IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNEDE LA RESPUESTA INMUNE

RESPUESTA INMUNE HUMORAL

SEROLOGÍAsuero estudio

“Ciencia de la detección de anticuerpos”

Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines diagnósticos, a partir del suero de un animal.

Sensibilidad

Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos”

(VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”.

Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA

Especificidad

Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos”

(VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”.

Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING

Negativo Negativo verdaderoverdadero

Falso negativoFalso negativo--

Falso positivoFalso positivoPositivo Positivo verdaderoverdadero++

SANOSANOENFERMOENFERMO

AnimalPr

ueba

1. PRIMARIAS

2. SECUNDARIAS

3. TERCIARIAS

Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado

Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in vitro

Miden las consecuencias o el efecto protector de anticuerpos en el animal (in vivo)

CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL

0200400600800

10001200140016001800

0 30 60 90120 150 180 210 240 270 300 330 360

PostPost--infeccióninfecciónNaturalNatural

PostPost-- VacunaciónVacunaciónB. abortus B. abortus cepacepa 1919

Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus

IgIg MM

IgIg GG

0200400600800

10001200140016001800

0 15 30 45 60 75 90105 120 135 150 165 180

Ig M

IgIg GG

Respuesta inmune humoralBrucella abortus

Isotipo Cantidad Presencia Características

IgM Abundante Temporaria Inespecífica ? IgG1 Abundante Continua EspecíficaIgG2 Escasa Discontinua EspecíficaIgA Abundante Discontinua Específica

APLICACIONES EN R. A. BRUCELOSIS BOVINA

Resolución 438/2006 del SENASA.

PAL - ELISA IVIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA

FC DEFINITORIA

SAT + 2-ME – FPA ELISA C

COMPLEMENTARIAS

BPA – ELISA ITAMIZ

Prueba

Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a

través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del

sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.

ENZIMAS UTILIZADAS

• PEROXIDASA

• Fosfatasa alcalina

SUSTRATO

• ortofenildiamina

• paranitrofenilfosfato

ELISA

PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS

Tipos de pruebas

INDIRECTA COMPETICIÓNSANDWICH

detección de ANTICUERPO

detección de ANTÍGENO

detección de ANTICUERPO

ELISA

ELISA INDIRECTO

ANTÍGENO adsorbido (reactivo)

Suero PROBLEMA

ANTIGLOBULINA marcada con

ENZIMA (reactivo)SUSTRATO de la enzima (reactivo)

CAMBIO DE COLOR

Lavado

Detección de ANTICUERPOS

Lavado Lavado

NNEEGGAATTIIVVOO

PPOOSSIITTIIVVOO

Antígeno Suero

ProblemaAc

monoclonalConj. con

enzima peroxidasa

Sustrato cromógeno

COLOR

Y Y Y Y

AUSENCIA DE COLOR

ELISA COMPETICIÓN

Lavado Lavado Lavado Lavado

Lavado Lavado Lavado Lavado

ELIS

A

VENTAJAS

§ Alta sensibilidad y especificidad§ Rápido§ Reactivos estables§ Resultado visual

DESVENTAJAS

§ Costo microplacas

§ Costo equipo automatización

§ Brucelosis

§ IBR

§ BVD

§ Peste porcina

§ Aujesky

§ Newcastle

§Bia

§Leucemia felina

§Salmonella

§Aftosa

§Estreptococos

§TBC

§ Babesia

§ Trichinella

§ Toxoplasma

§ Toxocara

§ Hormonas

§ Micotoxinas

§ Cuantificación de inmunoglobulinas

APLICACIONES EN VETERINARIA

PRUEBAS SECUNDARIAS

§ SOLUBLE

§ PARTICULADO

§ SUPERFICIE + COMPLEMENTO

PRECIPITACIÓN

AGLUTINACIÓN

FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

La prueba a realizar depende de las

características del Ag

Comparación precipitación - aglutinación

Antígeno SOLUBLE

Antígeno PARTICULADO

Y

YYY

Y

YFormación de “retículo” “Amontonamiento”

Y

YY Y

PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN

Anticuerpo

AGLUTINACIÓN

Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo:

bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su

anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une

por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión

agruma, produciendo una reacción de aglutinación.

Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con

respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de

tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión

de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de

dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la

aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de

sueros muy positivos.

FENÓMENO DE ZONA O PROZONA

Antígeno particulado (reactivo)

+YYYY Y

Suero problema

Proporción

Medio

YY

Y

YYAGLUTINACIÓN

AGLUTINACIÓN

En PLACA En TUBO

BrucellaSalmonella Micoplasma

BPA

Brucella

SAT+2-ME PAL

Aglutinación en placa: BPA

1. Suero problema 2. Antígeno específico (reactivo)

Aglutinoscopio + placa de vidrio

Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado

3. Mezclar

8 MINUTOS

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Con GRUMOS Sin GRUMOS

AGLUTINACIÓN POSITIVA Negativa

Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME

SAT (Seroaglutinación en Tubo)

Ig M Ig G

2- ME (2- Mercaptoetanol)

Se realizan en simultáneo

En TUBO: SAT + 2- ME

SUERO BPA (+)

1. Suero problema

Título

SAT

2-ME

37ºC-48 hs

2. Solución fisiológica fenicada (SFF)

2. Solución 2-ME

3. Antígeno

60 MINUTOS

1/25 1/50 1/100 1/200

LECTURA e INTERPRETACIÓN

37ºC-48 hs

POSITIVA INCOMPLETA NEGATIVA

FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento

por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen

complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se

une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene

hemólisis.

