Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Pengolahan Plaa-Som, Produk Fermentasi Ikan Tradisional Thailand

AbstrakPlaa-som adalah produk fermentasi ikan ala Thai dari ikan utuh maupun filet yang difermentasi dengan nasi, garam, dan bawang. 762 jumlah total bakteri asam laktat (BAL) diisolasi dari kultur agar lempeng CaCO3-MRS selama fermentasi plaa-som. BAL disaring dan dikelompokkan dengan analisa restriksi DNA ribosom (ARDRA), menghasilkan 6 kelompok berdasarkan DNA ribosom-nya yaitu Lactococcus garvieae, Streptococcus bovis, Weissella cibaria, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, dan Lactobacillus fermentum. Bahan segar yang dicampurkan mengandung populasi BAL rendah (kurang dari 10 CFU / g) selama fermentasi dan populasi fermentasi akhir sekitar 107 CFU / g. Pada proses awal didominasi Lc. garvieae, S. bovis, and W. cibaria. Pada fermentasi selama 48 jam terdapat W. cibaria, P. pentosaceus, and Lb. plantarum yang didominasi Lb. Plantarum sampai fermentasi selesai. Campuran spesies-spesies BAL tersebut dianggap spesies yang dapat dikembangkan sebagai kultur starter fermentasi Plaa-som.

1. PendahuluanPlaa-som adalah produk fermentasi ikan ala Thai dari ikan utuh maupun filet yang difermentasi dengan nasi, garam, dan bawang sampai dihasilkan rasa asam yang dapat diterima (TISI, 2005). Setelah fermentasi, ikan dimasak dengan deep frying atau dibakar sebelum dikonsumsi. Sebagai produk fermentasi tradisional, resep pembuatannya berbeda-beda menurut kerajaan-kerajaan Thailand, tergantung dengan konsumen lokal dan ketersediaan bahan (Valyasevi and Rolle, 2002). Hasilnya mikrobiologi, karakteristik kimia dan sensoriknya berbeda-beda. Proses produksi secara tradisional bergantung pada fermentasi spontan yang ditandai dengan munculnya mikroorganisme alami, terutama bakteri asam laktat (BAL), yang ditemukan dalam bahan, peralatan pengolahan, dan atmosfer lokal sebagai starter alami (Khieokhachee et al., 1997; Valyasevi and Rolle, 2002; Visessanguan et al., 2004). Selama fermentasi, BAL memanfaatkan substrat karbohidrat yang tersedia dalam sistem fermentasi dan menghasilkan asam-asam organik, terutama asam laktat, sebagai bagian dari metabolitnya (Kandler, 1983; Paludan-Mller et al., 2002a). Asam-asam tersebut tidak hanya menghasilkan rasa, aroma, dan tektur tetapi juga mengakibatkan pH rendah yang mana menjadi faktor kunci mutu dan keamanan (Owens and Mendoza, 1985; Paludan- Mller et al., 2002a; Visessanguan et al., 2006; Kopermsub and Yunchalard, 2008). Penelitian untuk menentukan dan mengembangkan kultur starter BAL untuk produksi Plaa-som akan memungkinkan proses yang lebih terkontrol dan menghasilkan produk dengan konsistensi yang lebih besar dalam kualitas dan keamanan. Pembentukan starter seperti itu perlu dikembangkan dari spesies utama BAL yang diinginkan selama proses fermentasi Plaa-som. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan spesies dominan BAL yang tumbuh selama proses tradisional tapi diharapkan keberadaannya dalam fermentasi Plaa-som di wilayah timur laut Thailand.

