١

أحیاء دقیقة عملي

نبت٢١١أحياء دقيقة عملي

دراسة الميكروسكوب :الدرس العملي األول أهداف العمل

.تعلم كيفية استخدام المجهر وخاصة العدسات الشيئية العادية والزيتية – ١ .جاهزة باستخدام المجهر شرائح + مشاهدة قصاصات ورقية – ٢ هزةشرح طرق التعقيم واألج -٣ .والمواد الكيماوية المستخدمة التعرف على األدوات – ٤

،المـرق المغـذي Nutrient agar اآلجار المغـذي ( الغذائية للبكتيريا تحضير البيئات: الدرس العملي الثاني Nutrient Broth (

:خطوات العمل .في حجم معين من الماء المقطر Nutrient agarتجهز بوزن كمية معينة من منبت – ١ .لتر ١حتى يصبح معلق متجانس ويكمل إلى يقلب جيدا – ٢حتى تتم عملية التجانس التام ويتم طبخ المنبت وينصهر اآلجـار ٥م ١٠٠يوضع في حمام مائي عند درجة – ٣

.تماما .بنفس الطريقة دون إضافة اآلجار حتى يصبح المنبت سائال Nutrient Brothكما يجهز الـ – ٤ .دقيقة عند ضغط واحد ونصف جوي ١٥والسائلة في جهاز األوتوكالف لمدة تعقم المنابت الصلبة – ٥نصب المنابت الصلبة في أطباق معقمة وكذلك نصب المنابت السائلة في انابيـب اختبـار معقمـة أو مـن – ٦

. األفضل تعقم المنابت السائلة في األنابيب نفسها

باستخدام طريقة التخفيف المتتابعمن التربة عزل البكتيريا :الدرس العملي الثالث والمواد األدوات

وتعقم توضع في أنابيب اإلختبار ( ماء مقطر + أنابيب اختبار ) + جم من التربة ١( ةعينات ترب+ أطباق بتري جاهز يوضع على حمام مائي بدرجـة المعقم Nutrient agarار المغذيجمنبت اآل) + لعمل تخفيفات التربة

م٥ ٥٠ -٤٥ :خطوات العمل

بحيث يكون حجم الماء في أحد األنابيـب ) تحتوي على ماء معقم ( بعد تجهيز مجموعة من أنابيب اإلختبار – ١ .مل ٩مل وفي البقية ١٠

٢

أحیاء دقیقة عملي

ثـم ١-١٠ X ١فيكون التخفيف ماء معقم مل ١٠ بها ختبارإ أنبوبةجم من التربة وتوضع في ١نأخذ وزن – ٢مل فيصبح التخفيـف فـي ٩ويوضع في األنبوب الثاني ذو الحجم ) ١-١٠ X ١(خفف مل من األنبوب الم١يؤخذ

حتى نحصل على عدد من األنابيب ذات التخفيفـات وهكذا على التوالي وبجوار اللهب٢-١٠ X ١ األنبوب الثاني . المتتابعة

Nutrient agar اآلجار المغذي صب عليه البيئةنثم معقم التخفيف األول في طبق بتريمل من ١صب – ٣ . يكرر العمل مع التخفيفات األخرى وهكذا الموجودة في الحمام المائي

وبعد فتـرة التحضـين ساعة ٤٨ -٢٤من ٥م ٣٥تترك األطباق لتبرد ثم حضنها وهي مقلوبة عند درجة – ٤األصـلية بـدون تحسب عدد الخاليا الموجودة في كل طبق ومنها يتم حساب عدد الخاليا الموجودة في العينـة

. وتستعمل طرق التخفيف للحصول على مزارع نقية كذلك لسهولة عد الخاليا . تخفيف

الصبغ البسيط : الدرس العملي الرابع والمواد األدوات

+ ابر تلقـيح + أحواض الصبغ + ٢أو صبغة أزرق الميثيلين ١صبغة الصفرانين+ أطباق بتري مزروعة مسبقا .بنزنهب ل

العملخطوات .مستعمرات بكتيرية مزروعة في أطباق بتريتجهيز معلق بكتيري من – ١وذلـك باسـتخدام حتى تتكون عكارة خفيفة بعد نشر المعلق الزجاجيةشريحة ال علىيثبت المعلق البكتيري – ٢

