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Illumina Experiment Manager v1.7簡易操作（2014年 4月）

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Illumina Experiment Manager (IEM) v1.7 簡易マニュアル

＊注：

IEM v1.7 で作成されるサンプルシートは、MiSeq Control Software (MCS) / MiSeq Reporter

(MSR) v2.3 or v2.4 にのみ完全に対応しています。

1. IEM の起動とサンプルシートの作成

(1) デスクトップ上に作成された IEM のショートカットアイコンを

ダブルクリックして、ソフトウェアを起動する。

(2) 以下の画面が表示されるので、「Create Sample Sheet」をクリックする。

ここをクリック


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(3) 以下の画面が表示されるので、”MiSeq”を選択し、「Next」をクリックする。

(4) 以下の画面が表示されるので、Category、Application から目的に沿った内容を選択する。

① MiSeq を選択

② [Next]をクリック


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(注意)

マークがついている Application は FASTQ ファイルのみ出力されます。

MiSeq Reporter での 2 次解析には現在対応していませんので、ご留意ください。

Category 一覧

<Category>

<選択可能な Application>


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例-1）配列のみ（Fastq ファイルのみ）を出力したい場合。 Category で”Other”を選択し、

Application で”FASTQ Only”を選択し、Next をクリックする。

例-2）ライブラリのリシーケンスを行う場合。Category で”Small Genome Sequencing”

を選択し、Application で”Resequencing”を選択し、Next をクリックする。

①

②

①

②

③

③


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(5) 続けて表示される画面から、以下の要領で必要な情報を入力する。

i) 試薬カートリッジのバーコードに記載されている番号を”Reagent Cartridge Barcode”

に入力する。これがそのまま Sample Sheet のファイル名（.csv）になる。

使用する試薬のバージョン (V2、あるいは V3) によって入力内容は若干異なる。

V2 試薬の場合：

500 サイクルキット ⇒ MSxxxxxxx-500V2

300 サイクルキット ⇒ MSxxxxxxx-300V2、


V3 試薬の場合：


150 サイクルキット ⇒ MSxxxxxxx-150V3、

＊ご利用試薬の末尾“ V2 ” 、 “ V3 ”、まで入力してください

ii) “Sample Prep Kit” でNextera、Nextera XT、TruSeqHT、TrusSeqLT、Small RNA、TruSight

Enrichment など (選択したApplicationで選択肢が変わる)を選択することができるので、

該当するものを選ぶ。

iii) Index Reads、Read Type、Cycle Reads を適宜指定、入力する。

入力が終了したら、「Next」をクリックする。

＊画面右側のチェックボックスについては資料末の” 3.Appendix 1-A~J” を参照する

＊Experiment Name から Date までは任意に記入する

（例では TruSeq LT、Index Reads 1、2x151 の Paired End）。


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① 試薬カートリッジのバーコード番号を入力

②サンプル調製に

使用したキットを選択

③Index Reads

を指定

④Read Type

を指定

⑤Cycle Reads を指定

⑥入力が終わったら[Next]をクリック


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Index Read を使用して複数サンプルをランする場合、左側に Sample Plate テーブル、右側

に Samples to include in sample sheet テーブルが表示される。Index Read を行わない場合

は、右側の Samples to include in sample sheet テーブルのみが表示される。

1) Sample Plateテーブルは、多検体の入力がしやすいようになっており、入力後、「Add

Selected Samples」ボタンをクリックすることで Samples to include in sample

sheet テーブルにロードできる。

2) Samples to include in sample sheet テーブルに直接記入する場合は、「Add Blank

Row」をクリックして、空白行を追加し、各項目を入力する。*の付いている項目

は必須のため、必ず記入する。画面右上の「Maximize」チェックを入れると、この

テーブルが画面全体に広がる。

3) “Resequencing” などのリファレンスゲノムが必要な解析には、ゲノムフォルダを

指定することができる。下図にあるように、プルダウンで選ぶことができるので、

適切なゲノムを選ぶ。

Add Selected Samples

Add Blank Row

Maximize


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4) 入力が終了したら、Status が Valid になっていることを確認する。必須項目が記入

されていない、あるいは余分な空白行があると Invalid となり、「Finish」ボタンが

アクティブにならない。

なお、Index の組み合わせが理想的でない場合は、その注意事項 (Warning) が表示

されるが、Finish を選択することは可能。

<Valid の場合の表示>

<Invalid の場合の表示例>

<Warning の場合の表示例>

Status

ゲノムフォルダを

プルダウンメニュー

から選択


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5) 「Finish」をクリックする。

(6) ファイルの保存先を指定し、Save する。

(MiSeq 上で作成した場合は、MiSeq Control Software (MCS)の参照先に保存すると良い。

MCS の参照先の初期設定は、D:¥Illumina¥MiSeq Control Software¥SampleSheets )