2. Materi dan Metode2.1. Preparasi Plaa-som dan SamplingDua batch Plaa-som 10 kg produksi lokal terpilih dari Khon Kaen, sebuah provinsi di wilayah timur laut Thailand dengan teknik tradisional dan resep produsen. Ikan air tawar Thai, Barb Perak (Barbodes gonionotus), dengan nama lokal Plaa-ta-pien, masing-masing sekitar 300 g sebagai bahan baku utama. Ikan disiangi, dihilangkan sisiknya, dibelah kedua sisi, dicuci dengan air bersih selama 3-4 kali, direndam dalam air garam laut 25% (b/v) selama kurang lebih 3 jam, kemudian dibilas dengan air bersih dan dikeringkan. Ikan yang bersih dan kering kemudian dicampurkan dengan garam laut dan gula, masing-masing sekitar 150 g dan 50 g/10 kg ikan, diikuti dengan beras jasmine kukus dan bawang putih cincang 1000 g dan 50 g/10 kg ikan. Campuran bahan juga dimasukkan ke dalam perut ikan. Tempatkan ikan dalam mangkok yang ditutupi dengan lembaran plastik dan disimpan pada suhu 30C selama 6 jam untuk difermentasi. Kemudian ikan disimpan pada suhu -18C selama 6 jam setelah masing-masing ikan dikemas dalam kantong plastik 1 kg. Udara dikeluarkan dari kantong dengan menekannya kemudian diikat dengan karet gelang. Fermentasikan pada suhu 30 C selama 144 jam (6 hari). Sampel Plaa-som dianalisa kimia dan mikrobiologinya selama proses produksi pada langkah-langkah dan waktu sebagai berikut: Setelah pencampuran dan pengisian bahan ke dalam perut ikan, disebut sampel 1; 6 jam setelah pencampuran disebut sampel 2, setelah dikemas dan disimpan dalam alat pembekuan pada suhu -18C disebut sampel 3, dan setiap selang 24 jam selama fermentasi pada suhu 30 C selama 144 jam disebut sampel 4 9.2.2. Isolasi Bakteri Asam LaktatSatu Ikan utuh diambil sebagai sampel dengan aseptis dipotong kecil-kecil sebelum dihomogenisasi dengan Stomacher 400 Lab Blender (Seward Ltd, Worthington, Inggris) kecepatan tinggi selama 3 menit dan diencerkan dengan pengenceran desimal dalam air garam pepton (0,1% (b/v) pepton dan 0,85% (b/v) NaCl dalam air suling) dan diinokulasikan secara triplo untuk dihitung koloninya kemudian diisolasi dengan teknik lempeng spread (Speck, 1984). BAL diisolasi menggunakan inkubator mikroaerob dalam candle jar pada suhu 30C selama 3-5 hari dengan agar MRS (Man et al., 1960) dimodifikasi dengan penambahan 1,0% (b / v) CaCO3. Asam yang diproduksi koloni bakteri diambil dari agar lempeng. Kemungkinan lebih dari 100 isolat terambil dari tiap sampel. Semua isolat dimurnikan dan dipastikan sebagai BAL setelah diketahui karakteristik biokimia dan mikroskopiknya dengan menggunakan pewarnaan gram, uji katalase, dan uji fermentasi glukosa O-F. Semua isolat BAL disimpan pada suhu -80 C dalam alat pembekuan (Gibson dan Khoury, 1986) sampai dapat diidentifikasi dengan Analisis Restriksi DNA Ribosom (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)) dan sekuensing DNA ribosom (Ribosomal DNA Sequencing).2.3. Ekstraksi dan persiapan genom DNA dari isolat BAL Isolat BAL dibiakkan selama 12 jam dalam 1,5 ml MRS broth pada suhu 30C dan sel-sel disentrifus (pemisahan komponen-komponen sel) dengan kecepatan 5000 rpm selama 3 menit [Refrigerated microcentrifuge (model: Sigma 3K15, SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Jerman)]. MRS broth dikeluarkan dari tabung dan genom DNA diekstraksi dari pelet selnya (struktur-struktur lebih