) تجفيف غير مباشر ( اللهب تيـار ( ثم اغسلها في المـاء فقط ثانية ٣٠على الشريحة لمدة ) الصفرانين أو أزرق الميثيلين(ضع الصبغة – ٣

)الماء خفيف . بوضع نقطة زيت سيدر على الغشاء جفف الشريحة ثم افحصها بالمجهر – ٣

الصبغ البسيط بالصفرانين أو أزرق الميثلين

ثم یضاف لتر ماء مقطر % ٩٥ول ایثیلي مل من الكح ١٠٠جم من الصفرانین وإذابتھ في ٢.٥یحضر بوزن ١مل من محلول ھیدروكسید ١٠٠ثم یضاف إلى% ٩٥مل من الكحول ایثیلي ٣٠جم من صبغة أزرق المیثیلین ویذاب بـ ٠.٣یحضر بوزن ٢

% . ٠.١البوتاسیوم

٣

أحیاء دقیقة عملي

)الصبغة التفريقية ( جرام صبغة : الخامس الدرس العملي والمواد األدوات

+ أحواض الصـبغ + ٤ستال البنفسجييالكر+ ٣اليود+ %٩٥ الكحول+ )الصبغة العكسية ( صبغة الصفرانين

.حوامل الشرائح + ابر التلقيح

خطوات العمل .)من أطباق بتري مزروعة بالبكتيريا ( عمل معلق بكتيري – ١ . بتمريره على اللهب المعلق البكتيري بتثي – ٢ ) تيار خفيف ( لمدة دقيقة ثم تغسل بالماء صبغة الكرستال البنفسجي نضيف – ٣ )تيار خفيف ( ثم تغسل بالماء نضيف اليود لمدة دقيقة – ٤ ) تيار خفيف ( ثانية ثم تغسل بالماء ٢٠نضيف الكحول لمدة - ٥ )تيار خفيف ( ثانية ثم تغسل بالماء ٣٠ نضيف الصفرانين لمدة - ٦ .تجفف الشريحة ثم تفحص – ٧

:يمكن التمييز بين مجموعتين من البكتيريا : مالحظة تأخذ اللون البنفسجي رام جبكتيريا موجبة إذا كانت ال – ١ .األحمر اللون رام تأخذجبكتيريا سالبة ال إذا كانت – ٢

موجبة جرام -العصوية البكتيريا

ثم یذاب في ٢+ جم ١یحضر بوزن صبغة الیود ٣ یحفظ المحلول في زجاجة . مل م ء م طر٣٠٠جم یودید البوتاسیوم ثم یطحنان بالھاون معا

.ملونة + جم ٠.٨أكساالت األمونیوم ( ثم یخلط مع محلول % ٩٥مل من الكحول ایثیلي ٢٠جم من صبغة الكریستال البنفسجي ویذاب بـ ٤حضر بوزن ٤ ) .مل م ء م طر ٨٠

٤

أحیاء دقیقة عملي

موجبة جرام -الكروية البكتيريا جرام سالبة -العصوية البكتيريا

جرام سالبة -الكروية البكتيريا

الصبغ السالب: سادس الدرس العملي ال والمواد األدوات

)أو الحبر الشيني ( ٥روسينلنجصبغة ا+ شرائح زجاجية + معلق بكتيري :خطوات العمل

.علق البكتيري على الشريحة ضع قطرة من الم – ١ .روسين فوق المعلق ثم اخلطهم جيدا نجضع قطرة من صبغة ال – ٢

مل من الماء المقطر ٠٠روسین وتذاب فيلنججم من صبغة ا١یحضر بوزن ٥

٥

أحیاء دقیقة عملي

بوضعها بزاوية معينة حتى تالمس الخلـيط ثـم شريحة أخري طرف افرد الخليط على الشريحة باستخدام – ٣ . اسحبها في اإلتجاه اآلخر ليتكون غشاء يتفاوت لونه بين األسود والرمادي

