvitadoaparticiparenunestudiodeinvestigaciónpropuestoporelInstitutodeGenéticaHumanadeUNIVERSIDADNACIONALDECOLOMBIAFUNDACIONUNIVERSITARIADECIENCIASDELASALUDyelHOSPITALINFANTILUNIVERSITARIODESANJOSE.Esmuyimportantequeustedleayentiendaciertospuntosimportantesenlarealizacióndeesteestudio:

(a) a)Suparticipaciónenesteestudioestotalmentevoluntaria.(b) (c) (b) Esteestudiopuedegenerarbeneficiosdirectos sobreusted y su familia, yaqueenalgunospacientes se

detectaránmutacionesenelgenFGFR2.ConlosdatosobtenidosenesteestudiopodremosconocermássobreeldesarrollodelSíndromedeAPERTysepodríaafuturoofrecerdeterminadasalternativasterapéuticas.

(d) (e) (c)Ustedennombredelmenorasucargopuederetirarsedelestudiocuandolodesee.Larevocatoriadeeste

consentimiento no tendrá perjuicio alguno sobre la relación médico-paciente ni consecuencia alguna en la

Anexo A. Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación

61

calidaddeatenciónmédicaqueselesuministre.

(f) (g) (d) Ninguna persona involucrada en este estudio recibirá beneficios económicos como pago por su

participación.(h) (i) (e)Esteestudionotieneningúninteréseconómicoporpartenuestraodelasinstitucionescolaboradoras.(j) (k) (f)Participarenesteestudionotieneningúncostoparausted.(l) (m) (g) CONFIDENCIALIDAD: Los registros con la información de cada individuo permanecerán archivados en el

Instituto de Genética de la Universidad Nacional. Las historias médicas, los resultados de exámenes y lainformaciónqueustednos ha dado sonde carácter absolutamente confidencial, demanera que, solamenteustedyelequipodeinvestigacióntendráaccesoaestosdatos.Porningúnmotivosedivulgaráestainformaciónsinsuconsentimiento.Cuandolosresultadosdeesteestudioseanreportadosenrevistasmédicascientíficasoencongresoscientíficos,losnombresdetodosaquellosquetomaronparteenelestudioseránomitidos.

(n) (o) (h) La naturaleza de este estudio, sus riesgos, sus inconvenientes, incomodidades y cualquier información

importanteestáresumidayexplicadaporelgrupoinvestigador.Sitienealgúninterrogantesobreelestudioporfavor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores, quien con mucho gusto, contestará suspreguntas.

Para mayor información, llame en Colombia al 3165000 EXT 11631, para comunicarse con el investigador Dr. Harvy Velasco Parra, en el Instituto de Genética Humana de la Universidad Nacional, Carrera 44 #26-85 y al correo por Internet: [email protected],

Adicionalmente,siustednoestásatisfechoconlaformacomoseestáconduciendoesteestudiootieneotraspreguntasconcernientesasusderechoscomoparticipantedelestudio,porfavorcontactealmismoteléfonoocorreoelectrónicomencionadosantes.

AUTORIZACION

El ingreso a este estudio es voluntario. Usted tiene derecho a retirarse del estudio en cualquier momento. Los investigadores guardarán las muestras de sangre y tejido para realizar estudios sobre el IMPACTO DE LA DEGRADACION DE HEPARAN SULFATO EN LOS PERFILES DE EXPRESION DOWNSTREAM DE FIBROBLASTOS DE PACIENTES CON MUTACIONES P2353R EN FGFR2

Una vez terminado este trabajo, requerimos de su autorización para:

• Ser almacenadas para emplearlas en estudios de investigación nacionales e internacionales de patologías relacionadas con la entidad objeto de esta investigación (Sindrome de Apert), siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación y los del menor a mi cargo. En el caso que su respuesta sea afirmativa, el

�Si �No


grupo de investigación se compromete a contactarse con usted y solicitar una nueva autorización, previa autorización del comité de Ética de la Universidad Nacional y de Ética e Investigación en Seres Humanos del Hospital Infantil Universitario de San José para proteger la integridad del sujeto de estudio

• Ser desechadas una vez terminado este trabajo, mediante incineración y se tendrá un registro de desecho de muestras

�Si �No

AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL

ESTUDIO: “IMPACTO DE LA DEGRADACION DE HEPARAN SULFATO EN LOS

PERFILES DE EXPRESION DOWNSTREAM DE FIBROBLASTOS DE PACIENTES CON

MUTACIONES P2353R EN FGFR2” Yo, _________________________________________identificado con documento numero

________________ de _____________, acepto voluntariamente que se me tome a mi o a mi

hijo (a) o menor a mi cargo, cuyo nombre es

_______________________________________________________________ muestras

de__________________________________________, con el fin de almacenarlas para el

estudio molecular en el Síndrome de Apert. Así mismo, declaro que se me ha explicado Y HE

ENTENDIDO la presencia de los riesgos y el manejo que se le dará al material de muestra.