besar yang terkumpul di bagian bawah tabung sentrifuge), menurut modifikasi metode Anderson dan McKay (1983) dan Wilson (1990). Genom DNA diekstraksi dari setiap isolat BAL dengan elektroforesis gel horisontal [aparat gel horisontal (GelMate GEP102, Toyobo Co, Ltd, Osaka, Jepang)] dengan 0,8% (b / v) agarosa yang mengandung 0,5 mg / ml ethidium bromida di TBE 0.5x menggunakan 100 V selama 20 menit. Gel itu divisualisasikan menggunakan Image Master VDS (Amersham Plc., Buckinghamshire, Inggris). Konsentrasi dan kemurnian DNA juga ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri (Spektrofotometer UV-VIS, Shimadzu Corp, Kyoto, Jepang) berdasarkan Maniatis dkk. (1982). Preparasi DNA disimpan dalam 40 l air bebas- nuklease pada suhu -20C sampai digunakan.2.4. Amplifikasi rDNA 16S isolat BAL DNA dari stok yang disimpan dalam suhu -20C diencerkan antara 10 pg dan 1 g/50 ml menggunakan air suling bebas ganda-nuklease. Fragmen rDNA 16S diamplifikasi dengan PCR menggunakan universal primer set dari 27-f (5'-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3 ') dan 1490-r (5'-GTT ACC TTG TTA CGA CTT C-3 ') menurut Chen et al. (2005) menggunakan Cycler iCyclerThermal (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, USA). Semua reagen yang digunakan dalam amplifikasi PCR dibeli dari di Fermentas International Inc, Ontario, Kanada. Amplifikasi ini dilakukan dengan 50 l volume reaksi seperti yang dijelaskan oleh Hoefel et al. (2005). Setiap Reaksi PCR terdiri dari 200 M setiap dNTP, 1.0 pM primer masing-masing, 2.5 mM MgCl2, 1X PCR buffer, 2.5 U Taq polimerase DNA, dan 1 l DNA template. Siklus termal yang terjadi meliputi denaturasi tahap awal pada 95C selama 10 menit, 30 siklus dari tahap denaturasi padasuhu 95C selama 30 detik, tahap anil pada suhu 50C selama 1 menit, tahap ektensi pada suhu 72C selama 2 menit, dan ekstensi terakhir pada suhu 72C selama 10 menit. Produk PCR diperiksa menggunakan 0,8% (b / v) elektroforesis agarose gel. Gel divisualisasikan dengan menggunakan Image Master VDS.2.5. Analisis Pembatasan produk PCR rDNA 16SProduk PCR rDNA 16S dari masing-masing isolat BAL dipotong dengan individual tetrameric restriction endonuclease enzyme: Acc II (CG / CG) atau Hae III (GG / CC) menurut Sato et al. (2000) dan Chen et al. (2005), mengikuti prosedur yang diuraikan oleh Fermentas International Inc, Ontario, Kanada. Campuran reaksi pembatasan endonuklease dicampur dengan lembut dan diputar menurun selama beberapa detik. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 3 jam. Pola pembatasan atau profil ARDRA diperiksa dengan menggunakan 3,0% (b / v) gel agarosa di 0.5x penyangga TBE pada 100 V selama 40 menit [aparat gel horisontal (GelMate GEP102, Toyobo Co, Ltd, Osaka, Jepang)] dengan tangga DNA (GeneRuler 100 bp DNA tangga). Gel itu divisualisasikan menggunakan Image Master VDS.2.6. Sequencing rDNA 16SMasing-masing pola kelompok ARDRA secara acak dipilih untuk analisis sekuens. Analisis sekuens DNA dilakukan sesuai dengan metode dideoksi-dimediasi rantai terminasi (Sanger et al., 1977) menggunakan MegaBACE 1000 automated DNA sequencer (Pharmacia Biotech, Swedia) di laboratorium khusus sekuensing DNA Departemen Biokimia, Fakultas Kedokteran, Khon Kaen University. Pencarian homologi rDNA 16S diurutkan dengan GenBank dengan program BlastN.