.ليجف في الهواء ثم يتم الفحص ك الغشاءاتر – ٤

صبغ الجراثيم : سابع الدرس العملي ال والمواد األدوات

بوضع مزرعة البكتيريا المختلطة في حمام مائي بحيـث يمكن الحصول عليها وذلك ( عينات بكتيريا متجرثمة محافظا على هذه الدرجـة لمـدة ٥م٨٠ها لدرجة يكون سطح الماء فيه أعلى من سطح الخليط في األنبوبة وسخن

بواسطة اإلبرة المعقمة انقل مسحة من البكتيريا . دقيقة حتى يتم قتل الخاليا الخضرية غير المكونة للجراثيم ١٥سـاعة ٤٨-٢٤لمـدة ٥م ٣٠احفظ األطباق مقلوبة في الحاضنة عند درجة . إلى سطح الوسط الغذائي الصلب

اعمل صبغة جرام لمستعمرة معزولة وعنـد التأكـد . ت من البكتيريا المكونة للجراثيم فقطفتحصل على مجموعاليومين أو يومين وبذلك تحصل على مزرعة نقية من ٥م ٣٠مائل وحضنها في درجةمن نقاوتها لقح أنبوبة آجار

. ٧الصفرانين+ شرائح + لهب + ٦صبغة األخضر مالكيت+ ) البكتيريا المكونة للجراثيم خطوات العمل .البكتيري وتثبيته على الشريحة لغشاءتحضير ا -١ ) مراعاة إضافة الصبغة كلما حدث تبخر للصبغة ( دقائق مع التسخين ٥نضيف أخضر المالكيت لمدة – ٢ .غسل الشريحة بتيار خفيف من الماء بعد التخلص من الزيادة من الصبغة – ٣ .ثم تغسل الشريحة ثانية ٣٠إضافة صبغة الصفرانين لمدة – ٤ .تجفف الشريحة ثم تفحص – ٥

.مل من الماء المقطر ١٠٠جم من أخضر المالكیت ویذاب في ٥وزن یحضر ب ٦ .مل من الماء المقطر ١٠٠جم من الصفرانین ویذاب في ٠.٥تختلف عن الصبغ البسیط وصبغ الجرام ویحضر بوزن ٧

٦

أحیاء دقیقة عملي

جراثيم وسطية

جراثيم طرفية

اإلسبيروكيتات) Spirochaete( صبغ البكتيريا الحلزونية : ثامن الدرس العملي الركبـة ، حيـث عبارة عن بكتيريا حلزونية رفيعة ال يمكن رؤيتها إال باستعمال صبغات خاصة وم اتالسبيروكيت

.تقوم هذه الصبغات بترسيب بعض المواد على خلية البكتيريا ، ويؤدي ذلك إلى صبغها والمواد األدوات

.أو يفضل أخذ جزء من مخلفات الطعام الموجودة على األسنان أو بينها اتمزرعة السبيروكيت – ١ ٨مثبت فونتانا – ٢ . ٩معمق فونتانا – ٣ يحضر: ا محلول فضة فونتان – ٤ ماء مقطر مل ١٠٠جرام نترات فضة في ٥يذاب -أ

مل ماء مقطر ٤٥من محلول أمونيا مركزة بـ مل ٥خفف –ب مل من محلول مخفف األمونيا٢٥مل من محلول نترات الفضة وأضف إليه ٩٠خذ –ج

ماء قطر مل ١٠٠+ مل فورمالین ٢+ مل حمض الخلیك الثلجي ١من یتكون ٨ مل ١٠٠اء م طر م+ جرام ٥تانیك یتكون من حمض ٩

٧

أحیاء دقیقة عملي

.أستمر في إضافة األمونيا نقطة نقطة حتى يذوب الراسب المتكون –د إلى المحلول الرئيسي نقطة نقطة حتى يتكون عطارة ) مل المحتفظ بها ١٠( ول نترات الفضة أضف محل -هـ

أحفظ المحلول لإلستخدام . خفيفة

خطوات العمل .وثبته بالحرارة مستعمال اللهب اتحضر غشاء من السبيروكيت – ١ .ثانية ٣٠مرات بمثبت فونتانا كل مرة ٣عامل الغشاء – ٢ .دقائق على الغشاء ٣مثبت بكحول مطلق واترك الكحول أغسل ال – ٣ .أزل الزيادة من الكحول بكل دقة واجعل الزيادة من الكحول تجف على اللهب – ٤ .ثانية ٣٠سخن حتى يتصاعد البخار وتترك . ضع معمق فونتانا على الغشاء – ٥ .أغسل بالماء المقطر ثم أترك الشريحة لتجف – ٦ .ثانية أو حتى يصبح الغشاء بني اللون ٣٠ء بمحلول فضة الفونتانا وأترك المحلول عامل الغشا – ٧ جفف في الهواء ثم أفحص بالعدسة الزيتية . أغسل بالماء المقطر – ٨