_____________________________

Firma del padre

Nombre:______________________

Identif: _______________________

Teléfono: _____________________

_____________________________

Firma de la madre Nombre: _______________________ Identif: _________________________ Teléfono:_______________________

_____________________________ __________________________________

Responsable del menor Sujeto de investigación (mayor de 7 años)

Nombre:______________________

Identif: _______________________

Teléfono: _____________________

_____________________________ _____________________________

Anexo A. Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación

63

Testigo 1 Testigo 2

Nombre:______________________ Nombre:______________________

Identif: _______________________ Identif: _______________________

Teléfono: _____________________ Teléfono: _____________________

_____________________________ Fecha: _______________________

Investigador

Bibliografía 64

Bibliografía 1. Park WJ, Theda C, Maestri NE, Meyers GA, Fryburg JS, Dufresne C, et al.

Analysis of phenotypic features and FGFR2 mutations in Apert syndrome. Am J Hum Genet. 1995;57:321–8.

2. Cohen MM, Kreiborg S, Lammer EJ, Cordero JF, Mastroiacovo P, Erickson JD, et al. Birth prevalence study of the apert syndrome. Am J Med Genet Part A [Internet]. 1992;42(5):655–9. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/ajmg.1320420505%5Cnpapers3://publication/doi/10.1002/ajmg.1320420505%5Cnfile:///Users/Joel/Documents/Library.papers3/Articles/1992/Cohen/Am. J. Med. Genet. 1992 Cohen.pdf

3. Martínez-Abadías N, Heuzé Y, Wang Y, Jabs EW, Aldridge K, Richtsmeier JT. FGF/FGFR signaling coordinates skull development by modulating magnitude of morphological integration: Evidence from apert syndrome mouse models. PLoS One. 2011;6(10).

4. McDowell LM, Frazier BA, Studelska DR, Giljum K, Chen J, Liu J, et al. Inhibition or activation of apert syndrome FGFR2 (S252W) signaling by specific glycosaminoglycans. J Biol Chem. 2006;281:6924–30.

5. Wang Y, Sun M, Uhlhorn VL, Zhou X, Peter I, Martinez-Abadias N, et al. Activation of p38 MAPK pathway in the skull abnormalities of Apert syndrome Fgfr2(+P253R) mice. BMC Dev Biol. 2010;10:22.

6. Lu C, Huguley S, Cui C, Cabaniss LB, Waite PD, Sarver DM, et al. Effects of FGFR Signaling on Cell Proliferation and Differentiation of Apert Dental Cells. Cells Tissues Organs. 2015;201(1):26–37.

7. Du X, Xie Y, Xian CJ, Chen L. Role of FGFs/FGFRs in skeletal development and bone regeneration. Journal of Cellular Physiology. 2012. p. 3731–43.

8. Su N, Jin M, Chen L. Role of FGF/FGFR signaling in skeletal development and homeostasis: learning from mouse models. Bone Res [Internet]. 2014;2(April):14003. Available from: http://www.nature.com/articles/boneres20143

9. Oberoi S, Hoffman WY, Vargervik K. Craniofacial team management in Apert syndrome. Am J Orthod Dentofac Orthop. 2012;141.

10. Agochukwu NB, Solomon BD, Muenke M. Impact of genetics on the diagnosis and clinical management of syndromic craniosynostoses. Child’s Nerv Syst.

Bibliografía 65

2012;28:1447–63.

11. Bodo M, Carinci F, Baroni T, Giammarioli M, Bellucci C, Bosi G, et al. Apert’s syndrome: differential in vitro production of matrix macromolecules and its regulation by interleukins. Eur J Clin Invest [Internet]. 1997;27(1):36–42. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9041375

12. Pan J, Qian Y, Zhou X, Lu H, Ramacciotti E, Zhang L. Chemically oversulfated glycosaminoglycans are potent modulators of contact system activation and different cell signaling pathways. J Biol Chem. 2010;285:22966–75.

13. Teplyuk NM, Haupt LM, Ling L, Dombrowski C, Foong KM, Nathan SS, et al. The osteogenic transcription factor Runx2 regulates components of the fibroblast growth factor/proteoglycan signaling axis in osteoblasts. J Cell Biochem. 2009;107:144–54.

14. Shimokawa K, Kimura-Yoshida C, Nagai N, Mukai K, Matsubara K, Watanabe H, et al. Cell Surface Heparan Sulfate Chains Regulate Local Reception of FGF Signaling in the Mouse Embryo. Dev Cell. 2011;21:257–72.

15. Pellegrini L. Role of heparan sulfate in fibroblast growth factor signalling: A structural view. Current Opinion in Structural Biology. 2001. p. 629–34.

16. Brown A, Robinson CJ, Gallagher JT, Blundell TL. Cooperative heparin-mediated oligomerization of fibroblast growth factor-1 (FGF1) precedes recruitment of FGFR2 to ternary complexes. Biophys J. 2013;104:1720–30.

17. Cunningham ML, Seto ML, Ratisoontorn C, Heike CL, Hing A V. Syndromic craniosynostosis: From history to hydrogen bonds. Orthod Craniofacial Res. 2007;10(2):67–81.

