DIPARTIMENTO delle SCIENZE BIOLOGICHE

UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO IICNISM

Consorzio Nazionale Interuniversitario per le Scienze Fisiche della Materia

Adriana Zagari____________

Il contributo della radiazione di sincrotrone alla

conoscenza della struttura delle macromolecole biologiche

La Biologia mira alla comprensione di complessi processi biologici in cui intervengono molti componenti cellullari

Biologia Strutturale

La Biologia Strutturale interpreta i processi biologici in termini di struttura tridimensionale delle macromolecole che partecipano a tali processi. La struttura tridimensionale viene descritta dalle posizioni di tutti gli atomi che costituiscono la macromolecola

L’ utilizzo della luce di sincrotrone e’ divenuto indispensabile !

The most popular synchrotron based techniques for biomolecules:

1 - Small Angle X-ray Scattering (SAXS)

2 - X-ray Absorption Spectroscopy (XAS)Extended X-ray Absorption Fine StructureX-ray Absorption Near Edge Structure

3 - Macromolecular Crystallography (MX)

“ Every year several thousand researchers take advantage of the exceptional properties of the synchrotron radiation to study a

remarkably wide range of materials, from biomolecules tonanomagnets, and ancient Egyptian cosmetics to metallic foams”

dalle pagine web di ESRF

Cristallografia di macromolecole biologiche

La figura illustra la traccia della catena polipeptidica della mioglobina pubblicata su Naturenel 1958 da John Kendrew e collaboratori

La mioglobina (1958)

Recenti successidella cristallografiadi macromolecolebiologiche

La disponibilità della radiazione di

sincrotrone e la costruzione di

nuove linee per la biologia ha dato

impulso ad importanti progetti

di cooperazione internazionale di

GENOMICA STRUTTURALEStructural genomics

pipeline

Structural Biology at ESRF

Structural Genomics on: - Deinococcus radiodurans

- Helicobacter pylori

Tunable Beamlines: MAD technique (multiwavelenght anomalous diffraction)microfocus (10 micron)automation

31541

5522206

--------37269

28

6

1353

121

902

705

29258

4690

TOTALOtherTheirComplexes

NucleicAcids

Proteins

X-rayStructures

NMRaltro

PDB Current Holdings: June 23, 2006

Il Protein Data Bank

1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 20060

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Stru

ctur

es d

epos

ited

Year

total annual

Il Protein Data Bank

1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 20060

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Stru

ctur

es d

epos

ited

Year

total synchrotron

Total vs Synchrotron

3 luglio 2006

Il Protein Data Bank

Il Protein Data Bank

Un esempio di file del PDB

…………..ATOM 159 N GLU I 19 17.953 30.382 47.349 1.00 31.70 N ATOM 160 CA GLU I 19 18.924 29.486 47.967 1.00 32.26 C ATOM 161 C GLU I 19 20.221 30.177 48.241 1.00 30.57 C ATOM 162 O GLU I 19 20.853 29.984 49.280 1.00 30.42 O ATOM 163 CB GLU I 19 19.159 28.290 47.063 1.00 34.66 C ATOM 164 CG GLU I 19 17.861 27.539 46.835 1.00 42.15 C ATOM 165 CD GLU I 19 18.006 26.316 45.955 1.00 48.99 C ATOM 166 OE1 GLU I 19 19.143 26.046 45.489 1.00 50.09 O ATOM 167 OE2 GLU I 19 16.961 25.639 45.735 1.00 53.19 O ATOM 168 N LEU I 20 20.609 31.010 47.300 1.00 29.37 N ATOM 169 CA LEU I 20 21.838 31.769 47.431 1.00 29.17 C ATOM 170 C LEU I 20 21.659 32.694 48.621 1.00 30.35 C ATOM 171 O LEU I 20 22.531 32.815 49.473 1.00 31.40 O ATOM 172 CB LEU I 20 22.037 32.550 46.143 1.00 26.77 C ATOM 173 CG LEU I 20 23.299 32.445 45.319 1.00 27.07 C ATOM 174 CD1 LEU I 20 24.045 31.140 45.420 1.00 27.90 C ATOM 175 CD2 LEU I 20 22.905 32.764 43.898 1.00 26.73 C ATOM 176 N LEU I 21 20.495 33.331 48.697 1.00 31.43 N ATOM 177 CA LEU I 21 20.187 34.214 49.809 1.00 32.68 C ATOM 178 C LEU I 21 20.250 33.452 51.150 1.00 34.61 C ……………………

ATOM 1340 N THR I 156 4.494 35.220 38.923 1.00 43.67 N ATOM 1341 CA THR I 156 4.626 34.376 37.725 1.00 45.46 C ATOM 1342 C THR I 156 3.345 33.587 37.392 1.00 46.98 C ATOM 1343 O THR I 156 3.263 32.960 36.357 1.00 46.79 O ATOM 1344 CB THR I 156 5.856 33.423 37.783 1.00 45.05 C ATOM 1345 OG1 THR I 156 5.652 32.422 38.781 1.00 44.86 O ATOM 1346 CG2 THR I 156 7.154 34.188 38.090 1.00 43.77 C …………………………….