(7) 以下の画面が表示されるので、PC に Excel がインストールされている場合で内容を確

認する際は「Yes」をクリックする。インストールされていない場合は、「No」をクリ

ックして終了する。あとで.csv ファイルを Notepad 等で開いて内容を確認できる。


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例：

・TruSeq LT キットでサンプル調製,

・Resequencing ワークフローで 3 生物種 (Arabidopsis thaliana、Bos taurus、Escherichia coli)

のリファレンスを指定,

・2x151 bp のランで 3 サンプルを解析

・”Resequencing Workflow-Specific Settings” は一切チェックを入れずに設定

以下の設定が Resequencing Workflow にデフォルトで付属します：

・アダプタ配列のトリミング実施

Read1 ⇒ “Adapter” の右隣に表示された配列がトリミング対象

Read2 ⇒ “AdapterRead2” の右隣に表示された配列がトリミング対象

・コールされた変異が Variant Quality Score ”30” を下回った場合、その変異にフィルターを

かけるよう設定

・


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＜注意＞

・IEM を使用せずにサンプルシートを作成、もしくは作成後に手入力で編集した場合、

入力の誤りに伴うエラーが生じやすいので、以下の点に注意すること。

余分のスペースや空行、全角文字が含まれていないか

以下の文字が含まれていないか

? ( ) [ ] / ¥ = + < > : ; " ' , * ^ | & . とスペースやタブ

セルの値が“”で囲まれていないか（Excel や OpenOffice ではなく、notepad 等で確

認する）

・サンプルシートを編集した場合、以下の手順でフォーマット崩れが無いかを確認すると

良い

Edit Sample Sheet

をクリック

編集後のサンプルシートを選択

フォーマットに異常が無い場合：

そのまま編集に移れる

フォーマットに異常がある場合：

エラーメッセージが表示される


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3. Appendix

1: 画面右側のチェックボックス補足

1-A. Custom Primer の使用について

Custom Primer for Read1、Index、Read2 と書かれている項目にチェックを入れると、

Custom Primer のみを用いてランを実施することができる (ただし、TruSeq Amplicon 以外)。

＊通常のランでは試薬カートリッジの 12, 13, および 14 番ポートのプライマー溶液を利用

する設定になっていますが、Custom Primer の項目にチェックを入れると、試薬カートリ

ッジの 18, 19, および 20 番ポートの中身をプライマー溶液と装置が判断し、シーケンス

に利用します。

（＊この時、12~14 番ポートのプライマーは一切シーケンスに使用されなくなります）

＊illumina 純正のプライマーの利用も同時に必要となる場合は、Custom Primer の項目には

チェックを入れず、12 (Read 1 プライマー), 13 (Index プライマー), 14 (Read 2 プライマ

ー) 番ポートにカスタムプライマーを混ぜてシーケンスを実施してください。

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下の項目が追加されます。

この部分にチェック


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＜カスタムプライマーのみを使用してシーケンスする場合＞

試薬カートリッジの 18~20 番ポートにカスタムプライマーをロードする時は、

次の手順を用いる

1) 0.5 μM のカスタムプライマーを 600 μl 用意する。プライマーは HT1 を

使用して希釈する。

2) きれいなピペットチップを使い、プライマーをロードするポートに対応した

ホイルシールに穴をあける。

3) MiSeq 試薬カートリッジの対応したポートに 600 μl のカスタムプライマーを

ロードする。プライマーを分注する際にはホイルシールに触れないように

気をつける。

場所はそれぞれ、

Read1 用 Custom Primer ⇒18 番ポート

Index Read 用 Custom Primer ⇒19 番ポート

Read2 用 Custom Primer ⇒20 番ポート

にロードする。


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1-B. Use Somatic Variant Caller について

変異コールツールに Somatic Variant Caller を使用する場合にチェックを入れる

（対象ワークフローは、TruSeq Amplicon、Resequencing、PCR Amplicon、および

Enrichment）。

Somatic Variant Caller は、TruSeq Amplicon- Cancer Panel の解析向けにイルミナが

開発した、変異コールのツールである。内容はテクニカルノート (以下 URL)で触れ

られているので、使用前に必ずこちらを参照のこと。

http://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_somatic_variant_c

aller.pdf

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下の項目が追加され、変異コールが Somatic

Variant Caller で実施されます。


http://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_somatic_variant_caller.pdf

http://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_somatic_variant_caller.pdf