18. Garza RM, Khosla RK. Nonsyndromic craniosynostosis. Seminars in Plastic Surgery. 2012. p. 53–63.

19. Wheaton SW. Two specimens of congenital cranial deformity in infants associated with fusion of the fingers and toes. Path Soc Lon. 1894;45:238–41.

20. Apert M. De l’acrocephalosyndatylie. Bull Mem Soc Med Hop Paris. 1906;23:1310–30.

21. Chen L, Li D, Li C, Engel A, Deng C-X. A Ser252Trp [corrected] substitution in mouse fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) results in craniosynostosis. Bone. 2003;33(2):169–78.

22. Wang Y, Xiao R, Yang F, Karim BO, Iacovelli AJ, Cai J, et al. Abnormalities in cartilage and bone development in the Apert syndrome FGFR2(+/S252W) mouse. Development. 2005;132(15):3537–48.

23. Carinci F, Pezzetti F, Locci P, Becchetti E, Carls F, Avantaggiato A, et al. Apert and Crouzon syndromes: clinical findings, genes and extracellular matrix. J Craniofac Surg. 2005;16(3):361–8.

24. Johnson D, Wilkie AOM. Craniosynostosis. Eur J Hum Genet. 2011;19(4):369–76.


25. Di Ieva A, Bruner E, Davidson J, Pisano P, Haider T, Stone SS, et al. Cranial sutures: A multidisciplinary review. Child’s Nervous System. 2013. p. 893–905.

26. Flaherty K, Singh N, Richtsmeier JT. Understanding craniosynostosis as a growth disorder. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2015;5(August).

27. Governale LS. Craniosynostosis. Pediatric Neurology. 2015. p. 394–401.

28. Pagnoni M, Fadda MT, Spalice A, Amodeo G, Ursitti F, Mitro V, et al. Surgical timing of craniosynostosis: What to do and when. J Cranio-Maxillofacial Surg. 2014;42(5):513–9.

29. Nagaraja S, Anslow P, Winter B. Craniosynostosis. Clinical Radiology. 2013. p. 284–92.

30. Melville H, Wang Y, Taub PJ, Jabs EW. Genetic basis of potential therapeutic strategies for craniosynostosis. American Journal of Medical Genetics, Part A. 2010. p. 3007–15.

31. Kirmi O, Lo SJ, Johnson D, Anslow P. Craniosynostosis: A Radiological and Surgical Perspective. Semin Ultrasound, CT MRI. 2009;30(6):492–512.

32. Derderian C, Seaward J. Syndromic craniosynostosis. Seminars in Plastic Surgery. 2012. p. 64–75.

33. Behr B, Longaker MT, Quarto N. Differential activation of canonical Wnt signaling determines cranial sutures fate: A novel mechanism for sagittal suture craniosynostosis. Dev Biol. 2010;344(2):922–40.

34. Tovetjärn R, Tarnow P, Maltese G, Fischer S, Sahlin P-E, Kölby L. Children with Apert syndrome as adults: a follow-up study of 28 Scandinavian patients. Plast Reconstr Surg [Internet]. 2012;130(4):573e–577e. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23018718

35. Surman TL, Logan RM, Townsend GC, Anderson PJ. Oral features in Apert syndrome: A histological investigation. Orthod Craniofacial Res. 2010;13(1):61–7.

36. Suzuki H, Suda N, Shiga M, Kobayashi Y, Nakamura M, Iseki S, et al. Apert syndrome mutant FGFR2 and its soluble form reciprocally alter osteogenesis of primary calvarial osteoblasts. J Cell Physiol. 2012;227(9):3267–77.

37. Yeh E, Fanganiello RD, Sunaga DY, Zhou X, Holmes G, Rocha KM, et al. Novel Molecular Pathways Elicited by Mutant FGFR2 May Account for Brain Abnormalities in Apert Syndrome. PLoS One. 2013;8(4).

38. Velásco HM, Ramirez D, Pineda T, Piñeros L, Vinasco T, Contreras G, et al. Análisis genotípico de 11 pacientes colombianos con Síndrome de Apert. 2013;61(1):35–40. Available from: http://www.bdigital.unal.edu.co/37695/1/39628-176894-1-PB.pdf

39. Balding DJ, Bishop M, Cannings C. Handbook of Statistical Genetics: Third Edition. Handbook of Statistical Genetics: Third Edition. 2008. 1-1476 p.

Bibliografía 67

40. Raposo-Amaral CE, Raposo-Amaral CA, Garcia Neto JJ, Farias DB, Somensi RS. Apert syndrome: quality of life and challenges of a management protocol in Brazil. J Craniofac Surg [Internet]. 2012;23(4):1104–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22777480

41. Costa FWG, Rodrigues RR, Batista ACB, Ribeiro TR, Pereira KMA. Multiple radiopaque mandibular lesions in a patient with apert syndrome. J Endod. 2012;38(12):1639–43.