3. HasilSebanyak 762 isolat BAL yang ditemukan dan dimurnikan dari sampel 1 sampai 9. Semua isolat dipastikan termasuk kelompok BAL berdasarkan Gram-positif, tidak ada aktivitas katalase, dan hasil positif untuk kemampuan fermentasi glukosa (data tidak ditampilkan). Dari semuanya, hanya dua isolat BAL yang ditemukan dari sampel 1. Seratus isolat BAL masing-masing ditemukan dari sampel 2 sampai 8, dan 60 Isolat BAL yang ditemukan dari sampel 9 seperti yang tercantum dalam Tabel 2.

Ditemukan bahwa dua primer terpilih mampu memperkuat fragmen rDNA 16S setiap isolat BAL yang mengakibatkan amplikon dari sekitar ukuran 1463 bp (data tidak ditampilkan). Kedua enzim tetramerik dipilih (baik Acc II atau III Hae) untuk pembatasan amplikon sehingga mampu membedakan semua 762 isolat BAL menjadi 6 pola pembatasan. Pola-pola ini, atau profil ARDRA, tertulis A, B, C, D, E, dan F seperti ditunjukkan pada Gambar. 1 dan tercantum dalam Tabel 1. Isolat yang mewakili setiap profil dianalisis untuk urutan rDNA 16S. Pencarian homologi urutannya melampirkan (dengan 99-100% homologi) profil yang A milik Lactococcus garvieae, profil B milik Streptococcus bovis, profil C milik Weissella cibaria, Profil D milik Pediococcus pentosaceus, profil E milik Lactobacillus plantarum, dan profil F milik Lactobacillus fermentum. Urutan tersebut disetorkan ke GenBank Database. Nomor aksesi urutannya ditunjukkan pada Tabel 1. Frekuensi isolasi setiap spesies dari 100 isolat yang diambil pada setiap waktu sampel tercantum dalam Tabel 2.Hanya dua isolat BAL (Lc. garvieae dan S. bovis) ditemukan dari bahan baku setelah pencampuran (sampel 1). Selanjutnya, sebanyak 37 isolat dari 762 isolat BAL yang ditemukan adalah S. bovis (9 dan 28 isolat dari sampel 2 sampai 3 diambil selama tahap awal fermentasi). Dengan demikian, hanya 38 isolat yang diambil dari sampel 1 sampai 3 diidentifikasi sebagai S. bovis. Lc. garvieae yang tumbuh selama penyimpanan 6 jam berikutnya dengan bahan tambahan yang dicampurkan dan mewakili 88% isolat BAL. Pada isolasi tahap ini terdapat sedikit S. bovis dan W. cibaria. Lc. garvieae juga dominan (56%) di campuran setelah pembekuan, diikuti oleh S. bovis (28%) dan W. cibaria (16%). Selama fermentasi, Lc. garvieae semakin menghilang dari sampel 4 sampai 7 dan masing-masing 13, 13, 2, serta 4% dari isolat. W. cibaria pertama ditemukan dari sampel 2 sebesar 3% kemudian mengalami peningkatan pada sampel 3.W. cibaria ditemukan sebagai spesies dominan dalam sampel 4, mewakili 85% dari isolat. Namun, kemudian menurun selama fermentasi (sampel 5 sampai 9), dan hanya 1,6% pada sampel 9. P. pentosaceus dan Lb. plantarum pertama kali diisolasi pada frekuensi 1% pada sampel 4 kemudian menjadi dominan dalam sampel 5 dan 6 pada masing-masing frekuensi 30%, 29% dan 29%, 57%. Setelah itu, P. pentosaceus menurun menjadi sekitar 8% pada sampel 9. Tahap akhir fermentasi didominasi dengan Lb. plantarum yang memberikan frekuensi isolasi sama tingginya 70-90% pada sampel 7 sampai 9. Lb. fermentum kadang-kadang ditemukan dari sampel 6 sampai 8, tapi pada frekuensi yang rendah (sekitar 1%).