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1-C. Flag PCR Duplicate について

Flag PCR Duplicate にチェックを入れると、PCR デュプリケートと認識されたリードにフラグ

が立ち、そのリードが変異コールに使用されないようになる。

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下のように数字 “ 1 “が表示され、PCR デュプリケートに対して処理が実施されます。

＊チェックを入れなかった場合にはサンプルシートに以下のように数字 “ 0 “が表示され、PCR

デュプリケートを “無視して” 処理が実施されます。



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1-D. Variant Quality について

コールされた変異の Variant Quality Score が指定した値を下回った場合、その変異にフラグを立

てフィルターにかかるようにする設定。Variant Quality Score についての詳細は、MiSeq Reporter

User Guide を参照のこと。

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下の項目が追加され、フィルターをかける

Variant Quality Score の閾値（指定した数値）が表示されます。

この部分の

数字で調整


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1-E. Adapter Trimming について

長いリードを読むとそのインサート DNA を読み超えて、アダプタ配列を読んでしま

う場合がある。その場合、出力の配列にアダプタ配列が混じってしまうが、Adater

Trimming で配列を指定しておくと、アダプタ配列を検出して、検出されたアダプタ

以降の配列をトリムすることができる (TruSeq Amplicon 以外のワークフローが対象)

アダプター配列の指定は、MiSeq Reporter v2.1.43 から Read 1、および Read 2 それ

ぞれで個別に行うことが可能となった。

[Use Adapter Trimming]

⇒ Read 1 中でトリムする対象とするアダプタ配列を指定

[Use Adapter Trimming Read 2]

⇒ Read 2 中でトリムする対象とするアダプタ配列を指定

＊Nextera 系のキット (Mate pair は除く) は、Read 1、2 ともに同じアダプター配列を対象

にトリムを実施する

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下の項目が追加され、表示されたアダプタ

配列がトリムされます。

＊[Resequencing] ワークフローの選択時には、チェックを入れなくても自動的にトリムす

るアダプター情報がサンプルシートに入力されます。



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1-F. Indel Realignment GATKについて ([Resequencing]、あるいは[Enrichment]ワークフローのみ)

シーケンスした領域中に短い Indel があり、マッピングが難しい部分があった場合、その領域に対して GATK で再アライメントを実施する設定。

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下の項目が追加され、Indel 周辺における GATK

での再アライメント実施が有効となります。



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1-G. Run Picard HsMetrics について ( [Enrichment]ワークフローのみ)

作成された BAM ファイルに対して、Picard hybrid selection (HS) 解析を実施するかどうかを決める設定。Picard、および Picard HS metrics の詳細については、Broad Institute のホームページなどを参照のこと。参考 URL：

-http://www.broadinstitute.org/files/shared/mpg/nextgen2010/nextgen_cibulskis.pdf

- http://picard.sourceforge.net/picard-metric-definitions.shtml

＊チェックを入れるとサンプルシートに以下の項目が追加され、Picard hybrid selection

(HS) 解析が実施されます。


http://www.broadinstitute.org/files/shared/mpg/nextgen2010/nextgen_cibulskis.pdf

http://picard.sourceforge.net/picard-metric-definitions.shtml


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1-H. Reverse Complement について (Nextera Mate pair キットで調製したサンプル解析時に使用)

Nextera Mate Pair キットで調製したサンプルは、キットの特性上、シーケンス時に得られるシーケンスの向きが [mate-pair] 特有となる（詳細はキットのデータシート

http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_nextera_mate_pair.pdf を参照のこと）。 Velvet や BWA でのデータ処理にあたっては、[mate-pair]特有の向きから、通常の[Paired-End]

の向きへ情報を変換する必要があるが、本パラメータはその処理を自動で実施する設定。

[Nextera Mate-Pair キットの調製手順]

＊チェックを入れるとサンプルシートの [ReverseComplement] の項目に”1” が表示され、シーケンスデータの向きの変換が実施されます。

＊チェックを入れなかった場合はサンプルシートの [ReverseComplement] の項目に”0” が表示されます。シーケンスデータに変更は加わりません。


http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_nextera_mate_pair.pdf


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1-I. K-mer size について ([Assembly] ワークフローのみ)

[Assembly]ワークフローを指定した際に、解析ツールである Velvet が使用する K-mer のサイズを指定する項目。数値は 2 ~ 255 の間で指定可能だが、数値を上げると PC のメモリ使用量も増加するので注意が必要。デフォルトでは、K-mer サイズ ”31” が使用される。