42. Kreiborg S, Cohen MM. Ocular manifestations of Apert and Crouzon syndromes: qualitative and quantitative findings. J Craniofac Surg. 2010;21(5):1354–7.

43. Stavropoulos D, Tarnow P, Mohlin B, Kahnberg KE, Hagberg C. Comparing patients with Apert and Crouzon syndromes-clinical features and cranio-maxillofacial surgical reconstruction. Swed Dent J. 2012;36(1):25–34.

44. Rajenderkumar D, Bamiou D, Sirimanna T. Management of hearing loss in Apert syndrome. J Laryngol Otol. 2005;119(5):385–90.

45. Rajenderkumar D, Bamiou D-E, Sirimanna T. Audiological profile in Apert syndrome. Arch Dis Child. 2005;90(6):592–3.

46. Varoli FP, Santos KCP, Costa C, Oliveira JX. Apert syndrome: clinical and radiographic features and case report^ien; Síndrome de Apert: características clínicas e radiográficas e relato de caso^ipt. Rev.odonto ciênc [Internet]. 2011;26(1):96–9. Available from: http://caioba.pucrs.br/fo/ojs/index.php/fo/article/view/7795/6225

47. Jia F, Jiang H, Du L, Niu C. Apert syndrome: A case report. Proc 2011 Int Conf Hum Heal Biomed Eng. 2011;150–2.

48. Esparza J, Hinojosa J, García-Recuero I, Romance A, Pascual B, Martínez de Aragón A. Surgical treatment of isolated and syndromic craniosynostosis. Results and complications in 283 consecutive cases. Neurocirugia (Astur). 2008;19(6):509–29.

49. Hardin KA. Syndromic craniosynostosis: complicated airway obstruction calls for progressive strategies in surgical management. Expert Rev Respir Med. 2010;4(3):315–9.

50. Allam KA, Wan DC, Khwanngern K, Kawamoto HK, Tanna N, Perry A, et al. Treatment of apert syndrome: a long-term follow-up study. Plast Reconstr Surg. 2011;127(4):1601–11.

51. Holmes G. Mouse models of Apert syndrome. Child’s Nerv Syst. 2012;28(9):1505–10.

52. Baxevanis AD. Searching online mendelian inheritance in man (OMIM) for information on genetic loci involved in human disease. Curr Protoc Bioinforma. 2012;(SUPPL.37).

53. Wilkie AO, Slaney SF, Oldridge M, Poole MD, Ashworth GJ, Hockley AD, et al. Apert syndrome results from localized mutations of FGFR2 and is allelic with


Crouzon syndrome. Nat Genet. 1995;9(2):165–72.

54. Marie PJ, Coffin JD, Hurley MM. FGF and FGFR signaling in chondrodysplasias and craniosynostosis. J Cell Biochem. 2005;96(5):888–96.

55. Brooks a N, Kilgour E, Smith PD. Molecular pathways: fibroblast growth factor signaling: a new therapeutic opportunity in cancer. Clin Cancer Res [Internet]. 2012;18(7):1855–62. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22388515

56. Kelleher FC, O’Sullivan H, Smyth E, McDermott R, Viterbo A. Fibroblast growth factor receptors, developmental corruption and malignant disease. Carcinogenesis. 2013. p. 2198–205.

57. Turner N, Grose R. Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer. 2010;10(2):116–29.

58. Nguyen TH, Kim S-H, Decker CG, Wong DY, Loo J a, Maynard HD. A heparin-mimicking polymer conjugate stabilizes basic fibroblast growth factor. Nat Chem [Internet]. 2013;5(3):221–7. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3579505&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

59. Itoh N, Ornitz DM. Fibroblast growth factors: From molecular evolution to roles in development, metabolism and disease. Journal of Biochemistry. 2011. p. 121–30.

60. Wesche J, Haglund K, Haugsten EM. Fibroblast growth factors and their receptors in cancer. Biochem J. 2011;437(2):199–213.

61. Ornitz DM, Itoh N. Protein family review Fibroblast growth factors Gene organization and evolutionary history. Genome Biol. 2001;2(reviews):1–12.

62. Mason I. Initiation to end point: the multiple roles of fibroblast growth factors in neural development. Nat Rev Neurosci. 2007;8(8):583–96.

63. Haugsten EM, Wiedlocha A, Olsnes S, Wesche J. Roles of fibroblast growth factor receptors in carcinogenesis. Mol Cancer Res. 2010;8(11):1439–52.

64. Robin NH. FGFR-Related Craniosynostosis Syndromes. GeneReviews. 2007;1–30.

65. Ahmad I, Iwata T, Leung HY. Mechanisms of FGFR-mediated carcinogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 2012. p. 850–60.

66. Yun Y-R, Won JE, Jeon E, Lee S, Kang W, Jo H, et al. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 2010;2010:218142.

67. Cotton LM, O’Bryan MK, Hinton BT. Cellular signaling by fibroblast growth factors (FGFs) and their receptors (FGFRs) in male reproduction. Endocrine Reviews. 2008. p. 193–216.