FIJACIÓN DE COMPLEMENTO2 sistemas

Sistema de PRUEBA Sistema INDICADOR

• Suero problema

• Antígeno específico

• Complemento

• Eritrocitos

• Hemolisina (Ac. anti eritrocitos)

FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

CEritrocitos

Ac antieritrocitos

Y

YY YAntígeno

Suero problema Complemento

Suero problema

-

SIN HEMÓLISIS

POSITIVO

Con HEMÓLISIS

Negativo

Y

C

APLICACIONES EN VETERINARIA

§BRUCELOSIS

§ IBR

§ DVB

§ AFTOSA

§ MOQUILLO CANINO

§ TOXOPLASMOSIS

POLARIZACIÓN FLUORESCENTE POLARIZACIÓN FLUORESCENTE (FPA)(FPA)

nn Fundamento:Fundamento:Se produce in Se produce in vitrovitro una reacción antígenouna reacción antígeno--anticuerpo, anticuerpo,

enfrentando el suero de un animal enfermo de enfrentando el suero de un animal enfermo de brucelosis con una fracción de del antígeno de brucelosis con una fracción de del antígeno de bruecellabruecella (cadena O), este complejo forma una masa (cadena O), este complejo forma una masa grande que en suspensión gira mas lentamente . grande que en suspensión gira mas lentamente . Además ese antígeno se conjuga con Además ese antígeno se conjuga con isotiocianatoisotiocianato de de fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados de despolarización en función de su velocidad de de despolarización en función de su velocidad de rotación.rotación.

Aglutinación en tubo: PAL

PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE

Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra

un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno

particulado coloreado, ambos se unirán, formando un

complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y

asciende con la nata

1. Leche problema

2. Antígeno (reactivo)

37ºC-1 hora

LECTURA e INTERPRETACIÓN

+ ++ +++ ++++

PAL

DESCANSO

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

PRUEBAS MOLECULARESPRUEBAS MOLECULARES

HIBRIDOMA

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR)

Multiplicación de una secuencia de ADN

específica y conservada de la especie a

identificar, que puede ser visualizada y

cuantificada

NUCLÉOTIDONUCLÉOTIDO

FosfatoBase nitrogenada

Azúcar

CADENA DE AZÚCAR Y FOSFATO

AZÚCAR

FOSFATO

BASE

ADN

vv ADNADN

v OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)

A T

G Cv NUCLEÓTIDOS

v POLIMERASA

Primers

Primers

Polimerasa

Polimerasa

100

90

80

70

60

50

40

30

20Detección

35 ciclos

ADN

Primers

Polimerasa

dNTP

Desnaturalización 94º C

1 min

Extensión 72º C

1 min

Hibridación 56º C

1 min

Producto de PCR para identificar Brucella spp en muestras de leche

Producto de PCR para caracterizar cepas de Brucella abortus en muestras de leche

ID 1117335861

11316817218924225514871511571792282601380124

PCRB. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.

B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51

B. abortus RB51

Cultivo-------------+-----

FC ++++++++++++++++++-

ELISA-C ++++++++++++++++++-

ELISA-I ++++++++++++++++++-

37 % con B. abortus silvestre se infectó con RB51 0,8 % de las sanas se infectó con B. abortus RB51

(p<0,0001)

37 % con B. abortus silvestre se infectó con RB51 0,8 % de las sanas se infectó con B. abortus RB51

(p<0,0001)

n=223n=223

Tipos de Tipos de PCRPCR

vv CON PRIMERS ANIDADOSCON PRIMERS ANIDADOS

vv ASIMÉTRICAASIMÉTRICA

vv INVERSAINVERSA

vv MULTIPLEXMULTIPLEX

vv NESTEDNESTED

VENTAJASVENTAJAS

vv FIDELIDADFIDELIDAD

vv SENSIBILIDADSENSIBILIDAD

vv ESPECIFICIDADESPECIFICIDAD

vv AUTOMATIZACIÓNAUTOMATIZACIÓN

APLICACIONESAPLICACIONES

vv Diagnóstico (viralesDiagnóstico (virales-- bacterianasbacterianas-- parasitariasparasitarias-- micóticas)micóticas)

vv Enfermedades hereditariasEnfermedades hereditarias

vv Enfermedades autoinmunesEnfermedades autoinmunes

vv OncologÍaOncologÍa

vv Medicina forenseMedicina forense

vv ArqueologíaArqueología

HIBRIDOMA

M

MMM

M M

MM

M

MMM

M M

MM

Selección in vitroen el medio HAT

M

MMM

M M

MM

M

MMM

M M

MM