“Identificación y caracterización molecular de genes ...
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“Identificación y caracterización molecular de genes relacionados con la actividad celulolítica en bacterias del género Bacillus aisladas en el
estado de Sinaloa”.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA:
MANUEL FAUSTINO JIMÉNEZ LEYVA
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO, DICIEMBRE DEL 2015
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
v
Agradecimientos a proyectos
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro
Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad
Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado
económicamente a través del SIP20144021 y SIP20144369. El alumno Manuel Faustino
Jiménez Leyva fue apoyado con una beca CONACYT con clave 560300.
vi
DEDICATORIA
Primeramente a Dios por permitir llegar a este momento y concluir una meta más en
mi vida.
Con mucho cariño a mi familia, por su apoyo incondicional a lo largo de esta etapa.
A mis amigos por su cariño y apoyo, muchas gracias.
Y a todas las personas que forman parte de mi vida y que de alguna u otra manera
influyeron en este proceso, muchas gracias, esto también es para ustedes.
vii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ponerme en este camino, rodeado de personas valiosas que me guiaron y
apoyaron.
Agradezco al Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral
Regional (CIIDIR-IPN Sinaloa), al Departamento de Biotecnología Agrícola
(BIOTECSIN) y al Laboratorio de Genómica funcional por permitirme desarrollar mi
proyecto de investigación y ayudarme a crecer académicamente.
A mis directores de tesis la Dra. Claudia Castro Martínez y el Dr. Carlos Ligne
Calderón Vázquez por su apoyo, paciencia, consejos y excelente dirección en mi
trabajo de tesis. Especialmente agradezco al Dr. Carlos por abrirme las puertas de su
laboratorio y ayudarme a crecer tanto académica como personalmente, por su
confianza y amistad, muchas gracias.
Agradezco a mi comité tutorial, Dr. Hervey Rodríguez González, Dr. Ignacio
Maldonado Mendoza y Dr. José Antonio Cervantes Chávez por su disponibilidad y
aportaciones durante el desarrollo de este proyecto.
A cada uno de mis compañeros y amigos del Laboratorio de Genómica Funcional y
el Laboratorio de Bioenergéticos, gracias por su apoyo y amistad, y por hacer que mi
estancia en este centro fuera más placentera.
Gracias también a mis compañeros de generación por su amistad durante las clases,
seminarios y fuera de este centro de trabajo. A mis maestros gracias por sus
enseñanzas, consejos y por ayudarme a crecer académicamente.
Pero ante todo, agradezco a mi familia por su apoyo incondicional a lo largo de este
proceso.
Sin olvidar a cada una de las personas que de alguna u otra forma me apoyaron
durante mi maestría, muchas gracias.
viii
CONTENIDO
Pág.
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................................... xi
ÍNDICE DE CUADROS ..................................................................................................................... xiii
GLOSARIO .......................................................................................................................................... xiv
RESUMEN ........................................................................................................................................... xvi
ABSTRACT ........................................................................................................................................ xvii
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 2
2.1. Biomasa lignocelulósica ................................................................................................... 2
2.2. Celulosa ................................................................................................................................. 2
2.3. Hidrólisis de la celulosa .................................................................................................... 3
2.4. Microorganismos relacionados con actividad celulolítica ....................................... 4
2.5. Enzimas y mecanismo involucrado en la degradación de celulosa. ..................... 5
2.6. Endo-1,4-β-glucanasas ...................................................................................................... 6
2.7. Exo-1,4-β-glucanasas ......................................................................................................... 9
2.8. β-glucosidasas ..................................................................................................................... 9
2.9. Aplicaciones de enzimas celulolíticas a nivel industrial ......................................... 10
2.10. Aspectos moleculares implicados en la actividad celulolítica .......................... 10
2.11. Antecedentes de genes implicados en actividad celulolítica ............................ 11
2.12. Regulación génica de la actividad celulolítica en microorganismos ............... 14
2.13. Género Bacillus como productores de enzimas celulolíticas ........................... 15
2.14. Antecedentes de enzimas y genes implicados en actividad celulolítica en el género Bacillus. ............................................................................................................................. 16
2.14.1. Actividad endoglucanasa ........................................................................................ 16
2.14.2. Actividad exoglucanasa .......................................................................................... 17
2.14.3. Actividad β-glucosidasa .......................................................................................... 18
2.14.4. Regulación de la actividad celulolítica en Bacillus .......................................... 18
2.15. Antecedentes de enzimas celulolíticas de estudios en CIIDIR-Sinaloa .......... 18
ix
3. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 20
4. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 21
4.1. Objetivo general ................................................................................................................ 21
4.2. Objetivos específicos ....................................................................................................... 21
5. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 22
6. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 23
6.1. Microorganismos y medio de cultivo ........................................................................... 23
6.2. Identificación a nivel molecular los aislados (RS351, RS273 y RZ164) ............... 23
6.3. Identificar y seleccionar mediante herramientas bioinformáticas los genes que codifican para la actividad celulolítica en el genoma de especies del género Bacillus……………………………………………………………………………………………………………………………………….23
6.4. Análisis de la secuencia de los genes que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus ........................................................................... 24
6.5. Curva de crecimiento y determinacion de actividad celulolítica de los aislados del género Bacillus en dos diferentes fuentes de carbono ................................................ 25
6.6. Cuantificación el nivel de expresión del gen eglS bajo el efecto de dos fuentes de carbono ...................................................................................................................................... 27
7. RESULTADOS ............................................................................................................................ 29
7.1. Identificación molecular de aislados bacterianos .................................................... 29
7.2. Identificación de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168 ...................................................................................................................................... 29
7.3. Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168………………………………………………………………………………………………………………………………………………..30
7.4. Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus ........................................................................... 36
7.5. Curva de crecimiento y determinación de la actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo diferentes fuentes de carbono ............................. 39
7.6. Síntesis de ADNc en los aislados RZ164, RS273 y RS351 ..................................... 42
7.7. Cuantificación del nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de dos fuentes de carbono ................................................. 44
8. DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 47
8.1. Identificación de los aislados bacterianos ................................................................. 47
8.2. Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en B. subtilis 168 .. 47
8.3. Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus ........................................................................... 49
x
8.4. Curva de crecimiento y actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en CMC y avicel como fuentes de carbono ............................................................... 50
8.5. Nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de CMC y avicel como fuentes de carbono ............................................................... 51
9. CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 56
10. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 57
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo implicado en degradación de celulosa………………….. 21
Figura 2. Estructura de las enzimas celulolíticas………………………………… 26
Figura 3. Mecanismo de degradación de celulosa por el sistema celulolítico
modelo de T. reesei…………………………………………………………
30
Figura 4. Gel de agarosa al 2 % representativo con los amplicones
correspondientes a los genes eglS, BglC, BglA y BglH en los
aislados RS273, RZ164 y RS351………………………………………….. 50
Figura 5. Alineamiento múltiple de la fracción GH5-CBM3 de endoglucanasas
del género Bacillus………………………………………………………….. 51
Figura 6. Agrupamiento de la fracción GH5-CBM3 de endoglucanasas de
bacterias del género Bacillus……………………………………………… 52
Figura 7. Agrupamiento de betaglucosidasas bacterianas pertenecientes a la
familia GH1 del género Bacillus y otras bacterias filogenéticamente
cercanas……………………………………………………………………..... 53
Figura 8. Cinética de crecimiento de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo
2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación de
120 h………………………………………………………………………….... 54
Figura 9. Actividad endoglucanasa de los aislados RZ164, RS351 y RS273
bajo 2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación
de 120 h ………………………………………………………………………. 55
Figura 10. Actividad exoglucanasa de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo
2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación de
120 h …………………………………………………………………………… 55
Figura 11. Actividad β-glucosidasa de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo
2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación de
120 h …………………………………………………………………………… 56
Figura 12. Gel de agarosa al 1 % mostrando los ARNs de las 3 cepas objeto de
estudio en este trabajo crecidas en medio con CMC como única
fuente de carbono……............................................................................. 57
Figura 13. Gel de agarosa al 1.8 % mostrando los amplicones generados a
partir de los ADNc de las 3 cepas objeto de estudio en este trabajo
crecidas en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono 58
xii
en un periodo de incubación de 120 h……………………………………
Figura 14. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y
RS273 bajo el efecto de CMC como única fuente de carbono en un
periodo de 120 h de incubación…………………………………………… 59
Figura 15. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y
RS273 bajo el efecto de avicel como única fuente de carbono en un
periodo de 120 h de incubación…………………………………………… 60
Figura 16.
Mecanismo general de acción del gen eglS en CMC y avicel como
única fuente de carbono propuesto en este estudio…………………... 68
xiii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Resumen de actividades de los cinco aislados
seleccionados……………………………………………………………… 33
Cuadro 2. Lista de oligonucleótidos para PCR-Tiempo real……………………. 42
Cuadro 3. Lista de los 3 mejores hits arrojados por las bases de datos del
NCBI y RDP al comparar los fragmentos del gen 16S ADNr de los
aislados RS273, RS351 y RZ164………………………………………… 44
Cuadro 4. Genes con anotación con actividad celulolítica en B. subtilis
168……………………………………………………………………………. 45
Cuadro 5. Búsqueda de proteínas homólogas a exoglucanasas bacterianas
previamente reportadas en el genoma de B. subtilis 168………….. 46
Cuadro 6. Búsqueda de endoglucanasas reportadas en bacterias del género
Bacillus contra el genoma de B. subtilis 168 ………………………… 47
Cuadro 7. Predicción de dominios de endoglucanasas de B. subtilis 168
mediante las herramientas de NCBI y EXPASY………………………. 48
Cuadro 8. Búsqueda de β-glucosidasas bacterianas en el genoma de B.
subtilis 168 en las bases de datos del NCBI y BsubCyc……………. 49
Cuadro 9. Predicción de dominios en β-glucosidasas de B. subtilis 168
mediante las herramientas del NCBI y EXPASY……………………… 49
xiv
GLOSARIO
Actividad enzimática: es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del
nivel de actividad de la misma, se expresa en Unidades Internacionales (UI) por mL,
considerando una unidad como la cantidad de enzima que libera 1µmol de glucosa
por min.
Azúcar reductor: monosacárido o disacárido que puede ceder electrones a otra
molécula y por tanto actuar como agente reductor.
Biocombustible: son los combustibles obtenidos a partir de biomasa, pueden ser
sólidos como carbón de leña y maderas, líquido como etanol, biodiesel y aceites de
la pirolisis, o gaseosos como el biogás (metano).
Bioetanol: se denomina bioetanol, al alcohol etílico deshidratado al 99.4% de pureza
y se produce mediante la fermentación de los azúcares presentes en la caña de
azúcar, maíz, sorgo y otros cultivos, así como también de residuos agroindustriales.
Avicel: presentación sintética de celulosa cristalina.
Carboximetilcelulosa: Presentación sintética de celulosa amorfa soluble.
Celulasas: Mezcla compleja de enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces β-
1,4 que unen dos moléculas de glucosa en la molécula de celulosa, estas enzimas
son endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas.
Celulosa: carbohidrato compuesto de unidades de D-glucosa unidas en una larga
cadena lineal por enlaces glucosídicos β en los átomos de carbono 1 y 4 de la
molécula de azúcar.
Enzima: biocatalizadores complejos de gran especificidad, producidos por células de
organismos vivos, que aumentan la velocidad de reacciones biológicas.
Método del ácido di-nitro-salicílico (DNS): método colorimétrico para determinar la
actividad del sistema enzimático celulolítico, esta técnica demuestra la presencia del
xv
grupo carbonilo libre (C=O) de los azúcares reductores que implica la oxidación del
grupo funcional aldehído de la glucosa.
Microorganismos celulolíticos: microorganismos que poseen enzimas capaces de
hidrolizar la materia lignocelulósica, incluyen bacterias, hongos, protozoarios y algas.