68. Matsuo I, Kimura-Yoshida C. Extracellular modulation of Fibroblast Growth Factor

Bibliografía 69

signaling through heparan sulfate proteoglycans in mammalian development. Curr Opin Genet Dev [Internet]. 2013;23(4):399–407. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23465883

69. Marie PJ, Miraoui H, Sévère N. FGF/FGFR signaling in bone formation: Progress and perspectives. Growth Factors. 2012. p. 117–23.

70. Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling controlling bone formation: An update. Gene. 2012. p. 1–4.

71. Hajihosseini MK, Duarte R, Pegrum J, Donjacour A, Lana-Elola E, Rice DP, et al. Evidence that Fgf10 contributes to the skeletal and visceral defects of an apert syndrome mouse model. Dev Dyn. 2009;238(2):376–85.

72. Miraoui H, Marie PJ. Fibroblast growth factor receptor signaling crosstalk in skeletogenesis. Sci Signal. 2010;3(146):re9.

73. Miraoui H, Oudina K, Petite H, Tanimoto Y, Moriyama K, Marie PJ. Fibroblast growth factor receptor 2 promotes osteogenic differentiation in mesenchymal cells via ERK1/2 and protein kinase C signaling. J Biol Chem. 2009;284(8):4897–904.

74. Su N, Sun Q, Li C, Lu X, Qi H, Chen S, et al. Gain-of-function mutation in FGFR3 in mice leads to decreased bone mass by affecting both osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Hum Mol Genet. 2010;19(7):1199–210.

75. Holmes G, Rothschild G, Roy UB, Deng CX, Mansukhani A, Basilico C. Early onset of craniosynostosis in an Apert mouse model reveals critical features of this pathology. Dev Biol. 2009;328(2):273–84.

76. Dienstmann R, Rodon J, Prat A, Perez-Garcia J, Adamo B, Felip E, et al. Genomic aberrations in the FGFR pathway: Opportunities for targeted therapies in solid tumors. Annals of Oncology. 2014. p. 552–63.

77. Morita J, Nakamura M, Kobayashi Y, Deng CX, Funato N, Moriyama K. Soluble form of FGFR2 with S252W partially prevents craniosynostosis of the apert mouse model. Dev Dyn. 2014;243(4):560–7.

78. Martínez-Abadías N, Percival C, Aldridge K, Hill CA, Ryan T, Sirivunnabood S, et al. Beyond the closed suture in apert syndrome mouse models: Evidence of primary effects of FGFR2 signaling on facial shape at birth. Dev Dyn. 2010;239(11):3058–71.

79. Chen P, Zhang L, Weng T, Zhang S, Sun S, Chang M, et al. A Ser252Trp mutation in fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) mimicking human apert syndrome reveals an essential role for FGF signaling in the regulation of endochondral bone formation. PLoS One. 2014;9(1).

80. Andersen J, Burns HD, Enriquez-Harris P, Wilkie AOM, Heath JK. Apert syndrome mutations in fibroblast growth factor receptor 2 exhibit increased affinity for FGF ligand. Hum Mol Genet. 1998;7(9):1475–83.

81. Ibrahimi OA, Eliseenkova A V, Plotnikov AN, Yu K, Ornitz DM, Mohammadi M. Structural basis for fibroblast growth factor receptor 2 activation in Apert syndrome.


Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(13):7182–7.

82. Fei Y, Xiao L, Doetschman T, Coffin DJ, Hurley MM. Fibroblast growth factor 2 stimulation of osteoblast differentiation and bone formation is mediated by modulation of the Wnt signaling pathway. J Biol Chem [Internet]. 2011;286(47):40575–83. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3220493&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

83. Xiao L, Sobue T, Esliger A, Kronenberg MS, Coffin JD, Doetschman T, et al. Disruption of the Fgf2 gene activates the adipogenic and suppresses the osteogenic program in mesenchymal marrow stromal stem cells. Bone. 2010;47(2):360–70.

84. Lin GL, Hankenson KD. Integration of BMP, Wnt, and notch signaling pathways in osteoblast differentiation. J Cell Biochem. 2011;112(12):3491–501.

85. Dailey L, Ambrosetti D, Mansukhani A, Basilico C. Mechanisms underlying differential responses to FGF signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16(2):233–47.

86. Biver E, Soubrier A-S, Thouverey C, Cortet B, Broux O, Caverzasio J, et al. Fibroblast growth factor 2 inhibits up-regulation of bone morphogenic proteins and their receptors during osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2012. p. 737–42.

87. Wang Y, Zhou X, Oberoi K, Phelps R, Couwenhoven R, Sun M, et al. p38 inhibition ameliorates skin and skull abnormalities in Fgfr2 Beare-Stevenson mice. J Clin Invest. 2012;122(6):2153–64.