4. PembahasanDalam memproduksi makanan berfermentasi, matriks awal makanan menyajikan kondisi abiotik dan biotik yang dipilih untuk pertumbuhan koloni mikroba tertentu (Giraffa, 2004). Pada Plaa-som, konsentrasi awal garam (1,43% b/b) dan gula (0,5% b/b) dengan pengaruh antimikroba dari bawang putih terpilih bertujuan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat yang berkembang dari populasi awal sangat rendah sampai lebih besar dari 107 CFU/g. Akibatnya, pH produk menurun dari sekitar 6,5 menjadi sekitar 4,5. Penemuan ini konsisten dengan penelitian sebelumnya dengan produk yang sama (Tanasupawat dan Komagata, 1995; Paludan-Mller et al, 1999.; Kopermsub dan Yunchalard, 2008).Dalam penelitian ini, ARDRA melakukan penyaringan dan identifikasi dalam jumlah besar (762) isolat BAL yang diperoleh dari fermentasi Plaa-som. Berdasarkan penyaringan ini, isolat dikategorikan menjadi enam kelompok berbeda yang diurutkan menjadi enam spesies (Tabel 1). Peneliti lain juga melaporkan kegunaan ARDRA untuk pengelompokan cepat dan identifikasi isolat BAL (Sato et al, 2000.; Vaneechoutte dan Heyndrickx, 2001; Chen et al, 2005, 2006). Bakteri asam laktat dari campuran bahan baku segar dan bisa disebabkan proses higienis yang diadopsi oleh tempat produksi lokal. Tahap pembersihan dan pencucian sebelum bahan baku dan bahan-bahan tambahan dicampurkan menghasilkan BAL kurang dari 10 CFU / g. Namun, pada penyimpanan berikutnya dari campuran bahan (sampel 2) menghasilkan pertumbuhan BAL yang didominasi Lc. garvieae, S. bovis, dan W. cibaria dan jumlah total ditemukan meningkat menjadi 104 CFU / g. Uniknya proses pembekuan digunakan dalam proses ini diperlukan untuk membuat tekstur ikan padat dan juga, memungkinkan penyimpanan jangka panjang dalam produksi Plaa-som skala besar. Proses pembekuan dan pelelehan menyebabkan pengurangan jumlah total populasi BAL yang kecil sampai sekitar 5 103 CFU / g. Namun demikian, spesies BAL yang ditemukan dari tahap awal seperti Lc. garvieae, S. bovis, dan W. cibaria masih ada dan ditemukan dari sampel 3 setelah pembekuan dan pelelehan.S. bovis ditemukan pada tahap awal produksi dan konsisten menghasilkan amilase yang mungkin berperan dalam degradasi pati nasi, yang menjadi bahan kunci dari Plaa-som (Cotta, 1988;. Narita et al, 2004). Monosakarida dan disakarida yang dihasilkan oleh aktivitasnya akan menyediakan karbohidrat untuk BAL lain dalam melakukan proses fermentasi dan menghasilkan asam laktat (Kandler, 1983) yang memberikan rasa asam yang diinginkan dan flavor Plaa-som. S. bovis dilaporkan terkait dengan mikroba di hewan dan sebelumnya diisolasi dari perut babi (Fuller et al., 1978). Oleh karena itu, ditemukannya S. bovis dari tahap awal proses bisa disebabkan oleh kontaminasi dari lingkungan pedesaan yang berdekatan dengan peternakan hewan dan pengolahan daging babi dalam pembuatan produk lainnya di lokasi produksi. Meskipun BAL umumnya dikenal sebagai mikroorganisme yang aman, ada beberapa kekhawatiran tentang patogenisitas S. bovis dan Lc. garvieae (Collins et al, 1983;. Cai et al, 1999;. De Herdt et al, 1992;. Vendrell et al, 2006). Lc. garvieae yang biasanya telah diperkenalkan ke produk makanan dari