PCR-Tiempo real: variante de la técnica de PCR que permite cuantificar la cantidad
de ADN en tiempo real mediante detectores de fluorescencia
Rastrojos: es el conjunto de restos de tallos y hojas que quedan en el suelo después
de cosechar un cultivo.
xvi
RESUMEN
Las celulasas ocupan el tercer lugar en importancia económica mundial debido a sus
aplicaciones en procesos de la industria alimentaria, textil, papel y biocombustibles;
considerándose el incremento en ésta última el pasaporte al primer lugar. Beltrán-
Arredondo (2013) aisló y caracterizó microorganismos de rastrojo y de rizósfera de
maíz en Sinaloa, con actividad celulolítica y seleccionó 5 aislados que presentaron
actividad endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa comparable con lo reportado
previamente en bacterias. En el género Bacillus se han reportado las tres actividades
enzimáticas, así como un efecto inductor por fuentes de carbono
(carboximetilcelulosa, avicel). En los aislados de Sinaloa, se desconocen los genes
involucrados, por lo que el objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar los
genes relacionados con la actividad celulolítica en dichos aislados. Éstos fueron
identificados como B. subtilis y con base a análisis bioinformáticos se seleccionó al
gen eglS como responsable de la actividad endo y exoglucanasa, y a los genes bglC,
bglH y bglA de la actividad betaglucosidasa. Posteriormente se secuenció cada uno
de los 4 genes en los aislados RZ164, RS351 y RS273 y se encontró que las
celulasas se encuentran muy conservadas, sugiriendo que la funcionalidad puede ser
muy conservada en Bacillus sp. Posteriormente, los aislados fueron cultivados en
medio con CMC y avicel como única fuente de carbono y se determinó la actividad
celulolítica, observándose que la máxima actividad endoglucanasa se detectó entre
las 48 y 96 h en los 3 aislados. En avicel se detectó actividad máxima en diferentes
tiempos en las tres cepas de estudio. Finalmente se cuantificó el nivel de transcrito
de eglS en CMC y avicel, detectando un incremento a las 24 h, el cual pudiese
desencadenar la alta actividad endoglucanasa observada a partir de las 48 h,
además una disminución en el nivel de transcrito a las 48 h y se incrementa
nuevamente a las 72 h y 96 h, coincidiendo ésta última tendencia con la máxima
actividad exoglucanasa. En avicel se presentó un incremento a las 48 h, existiendo
para RS351 una marcada relación entre actividad y expresión. Es evidente que existe
una relación entre actividad enzimática y la actividad génica mediada por un efecto
transcripcional, y que efectivamente el gen eglS codifica para dichas actividades.
xvii
ABSTRACT
Cellulases rank third in global economic importance due to their applications in
processes of the food, textile, paper and biofuels industry; considering the increase in
the latter's passport to first place. Beltrán-Arredondo (2013) isolated and
characterized microorganisms from corn stover and corn rhizosphere that presented
cellulolytic activity. From those, five isolates were selected with endoglucanase,
exoglucanase and β-glucosidase activity levels comparable with other previously
reported strains. For Bacillus the three-enzymatic activities have been reported,
together with an inductive effect that is modulated by the carbon source
(carboxymethylcellulose, avicel). At least for the isolates from Sinaloa, genes involved
in those enzymatic activities are still not known, so the aim of this work was to identify
and to characterize the genes related with the cellulolytic activity that these isolates
presented. The isolates were identified as B. subtilis and through a bioinformatics
analysis the egls gene was selected as the possible responsible for both the endo
and exoglucanase activity, and the genes bglC, bglH and bglA for the beta-
glucosidase activity. Subsequently, these genes were sequenced from isolates
RZ164, RS351 and RS273. It was found that cellulases are highly conserved,
suggesting that the functionality can be highly conserved in Bacillus as well.
Subsequently, isolates were grown in medium with CMC and avicel as the sole
carbon source and cellulolytic activity was determined, detecting that under CMC, the
beginning of the exponential phase was at 48 h presenting the highest
endoglucanase activity between 48 and 96 h for all the 3 isolates. For avicel, the
exponential phase started at 72 hours, with maximal activity at different times among
the three strains. Finally, the transcript levels of eglS gene was quantified under CMC,
detecting an increase at 24 h, which could be triggering the high endoglucanase
activity observed after 48 h, besides a decrease in transcript level at 48 h and
increased again at 72 h and 96 h, the latter trend coinciding with the maximum
exoglucanase activity. Clearly, there is a relationship among enzyme activity and
gene expression possibly mediated by a transcriptional effect, and that eglS gene
could be coding for these enzymatic activities.
1
1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años numerosos estudios han mostrado un interesante aumento en el
desarrollo y producción de biocombustibles como una alternativa sustentable a los
combustibles de origen fósil, ya que pueden contribuir a la disminución de emisiones
contaminantes a la atmósfera, a la reducción del uso de los combustibles de petróleo;
y a tener diversidad de fuentes de energía que garanticen el suministro demandado a
nivel mundial (Kim y Dale 2004; Cruz et al., 2009; Chandel y Singh, 2011).
Con la finalidad de responder a la creciente demanda de los biocombustibles,
están siendo desarrollados avances importantes en los procesos bioquímicos
utilizando enzimas. En este sentido, las enzimas han sido empleadas para
aprovechar la materia prima disponible en la naturaleza, como es la biomasa
lignocelulósica, para la producción de bioetanol de segunda generación ( Rubin,
2008; Chandel y Singh, 2011).
Las enzimas de origen microbiano son más estables que las enzimas de
origen animal o vegetal y su producción es más fácil y segura (Rubin, 2008).
Se han desarrollado estudios a nivel bioquímico de enzimas con actividad
celulolítica y también a nivel molecular de una gran diversidad de microorganismos.
Sin embargo, en los últimos años se ha puesto gran interés en bacterias del género
Bacillus spp, debido a que presentan características muy favorables para posibles
aplicaciones a nivel industrial como termotolerancia, halotolerancia, entre otras (
Annamalai et al., 2011; Asha et al., 2015).
Por lo mencionado anteriormente, el presente proyecto tiene como objetivo
caracterizar a nivel molecular los genes que codifican para enzimas celulolíticas en
bacterias del género Bacillus spp aisladas del estado de Sinaloa, con la finalidad de
brindar bases moleculares para futuros trabajos de investigación enfocados en el
mejoramiento en la producción de enzimas de este tipo, así como para potenciales
aplicaciones a nivel industrial.
2
2. ANTECEDENTES 2.1. Biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica (fibras de la materia vegetal) está constituida
principalmente por tres tipos de polímeros: celulosa, hemicelulosa y lignina, forman
parte de la pared celular de las plantas y químicamente están enlazados por enlaces
covalentes y no covalentes (Cullen y Kersten, 1992; Pérez et al., 2002).
En las fibras también se encuentran otros componentes como las pectinas, los
taninos y minerales. Los polímeros que constituyen la fibra tienen las siguientes
características:
a) La celulosa es el mayor componente del complejo lignocelulosa compuesto
por unidades de glucosa (Cullen y Kersten, 1992; Pérez et al., 2002).
b) La hemicelulosa es un polímero complejo que cubre las fibras de la
celulosa, su estructura se compone de unidades de xilosa, manosa, galactosa,
glucosa, arabinosa y ácidos glucorónicos, y a diferencia de la celulosa, es un
polímero fácil de hidrolizar (Beg et al., 2001; Polizeli et al., 2005).
c) La lignina recubre el polímero de la hemicelulosa; su estructura está
compuesta de unidades de fenilpropano, su función es conferir soporte
estructural, impermeabilidad y resistencia al ataque por microorganismos
(Howard et al., 2003; Martínez et al., 2005).
2.2. Celulosa La celulosa es el componente más abundante de la biomasa vegetal.
Estructuralmente, es un polisacárido compuesto de unidades de glucosa unidas en
una larga cadena lineal por enlaces β entre los átomos de carbono 1 y 4 de la
molécula de glucosa (Lynd et al., 2002). Este polisacárido existe en las plantas
superiores, en las algas, en algunos tipos de hongos y en los quistes de algunos
protozoarios.
La celulosa está localizada en la pared celular donde se encuentra como
unidades submicroscópicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,
estas micelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas, las cuales se
3
encuentran suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración no solo de
enzimas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua (Lynd et al., 2002).
Una importante característica de la celulosa, relativamente inusual de los
polisacáridos es su estructura cristalina, sin embargo, las fibras individuales no son
puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas donde las fibras contienen
torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual permite la formación de microporos
y capilares lo suficientemente espaciosos para permitir la penetración de moléculas
relativamente grandes incluyendo, en algunos casos enzimas celulolíticas (Lynd et
al., 2002).
Las microfibrillas de celulosa están estabilizadas por enlaces de hidrógeno
intra e intermoleculares y rodeadas por polisacáridos hemicelulósicos (manano y
xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrógeno y enlaces covalentes, la
hacen extremadamente resistente a la hidrólisis química y biológica (enzimas
producidas por microorganimos). Así mismo, las regiones amorfas de la estructura
cristalina de la celulosa tienen una composición heterogénea caracterizada por una
variedad de enlaces. Finalmente, este arreglo asimétrico que caracteriza las regiones
amorfas es crucial para la degradación de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).
2.3. Hidrólisis de la celulosa Las celulasas son enzimas que hidrolizan los enlaces glicosídicos internos β-1,4 de
la celulosa a través de la acción conjunta de tres tipos de enzimas: a) Las
endoglucanasas (EGs), endo-1,4-β-glucanasas o carboximetilcelulasas hidrolizan al
azar los enlaces internos de las regiones amorfas que se encuentran en las fibras de
la celulosa generando sitios nuevos para la acción de otras enzimas, y generando
dímeros de celobiosa como productos de su hidrólisis. b) Las celobiohidrolasas
(CBHs), exo-1,4-β-glucanasas ó simplemente exoglucanasas, actúan en los
extremos de las fibras de la celulosa y en los sitios creados por la acción de las EGs
generando moléculas de celobiosa y pequeñas cantidades de glucosa. c) Las β-
4
glucosidasas, por otro lado, hidrolizan las moléculas de celobiosa que fueron
generadas por la hidrólisis de las EGs y CBHs a monómeros de glucosa.
De esta manera, los microorganismos pueden utilizar los productos generados
por la hidrólisis de la celulosa como fuente de carbono para el crecimiento (Cullen y
Kersten, 1992; Pérez et al., 2002; Rabinovich et al., 2002).
2.4. Microorganismos relacionados con actividad celulolítica
Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aeróbicos o
anaeróbicos, mesófilos o termófilos. Sin embargo, sólo algunos de ellos producen la
enzima celulasa extracelular que es capaz de hidrolizar la celulosa (Ljungdahl y
Eriksson, 1985; Marsden y Gray, 1986; Bhat y Bhat, 1997; Dongowski et al., 2002).
A partir de los hongos aeróbicos, tales como: Trichoderma viride, Trichoderma
reesei, Penicillium pinophilum, Sporotrichum pulverulentum, Fusarium solani,
Talaromyces emersonii y Trichoderma koningii, se han obtenido los complejos
celulolíticos utilizados en la mayoría de los estudios (Eriksson y Wood, 1985), debido
a que presentan un sistema enzimático completo de celulasas capaces de degradar
parcial o totalmente la celulosa en celobiosa y glucosa (Ryu y Mandels, 1980). Entre
estos microorganismos, el hongo filamentoso Trichoderma reesei se caracteriza por
la efectividad que tiene en la degradación de la celulosa nativa y cristalina con el
complejo celulolítico que produce y secreta, el cual presenta las tres actividades
necesarias para la hidrólisis de la celulosa (endo-β-1,4-glucanasa, exo-β-1,4-
glucanasa y β-1,4-glucosidasa) (Ben-Ghedalia y Miron, 1981). También, las celulasas
de T. reesei tienen la ventaja de que son resistentes a inhibidores químicos y
estables en reactores agitados bajo condiciones de pH 4.8 a 50ºC durante 48 horas
(Ryu y Mandels, 1980).
Otros microorganismos productores de celulasas incluyen a los hongos
anaeróbicos mesofílicos: Neocallimastix frontalis, Piromonas communis,
Sphaeromonas communis, las bacterias aeróbicas mesofílicas y termofílicas:
Cellulomonas sp., Cellvibrio sp., Microbispora bispora y Thermomonospora sp., y las
5
bacterias anaeróbicas mesofílicas y termofílicas: Acetivibrio cellulolyticus,
Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens y
Clostridium thermocellum (Koeck et al., 2015; Sangkharak et al., 2012; Beguin y
Aubert, 1993). Entre estos microorganismos, los termofílicos son de interés por su
capacidad para producir enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en
general estables bajo condiciones severas, incluso en valores de pH altamente
ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta 90 °C (Lamed y Bayer, 1988;
Sugden y Bhat, 1994).