88. De A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) [Internet]. 2011;43(10):745–56. Available from: http://abbs.oxfordjournals.org.proxy.library.uu.nl/content/43/10/745.full%5Cnhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21903638

89. Hamidouche Z, Fromigué O, Nuber U, Vaudin P, Pages JC, Ebert R, et al. Autocrine fibroblast growth factor 18 mediates dexamethasone-induced osteogenic differentiation of murine mesenchymal stem cells. J Cell Physiol. 2010;224(2):509–15.

90. Lai W-T, Krishnappa V, Phinney DG. Fibroblast growth factor 2 (Fgf2) inhibits differentiation of mesenchymal stem cells by inducing Twist2 and Spry4, blocking extracellular regulated kinase activation, and altering Fgf receptor expression levels. Stem Cells [Internet]. 2011;29(7):1102–11. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3410557&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

91. Miraoui H, Severe N, Vaudin P, Pagès JC, Marie PJ. Molecular silencing of Twist1 enhances osteogenic differentiation of murine mesenchymal stem cells: Implication of FGFR2 signaling. J Cell Biochem. 2010;110(5):1147–54.

92. Chen G, Deng C, Li Y-P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and

Bibliografía 71

bone formation. Int J Biol Sci [Internet]. 2012;8(2):272–88. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3269610&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

93. Schultz GS, Wysocki A. Interactions between extracellular matrix and growth factors in wound healing. Wound Repair and Regeneration. 2009. p. 153–62.

94. Zhu H, Duchesne L, Rudland PS, Fernig DG. The heparan sulfate co-receptor and the concentration of fibroblast growth factor-2 independently elicit different signalling patterns from the fibroblast growth factor receptor. Cell Commun Signal. 2010;8:14.

95. Xu R, Rudd TR, Hughes AJ, Siligardi G, Fernig DG, Yates EA. Analysis of the fibroblast growth factor receptor (FGFR) signalling network with heparin as coreceptor: Evidence for the expansion of the core FGFR signalling network. FEBS J. 2013;280(10):2260–70.

96. Conway CD, Howe KM, Nettleton NK, Price DJ, Mason JO, Pratt T. Heparan sulfate sugar modifications mediate the functions of slits and other factors needed for mouse forebrain commissure development. J Neurosci. 2011;31(6):1955–70.

97. Sarrazin S, Lamanna WC, Esko JD. Heparan Sulfate Proteoglycans. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2011. p. a004952–a004952.

98. Ling L, Nurcombe V, Cool SM. Wnt signaling controls the fate of mesenchymal stem cells. Gene. 2009. p. 1–7.

99. Jackson RA, Nurcombe V, Cool SM. Coordinated fibroblast growth factor and heparan sulfate regulation of osteogenesis. Gene. 2006;379(1–2):79–91.

100. De Cat B, David G. Developmental roles of the glypicans. Semin Cell Dev Biol. 2001;12(2):117–25.

101. Gorsi B, Stringer SE. Tinkering with heparan sulfate sulfation to steer development. Trends in Cell Biology. 2007. p. 173–7.

102. Lamanna WC, Kalus I, Padva M, Baldwin RJ, Merry CLR, Dierks T. The heparanome-The enigma of encoding and decoding heparan sulfate sulfation. J Biotechnol. 2007;129(2):290–307.

103. Giantsos-Adams KM, Koo AJA, Song S, Sakai J, Sankaran J, Shin JH, et al. Heparan sulfate regrowth profiles under laminar shear flow following enzymatic degradation. Cell Mol Bioeng. 2013;6(2):160–74.

104. Liu R, Xu Y, Chen M, Weïwer M, Zhou X, Bridges AS, et al. Chemoenzymatic design of heparan sulfate oligosaccharides. J Biol Chem. 2010;285(44):34240–9.

105. Meikle PJ, Fuller M, Hopwood JJ. Lysosomal degradation of heparin and heparan sulfate. Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate. 2005. p. 285–311.

106. Bame KJ. Heparan sulfate degradation by heparanases. Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate. 2005. p. 259–83.

107. Xu D, Esko JD. Demystifying Heparan Sulfate-Protein Interactions. Annu Rev


Biochem [Internet]. 2014;(February):1–29. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24606135

108. Fanganiello RD, Sertie AL, Reis EM, Yeh E, Oliveira NAJ, Bueno DF, et al. Apert p.Ser252Trp mutation in FGFR2 alters osteogenic potential and gene expression of cranial periosteal cells. Mol Med [Internet]. 2007;13:422–42. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17622301

109. Witt RM, Hecht ML, Pazyra-Murphy MF, Cohen SM, Noti C, Van Kuppevelt TH, et al. Heparan sulfate proteoglycans containing a glypican 5 core and 2-O-sulfo-iduronic acid function as sonic hedgehog co-receptors to promote proliferation. J Biol Chem. 2013;288(36):26275–88.