＊K-mer サイズについては特にイルミナから推奨値はご案内しておりません。＊デフォルトから変更する場合は条件検討が必要となりますので、ご留意ください。＊弊社のサポート外とはなりますが、条件に応じて k-mer の目安値を推測するようなツール（http://bioinformatics.net.au/software.velvetk.shtml）、ウェブサイト (http://dna.med.monash.edu.au/~torsten/velvet_advisor/) もあります。宜しければご参照ください。

＊設定した数値がサンプルシートに以下のような形で出力されます。

この部分の数値を変更

http://bioinformatics.net.au/software.velvetk.shtml

http://dna.med.monash.edu.au/~torsten/velvet_advisor/


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1-J. Small RNA ワークフローに特有のボックス

Small RNA ワークフローでは、アライメントに 4 種類のデータベース情報 (FASTA ファイ

ル)を使用するため、そのそれぞれへのパスを個別に指定する必要がある。

画面右側にあるボックスから、アライメントに使用するファイル（または、その場所）を

指定する。

Small RNA ワークフローでは、以下の順に Data Base に対してアライメントを行いカウン

トしている。

Contaminants> miRNA> smallRNA> Genome

＊ボックスに情報を入れるとサンプルシートに以下の項目が追加され、指定した情報が表示されます。

プルダウンメニューから選択

該当 FASTAファイルを保存した場所へのパスを入力

指定した情報


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1-H. Export to gVCF について ([TruSeq Amplicon]、[Enrichment]、[PCR Amplicon]に特有のボックス)

gVCF ファイルを出力するかどうかを設定する項目。gVCF ファイルは、VCF ファイルの拡張フォーマットであり、変異が検出されたサイトだけではなく、変異が検出されなかったサイトの情報がどうであったのかも vcf 形式で記述したもの。

詳細については、以下の URL を参照のこと。

https://sites.google.com/site/gvcftools/home/about-gvcf

＊チェックを入れるとサンプルシートの [outputgenomevcf] の項目に”TRUE” が表示され、AlignmentN フォルダ直下に*.genome.vcf.gz ファイルが追加出力されます。

＊チェックを入れなかった場合はサンプルシートの [outputgenomevcf] の項目に”FALSE” が表示されます。gVCF ファイルは出力されません。


https://sites.google.com/site/gvcftools/home/about-gvcf


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1-I. Genus-level Classification について ([16S Metagenomics]に特有のボックス)

MiSeq Reporter (Metagenomics ワークフロー)の解析を Genus (属) レベルまでに設定する項目。MiSeq Reporter v2.3 から分類が Species(種)レベルまでに拡張されたが、チェックを入れると v2.2 以前のデフォルトであった Genus (属) レベルまでの解析が実施可能になる。

＊チェックを入れるとサンプルシートの [TaxonomyFile] の項目に ” gg_13_5_genus_32bp.dat” が表示され、Genus レベルまでの分類が実施されます


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2: ユーザが用意したゲノム配列をリファレンスファイルとして使いたい場合

以下の方法で、IEM のプルダウンで表示されるゲノムフォルダを追加できる

1) IEM を立ち上げた際に出てくる、下記画面の”Folder Settings”をクリックする。

2) Genome Repository の中を、

C:¥Illumina¥MiSeq Repoter¥Genomes

に変更する（’¥’マークは、海外の Windows では’ ╲’になるので注意）


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3) C:¥Illumina¥MiSeq Repoter¥Genomes に（’¥’マークは、海外の Windows では’ ╲’

になるので注意）、

I) 任意の名前のフォルダ（生物種などにするとわかりやすい）を作製し、

ii). その中にリファレンスとなる Multi Fasta フォーマットのファイルを入れる。

ファイル名の拡張子（最後の文字）は、“.fa”にする。

また、Multi Fasta フォーマットのヘッダ行（’>’で始まる行）については、

記号文字がないようにする。

(Multi-FASTA、FASTA ファイルについては以下のようなウェブサイトに説明があり

ます。宜しければご参照ください

・http://ibis.tau.ac.il/ssat/MultiFasta.htm

・http://quma.cdb.riken.jp/help/multiFastaHelp_j.html

・http://quma.cdb.riken.jp/help/fastaHelp_j.html

・http://en.wikipedia.org/wiki/Fasta_format

4) IEM を一度閉じ、再度立ち上げなおす。

5) Resequencing Workflow などのリファレンスを必要とするワークフローを選択し、

追加したゲノムが追加されたことを確認する。

追加したゲノム

http://ibis.tau.ac.il/ssat/MultiFasta.htm

http://quma.cdb.riken.jp/help/multiFastaHelp_j.html

http://quma.cdb.riken.jp/help/fastaHelp_j.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Fasta_format