Por otro parte, las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias del
género Bacillus presentan básicamente actividad de endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-
1,4-glucanasa; y tienen una característica particular, en especial las enzimas
producidas por B. subtillis y es que no son inhibidas por la presencia de la glucosa o
celobiosa (Ljungdahl y Eriksson, 1985). El pH óptimo para la actividad de las
celulasas producidas por bacterias abarca un amplio margen. Mientras que, las
celulasas producidas por hongos son activas generalmente a un pH ácido (Howard et
al., 2003).
Para producir celulasas a gran escala se han utilizado principalmente los
hongos mesófilos y termófilos por su capacidad de secretar cantidades considerables
de enzimas al medio (Howard et al., 2003; Ovando y Waliszewski, 2005). Sin
embargo, en los últimos tiempos se ha dirigido el enfoque hacia la producción de
celulasas en bacterias, ya que éstas presentan tiempos de generación cortos,
versatilidad bioquímica, facilidad de manipulación genética y adaptabilidad a diversas
condiciones ambientales, comparadas con los hongos.
2.5. Enzimas y mecanismo involucrado en la degradación de celulosa.
El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrólisis enzimática de la
celulosa por parte de los hongos y las bacterias involucra la acción enzimática de
6
tres enzimas: la endo β-1,4 glucanasa (β-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo β-
1,4 celobiohidrolasa y la β-1,4 glucosidasa.
La endo β-1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces β-1,4
glucosídicos intramoleculares accesibles de cadena de celulosa para producir
oligosacáridos de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa rompe los
extremos no reductores del sustrato generando unidades de celobiosa o glucosa y
por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso hidrolítico convirtiendo los
fragmentos de celobiosa en glucosa o removiendo unidades de glucosa desde los
extremos no reductores (Figura 1) (Lynd et al., 2002; Zhang et al., 2006). En los
últimos años se ha descrito una variante al mecanismo en algunas bacterias y
hongos, en el cual la enzima endo β-1,4 glucanasa tiene la capacidad de actuar
sobre toda la cadena de celulosa sin necesidad de la acción de la enzima exo β-
1,4 celobiohidrolasa, ya que se han descrito microorganismos que carecen de
dicha enzima pero tienen la capacidad de hidrolizar celulosa cristalina.
Las enzimas celulolíticas pertenecen a la ampliamente distribuida familia de
las glucosil hidrolasas (GHs), familia de enzimas implicadas en el metabolismo de
carbohidratos en una gran diversidad de organismos (Henrissat y Davies, 1997).
De acuerdo a características catalíticas, bioquímicas y genéticas, las enzimas
endoglucanasas y exoglucanasas se encuentran distribuidas en las familias GH5,
6, 8, 9, 12, 44, 45 y 48 principalmente, mientras que enzimas β-glucosidasas se
encuentran en las familias GH1 y GH3 (Berlemont, y Martiny, 2013).
2.6. Endo-1,4-β-glucanasas Las endo-1,4-β-glucanasas rompen los enlaces glucosídicos internos de la
celulosa en forma aleatoria, lo que provoca una rápida disminución en la longitud
de la cadena de los β-glucanos con un incremento lento de los grupos reductores
(Wood, 1989). Estas enzimas han sido reportadas en una gran diversidad de
organismos entre los que destacan los hongos y las bacterias.
7
Figura 1. Mecanismo implicado en degradación de celulosa: endoglucanasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasas (Koeck et al., 2014).
Las endoglucanasas son clasificadas en familias de acuerdo a sus
propiedades hidrofóbicas (Henrissat et al., 1989) y su dominio catalítico (Gilkes et
al., 1991). Las endoglucanasas están distribuidas en 16 de las 118 familias de
glucosil hidrolasas. La familia 5 de las glucosil hidrolasas es una familia altamente
divergente en términos de función con un gran número de miembros, incluyendo
más de 240 endoglucansas diferentes (CAZy database, www.cazy.org). Los
miembros de esta familia tienen una muy baja identidad a nivel de secuencia, y
solo ocho aminoácidos están conservados (Wang et al., 1993), normalmente
caracterizada por un dominio de unión a celulosa CBM3.
Sus sustratos incluyen a la carboximetilcelulosa (CMC) y a la celulosa amorfa
tratada con H3PO4 o álcali, la acción de las endoglucanasas en este sustrato
celulósico se caracteriza por la disminución de la viscosidad como resultado de los
cortes intramoleculares que realiza (Zhang et al., 2006). Además la tasa de hidrólisis
está condicionada a la habilidad de las endoglucanasas para actuar en las regiones
amorfas de la matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos reductores en
los cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete, 2002).
La celulosa cristalina, así como las fibras de algodón o el avicel no son
atacadas de manera efectiva por esta enzima. El porcentaje de hidrólisis de
celooligosacáridos de cadenas largas es alta y se incrementa en el grado de
polimerización, siendo la celobiosa el principal producto de la reacción (Wood et al.,
1988). Sin embargo, en algunas bacterias y hongos se ha reportado la presencia de
enzimas endoglucanasas con la capacidad de actuar sobre este tipo de sustratos
anteriormente conocidos como específicos para exoglucanasas.
La medición de la actividad de endoglucanasa, puede ser basada en la
reducción de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos reductores
que se determinan por técnicas que permitan medir azúcares reductores.
Considerando que la actividad de las exoglucanasas también incrementa el número
de extremos reductores, es recomendable que la actividad de las endoglucanasas
sea medida por ambos métodos (viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al.,
2002).
Por otro lado, dicha actividad puede ser fácilmente detectada en medios con
CMC o celulosa y adición de varios colorantes como el rojo Congo, debido a que
estos son adsorbidos solo por largas cadenas de polisacáridos. Este método es
semi- cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un gran número de
muestras (Teather y Wood, 1982).
9
2.7. Exo-1,4-β-glucanasas Las exo-1,4-β-glucanasas, también llamadas celobiohidrolasas, actúan cortando la
celobiosa del extremo no reductor de la cadena y en algunas ocasiones liberan
pequeñas cantidades de glucosa. El porcentaje de hidrólisis de la celobiosa y de
celoligosacáridos de cadenas largas se incrementa con el grado de polimerización de
las mismas (Félix, 1993; Warren, 1996; Wood et al., 1988). La celulosa
microcristalina (Avicel) es un sustrato adecuado para la medición de esta actividad
por tener un bajo grado de polimerización y una baja accesibilidad (Lynd et al., 2002;
Zhang et al., 2006). Las celobiohidrolasas exhiben una acción sinérgica altamente
cooperativa en presencia de endoglucanasas (Gaitán y Pérez, 2007; Wachinger et
al., 1989). Se encuentran ampliamente distribuidas en distintas familias de las
enzimas glucosilhidrolasas, entre las que destacan la GH5, 6, 7, 8, 9, 12 entre otras.
Estas enzimas son producidas por hongos principalmente, sin embargo, existen
algunos reportes de bacterias que las producen, como es el caso de Cellulomonas
flavigena, Thermobifida fusca, Caldicellulosiruptor saccharolytic, entre otras, aunque
por otra parte, existe una gran cantidad de bacterias que carecen de la producción de
enzimas de este tipo, como es el caso de bacterias del género Bacillus y
Saccharophagus.
2.8. β-glucosidasas
Las β-glucosidasas no son propiamente celulasas. No obstante, son componentes
muy importantes de los sistemas celulolíticos, ya que terminan la hidrólisis de
cadenas pequeñas de celoligosacáridos y de celobiosa, liberados por otras enzimas,
hasta glucosa. Los sistemas celulolíticos con niveles bajos de β- glucosidasa, tienen
una baja actividad, debido a la inhibición de las endoglucanasas y celobiohidrolasas
por la celobiosa. No son específicas para enlaces β-1,4 (Félix, 1993; Wood y Bhat,
1988). La tasa de hidrólisis disminuye con el incremento en el grado de
polimerización del sustrato. La actividad de esta enzima puede ser medida usando
celobiosa, la cual no es hidrolizada por las endoglucanasas ni exoglucanasas (Lynd
et al., 2002). Se encuentran distribuidas en diversas familias de las enzimas
glucosilhidrolasas, ubicándose la mayoría de los reportes en las familias GH1 y GH3.
10
2.9. Aplicaciones de enzimas celulolíticas a nivel industrial
Las enzimas celulolíticas presentan una gran diversidad de aplicaciones, entre las
que se puede citar las siguientes (Ovando- Chacón y Waliszewski, 2005):
• En la industria textil, las celulasas juegan un papel muy importante en el
desteñido de telas de mezclilla ya que se usan para remover el color azul
índigo y dar una apariencia de desteñido reduciendo el daño a las telas.
• Las celulasas también son utilizadas en la industria de los detergentes. Estas
enzimas degradan las microfibrillas que se separan parcialmente de las fibras
principales, restituyendo a las fibras una superficie suave y a la prenda su
color original.
• Dentro de la industria alimenticia, las celulasas se usan para favorecer la
extracción y filtración de jugos de frutas o verduras, filtración de mostos,
extracción de aceites comestibles, entre otras aplicaciones.
• Otra aplicación de la celulosa y celulasas es en la obtención de
biocombustibles. Los residuos vegetales son el recurso renovable más grande
que existe, y se considera que más del 85% de los residuos agrícolas y
agroindustriales son de este tipo (Cruz et al., 2009). La producción de
bioetanol de segunda generación a partir de materia lignocelulósica como
residuos agrícolas (tallos, hojas, rastrojos, etc.), hierbas, cultivos leñosos y
desechos de papel, presenta ventajas económicas, ambientales y
estratégicas, debido a se puede producir a gran escala, para ser utilizado en la
elaboración de productos químicos o en la producción de biocombustibles
(Kim y Dale 2004; Chandel y Singh, 2011).
2.10. Aspectos moleculares implicados en la actividad celulolítica
Todas las enzimas celulolíticas son glucosilhidrolasas (GH) que utilizan el mismo
mecanismo catalítico de catálisis acido-base (Davies y Henrissat, 1995). Existen dos
tipos comunes de sitio activo en las celulasas. Celulasas con sitio activo abierto tipo
hendidura típicamente exhiben actividad endocelulolítica, actuando en cualquiera de
los enlaces internos a lo largo de la molécula de celulosa. Por otro lado, las celulasas
que presentan un sitio activo tipo túnel exhiben actividad exocelulolítica, actuando
11
sobre los extremos de la molécula de celulosa y produciendo oligosacáridos (Kurasin
y Valjamae, 2011). Generalmente, las exocelulasas son enzimas procesivas, es
decir, que se unen a la cadena de celulosa y no se desprenden hasta que la cadena
este completamente hidrolizada, mientras las endocelulasas pueden ser procesivas y
no procesivas (Becham et al., 2011).
Las enzimas celulolíticas se caracterizan por contar con un domino catalítico
(en el cual se encuentra el sitio activo) y un péptido señal (el cual funciona como una
señal de reconocimiento para la secreción de la proteína al medio extracelular). Sin
embargo, muchas celulasas son proteínas multidominio, y además de contar con un
dominio catalítico, presentan dominios accesorios tales como módulos de unión a
celulosa (CBMs). La función principal de estos dominios accesorios es ayudar a las
celulasas a unirse a la celulosa y facilitar la procesividad (Fontes y Gilbert, 2010;
Shoseyov et al., 2006) Figura 2.
Todas las celulasas conocidas se encuentran principalmente dentro de 12
familias de glucosilhidrolasas (GH) de la base de datos CAZy. Las familias GH5 y
GH9 tienen el mayor número de celulasas caracterizadas bioquímicamente, esto
podría ser debido a que celulasas de esas familias son abundantes en el modelo
celulolítico bacteriano. A su vez, se han reportado enzimas bifuncionales
presentando actividad endo y exocelulasa dentro de una misma proteína (Han et al.,
1995; Zhao et al., 2012).
2.11. Antecedentes de genes implicados en actividad celulolítica
Existen dentro de la literatura algunos reportes acerca de genes relacionados con
actividad celulolítica. Se han identificado y caracterizado dichos genes con la
finalidad de conocer el mecanismo por el cual están regulados. Dentro de estos
estudios se citan los siguientes:
• Chen et al, (2014) trabajaron con el hongo filamentoso Trichoderma reesei, y
llegaron a la conclusión que la producción de enzimas celulolíticas está
regulada a nivel transcripcional. La transcripción de genes de celulasas es
12
inducida por celulosa y sus derivados, así como por lactosa, L-sorbosa, y está
sujeta a represión catabólica de carbono.