Cristallografia di macromolecole biologiche

Primo step: il cristallo

a

b

c

αβ

γ

Cella elementare, reticoli tridimensionali, cristalli

a

b

c

Cella elementare

Reticolo tridimensionale

Cella elementare

Unique property of protein crystals

Crystals contain water up to 80%

Crystals are biphasic, as they contain liquid channels

Ordered protein molecules have large surfaces in contact with water

The water presence produces advantages

Ionisable residues change their charge, if pH of the medium is changed In the crystal, the protein undergoes moderate conformational changes

Small molecules, like ligands, substrates, inhibitors, diffuse into crystals and react!Enzymes are still active in the crystal state!

The water presence produces disadvantages

Disintegrate if allowed dehydratePresent weak lattice forcesAre soft and crush easilyDiffract poorly……….

Protein crystals:

Montaggio del cristallo

A temperatura ambiente e con sorgenti convenzionaliil cristallo va montato dentro un capillare chiuso ed in presenza delle acque madri, in modo che la tensione di vapore sia la stessa

I cristalli di proteine, quando esposti alla radiazione X,si danneggiano

Dopo brevi ( secondi ) esposizioni ai sincrotroni o lunghe (20-30 ore) esposizioni con generatori convenzionali, i cristalli di proteine

non diffrangono più

CriocristallografiaDecadimento del cristallo

Il fenomeno è estremamente più esteso per i cristalli di proteine che per gli altri cristalli perché i radicali liberi - che inizialmente si formano per effetto della interazione tra i raggi X e le molecole - DIFFONDONO rapidamente nei canali liquidi del cristallo di proteina generando a cascata altri radicali.

Il fenomeno è estremamente più esteso usando come sorgente la radiazione di sincrotrone rispetto alle sorgenti convenzionali

Criocristallografia al sincrotrone

Per evitare il decadimento si opera alla T di 100 K In tal modo si rallenta moltissimo la diffusione dei

radicali liberi

Perché proprio a 100 K?

Perchè l’ acqua, in soluzioni acquose Perchè l’ acqua, in soluzioni acquose crioprotettricicrioprotettrici, se portata , se portata

velocemente (s) a quella temperatura non forma ghiaccio (che è velocemente (s) a quella temperatura non forma ghiaccio (che è

comunque cristallino e diffrangerebbe) ma una forma solida vetrocomunque cristallino e diffrangerebbe) ma una forma solida vetrosa sa

dell’ Hdell’ H22O.O.

Set up del cristallo “surgelato”

Il cristallo viene “pescato” con un piccolo loop di fibra ( diametro dell’ ordine delle dimensioni del cristallomicron)

Il cristallo viene immerso per pochi secondi (5-20 s) nel liquidocrioprotettore (Ad es. aggiungendo glicerolo)

Flash-cooling

Il loop viene posto sotto flusso d’ azoto a 100 K. La soluzione in cui è immerso il cristallo solidifica ma resta trasparente.

Questa operazione viene spesso fatta nel proprio laboratorio e i cristalli conservati in un “cilindro del sample changer” e poi portati o spediti al sincrotrone.

Arzt, S. et al. “Automation of macromolecular crystallograpghy beamlines”Progress in Biophysics & Mol. Biology 2005, 89: 124-152

Automazione sulle beamlines dedicate alla cristallografia di macromolecole biologiche

Basket for sample changer

Automazione sulle beamlines dedicate alla cristallografia di macromolecole biologiche

Arzt, S. et al. “Automation of macromolecular crystallograpghy beamlines”Progress in Biophysics & Mol. Biology 2005, 89: 124-152

Fascio di raggi-X

Rivelatore

Raggiodiffratto

Cristallo di proteina

Immagine di diffrazioneGoniometro per il controllodell’orientazione del cristallo