:مالحظة يمكن مشاهدة البكتيريا التالية ) ميكرون في الطول ٤-٣( حلزونية قصيرة نسبيا - )رون في الطول ميك ٨-٣( حلزونية طويلة نسبيا -

دراسة شرائح البكتيريا : التاسعالدرس العملي :شرائح جاهزة ةكروي أشكال البكتيريا

٨

أحیاء دقیقة عملي

ةعصوي

)األرثروسبيرا ( حلزونية

)تشابكس ( بيئة الفطريات تحضير : العاشرالدرس العملي والمواد األدوات

لتر/جم ٠.٥كلوريد البوتاسيوم – ١ لتر/جم ٢نترات الصوديوم – ٢ لتر/جم ٠.٥كبريتات المغانيسيوم – ٣ لتر/جم ١ثنائي هيدروجين فوسفات البوتاسيوم – ٤ لتر/جم ١٧جلوكوز – ٥ لتر/جم ١٠آجار – ٦ .لتر / مل ١٠) Rose bengal( ١٠صبغة روز بنغال – ٧

جهاز التعقيم+ أطباق بتري + لهب + ميزان + دوارق

.مل من الماء المقطر ١٥٠جم من الصبغة في ١یحضر بإذابة ١٠

٩

أحیاء دقیقة عملي

زراعة الفطريات من الهواء: الحادي عشر الدرس العملي والمواد األدوات

حاضنة + طبق بتري يحتوي على بيئة تشابكس خطوات العمل

.لمدة من الزمن يتم تعريض طبق بتري المحتوي على بيئة لنمو الفطريات للهواء -١ .أيام لنمو الفطريات ٧-٤يوضع الطبق في الحاضنة لمدة من – ٢ .عند نمو الفطريات يمكن أن تحتفظ بها في الثالجة – ٣

التعرف على أنواع الفطريات الموجودة في أطباق بتري : الثاني عشر الدرس العملي والمواد األدوات

أغطية شرائح+ شرائح جديدة + إبرة تلقيح + ماء مقطر + لهب + ة طبق بتري يحتوي على فطريات نامي خطوات العمل

يمكن فحصها للتعرف على األنواع التي نمت وذلك بأخذ جزء بسيط بواسطة إبرة التلقيح ثم توضع على شـريحة عرف علـى زجاجية ويضاف إليها نقطة من الماء المقطر ثم تغطى بغطاء الشريحة ويتم فحصها تحت المجهر للت

.األنواع المختلفة

الجاهزةشرائح الفطريات بعض دراسة: الثالث عشر الدرس العملي طائفة الفطريات الزيجية

التكاثر باإلقتران، الشكل العام فطر عفن الخبز فطر عفن الخبز

١٠

أحیاء دقیقة عملي

التكاثر الجنسي باإلقتران

: طائفة الفطريات الزقية ل العام ، التبرعمالشك الخميرة

البنسيليوم اإلسبرجلس

الخميرة

التبرعم في الخميرة

١١

أحیاء دقیقة عملي

البنسيليوم

سبرجلساإل

: طائفة الفطريات البازيدية ، الخياشيم الشكل العام) عيش الغراب( فطر أجاريكس

)، الخاليا اليوريدية نيديالكأس األسيدي ، الوعاء البك: صدأ القمح( بكسينيا جرامينيس الشكل العام ) عيش الغراب( فطر أجاريكس

١٢

أحیاء دقیقة عملي

في الخياشيم.ق

جزء مكبر – في الخياشيم.ق

الكأس األسيدي: )صدأ القمح ( فطر بكسينيا جرامينيس

١٣

أحیاء دقیقة عملي

يديالوعاء البكن

الجراثيم اليوريدية

البوجو كانديدا: البيضية طائفة الفطريات