Figura 2. Estructura de las enzimas celulolíticas. Propiedades estructurales características (Fontes y Gilbert, 2010; Shoseyov et al., 2006).
• Saibi et al., (2011) determinaron que la expresión diferencial de β-
glucosidasas en Stachybotrys microspora, está relacionada con la fuente de
carbono empleada, ya que en sus estudios la expresión de genes bglG
pertenecientes a la familia 3 de las enzimas glucosil hidrolasas fue inducida
utilizando glucosa como fuente de carbono, caso contrario para enzimas
pertenecientes a la familia 1, donde la expresión resultó reprimida.
• En C. flavigena se aisló el gen celcflB, el cual produce una endo-β-1,4-
glucanasa. Al caracterizar dicho gen, la expresión fue inducida utilizando
bagazo de caña de azúcar como fuente de carbono, y reprimida utilizando
glucosa como única fuente de carbono, con lo cual se sugiere que dicho gen
es regulado a nivel transcripcional (Gutiérrez-Nava et al., 2003).
13
• Wang et al, (2015) desarrollaron un análisis transcriptómico del hongo
celulolítico modelo Neurospora crassa sometiéndolo a 5 diferentes residuos
agrícolas como fuente de carbono, algo interesante que encontraron es la
homogeneidad que dicho hongo presenta frente a los diferentes tipo de
residuo (a pesar de las diferencias en su composición química), ya que se
detectaron grupos de genes (regulones) que se expresaron de igual manera
en las 5 condiciones, en especial genes relacionados con el metabolismo de
polisácaridos, con esto, dicho hongo pudiese ser aprovechado para la
producción de enzimas de interés biotecnológico, utilizando indistintamente
una diversidad de residuos agrícolas, ya que al parecer para este
microorganismo el tipo de residuo no contribuye a una expresión diferencial
entre las 5 condiciones.
• Zhang y Hutcheson (2011) detectaron en S. degradans actividad
endoglucanasa máxima después de 24 h de crecimiento en medio con avicel
como única fuente de carbono, coincidiendo con el más alto nivel de
transcritos de los genes Cel5A, Cel5H y Cel5I, el cual se presentó después de
24 de inducción bajo la misma condición, sugiriendo que estos genes
pudiesen ser los responsables de dicha actividad.
• Zhang et al., (2011) observaron actividad β-glucosidasa máxima en fase de
crecimiento exponencial en avicel como única fuente de carbono, de igual
manera detectaron el nivel de trascritos mas alto de los genes Bgl3C y Bgl1A
durante la misma fase de crecimiento, sugiriendo a estos como probables
candidatos de la actividad hidrolítica detectada en S. degradans.
Todos los trabajos de investigación antes mencionados han servido como
base o han brindado bases para otros trabajos de investigación y enfoques a nivel
industrial, ya que conocer cómo se encuentran estructurados los genes de interés y
como se lleva a cabo su regulación, permiten manipular la producción de enzimas
celulolíticas.
14
2.12. Regulación génica de la actividad celulolítica en microorganismos
La producción de celulasas es estrictamente regulada por represión catabólica, este
mecanismo completo de inducción y represión ayuda a los microorganismos a
guardar la energía que no es requerida cuando tiene que ser usada como una fuente
industrial de celulasas. Como ya se ha mencionado anteriormente, se ha reportado que la regulación
en la producción de celulasas por hongos y bacterias está dada a nivel
transcripcional, es decir, que existen moléculas efectoras sobre el inicio de la
transcripción de los genes implicados.
En el sistema celulolítico Trichoderma reesei, se ha reportado la producción de
ocho endoglucanasas (EGLI, EGLII, EGLIII, EGLIV, EGLV, EGLVI, EGLVII, EGLVIII),
dos celobiohidrolasas (CBHI Y CBHII) y dos β-glucosidasas (BGLI, BGLII). Los genes
que codifican para estas celulasas son regulados a nivel transcripcional por los
productos de celulasas expresadas basalmente, es decir, en condiciones no
inductoras (Figura 3). En este sistema celulolítico, los genes de celulasas son
reprimidos en presencia de glucosa mediante represión catabólica (CCR) mediada
por los factores CREI y CreA, dichos genes son inducidos por celulosa y sus
derivados. Tres posibles sitios de unión del factor CREI presentes en la región de -
674 a -724 del promotor del gen cbh1 (el cual codifica para una celobiohidrolasa), se
considera que están involucrados en la represión por glucosa dependiente de la
afinidad de unión de la proteína CREI. La proteína Ace2 se une a la secuencia 5'-
GGCTAATAA-3' del promotor del cbh1 (aproximadamente a -783) dirigiendo la
activación de los genes celulolíticos (cbh1, cbh2, egl1, y egl2) y xyn2, en cultivos
inducidos con celulosa (Liu et al. 2008).
Los sistemas celulolíticos en bacterias también son regulados a nivel
transcripcional. El mecanismo regulatorio para sistemas bacterianos celulolíticos más
común involucra un represor. CebR es un clásico represor de diversos operones del
sistema celulolítico de Streptomyces griseus, el cual responde a celodextrinas. La
expresión del sistema celulolítico de Thermobifida fusca es inducida con celobiosa
mediada por el factor CelR, este factor se une a una repetición invertida de 14 pb
15
para mediar la expresión de genes diana, en algunos casos por represión y en otros
por activación.
El celulosoma en Clostridium utiliza operones de los genes del sistema
celulolítico que son regulados por represores. En Cellulomonas flavigena la inducción
específica de celulasas y xilanasas se ha relacionado con sus sustratos
(carboximetilcelulosa, avicel y xilano) (Zhang y Hutcheson, 2011).
2.13. Género Bacillus como productores de enzimas celulolíticas
Las bacterias del género Bacillus son microorganismos Gram positivos, aerobios o
anaerobios facultativos. Taxonómicamente se encuentran situados dentro del reino
Bacteria, filo Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae y género
Bacillus. Una característica importante es que forman endoesporas
extraordinariamente resistentes a condiciones desfavorables, en especial, a
temperaturas altas ( Logan y Turnbull, 2003).
Una gran variedad de especies del género Bacillus producen celulasas,
incluyendo a: B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis, Bacillus sp. KSM-330, B.
amyoliquefaciens y Bacillus spp. Alcalofílicas (Thayer y David, 1978; Robson y
Chamblis, 1984; Dhillon et al., 1985; Ozaki e Ito, 1991; Horikoshi, 1984).
Investigaciones recientes están enfocadas en la utilización y mejoramiento de
enzimas provenientes de bacterias para el uso en la industria de los biocombustibles
y bioproductos, y se ha puesto gran interés en aquellas provenientes de bacterias del
género Bacillus (Kim et al., 2012), ya que tienen una característica particular, en
especial las enzimas producidas por B. subtilis, y es la resistencia a ser inhibida por
el producto en este caso por glucosa y celobiosa (Ljungdahl y Eriksson, 1985).
Una característica importante de las enzimas celulolíticas con utilidad a nivel
industrial es su termoestabilidad, actualmente se han logrado aislar bacterias del
género Bacillus que tienen esta capacidad, por ejemplo Annamalai et al. (2012)
purificaron y caracterizaron una celulasa termoestable de una bacteria marina B.
licheniformis que es capaz de crecer en residuos celulósicos.
16
Figura 3. Mecanismo de degradación de celulosa por el sistema celulolítico modelo de Trichoderma reesei (Furukawa et al., 2012; Schmoll y Kubicek 2003; Liu et al., 2008).
Además, en la actualidad existen disponibles numerosos preparados
enzimáticos comerciales grado alimenticio que contienen principalmente actividad
celulolítica endo-β-1,4-glucanasa, exo-β-1,4-glucanasa y β-1,4-glucosidasa. Algunos
de estos preparados enzimáticos son obtenidos de microorganismos entre los que se
encuentra B. subtilis (Bhat, 2000).
2.14. Antecedentes de enzimas y genes implicados en actividad celulolítica en el género Bacillus.
2.14.1. Actividad endoglucanasa
17
Se ha reportado que bacterias del género Bacillus presentan actividad
endoglucanasa, por ejemplo Lee et al., (2008) purificaron y caracterizaron una
endoglucanasa producida por B. amyloliquefaciens DL-3, la cual mostró alta
identidad con celulasas producidas por otras especies del género Bacillus. La
longitud del marco de lectura abierto consistió en 1497 pb codificando para una
proteína de 499 aminoácidos con un peso molecular de 55,118 Da, conformada de
un dominio catalítico correspondiente a la familia cinco de las enzimas glucosil
hidrolasas (GH5), así como un módulo de unión a celulosa tipo tres (CBM3). De igual
manera Yang et al., (2010) clonaron el gen de una endoglucanasa basándose en la
secuencia de ADN de los genes de celulasas reportados en B. subtilis (AY044252,
Z73234, y X04689). El marco de lectura de dicho gen fue de 1,503 pb codificando
una proteína de 501 aminoácidos. De acuerdo a la secuencia de genes relacionados,
esta enzima también corresponde a una glucosil hidrolasa de la familia 5 con un
domino de unión a celulosa tipo 3 (CBM3), ya que estas características estructurales
para endoglucanasas son muy comunes dentro de bacterias del género Bacillus.
Asha y Sakthivel (2014) purificaron y caracterizaron una nueva celulasa
producida por la cepa B. subtilis SU40, esta enzima exhibió propiedades halofílicas,
alcalofílicas y de tolerancia a solventes, además de actuar sobre diversos sustratos
celulósicos, entre ellos CMC y avicel.
2.14.2. Actividad exoglucanasa
Se ha detectado actividad del tipo exoglucanasa en bacterias del género Bacillus.
Kim et al., (2012) detectaron actividad celulolítica sobre avicel (exoglucanasa).
Oliveira et al. (2014) también detectaron actividad exoglucanasa en la cepa Bacillus
sp. SMIA-2 haciéndola crecer en avicel y bagazo de caña de azúcar pretratado como
fuentes de carbono, no hubo diferencias en la producción de enzima entre los dos
tratamientos. Sin embargo, no existen reportes de genes de exoglucanasas o
celobiohidrolasas en bacterias de Bacillus, pero en algunos reportes se ha detectado
degradación de avicel (sustrato específico de exoglucanasas) por parte de
endoglucanasas, atribuyendo esto a la procesividad de las enzimas mediada por los
módulos de unión a celulosa (Kim, 1995), o a la presencia de enzimas bifuncionales
18
(Han et al., 1995; Zhao et al., 2012). Se ha propuesto que posiblemente las bacterias
del género Bacillus poseen un gen que codifica una endoglucanasa (CMCasa) y que
a su vez puede actuar sobre sustratos específicos para exoglucanasas como son el
avicel y celulosa microcristalina (Kim et al., 2012)
2.14.3. Actividad β-glucosidasa
Asha et al. (2015) caracterizaron una β-glucosidasa producida por la cepa Bacillus
subtilis SU40, la cual presentó propiedades de interés industrial como estabilidad en
un amplio margen de pH y temperatura exhibiendo actividad máxima a 75°C y pH 12,
y presentando una alta actividad contra celobiosa y diversos glucósidos.
2.14.4. Regulación de la actividad celulolítica en Bacillus
Se ha reportado que la actividad celulolítica a nivel bioquímico está regulada por
diferentes sustratos, por ejemplo la actividad es inducida por CMC y avicel (Kim et
al., 2012) e inhibida por glucosa. Recientemente, Zhou et al., (2015) detectaron un
incremento en el nivel de transcritos de U712_19750 (fragmento de ADN con posible
actividad endoglucanasa) en la cepa B. subtilis HH2, bajo el efecto de avicel como
única fuente de carbono a las 12 h de incubación, sugiriendo que la regulación de
ésta endoglucanasa es a nivel transcripcional, sin embargo, no reportan la
comparación de los niveles de expresión con análisis de actividad enzimática.
2.15. Antecedentes de enzimas celulolíticas de estudios en CIIDIR-Sinaloa
Beltrán-Arredondo (2013), durante su trabajo de tesis de maestría, generó una
colección de microorganismos de rastrojo y rizósfera de maíz aislados en Sinaloa.
Mediante una serie de pruebas tanto cualitativas como cuantitativas, seleccionó cinco
aislados, los cuales mostraron actividades celulolíticas sobresalientes, denominados:
RZ164, RS241, RS273, R315 y RS351.