Esperimento di diffrazione

Il reticoloreciproco

Sorgente deiraggi X

Rivelatore

Per registrare le intensità deiriflessi, il cristallo deve ruotare

Immagine di diffrazione

I cristalli di MB spesso diffrangono solo a bassa risoluzione, perché i riflessi ad alto tetahanno intensita’deboli che si confondono con il rumore di fondo

La risoluzione dei dati di diffrazione

θ 2,d2

θ1

d3,θ3

La legge di Braggλ = 2 d(h,k,l) sen θ

λ è noto, dalla posizione del riflesso(hkl) si ottengono θ o d

d(hkl), distanza tra i piani del cristallo che, per riflessione, hanno generato il riflesso con indici hkl.

dmin corrisponde alla Risoluzione a cui diffrange il cristallo. Migliore è la risoluzione, minore è il valore di d (Å)

Urea Termolisina

Proteina del virus del raffreddore

Risoluzione limite di alcuni cristalli

N ref = Numero di riflessi misurabili

N ref = 2 π V3 d 3

2.3Å

2.3Å

2.3Å

L’ INTENSITA’ MISURATA, per ogni riflesso (hkl), è circa EGUALE AL QUADRATO DEL MODULO DEL FATTORE DI STRUTTURA

I (h,k,l) = k |F(h,k,l)|2

F (h,k,l) = |F(h,k,l)| exp (i φ)Quindi noi conosciamo solo le ampiezze dei raggi diffratti non la fase

( ) ( ) ( )[ ]∑ ∑ ∑ ++−=h k l

lzkykx2explkhFV1zyxρ iπ

La fase viene ottenuta mediante metodi di Solving(molto importante il MAD, praticabile solo al sincrotrone).

Si passa poi a calcolare la densità elettronica perché gli atomi vengono localizzati in corrispondenza dei massimi della funzione densità elettronica

Determinazione della struttura

Esempi di mappe di densità elettronica

NECESSITA’ del sincrotrone per registrare dati a più alta risoluzione e determinare strutture più accurate

NECESSITA’ del sincrotrone per registrare pattern di diffrazione con intensità deboli/forti in caso di pseudo-simmetrie

XX--ray synchrotron radiation frame fray synchrotron radiation frame fromromcrystals of 3(Procrystals of 3(Pro--ProPro--Gly) Gly) 1100

Real structure for Real structure for 33 (PPG)(PPG)10 10 (collagen model)(collagen model)

Struttura affinata e depositata a 1.3 Å di risoluzione

Cristalli di Cristalli di proteine nelloproteine nello spaziospazio

Viaggia alla velocità di 29000 km/hcon periodo orbitale di 90’

PerchéPerché la MICROGRAVITA’ ?la MICROGRAVITA’ ?AssenzaAssenza di di sedimentazionesedimentazione

AssenzaAssenza di di motimoti convettiviconvettivi dovutidovuti a a gradientigradienti di di densitàdensità

Il Il trasportotrasporto delledelle sostanzesostanze è solo è solo diffusivodiffusivo

I CRISTALLI SONO PIU’ ORDINATI E I CRISTALLI SONO PIU’ ORDINATI E DIFFRANGONODIFFRANGONO

I RAGGI X A PIU’ ALTA RISOLUZIONEI RAGGI X A PIU’ ALTA RISOLUZIONE

Foto scattata dalla NASA un giorno dopo il Foto scattata dalla NASA un giorno dopo il landinglanding

CristalliCristalli cresciuticresciuti in in microgravitàmicrogravità

PROGETTAZIONE DI FARMACI : Enzimi bersaglio

Ricadute e applicazioni

Campo biomedicoCampo farmaceuticoCampo biotecnologico…………………………

Dal cristallo al farmaco

Struttura ad alta risoluzione

BassaRisoluzione

X

From NASA web site

Diabete100 Milioni di pazienti

Influenza800 milioni di persone

all’ anno

Malaria20 milioni di pazienti

Plasmodium falciparum

DIPARTIMENTO delle SCIENZE BIOLOGICHE

UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO IICNISM

Consorzio Nazionale Interuniversitario per le Scienze Fisiche della Materia

Adriana Zagari____________

Il contributo della radiazione di sincrotrone alla conoscenza della struttura delle macromolecole

biologicheII parte

Rnasi in funzione del pHa risoluzione atomica

Il ribosoma

Due casi in studio(radiazione di sincrotrone insostituibile)

sincrotrone

26 giugno 2006

Strutture a risoluzione atomica(d < 1.2 Å)

Le strutture a risoluzione atomica forniscono modelli molto accurati (circa 0.02 Å ):