110. Cui X, Yu S, Tamhane A, Causey ZL, Steg A, Danila MI, et al. Simple regression for correcting ΔCt bias in RT-qPCR low-density array data normalization. BMC Genomics [Internet]. 2015;16(1):82. Available from: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/16/82

111. Hutmacher DW. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 2000;21(24):2529–43.

112. Young HE. Pluripotent Stem Cells, Endogenous versus Reprogrammed, a Review. MOJ Orthop Rheumatol [Internet]. 2014;1(3):1–20. Available from: http://medcraveonline.com/MOJOR/MOJOR-01-00019.php

113. Young HE. Pluripotent Stem Cells, Endogenous versus Reprogrammed, a Review. MOJ Orthop Rheumatol. 2014;1(3):1–20.

114. Eswarakumar VP, Monsonego-Ornan E, Pines M, Antonopoulou I, Morriss-Kay GM, Lonai P. The IIIc alternative of Fgfr2 is a positive regulator of bone formation. Development [Internet]. 2002;129(16):3783–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12135917

115. Vimalraj S, Arumugam B, Miranda PJ, Selvamurugan N. Runx2: Structure, function, and phosphorylation in osteoblast differentiation. International Journal of Biological Macromolecules. 2015. p. 202–8.

116. Bruderer M, Richards RG, Alini M, Stoddart MJ. Role and regulation of runx2 in osteogenesis. Eur Cells Mater. 2014;28:269–86.

117. Ge C, Xiao G, Jiang D, Franceschi RT. Critical role of the extracellular signal-regulated kinase-MAPK pathway in osteoblast differentiation and skeletal development. J Cell Biol [Internet]. 2007;176(5):709–18. Available from: http://jcb.rupress.org/cgi/content/abstract/176/5/709

118. Komori T. Regulation of osteoblast differentiation by runx2. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2010. p. 43–9.

119. Komori T, Yagi H, Nomura S, Yamaguchi A, Sasaki K, Deguchi K, et al. Targeted Disruption of Cbfa1 Results in a Complete Lack of Bone Formation owing to Maturational Arrest of Osteoblasts. Cell [Internet]. 1997;89(5):755–64. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867400802585

Bibliografía 73

120. Otto F, Thornell a P, Crompton T, Denzel a, Gilmour KC, Rosewell IR, et al. Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development. Cell. 1997;89(5):765–71.

121. Rahman MS, Akhtar N, Jamil HM, Banik RS, Asaduzzaman SM. TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation. Bone Res [Internet]. 2015;3(November 2014):15005. Available from: http://www.nature.com/articles/boneres20155

122. Leung-Hagesteijn C, Hu MC, Mahendra AS, Hartwig S, Klamut HJ, Rosenblum ND, et al. Integrin-linked kinase mediates bone morphogenetic protein 7-dependent renal epithelial cell morphogenesis. Mol Cell Biol [Internet]. 2005;25(9):3648–57. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1084303&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

123. Kinsella CR, Cray JJ, Durham EL, Burrows AM, Vecchione L, Smith DM, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2-induced craniosynostosis and growth restriction in the immature skeleton. Plast Reconstr Surg. 2011;127:1173–81.

124. Dwivedi PP, Grose RH, Filmus J, Hii CST, Xian CJ, Anderson PJ, et al. Regulation of bone morphogenetic protein signalling and cranial osteogenesis by Gpc1 and Gpc3. Bone. 2013;55(2):367–76.

125. Choi YH, Kim YJ, Jeong HM, Jin YH, Yeo CY, Lee KY. Akt enhances Runx2 protein stability by regulating Smurf2 function during osteoblast differentiation. FEBS J. 2014;281(16):3656–66.

126. Canalis E, Economides AN, Gazzerro E. Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton. Endocrine Reviews. 2003. p. 218–35.

127. Wan DC, Pomerantz JH, Brunet LJ, Kim JB, Chou YF, Wu BM, et al. Noggin suppression enhances in vitro osteogenesis and accelerates in vivo bone formation. J Biol Chem. 2007;282(36):26450–9.

128. Hartwig S, Hu MC, Cella C, Piscione T, Filmus J, Rosenblum ND. Glypican-3 modulates inhibitory Bmp2-Smad signaling to control renal development in vivo. Mech Dev. 2005;122(7–8):928–38.

129. Coussens AK, Wilkinson CR, Hughes IP, Morris CP, van Daal A, Anderson PJ, et al. Unravelling the molecular control of calvarial suture fusion in children with craniosynostosis. BMC Genomics [Internet]. 2007;8(1):458. Available from: http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-8-458

130. Warren SM, Brunet LJ, Harland RM, Economides AN, Longaker MT. The {BMP} antagonist noggin regulates cranial suture fusion. Nature [Internet]. 2003;422(6932):625–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12687003

131. Graf D, Malik Z, Hayano S, Mishina Y. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine Growth Factor Rev [Internet]. 2015;27:129–39. Available from:


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26747371

132. Okamoto M, Udagawa N, Uehara S, Maeda K, Yamashita T, Nakamichi Y, et al. Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/β-catenin signaling during osteoblastogenesis. Sci Rep [Internet]. 2014;4:4493. Available from: http://www.nature.com/srep/2014/140327/srep04493/full/srep04493.html

133. Nemoto E, Ebe Y, Kanaya S, Tsuchiya M, Nakamura T, Tamura M, et al. Wnt5a signaling is a substantial constituent in bone morphogenetic protein-2-mediated osteoblastogenesis. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. Elsevier Inc.; 2012;422(4):627–32. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.05.039

134. Baron R, Kneissel M. WNT signaling in bone homeostasis and disease: from human mutations to treatments. Nat Med [Internet]. 2013;19(2):179–92. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23389618

135. Nemoto E, Ebe Y, Kanaya S, Tsuchiya M, Nakamura T, Tamura M, et al. Wnt5a signaling is a substantial constituent in bone morphogenetic protein-2-mediated osteoblastogenesis. Biochem Biophys Res Commun. Elsevier Inc.; 2012;422(4):627–32.