Dentro del grupo de cinco aislados seleccionados las actividades máximas del
tipo endoglucanasa fueron las presentadas en el Cuadro 1, valores comparables con
los de otros autores, por ejemplo, Afzal et al. (2010) evaluaron la actividad
endoglucanasa de una cepa de Bacillus sp., obteniendo la máxima hidrólisis de
19
CMC a 60°C y pH 7, con una actividad de 20 UI/mL, siendo este valor de actividad
endoglucanasa menor a los obtenidos para los cinco aislados.
En lo que respecta a la actividad exoglucanasa, los resultados máximos son
comparables con los obtenidas por otros autores, por ejemplo, Kim et al. (2009),
reportaron valores inferiores a los de este estudio en la actividad exoglucanasa
utilizando papel filtro como sustrato (17 UI/mL), también Assareh et al. (2012)
detectaron una actividad máxima de 90.74 UI/mL, cuyo valor es muy cercano a las
máximas actividades exoglucanasa de los aislados RZ164 y RS273.
Cuadro 1. Resumen de actividades de los cinco aislados seleccionados por Beltrán-Arredondo en el 2013.
No de aislado
Actividad Endoglucanasa
UI/mL
Actividad Exoglucanasa
UI/mL
Actividad Glucosidasa
UI/mL RZ164 53.02 184.03 94.81
RS241 55.83 188.02 60.89
RS273 26.86 168.87 97.84
R315 40.03 164.24 86.83
RS351 60.92 243.09 79.33
20
3. JUSTIFICACIÓN
Las enzimas celulolíticas son de importancia económica debido a sus aplicaciones
biotecnológicas en procesos de la industria alimentaria, textil, papel y
biocombustibles.
Existen numerosos estudios en lo que se refiere a la caracterización
bioquímica de las enzimas celulolíticas, además, en la literatura existen reportes
acerca de genes relacionados con actividad celulolítica en hongos y bacterias. Se
han identificado y caracterizado dichos genes con la finalidad de conocer los
mecanismos moleculares implicados en su regulación.
Los microorganismos aislados en Sinaloa presentaron niveles de actividad
celulolítica competitivos comparados con estudios previos. Para utilizar estas
enzimas en probables aplicaciones biotecnológicas el primer paso es su
caracterización a nivel molecular, por lo tanto, se requiere conocer que genes están
implicados, si dicha actividad está relacionada con su estructura, y si su regulación
es a nivel transcripcional por diferentes fuentes de carbono. De esta forma, se
obtendrán las bases moleculares para proyectos de investigación posteriores
encaminados a una caracterización bioquímica mas detallada y al mejoramiento de la
producción de enzimas celulolíticas, considerando la importancia económica que esto
implica.
21
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Identificar y caracterizar los genes relacionados con la actividad de endo -1-4,
β- glucanasas, exo -1-4, β- glucanasas y β- glucosidasas en 3 bacterias del
género Bacillus (RZ164, RS273 y RS351).
4.2. Objetivos específicos
1) Identificar taxonómicamente los aislados RZ164, RS273 y RS351 mediante
herramientas moleculares.
2) Identificar y seleccionar mediante herramientas bioinformáticas los genes que
codifican para la actividad celulolítica en el genoma de especies del género
Bacillus.
3) Analizar la secuencia de los genes que codifican para la actividad celulolítica
en aislados del género Bacillus.
4) Cuantificar el nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS273 y
RS351 crecidos en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono.
22
5. HIPÓTESIS
La actividad celulolítica de los aislados de Bacillus está regulada a nivel
transcripcional por la fuente de carbono utilizada.
23
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Microorganismos y medio de cultivo Se decidió enfocar nuestro estudio en tres aislados (RS273, RS351 y RZ164) que
fueron los que presentaron mayor actividad endoglucanasa, exoglucanasa y β-
glucosidasa de los aislados con actividad celulolítica sobresaliente obtenidos por
Beltrán-Arredondo, 2013. La selección fue de acuerdo a que el aislado RS351
presentó la mayor actividad endo y exoglucanasa y RS273 y RZ164 presentaron la
mayor actividad β-glucosidasa. Dichas bacterias son cultivadas en medio LB a 30°C
y 200 rpm durante un periodo de incubación de 24, 48, 72, 96 y 120 h.
6.2. Identificación a nivel molecular de los aislados (RS351, RS273 y RZ164)
Para identificar las bacterias de interés en este trabajo, se amplificó un fragmento del
gen 16S ADNr de 1500 pb mediante PCR. Para eso se utilizaron los oligonucleótidos
universales siguientes: 27F: 5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 y 1522 R: 5-
AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3 (Kim et al., 2012). Para la amplificación se utilizó un
termociclador C1000 touch BIORAD con los siguientes parámetros: 4 minutos a
94°C, seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 30 s a 55 °C, 1 minuto a 68 °C con
una extensión final por 10 minutos a 68°C. Las secuencias obtenidas fueron
comparadas mediante el programa BLAST del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI) en conjunto con la comparación contra las secuencias de la
base de datos Ribosomal database Project (RDP)(Cole et al., 2009).
6.3. Identificación y selección mediante herramientas bioinformáticas de los genes que codifican para la actividad celulolítica en el genoma de especies del género Bacillus
Una vez identificados los aislados RS273, RS351 y RZ164 como B. subtilis, se eligió
como modelo el genoma de la cepa B. subtilis 168 y se seleccionaron genes de
referencia reportados para las tres actividades en bacterias del género Bacillus con la
finalidad de que sirvieran como modelo para identificar los genes responsables de la
actividad celulolítica en dicho genoma: (AY044252, Z73234, X04689, M96979), los
24
cuales se buscaron mediante blastx y blastp en las bases de datos exclusiva para
B. subtilis BsubCyc (Barbe et al., 2009). A su vez, se hicieron búsquedas en la base
de datos BsubCyc de acuerdo a la ontología génica (GO) teniendo en cuenta los
criterios de función celular del gen, rol en procesos biológicos y anotación de cada
gen. También se realizaron búsquedas en dicha base de datos a través del número
de EC (Enzyme commission ontology): EC: 3.2.1.4 para endo-1,4-β-glucanasa, EC:
3.2.1.91 para exo-1,4-β-glucanasa y EC: 3.2.1.21 para β-glucosidasa EC: 3.2.1.21,
teniendo como criterio que estas enzimas son hidrolasas y que actúan como
glucosilasas. Además mediante la herramienta Regulatory Overview de la base de
datos BsubCyc, revisamos si este listado de genes anotados como celulolíticos no se
encontraban arreglados formando un operón, es decir, que no estuviesen regulados
por un mismo mecanismo. Esta herramienta nos permite buscar si un determinado
gen se encuentra formando parte de algún operón. Para nuestro interés, la idea era
determinar si este listado de genes celulolíticos o algunos de ellos se encontraban
dentro de un mismo operón, ya que este resultado nos facilitaría entender el
mecanismo de regulación génica en la degradación de celulosa, sin embargo se
observó que estos genes no se encontraban dentro de un mismo operón, esto
también fue corroborado al revisar la localización de cada gen en el genoma (datos
no mostrados), donde observamos que ninguno de los genes se encuentra anterior o
posterior de otro del listado.
Mediante estas búsquedas se obtuvieron genes candidatos como responsables de la
actividad celulolítica en Bacillus, los cuales fueron seleccionados en base a los
siguientes criterios: Identidad (%Id), presencia de dominios característicos (dominio
catalítico y dominio de unión a celulosa) mediante la herramienta Expasy-
SUPERFAMILY HMM Search y Conserved Domain Database (CDD) del NCBI
(Gasteiger et al., 2003).
6.4. Análisis de la secuencia de los genes que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus
Las cepas aisladas fueron cultivadas en medio líquido LB a 30 °C y 200 rpm para
tener suficiente biomasa para la extracción de ADN. La extracción se llevó a cabo
25
con el reactivo DNazol y técnicas convencionales para microorganismos (Sambrook
et al., 1989).
Para amplificar los genes de interés, se diseñaron oligonucleótidos de acuerdo
a las secuencias de los genes identificados en el genoma correspondiente o bien en
bases de datos a través del programa Primer3plus de acuerdo a los genes de
referencia mencionados en el punto anterior. Se utilizó ADN total de las bacterias en
estudio y se llevaron a cabo reacciones de PCR para amplificar y obtener los genes
de interés. Se llevaron a cabo 3 reacciones de secuenciación (una con un
oligonucleótido forward, un oligonucleótido reverso y un oligonucleótido interno para
secuenciar la región central del gen) para cada uno de los genes seleccionados para
completar toda la secuencia.
Una vez secuenciados los genes de interés, dichas secuencias fueron
traducidas a proteína median la herramienta Expasy translate tool, se realizaron
alineamientos para comparar las secuencias entre las proteínas de los 3 aislados
objeto de estudio en este trabajo y otras previamente reportados con actividad
celulolítica en Bacillus a través del software MEGA 6.0, con el propósito de identificar
o descartar variaciones o regiones que pudiesen explicar la actividad dentro del
grupo de enzimas, y especialmente ubicar la presencia de dominios característicos
como el dominio catalítico y dominio de unión a celulosa Figura 2. A su vez, a partir
de los alineamientos obtenidos se generaron arboles filogenéticos utilizando el
método Neighbor Joining con un soporte estadístico de 1000 réplicas bootstraps,
esto último con la finalidad de ubicar la relación entre nuestras secuencias y otras
previamente reportadas.
6.5. Curva de crecimiento y determinacion de actividad celulolítica de los aislados del género Bacillus en dos diferentes fuentes de carbono
Para evaluar el efecto de la fuente de carbono en la actividad celulolítica, se partió de
los aislados almacenados en medio LB sólido a 4°C, los cuales fueron resembrados
en placas Petri con medio agar LB, para posteriormente realizar un inóculo en medio
LB líquido, éste se preparó en tubos para cultivo de 16 x 150 mm, que contenían 15
26
ml de medio, a los cuales se les inoculó una colonia del aislado con un asa estéril. Se
mantuvieron en incubación a 30°C y 200 rpm durante 16 h. Una vez transcurrido el
tiempo de incubación del inóculo hasta obtener una densidad óptica de 1.0 se
efectuó el cultivo en matraz, inoculando el 5% de los aislados en matraces
Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio CMC al 1% y avicel al 1%,
incubándose a 30°C y 200 rpm durante 120 h, se realizaron tres réplicas biológicas
para cada uno de los aislados. Se tomaron muestras cada 24 h; 5 ml por cada tiempo
para la cuantificación de UFC, determinación de actividad celulolítica y extracción de
ARN.
Posteriormente se realizó el conteo de UFC en placa mediante técnicas
microbiológicas convencionales.
Para la determinación de actividad enzimática las muestras se centrifugaron
durante 20 min a 1000 rpm, para obtener el líquido post-cultivo libre de células.
La actividad endo β-1,4 glucanasa o CMCasa se cuantificó de acuerdo al
protocolo de Stutzenberger (1972); se utilizaron los líquidos post-cultivo libre de
células, obtenidos por centrifugación. Se tomaron 200 µl del sobrenadante de cada
aislado seleccionado, se adicionaron 875 µl de CMC al 1% y 25 µl de amortiguador
acetato de sodio 1.0 M con pH 6.0. Se incubaron a 50 °C durante 50 min.
Posteriormente, se midió la liberación de azúcares reductores por el método de DNS
utilizado anteriormente (Miller, 1959).
La actividad exo β-1,4 glucanasa se determinó por el método de Stutzenberger
(1972). El ensayo consistió en colocar en un tubo de ensayo 12.5 mg de papel filtro
Whatman No.1 al cual se le añadieron 200 µl de amortiguador de acetato de sodio
0.6 M (pH 6.0) y 800 µl de líquido libre de células. Se incubaron a 50 °C durante 50
min y se determinó la liberación de azúcares reductores.
Para la actividad β-1,4 glucosidasa se utilizaron 250 µl de sobrenadante y 250
µl de salicina 10mM en amortiguador de acetato de sodio 1M (pH 6). Se incubaron
27
bajo las mismas condiciones que los casos anteriores y se determinó la liberación de
azúcares reductores (Bernier y Stutzenberger, 1989).
