II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.
-
Upload
benoit-soulier -
Category
Documents
-
view
106 -
download
0
Transcript of II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.
![Page 1: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/1.jpg)
II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes
![Page 2: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/2.jpg)
2
Généralités
• Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes)
• Marquage fluorescent des molécules à suivre
![Page 3: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/3.jpg)
3
Concentrations ioniques
• Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide
• Indicateurs sensibles aux ions– luminescents (aequorine de la
méduse)– fluorescents
![Page 4: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/4.jpg)
6
Autres indicateurs fluorescents
• Autres ions
![Page 5: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/5.jpg)
7
Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur
• Anticorps• Protéine cellulaire purifiée marquée• Exemple tubuline
![Page 6: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/6.jpg)
8
Fig 18-21 tubuline
![Page 7: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/7.jpg)
9
Fig 16-12 tubuline
![Page 8: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/8.jpg)
10
Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une
fonction• Anticorps anti myosine-II dans un œuf
d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose
![Page 9: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/9.jpg)
11
Quatre méthodes d'introduction de molécules
dans la cellule
• Microinjection• Électroporation• Vésiculation• Projection à haute vitesse…
![Page 10: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/10.jpg)
12
Fig 9-40 (AB)
![Page 11: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/11.jpg)
13
Fig 9-40 (CD)
![Page 12: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/12.jpg)
14
Molécules captives
• Synthèse d'une forme inactive de la molécule
• Introduction dans la cellule• Activation à un temps et moment
donné par un faisceau lumineux• eg : molécules captives pour Ca++,
AMPc, GTP, IP3
![Page 13: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/13.jpg)
15
Fig 9-41 Caged molecules
• La molécule X devient active après le flash d'UV
![Page 14: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/14.jpg)
16
Application
• Molécules fluorescentes piégées• Grosse modification de la molécule
qui doit rester active grosse difficulté
• Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules
• eg : tubuline
![Page 15: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/15.jpg)
17
Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine
• Tubuline rhodamine (rouge)• Dapi ADN (bleu)• Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et
invisible avant le rayon d'UV)
Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique
Après 1,5 mn Après 2,5 mn
![Page 16: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/16.jpg)
18
![Page 17: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/17.jpg)
19
![Page 18: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/18.jpg)
20
![Page 19: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/19.jpg)
21
![Page 20: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/20.jpg)
22
Desai,A1998
![Page 21: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/21.jpg)
23
![Page 22: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/22.jpg)
24
Green Fluorescence Protein
![Page 23: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/23.jpg)
25
Fig 9-43 GFP
![Page 24: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/24.jpg)
26
GFP 3D
![Page 25: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/25.jpg)
27
GFP TopolGFP
![Page 26: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/26.jpg)
28
GFP mice
![Page 27: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/27.jpg)
30
GFP
![Page 28: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/28.jpg)
32
• Isolement• Séparation (FACS)• Culture primaire et secondaire• Milieu de culture• Lignée cellulaire• Transformation• Congélation• Clone• Hybride
III - Culture cellulaire
![Page 29: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/29.jpg)
33
Facs
![Page 30: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/30.jpg)
34
Hybride cellulaire
![Page 31: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/31.jpg)
35
Production AC monoclonaux
![Page 32: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/32.jpg)
36
Culture SEM
![Page 33: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/33.jpg)
37
Immuno gold en ME
ME Immuno-gold
![Page 34: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/34.jpg)
38
• Pulse-chase• Patch-Clamp• Molécules « piégées »• Les anticorps
– immunofluorescence directe– immunofluorescence indirecte
Pistage de molécules dans la cellule
![Page 35: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/35.jpg)
39
Fig 9-46
![Page 36: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/36.jpg)
40
Fig 9-47
Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas
Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse
![Page 37: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/37.jpg)
41
Fig 9-48
![Page 38: II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062622/551d9dbc497959293b8df697/html5/thumbnails/38.jpg)
42
• Techniques biochimiques
IV - Fractionnement des cellules et analyse des
molécules