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3: Nextera XT v2 Index Kit の利用について

2014 年 4 月より新タイプ(V2) Nextera XT Index kit がリリースされ、IEM v1.7 から Sample

Prep Kit の選択肢に追加されている。V2 Index Kit では、インデックスの組合せが最大 384

種類まで可能（＊Set A ~ D、4 種類を全て用いた場合）。

従来の Nextera XT Index； Index 1(i7): 12 種類 x Index 2 (i5): 8 種類=計 96 種類

v2 Index Kit； Index 1(i7): 24 種類 x Index 2 (i5): 16 種類=計 384 種類

V2 Index Kit の品名と型番については以下の通り。

製品名型番 #

Nextera XT Index Kit Set V2 , 96 Indices, 384 Samples A FC-131-2001

Nextera XT Index Kit Set V2 , 96 Indices, 384 Samples B FC-131-2002

Nextera XT Index Kit Set V2 , 96 Indices, 384 Samples C FC-131-2003

Nextera XT Index Kit Set V2 , 96 Indices, 384 Samples D FC-131-2004

Set A ~ D に含まれる Index の種類はそれぞれ以下の表の通りである


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4: マニフェスト (Manifest) ファイルの作成について

Amplicon 系のワークフロー（PCR Amplicon、TruSeq Custom Amplicon、Enrichment）で

は、MiSeq Reporter での解析に、変異コールの対象とする領域を指定するファイル (マニ

フェストファイル) を必要とする。

PCR Amplicon で使用するマニフェストファイルは IEM 上で対象領域の情報を入力して作

成する。

一方、TruSeq Custom Amplicon (Cancer Panel、Targeted RNA を含む) 、Enrichment のマ

ニフェストファイルは、Myillumina から作製済みのものをダウンロードできるため、IEM 上

で作製する必要は無い。

PCR Amplicon のマニフェストファイルは、以下の要領で作成し、サンプルシートに入

力する。

1. IEM からサンプルシートの作成に進み、以下のアプリケーション選択まで進める。

PCR Amplicon を選択し、次に進む。

Nextera キットで PCR

アンプリコンを処理し

たサンプル向け


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2. アプリケーションの選択が終わって以下の画面に進んだら、試薬カートリッジ、リード

長等の必要項目を入力し、[Next] を押して次に進む。

3. サンプル名、Index 情報等、必要項目を入力したら表示を右側にスライドさせる。

① 必要項目を入力 ② 表示を右側に

スライド

必要項目を入力し

てからクリック


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4. 項目の一番右に[Nextera Manifest*]という項目があるので、この項目の空欄部分を

クリックする

5. 空欄部分をクリックすると、プルダウンメニューで以下のような内容が表示される。

表示される項目から、[New…] を選択する。


クリック


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6. 以下のウィンドウが表示されるので、[Genome] の下にある部分をクリックする。。

7. プルダウンメニューから参照配列が使用可能な生物種の一覧が表示されるので、この中

から解析に使用する生物のゲノム情報を選択する。


表示された中か

ら適切なゲノム

情報を選択


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8. ゲノムを選択すると、解析の対象領域を入力することが可能となる。

1 行につき 1 領域の染色体番号、領域の開始点、終了点、などの情報を入力する。

[Add Blank Row]をクリックして、適宜行を追加し、当該ランで解析する対象領域情報

を全て入力する。

対象領域の情報

を入力

クリックすると

1 行入力欄が

追加される

染色体番号は

プルダウンから選択

残りの部分は手入力


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＊変異コールの対象となるのは、下図の範囲。

Amplicon Start と End の間の領域から、上流・下流の Probe Length を除いた範囲に

対して変異コールが実施される。

9. 全ての領域情報の入力が終わったら、[Name for this manifest] にマニフェストファイ

ルの名称を入力して[OK]をクリックする。

入力した名称でマニフェストファイルが作成される。

Amplicon Start Amplicon End

Upstream Probe Length

Downstream Probe Length

マニフェストファイル

の名称を入力

入力が終わったらクリック


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10. [OK]をクリックすると、サンプルシートの作成画面に戻る。

[Nextera Manifest*] の欄から作成したマニフェストファイルが選択できるように

なっているので、これを選択する。

11. マニフェストファイルの選択が終わり、左下の Status 部分が” Valid “になったら、

[Finish]をクリックしてサンプルシートの作成を終了する。

これを選択

表示が“Valid” に

なったのを確認

表示が“Valid” に

なったのを確認

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