Las actividades enzimáticas se calcularon de acuerdo a la fórmula reportada
por Silveira et al. (2012), para el cálculo de la actividad endoglucanasa,
exoglucanasa y β-glucosidasa, los azúcares reductores del tiempo cero fueron
restados a los valores de los tiempos de incubación 24, 48, 72 y 120 h. Las
actividades enzimáticas se expresaron en unidades internacionales (UI) por ml,
considerando una unidad como la cantidad de enzima que libera 1µmol de glucosa
por minuto.
6.6. Cuantificación el nivel de expresión del gen eglS bajo el efecto de dos fuentes de carbono
De cada una de las condiciones analizadas se realizaron extracciones de ARN total
mediante la técnica sugerida para el Reactivo Trizol acoplado a perlitas de vidrio. La
presencia del ARN fue detectada mediante gel de agarosa al 1% y la calidad fue
evaluada mediante espectro utilizando el Nanodrop 2000. A partir del ARN obtenido
se sintetizó ADNc mediante la enzima retrotranscriptasa Super Script III de Invitrogen
utilizando hexámeros random. Se diseñaron oligonucleótidos específicos para PCR-
Tiempo real utilizando el programa en línea Primer3 plus (los primers diseñados en
este estudio se encuentran en el Cuadro 2) utilizando como modelo el gen eglS,
seleccionado en el objetivo número 2. La cuantificación del nivel de expresión del gen
eglS se llevó a cabo mediante la técnica de PCR-Tiempo real utilizando Syber Green
qPCR Supermix (Qiagen) en un termociclador Rotor Gene Q-Pure detector versión
1.7 (Qiagen). Como gen de referencia o gen normalizador se utilizó rpoB de B.
subtilis (Ho et al., 2011) (los oligonucleótidos se presentan en el Cuadro 2). Para
dicho análisis se consideró como condición control el tiempo a las 0 h, teniendo en
cuenta que el inóculo en ese momento proviene de medio LB (condiciones de
sustrato no inductoras) y que en ese momento no hay efecto de fuente de carbono
por sustratos celulósicos (CMC y avicel), esto para revisar si existe un efecto a nivel
trascripcional en la expresión del gen eglS.
28
La relación de la expresión de cada gen se calculó mediante la función 2-∆∆Ct
(método presentado por PE Applied Biosystems [Perkin Elmer, Forster City, CA]),
previa determinación de la eficiencia de la reacción de PCR para cada uno de los
pares de oligonucleótidos utilizados. La eficiencia calculada sustituirá el valor “2” de
la función descrita.
Cuadro 2. Lista de oligonucleótidos para PCR-Tiempo real.
Gen Oligonucleótido Longitud (pb)
Tm (°C) Amplicón Fuente
rpoB F-CAA ACC GTG GCG CAT GGT TAG AAT 24 60.3 83 Ho et al. 2011 R-CGG CAA CTT ACG TGT GCG ATC AAT 24 60.1
16S F-CAA GCG TTG TCC GGA ATT AT 20 53.2 112 Di Pascua et al. 2014 R-CTC AAG TTC CCC AGT TTC CA 20 54.7
eglS1
F-GTT CAC ACG GAT TGC AAT GG 20 54.8 100 Este estudio R-TAC ATC GCT GCA CGG AAA AC 20 55.9
eglS2
F-TTC TCG GCA CCA AAG ATT CG 20 55.4 102 Este
estudio R- CAT CCC CTG CTC TGT ATT GTA C 22 55.0
29
7. RESULTADOS 7.1. Identificación molecular de aislados bacterianos
Se amplificó un fragmento de ADN de los aislados bacterianos RS273, RS351 y
RZ164 de alrededor de 1500 pb correspondiente al gen 16S, el cual fue secuenciado
por ambos extremos para obtener finalmente alrededor de 1200 pb. Estas
secuencias se compararon con las bases de datos del NCBI y RDP buscando la
mayor identidad. Como se puede observar en el Cuadro 3, todas las secuencias
analizadas corresponden a bacterias del género Bacillus especie subtilis y coincide
en ambas bases de datos. Se presentan los tres primeros hits obtenidos para cada
aislado. Para algunos casos alguno de los hits corresponde a Bacillus sp., sin
embargo no existen diferencias en los parámetros como Query cover (superficie de
secuencia cubierta en el análisis), valor E (estadístico de identidad, entre más
cercano a 0 mayor identidad) y porcentaje de identidad con otros correspondientes a
B. subtilis. En lo que respecta a la base de datos RDP, los valores mayores del
parámetro S a_b score (coeficiente de identidad, entre más cercano a 1.0 mayor
identidad) corresponden a B. subtilis. Por lo tanto concluimos que los aislados son B.
subtilis.
7.2. Identificación de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168
Para la búsqueda de los genes implicados en la actividad celulolítica se utilizó como
base el genoma de la cepa B. subtilis 168, teniendo en cuenta que nuestros aislados
de interés son B. subtilis. Se realizaron búsquedas a través del algoritmo Blastp
contra proteínas ya reportadas con las tres actividades que intervienen en la
degradación de celulosa tanto en la base de datos del NCBI, como en la base de
datos BsubCyc la cual es una base de datos exclusiva de la cepa B. subtilis 168
(Barbe et al., 2009), y en dichas búsquedas se consideraron los parámetros de
porcentaje de identidad (%Id), cobertura (query cover) y el valor estadístico E (E
value).
30
Cuadro 3. Lista de los 3 mejores hits arrojados por las bases de datos del NCBI y RDP al comparar los fragmentos del gen 16S ADNr de los aislados RS273, RS351 y RZ164.
Aislado NCBI RDP Organismo Cobertura Valor E % Identidad Organismo Puntaje de identidad
RS273 B. subtilis 99 0.0 100 B. subtilis 0.890
Bacillus sp. 100 0.0 99 B. subtilis 0.889 B. subtilis 100 0.0 99 B. subtilis 0.889
RS351 Bacillus sp. 100 0.0 99 B. subtilis 1.000 Bacillus sp. 100 0.0 99 B. subtilis 1.000 B. subtilis 100 0.0 99 B. subtilis 1.000
RZ164 B. subtilis 99 0.0 99 B. subtilis 0.872 B. subtilis 99 0.0 99 B. subtilis 0.871 B. subtilis 99 0.0 99 B. subtilis 0.868
Además se hicieron búsquedas en la base de datos BsubCyc de acuerdo a la
ontología génica (GO) teniendo en cuenta los criterios de función celular del gen, rol
en procesos biológicos y anotación de cada gen. También se realizaron búsquedas
en dicha base de datos a través del número de EC (Enzyme commission ontology):
EC: 3.2.1.4 para endo-1,4-β-glucanasa, EC: 3.2.1.91 para exo-1,4-β-glucanasa y EC:
3.2.1.21 para β-glucosidasa EC: 3.2.1.21, teniendo como criterio que estas enzimas
son hidrolasas y que actúan como glucosilasas.
Estas búsquedas nos indican que existen en el genoma de B. subtilis 168: tres
genes anotados con actividad β-1,4-endoglucanasa, cinco genes anotados como β-
glucosidadas y de forma inesperada ningún gen anotado con actividad β-1,4-
exoglucanasa Cuadro 4.
7.3. Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168
Debido a que se encontró más de un gen anotado para actividad endoglucanasa y
para β-glucosidasa en el genoma de B. subtilis 168, se requirió depurar la lista
seleccionando genes que tuvieran actividad comprobada y propiedades estructurales
características Figura 2.
31
Cuadro 4. Genes con anotación con actividad celulolítica en B. subtilis 168. Genes por actividad y localización en el genoma. Se incluye el porcentaje de identidad con respecto al gen modelo empleado. NI corresponde a genes que no presentaron identidad con genes modelo pero se encontraron anotados en el genoma de B. subtilis 168.
Genes implicados en actividad celulolítica en B. subtilis 168
Actividad endo -1-4, β- glucanasa (EC: 3.2.1.4)
Gen Localización en el genoma %Id contra gen modelo
eglS 1940625 - 1942124 99
yhfE 1095063 - 1096103 NI
ysdC 2950221 - 2951306 NI
Actividad β-glucosidasa (EC: 3.2.1.21)
Gen Localización en el genoma % Id contra gen modelo
licH 3958516 - 3959844 NI
bglA 4121166 - 4122605 34
bglC 370259 - 371292 41
bglH 4032346 - 4033755 34
GmuD 628,630 - 630,027 36
Para dicha selección de genes implicados en la actividad celulolítica en B.
subtilis 168 se utilizó primeramente el algoritmo Blastp de proteínas reportadas en
bacterias del género Bacillus y algunas otras bacterias como C. flavigena, T. fusca,
C. saccharolytic, entre otras.
Además se realizó la búsqueda de dominios característicos para cada tipo de
actividad celulolítica (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa) (dominio
catalítico, dominio de unión a celulosa, etc) mediante la herramienta Expasy-
32
SUPERFAMILY HMM Search y Conserved Domain Database (CDD) del NCBI
(Gasteiger et al., 2003).
Debido a que en el genoma del modelo B. subtilis 168 no se encontraron
genes anotados con actividad exoglucanasa, decidimos buscar en dicho genoma
proteínas que presentaran identidad (de 0 a 100 % de identidad) con exoglucanasas
previamente reportadas en bacterias, esto con la finalidad de encontrar o descartar la
presencia de una gen que codifique para una exoglucanasa dentro del genoma de la
cepa modelo, por lo que usamos algunas proteínas ya reportadas con dicha
actividad, como fue el caso de T. fusca (Sandgren et al., 2013), C. flavigena (Herrera-
Herrera et al., 2009) y C Saccharolyticus (Thompson et al., 2010). Sin embargo no se
encontraron proteínas relacionadas Cuadro 5.
Para seleccionar los genes que estén implicados en la actividad
endoglucanasa en B. subtilis 168 se utilizó el algoritmo Blastp del NCBI con algunas
proteínas previamente reportadas con dicha actividad en bacterias del género
Bacillus entre las que se incluyeron: egl de B. subtilis DLG (Robson y Chambliss,
1987), BglC de B. amyloliquefaciens (Lee et al., 2010) y una proteína bifuncional
caracterizada en B. Sp DO4 (Han et al., 1995; Zhao et al., 2012).
Cuadro 5. Búsqueda de proteínas homólogas a exoglucanasas bacterianas previamente reportadas en el genoma de B. subtilis 168. NPR=ninguna proteína relacionadas.
Todas las proteínas presentaron alta identidad con una endoglucanasa
codificada por el gen eglS de B. subtilis 168 Cuadro 6. Las otras proteínas predichas
Proteína Bacteria Referencia NCBI BsubCyc
CelB T. fusca Sangren et al., 2012 NPR NPR
CelC C. flavigena Herrera-Herrera et al., 2009 NPR NPR
CelB C. Saccharolyticus Thompson et al., 2010 NPR NPR
33
como endoglucanasas en B. subtilis 168 no presentan identidad con endoglucanasas
del género Bacillus previamente reportadas en la literatura.
Para tener más certeza de que proteínas pudiesen ser la o las responsables
de la actividad endoglucanasa en B. subtilis 168, se realizó la búsqueda de dominios
característicos. De las proteínas codificadas por los tres genes anotados como
celulolíticos solo la codificada por el gen eglS presenta los dominios característicos
de las endoglucanasas del género Bacillus Cuadro 7.
Las proteínas codificadas por los genes yhfE y ysdC presentan dominios no
reportados actualmente en proteínas con actividad endoglucanasa en bacterias del
género Bacillus y no se presentan reportes actuales de su actividad como
endoglucanasas.
Cuadro 6. Búsqueda de endoglucanasas reportadas en bacterias del género Bacillus contra el genoma de B. subtilis 168 en las bases de datos del NCBI y BsubCyc.
Proteína Bacteria Referencia NCBI % Id BsubCyc E
egl B. subtilis DLG Robson y
Chambliss, 1987
Endoglucanasa 94 Endoglucanasa eglS 0
Proteína bifuncional B. sp DO4
Han et al., 1995; Zhao et
al., 2012 Endoglucanasa 99 Endoglucanasa
eglS 0
BglC B.
amyloliquefaciens
Lee et al., 2010 Endoglucanasa 93% Endoglucanasa
eglS 0
Para la selección de genes que codifiquen β-glucosidasas en B. subtilis 168,
se buscaron en dicho organismo algunas proteínas previamente reportadas en
bacterias del género Bacillus y algunas bacterias cercanas filogenéticamente entre
34
los que se incluyeron B. circulans, B. polymyxa, B. natto, B. sp, S. degradans, P. sp,
entre otros.