Sono localizzati molti degli atomi di idrogenoCatene laterali in doppia conformazione

Strutture a risoluzione atomica(d < 1.2 Å)

Utili modelli per comprendere meglio:

Le correlazioni tra struttura e funzione, Meccanismi cataliticiInterazioni con ligandiStato di protonazione di residui carichiMonitorare piccole modifiche dovute a variazioni dell’

ambiente esterno come ad es il pH (non praticabile per cristalli di piccole molecole)

RNAsi AMeccanismo catalitico dipendente dal pHCristalli diffrangenti a circa 1Å

Dati di diffrazione

Qualche mappa di densità elettronica a 1 Å

Titolazione acido-base al sincrotrone

Il Ribosoma

Il maggiore successo della cristallografia di macromolecole biologiche mediante l’ utilizzo della radiazione di sincrotrone

M.W. 850,000 Da1500 nucleotides21 proteins !

M.W. 1,450,000 Da3000 nucleotides35 proteins !

Il Ribosoma

This material is provided for educational use only. Property of :Joachim Frank Albany, New York 12201-0509

Ribosoma - the machine (protein factory)

mRNA - porta il messaggio

tRNA - dizionario con 20 parole (amminoacidi)Con il suo anticodone riconosce il codonedel mRNA e porta il corrispondente amminoacido sul ribosoma

Altri fattori: …..

The players

Il Ribosoma: uno schema

APE

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mRNA fornisceIl codice per l’ Amminoacido del aa tRNA

Ogni amminoacidoViene legato allaCatena peptidicaIn crescita, che poi fuoriesce dal tunnel

Subunita 30S Subunita 50S

280A

210 A

Ricerche condotte nell’ ultimo ventennio hanno portato all’ ottenimento di cristalli delle singole subunità 30S e 50S di ribosomi da batteri.

Le Strutture cristalline, determinate a circa 3 Å di risoluzione usando come sorgente di raggi X il sincrotrone, sono ora disponibili nel PDB e costituiscono un patrimonio di valore inestimabile per la comunità scientifica.

Il Ribosoma

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Dati Cristallografici

(ESRF, APS)

Sunit 30S (Deinococcus radiodurans)

Unit cell parameters (Å) 170.3 , 411.1, 695.5

Resolution limit (Å) 3.4

Mosaicity (°) 0.3

Number of unique reflections 291247

Completeness (%) 88.1

Rmerge (%) 9.9

<I>/<s(I)> 5.4

R-factor/ R-free (%) 26.2 / 31.0 (5%)

Molti pensano che una struttura cristallina sia rigida e quindi non sia un buon modello per processi dinamici quali ad es. la catalisi.

By Dunitz JD et al. Interpretation of atomic displacement parameters fromdiffraction studies of crystalsJ. Phys. Chem. 1988, 92:856-867

Diversamente ….”A Crystal should not beconsidered a chemical cemetery; long rows of molecules interred in a chemical cemetery ;long rows of molecules interred in a rigidgeometrical arrangement, lifeless, comparedwith the molecular mazurkas that can beimagined to occur in solution………

Il RibosomaUn breve filmato sulla subunità 30S

http://alf1.mrc-lmb.cam.ac.uk/~ribo/movies/

Yonath,Max Planck Institut,Hamburg, Germany& Weizmann Institute of Science,Rehovot, Israel

Noller,University of CaliforniaSanta Cruz

Cate,University of CaliforniaBerkley

CREDIT for Ribosome studies

Steitz,Yale university,New Haven,USA

Ramakrishnan,MRC, Cambridge,UK

La struttura cristallina del ribosoma, e di tanti altre macromolecole biologiche e di loro complessi, determinate in prestigiosi laboratori di tutto il mondo, ha contribuito in maniera decisiva ai grandi progressi nel campo della biologia…..

NON SAREBBE STATOPOSSIBILE SENZALA DISPONIBILITA’ DELLESORGENTI DI RADIAZIONEDI SINCROTRONE

Lesson learntReovirus

RNA polymerase

Nucleosome HIV envelope protein

Suggested Readings

Berisio R. et al.Protein Titration in the crystal state J.Molecular Biology (1999) 292, 845-854

Hendrickson W. Synchrotron crystallographyTIBS (2000), 25637-653. Review

Noller HFRNA structure: reading the ribosomeScience 2005, 309, 1508-1514

Chayen NTurning protein crystallisation from an art into a science.Curr Opin Struct Biol. 2004 Oct;14(5):577-83. Review.