136. Okamoto M, Udagawa N, Uehara S, Maeda K, Yamashita T, Nakamichi Y, et al. Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/β-catenin signaling during osteoblastogenesis. Sci Rep. 2014;4:4493.

137. Guntur AR, Rosen CJ. IGF-1 Regulation of Key Signaling Pathways in Bone. Bonekey Rep [Internet]. Nature Publishing Group; 2013;2(437):1–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/bonekey.2013.171%5Cn10.1038/bonekey.2013.171

138. Thrailkill KM, Jr CKL, Bunn RC, Kemp SF, John L, Lumpkin CK, et al. Is insulin an anabolic agent in bone? Dissecting the diabetic bone for clues. Am J Physiol Endocrinol Metab [Internet]. 2005;289(5):1–19. Available from: http://ajpendo.physiology.org/content/289/5/E735.full-text.pdf+html

139. Jiang J, Lichtler AC, Gronowicz GA, Adams DJ, Clark SH, Rosen CJ, et al. Transgenic mice with osteoblast-targeted insulin-like growth factor-I show increased bone remodeling. Bone. 2006;39(3):494–504.

140. Zaidi M. Skeletal remodeling in health and disease. Nat Med [Internet]. 2007;13(7):791–801. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nm1593

141. Zhang W, Shen X, Wan C, Zhao Q, Zhang L, Zhou Q, et al. Effects of insulin and insulin-like growth factor 1 on osteoblast proliferation and differentiation: Differential signalling via Akt and ERK. Cell Biochem Funct. 2012;30(4):297–302.

142. Brooks AJ, Waters MJ. The growth hormone receptor: mechanism of activation and clinical implications. Nat Rev Endocrinol [Internet]. 2010;6(9):515–25. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrendo.2010.123

143. Han J, Jogie-Brahim S, Harada A, Oh Y. Insulin-like growth factor-binding protein-3 suppresses tumor growth via activation of caspase-dependent apoptosis and cross-talk with NF-??B signaling. Cancer Lett. 2011;307(2):200–10.

Bibliografía 75

144. Li J, Jin D, Fu S, Mei G, Zhou J, Lei L, et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 modulates osteoblast differentiation via interaction with vitamin D receptor. Biochem Biophys Res Commun. 2013;436(4):632–7.

145. van Driel M, Pols H a P, van Leeuwen JPTM. Osteoblast differentiation and control by vitamin D and vitamin D metabolites. Curr Pharm Des. 2004;10(21):2535–55.

146. Ornitz DM, Itoh N. The fibroblast growth factor signaling pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2015;4(3):215–66.

147. Cabrita MA, Christofori G. Sprouty proteins, masterminds of receptor tyrosine kinase signaling. Angiogenesis. 2008. p. 53–62.

148. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? Journal of Endocrinology. 2009. p. 191–202.

149. Peters KG, Werner S, Chen G, Williams LT. Two FGF receptor genes are differentially expressed in epithelial and mesenchymal tissues during limb formation and organogenesis in the mouse. Development [Internet]. 1992;114(1):233–43. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1315677

150. Orr-Urtreger A, Bedford MT, Burakova T, Arman E, Zimmer Y, Yayon A, et al. Developmental localization of the splicing alternatives of fibroblast growth factor receptor-2 (FGFR2). Dev Biol [Internet]. 1993;158(2):475–86. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160683712054

151. Zhang X, Ibrahimi OA, Olsen SK, Umemori H, Mohammadi M, Ornitz DM. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family: The complete mammalian FGF family. J Biol Chem. 2006;281(23):15694–700.

152. Yu K, Herr AB, Waksman G, Ornitz DM. Loss of fibroblast growth factor receptor 2 ligand-binding specificity in Apert syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(26):14536–41.

153. Ibrahimi OA, Zhang F, Eliseenkova A V., Itoh N, Linhardt RJ, Mohammadi M. Biochemical analysis of pathogenic ligand-dependent FGFR2 mutations suggests distinct pathophysiological mechanisms for craniofacial and limb abnormalities. Hum Mol Genet. 2004;13(19):2313–24.

154. Teven CM, Farina EM, Rivas J, Reid RR. Fibroblast growth factor (FGF) signaling in development and skeletal diseases. Genes Dis [Internet]. 2014;1(2):199–213. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352304214000294

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