Cuadro 7. Predicción de dominios en endoglucanasas de B. subtilis 168 mediante las herramientas del NCBI y EXPASY. Con letras rojas se presenta la predicción de dominios para el gen modelo que presenta los dominios proteícos característicos de una endoglucanasa de Bacillus.
Gen NCBI EXPASY
Egl (B. subtilis DLG)
• Celulasa GH5
• CBM3
• β-glucanasa
• Dominio de unión a celulosa familia 3 (CBM3)
eglS • Celulasa GH5
• CBM3
• β-glucanasa
• Dominio de unión a celulosa familia 3 (CBM3)
yhfe • Peptidasa M42/endoglucanasa
• Exopeptidasa dependiente de Zn
• Aminopeptidasa/ glucanasa
ysdC • Peptidasa M42/endoglucanasa
• Exopeptidasa dependiente de Zn
• Aminopeptidasa/ glucanasa
Todas las proteínas empleadas en esta selección presentaron la mayor
identidad con cuatro proteínas codificadas por los genes bglC, gmuD, bglH y bglA, en
este orden de mayor a menor pero con muy poca diferencia en el porcentaje de
identidad Cuadro 8. Algo que resulta importante es que ninguna de las proteínas
empleadas en la búsqueda presentó identidad relevante con la proteína codificada
por el gen licH, siendo el hit mayor de % Id = 21 en una cobertura del 10 %.
Para identificar de forma precisa (estructural y funcional) los genes que
pudiesen ser los responsables de la actividad β-glucosidasa se realizó análisis de
presencia de dominios característicos con las proteínas codificadas por los cinco
35
genes en cuestión. Las proteínas codificadas por los genes bglC, gmuD, bglH y bglH
presentaron un dominio característico y previamente reportado en bacterias del
género Bacillus y otros géneros, el cual consiste en un domino transglucosilasa de la
Familia 1 (GH1) Cuadro 9.
Cuadro 8. Búsqueda de β-glucosidasas bacterianas en el genoma de B. subtilis 168 en las bases de datos del NCBI y BsubCyc.
β-glucosidasa NCBI BsubCyc
B. circulans, B. polymyxa, B. natto, Bacillus sp,
S degradans, Paenibacillus sp.
bglC bglC
gmud gmuD
bglH bglH
bglA bglA
Cuadro 9. Predicción de dominios en betaglucosidasas de Bacillus subtilis 168 mediante las herramientas del NCBI y EXPASY. Con letras rojas se presenta la predicción de dominios para el gen modelo que presenta el dominio proteico característico de una betaglucosidasa de Bacillus.
Gen NCBI EXPASY
bglA (B. circulans) GH1 TransglucosidasaGH1
bglC GH1 TransglucosidasaGH1
bglA GH1 TransglucosidasaGH1
bglH GH1 TransglucosidasaGH1
licH GH4 LDH Cterm
NAD(P) binding Rossman
gmuD GH1 TransglucosidasaGH1
36
En base a los resultados obtenidos referentes a la identidad y presencia de
dominios característicos, se propone que los genes implicados en la actividad
celulolítica en bacterias del género Bacillus son eglS (para actividad endoglucanasa y
posible exoglucanasa) y bglC, bglA y bglH (para actividad β-glucosidasa).
7.4. Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus
Una vez identificados y seleccionados los genes responsables de la actividad
celulolítica en Bacillus, se diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar
cada uno de los genes mediante PCR. En la Figura 4 se muestra un gel de
electroforesis representativo con los genes amplificados (eglS, bglC, bglA y bglH) con
su respectivo tamaño de amplicón.
Figura 4. Gel de agarosa al 2% representativo con los amplicones correspondientes a los genes eglS, BglC, BglA y BglH en los aislados RS273, RZ164 y RS351. Se incluye el tamaño esperado en pb para cada uno de los genes de interés.
37
Se obtuvieron las secuencias de los genes eglS, bglC, bglH y bglA mediante
tres reacciones de secuenciación utilizando un oligonucleótido forward, un
oligonucleótido reverso, y un oligonucleótido interno para secuenciar la región central
del gen, todo esto se realizó para cada uno de los genes en los aislados RS351,
RZ164 y RS273. Posteriormente se desarrolló la traducción de todos los genes a
proteína y se realizaron alineamientos por actividad con otras secuencias
previamente reportadas. En la Figura 5 se muestra el alineamiento múltiple de la
fracción GH5-CBM3 (390 aminoácidos) presente en endoglucanasas del género
Bacillus. Se observa que estas proteínas son muy conservadas en Bacillus,
específicamente en aminoácidos implicados en el sitio activo de la proteína,
marcados con las barras de color negro.
Figura 5. Alineamiento múltiple de la fracción GH5-CBM3 de endoglucanasas del género Bacillus. Marcadas con flechas negras se encuentran especificados los aminoácidos implicados en el sitio activo de la enzima así como aquellos que intervienen en la interacción con celulosa. Marcados con flechas rojas se encuentran los aislados RZ164, RS351 y RS273, los cuales son objeto de estudio de este análisis.
38
A partir del alineamiento se generó el respectivo árbol filogenético con la
finalidad de revisar de qué manera se agrupan las endoglucanasas obtenidas en este
estudio y las previamente reportadas (Figura 6).
Figura 6. Agrupamiento de la fracción GH5-CMB3 de endoglucanasas de bacterias del género Bacillus mostrando relación de cepas de B. subtilis de esta región(RZ164, RS351 y RS273) con otras del género Bacillus previamente reportadas. EL árbol fue construido mediante el método de Neighbor Joining en el Software MEGA 6. Se incluyen los soportes bootstrap (1000 réplicas) y se utilizó la secuencia de la endogucanasa de T. reesei como grupo externo. Marcados con flechas rojas se encuentran las endoglucanasas de los aislados RZ164, RS351 y RS273.
RS351
RZ164
B subt BEC-1
CelL15 B subt LN
eglS Bsubt 168
Bsubt 1986
B subt CK2
B subt A8-8
RS273
Bsubt 115
celG B subt chz1
Bifunctional B sp
B subt AH18
engA B amylo UMAS1002
eglII B amylo PSM3.1
B subt DLG
BglC B amylo FZB42
B subt JA18
B sp VLSH08
B subt BS-2
B amylo TB-2
B amylo TB-5
egl B lichen DSM13ATCC14580
Cel5A B lichen GXN151
eglI Trichoderma Reesei
99
7699
76
72
52
46
25
76
99
75
53
68
95
2964
4437
22
26
34
9
39
En lo que respecta a las β-glucosidasas, en la Figura 6 se muestra el
alineamiento múltiple de β-glucosidasas bacterianas, mostrando los aminoácidos
implicados en el sitio activo. En la Figura 7 se presenta un dendograma mostrando la
relación de las β-glucosidasas obtenidas en este estudio con las de estudios previos.
Cabe mencionar que el árbol carece de robustez debido a la falta de secuencias
disponibles de proteínas que tengan evidencia experimental de funcionalidad.
Figura 7. Agrupamiento de β-glucosidasas bacterianas pertenecientes a la familia GH1 del género Bacillus y otras bacterias filogenéticamente cercanas. EL árbol fue construido mediante el método de Neighbor Joining en el Software MEGA 6. Se incluyen los soportes bootstrap (1000 réplicas). Marcados con flechas rojas se encuentran las betaglucosidasas de los aislados RZ164, RS351 y RS273.
7.5. Curva de crecimiento y determinación de la actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo diferentes fuentes de carbono
Antes de medir la actividad celulolítica se realizó el conteo en placa de UFC para
revisar en que tiempo se alcanza la fase estacionaria y relacionar las células viables
de cada tiempo con la actividad enzimática presente. En la Figura 8 se muestra el
conteo de unidades formadoras de colonia para los tres aislados crecidos en A) CMC
BglC Bsubt 168
BglC164
BglC 273
BglC 351
BglA Bsubt 168
BglH Bsubt 168
BglH273
BglH351
cba3 C.bazotea
Bgl B sp
bgl Bcirculans
bglA Paenibacillus polymyxa
Bgla Paenibacillus sp
56100
100
9998
99
100 92
100
58
40
y B) avicel como única fuente de carbono. Cabe mencionar que con este conteo
corroboramos que realmente las cepas pueden crecer bajo dichas condiciones de
sustrato, observándose la fase estacionaria a las 24 y 48 h para CMC y avicel
respectivamente en las tres cepas, y que a las 120 h se mantiene aún la presencia
de células viables.
Figura 8. Cinética de crecimiento de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas en A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. El crecimiento bacteriano se reporta en unidades formadoras de colonia (UFC).
A continuación se presentan los resultados obtenidos para la actividad
celulolítica en los tres aislados bajo las condiciones antes mencionadas. En la Figura 9A se presentan los resultados para actividad endoglucanasa en medio con CMC
como fuente de carbono, en donde se detectó actividad desde las 24 h en los tres
aislados, y a partir de las 48 h se observa un intervalo donde la actividad es
sobresaliente y máxima en la mayoría de los tiempos. Por otra parte, en medio con
avicel como fuente de carbono la actividad se detectó a partir de las 72 h. Sin
embargo, fue significativamente menor a la obtenida en medio con CMC como fuente
de carbono (Figura 9B), sugiriendo que el CMC es una fuente de carbono más
adecuada para inducir la actividad de la enzima que producen estos aislados de
Bacillus.
41
Figura 9. Actividad endoglucanasa de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas con A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h.
En lo que respecta a la actividad exoglucanasa, en la Figura 10A se observa
que la actividad en CMC se detectó a partir de las 24 h, presentándose la actividad
máxima principalmente entre 72 y 120 h. Esto coincide con lo obtenido por Kim et al.,
(2012), quienes detectaron actividad exoglucanasa máxima después de 72-96 h de
crecimiento en medio con CMC como fuente de carbono en cepas del género
Bacillus. Sin embargo, en medio con avicel la actividad se detectó a partir de las 72 h
siendo esta significativamente menor a la obtenida en medio con CMC (Figura 10B).
Figura 10. Actividad exoglucanasa de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas con A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h.
42
Finalmente, en la Figura 11A se presenta la actividad β-glucosidasa en medio
con CMC como fuente de carbono. Dicha actividad se detectó a partir de las 24 h
obteniéndose la actividad máxima a partir de las 48 h. Por otra parte, en medio con
avicel la actividad fue significativamente menor a la obtenida en medio con CMC,
observándose perfiles de actividad diferentes entre los tres aislados (Figura 11B).
Figura 11. Actividad β-glucosidasa de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas con A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h.
7.6. Síntesis de ADNc en los aislados RZ164, RS273 y RS351 Una vez evaluada la actividad celulolítica a nivel bioquímico, se extrajo ARN total de
las tres cepas de interés bajo las mismas condiciones. En la Figura 12 se muestra un
gel de agarosa al 1% en el cual se presentan los ARN de los aislados de interés
crecidos en medio con CMC como única fuente de carbono a las 72 h de incubación,
se incluyen 3 réplicas biológicas de cada una de las cepas. Cabe mencionar que éste
gel es representativo del experimento ya que lo mismo se llevó a cabo para los
tiempos de incubación 0, 24, 48, 96 y 120 h, así como para las mismas cepas
crecidas en medio con avicel como única fuente de carbono durante el mismo
periodo de incubación.
43
Figura 12. Gel de agarosa al 1% mostrando los ARNs de las 3 cepas objeto de estudio en este trabajo (RZ164, RS273 y RS351) crecidas en medio con CMC como única fuente de carbono a las 72 h de incubación. Se presentan tres réplicas biológicas para cada una de las cepas. Se llevó a cabo lo mismo para los tiempos 0, 24, 48, 96 y 120 h (resultados no mostrados).
Posteriormente, a partir del ARN obtenido se sintetizó ADNc para ser utilizado
como templado en el análisis del gen eglS por PCR-tiempo real. En la Figura 13 se
presentan los amplicones generados a partir de los ADNc de las cepas RZ164,
RS273 y RS351 crecidas en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono
durante 120 h de incubación. Podemos observar que el gen eglS se expresa bajo las
condiciones antes mencionadas a partir de las 24 h. Sin embargo, no inferimos
acerca de incremento o disminución del nivel de transcrito del gen, ya que esto se
44
realizó únicamente para comprobar que efectivamente el gen se expresa, sin
presentar evidencia cuantitativa.