ternak dan ikan dan sering dikenal sebagai ternak atau ikan patogen (Collins et al., 1983; Vendrell et al, 2006). Namun, Lc. garvieae juga dapat diisolasi dari spesies dominan dari usus ikan yang sehat (Cai et al., 1999). Selain itu, Lc. garvieae telah ditemukan dalam sosis dan ikan fermentasi (Paludan-Mller et al, 2002a; Ammor et al, 2005). Meskipun S. bovis umumnya menghuni saluran pencernaan ruminansia, terkadang ditemukan sebagai penyebab penyakit manusia (De Herdt et al, 1992;. Whitehead dan Cotta, 2000). Namun, itu bukan masalah kesehatan yang serius karena ditemukan juga dalam produk susu seperti susu fermentasi dan keju (Randazzo et al, 2002;.. Rashid et al, 2007). Terlepas dari masalah kesehatan, strain S. boviswas disarankan sebagai starter probiotik dalam fermentasi makanan sehari-hari karena dapat menghasilkan angiotensin tinggi, mengubah senyawa enzimpenghambat yang bermanfaat untuk menurunkan tekanan darah tinggi manusia dan hewan (Rasyid dkk., 2007). Adanya W. cibaria pada tahap awal produk pengasaman fermentasi sesuai dengan Ampe et al. (1999), yang melaporkan spesies dari kelompok Leuconostoc-Weissella selalu ada pada tahap awal fermentasi sayuran dan pozol yang berkontribusi dalam pengasaman produk. Selain itu, W. cibaria juga ditemukan dan terisolasi dari Plaa-som dalam penelitian sebelumnya ditemukan dapat menghasilkan zat antimikroba yang disebut Weissellicin 110 (Srionnual et al., 2007).Setelah melalui proses pembekuan dan pelelehan, Plaa-som mengalami fermentasi BAL yang kuat yang ditandai dengan pergeseran ekologi dari spesies yang terlibat. Dari sampel 4 sampai 9, tiga-langkah suksesi BAL diamati. Pertama, spesies heterofermentatif dominan W. cibaria memberi jalan untuk BAL yang mendominasi lain dari spesies heterofermentatif W. cibaria, dan Lb. plantarum, dan spesies homofermentatif, P. pentosaceus. Hal ini akhirnya memberi jalan untuk Lb. Plantarum sebagai spesies dominan. Keunggulan Spesies ini konsisten dengan ditemukannya pada produk fermentasi ikan Thailand lainnya (Tanasupawat dan Daengsubha, 1983; Paludan-Mller et al, 1999, 2002a, b;. Srionnual et al, 2007). Lb. plantarum, ditemukan dalam tahap akhir fermentasi Plaa-som, disebutkan pula sebagai varietas dalam fermentasi sayuran (McDonald et al, 1990;. Brauman et al, 1996.). Penelitian ini secara khusus hanya menyelidiki spesies BAL untuk fermentasi Plaa-som karena pentingnya BAL dalam memproduksi produk dengan karakteristik yang diinginkan. Bakteri lain serta ragi mungkin juga terlibat, dan penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki kemungkinan ini.

5. KesimpulanHasil yang diperoleh dari penelitian ini adalah menetapkan distribusi dan suksesi spesies BAL yang dominan selama fermentasi Plaa-som. Spesies BAL yang dominan adalah Lc. garvieae, S. bovis, W. cibaria, P. pentosaceus, dan Lb. plantarum. Ini menjadi informasi berguna yang diperlukan lebih lanjut untuk mengembangkana starter BAL yang diinginkan sehingga proses fermentasi Plaa-som lebih terkendali dan akan memberikan kualitas produk yang lebih sesuai. Kultur starter Plaa-som yang sesuai berisi campuran dari semua atau sebagian spesies BAL dominan yang saat ini perlu dipertimbangkan.