Figura 13. Gel de agarosa al 1.8 % mostrando los amplicones generados a partir de los ADNc de las tres cepas objeto de estudio en este trabajo (RZ164, RS273 y RS351) crecidas en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. Se incluye el amplicón esperado para el gen eglS.
7.7. Cuantificación del nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de dos fuentes de carbono
Una vez obtenidos los ADNc correspondientes, se analizó la expresión relativa del
gen eglS bajo las condiciones antes mencionadas. El gen rpoB fue utilizado como
gen normalizador. Para revisar si existe un efecto transcripcional en la regulación del
gen, se consideró el tiempo a las 0 h como control, con la finalidad de analizar el
cambio en el nivel de transcrito en los diferentes tiempos con respecto a una
condición control (tiempo 0), en la cual el inóculo proviene de medio LB, donde no se
presentan condiciones inductoras ni efecto de sustratos celulósicos. En la Figura 14
45
se presenta un gráfico correspondiente al nivel de transcritos del gen eglS durante
120 h de incubación en CMC como única fuente de carbono en los aislados RZ164,
RS273 y RS351. Se observa a las 24 h un incremento en el nivel de transcritos con
respecto a la condición control, posterior descenso a las 48 h y nuevamente un
incremento a las 72 y 96 h, finalmente a las 120 h no existe diferencias con respecto
a la condición control.
Figura 14. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en CMC como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. Las barras corresponden a la desviación estándar de tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas.
En la Figura 15 se presenta el nivel de transcritos del gen eglS en avicel como
única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h de los tres aislados.
Como podemos observar, RS164 y RS273 presentan tendencias de expresión
similares, presentando un incremento en el nivel de transcritos a las 48 h y
posteriomente un descenso a las 72, 96 y 120 h. RS351 presenta de igual manera un
incremento en el nivel de transcritos a las 48 h, un descenso a las 72 h, y de nuevo
un incremento hacia las 96 y 120 h.
0
5
10
15
20
25
0 24 48 72 96 120
Expr
esió
n R
elat
iva
Tiempo (h)
RZ164
RS351
RS273
46
Figura 15. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. Las barras corresponden a la desviación estándar de tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 24 48 72 96 120
Expr
esió
n re
lativ
a
Tiempo (h)
RZ164
RS351
RS273
47
8. DISCUSIÓN 8.1. Identificación de los aislados bacterianos
De acuerdo a los resultados obtenidos en la identificación molecular, los aislados de
interés corresponden a B. subtilis y este resultado implica facilidad en su estudio ya
que a la fecha existen bases de datos disponibles. Además, diversos autores han
reportado o asociado cepas B. subtilis con la producción de enzimas celulolíticas
(Yang et al., 2010; Asha y Sakthivel., 2014). Algunas patentes se han desarrollado a
base de enzimas celulolíticas producidas por B. subtilis. Esto es importante ya que
estos aislados se obtuvieron de fuentes baratas y poco aprovechadas (rastrojo de
maíz), potenciando nuevas fuentes de obtención de dichas enzimas.
8.2. Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en B. subtilis 168
De acuerdo a los resultados obtenidos, no se presentan genes con posible actividad
exoglucanasa en el genoma de B. subtilis 168, sin embargo, hay reportes de dicha
actividad. Diversos autores reportan actividad sobre avicel (sustrato específico de las
exoglucanasas) en bacterias del género Bacillus, atribuyendo dicha actividad a una
enzima con actividad endoglucanasa (CMCasa). Beltrán-Arredondo en el 2013
determinó actividad exoglucanasa en aislados del género Bacillus utilizando papel
filtro como sustrato, al igual que otros autores (Kim, 1995; Kim et al., 2012; Lee et al.,
2008; Li, 2009; Robson y Chambliss, 1987). Por otra parte Han et al., en 1995; Zhao
et al., en 2012 caracterizaron una proteína bifuncional (con actividad endo y
exoglucanasa). Todos estos antecedentes nos pueden ayudar a explicar qué
proteína es responsable de la actividad exoglucanasa en bacterias del género
Bacillus ya que estas bacterias poseen esta actividad.
Para la actividad endoglucanasa, la proteína compuesta por un dominio
celulasa de la familia 5 y un dominio de unión a celulosa de la familia 3 (GH5-CBM3)
es la proteína reportada con actividad endoglucanasa en bacterias del género
Bacillus (Bischoff et al., 2006; Lee et al., 2008; Kim et al., 2012) y coincide con la
estructura presente en el gen eglS. Además, la actividad sobre avicel (exoglucanasa)
se atribuye a su dominio de unión a celulosa (Santos et al., 2012).
48
Los genes yhfE e ysdC no comparten identidad ni propiedades estructurales
con endoglucanasas previamente reportadas, por lo tanto, decidimos descartar yhfE
e ysdC, y seleccionar eglS como el gen responsable de la actividad endoglucanasa
en la cepa modelo B. subtilis 168.
En lo que respecta a la actividad β-glucosidasa, bglC, bglH y bglA presentan
identidad y el dominio característico con β-glucosidasas reportadas. Setlow et al.,
2004 analizaron la funcionalidad de las β-glucosidasas producidas por B. subtilis
determinando que bglC, bglA, bglH y gmuD producen proteínas funcionales. En
dicho análisis una cepa sin los genes bglA, bglH y bglC creció pobremente en aril-β-
D-glucósidos comprobando que estos tres genes son importantes en la actividad β-
glucosidasa de B. subtilis. Además revisando en la literatura se encontró que gmuD
se encuentra dentro del operón para utilización de glucomanano, un polisacárido
complejo altamente fibroso, y en dicho operón gmuD se induce por la presencia de
productos generados por la hidrólisis de este polisacárido, actuando la respectiva
proteína en la degradación de manósidos principalmente (Sadaie et al., 2007). Este
tipo de glucósidos no se presentan en la degradación de la celulosa por lo tanto el
gen gmuD no figura como un gen implicado en la actividad celulolítica en B. subtilis
168.
La proteína codificada por el gen licH presentó un dominio del tipo LDH
CtermNAD(P) binding Rossman, dicho dominio no presenta reportes actuales de
actividad β-glucosidasa Cuadro 9. Tobish et al., 1997 detectaron poca o nula
actividad de la proteína codificada por el gen licH contra aril-fosfo-β-D-glucósidos en
una cepa de B. subtilis. En la base de datos del NCBI este gen coincide con una
proteína con actividad di-acetil-quitobiosa hidrolasa. Además no hay reportes
actuales donde se describa la actividad de β-glucosidasas de la familia 4. Por lo que
esta anotación está poco fundamentada. Por esto, se decidió descartar gmuD y licH,
y atribuir la actividad a bglC, bglA y bglH.
49
8.3. Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus
De acuerdo a diversos reportes en las endoglucanasas del género Bacillus, a nivel
del dominio catalítico se encuentran involucrados cuatro aminoácidos de gran
importancia (Figura 5): Glu 169 y Glu 257 los cuales funcionan como neutrófilo y
electrófilo respectivamente, e His 229, Thr 256 y nuevamente Glu 257 formando la
tríada catalítica del sitio activo (Nurachman et al., 2010). De igual manera en el
dominio de unión a celulosa se presentan aminoácidos conservados con gran
importancia en la interacción de la enzima con el sustrato los cuales son: Asn 37, Trp
39, Tyr78 y Glu 80 (Shimon et al., 2000).
Como también se puede observar, la proteína codificada por el gen eglS de los
aislados RZ164, RS351 y RS273 comparten los aminoácidos implicados en el sitio
activo de la enzima y del dominio de unión a celulosa con el resto de las secuencias,
y dichas proteínas se encuentran muy conservadas estructuralmente, lo cual nos
permite sugerir que la funcionalidad de las endoglucanasas de Bacillus pudiese ser
similar y conservada dentro del género.
Como se observa en la Figura 6, se distinguen tres grupos principales
correspondientes a la especie subtilis (en el cual se ubicaron nuestros aislados),
amyloliquefaciens y licheniformis, aunque se encuentran más estrechamente
relacionadas las especies subtilis y amyloliquefaciens. Algo interesante que se
observa, es que las endoglucanasas de los aislados RS351 y RZ164 forman un
pequeño subgrupo con la endoglucanasa producida por la cepa B. subtilis BEC-1,
una enzima caracterizada por ser halotolerante, termotolerante, acidofílica y activa en
diferentes condiciones de solventes, iones metálicos, surfactantes, agentes
quelantes, y lo más relevante es que tiene la capacidad de hidrolizar celulosa soluble
e insoluble, sugiriendo que las endoglucanasas obtenidas en este estudio pudiesen
presentar también estas características de interés a nivel industrial ( Zhu et al., 2011).
En lo que respecta a β-glucosidasas, se ha reportado que en la catálisis
enzimática intervienen dos aminoácidos aromáticos que funcionan como nucleófilo y
50
electrófilo respectivamente y que interaccionan cada uno con cada una de las
moléculas de glucosa unidas por el enlace O-glucosídico.
En especial en B. subtilis se ha reportado que dichos aminoácidos son Glu 170
y Glu 365 (Barbe et al., 2009). Como se puede observar en la Figura 7, las β-
glucosidasas de los aislados de interés se encuentran conservadas en los
aminoácidos implicados en el sitio activo, y a pesar de ser todas las enzimas de la
misma familia (GH1), se distinguen diversos agrupamientos, entre ellos,
principalmente se agrupan las proteínas de nuestros aislados de interés con
proteínas ortólogas de la cepa B. subtilis 168 (por ejemplo: bglC164 con bglC Bsubt
168), pero de manera general se pueden observar dos grupos principales, uno donde
se agrupan las β-glucosidasas de nuestros aislados con las de la cepa B. subtilis
168, y otro donde se agrupan β-glucosidasas de bacterias filogenéticamente
cercanas pero que no son B. subtilis.
Adicionalmente a estas observaciones estos estudios filogenéticos confirman
la identidad de nuestros aislados como B. subtilis.
8.4. Curva de crecimiento y actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en CMC y avicel como fuentes de carbono
Los resultados del conteo de UFC coinciden con lo reportado por Viviano et al.
(2011), quienes reportan valores de 6.4 x106 UFC/ml a las 60 h de crecimiento en
medio con avicel como única fuente de carbono para la cepa Geobacillus
stearothermophilus, resultados del mismo orden que los obtenidos en este trabajo
para el aislado RS351 bajo la misma condición de crecimiento (1.66 x106 UFC/ml).
Como se mostró en los resultados de actividad enzimática los tres aislados
presentan las tres actividades enzimáticas necesarias para la degradación de
celulosa, esto coincide con lo que reportan Kim et al. (2012) donde distintas cepas
aisladas de suelo y de composta, presentan las tres actividades enzimáticas,
predominando bacterias del género Bacillus entre los aislados.
51
Los resultados obtenidos en este estudio son comparables con los obtenidos
por otros autores. Afzal et al. (2010) evaluaron la actividad endoglucanasa de una
cepa de Bacillus sp., obteniendo la máxima hidrólisis de CMC, con una actividad de
20 UI/mL, siendo este valor de actividad endoglucanasa menor a los obtenidos en
este estudio. Kim et al. (2009) analizaron una cepa del género Bacillus, la cual
presentó valores inferiores a los de este estudio en la actividad exoglucanasa
utilizando papel filtro como sustrato (17 UI/mL). Un aspecto importante de notar es
que la actividad β-glucosidasa en CMC se mantiene a partir de las 48 h y hasta las
120 h en los tres aislados, mostrando una aparente resitencia a la inhibición por el
producto final (glucosa). Esto ya ha sido reportado para cepas de B. subtilis
(Ljungdahl y Eriksson, 1985), y resulta relevante ya que la inhibición por glucosa es
un aspecto considerado como un “cuello de botella” en cepas celulolíticas explotadas
a nivel industrial.
8.5. Nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de CMC y avicel como fuentes de carbono
Como se puede observar en la Figura 14, RZ164 y RS273 presentan tendencias de
expresión del gen eglS similares, en donde el nivel de transcritos a las 24 h pudiese
explicar la actividad endoglucanasa máxima detectada a partir de las 48 h (Figura 9A), es decir, que a las 24 h se generó la cantidad de transcritos suficiente para la
síntesis de enzima necesaria para alcanzar la actividad máxima producida a partir de
las 48 h. A las 48 h el nivel de transcritos presentó una disminución probablemente
porque la célula evita gastar energía de manera innecesaria y en ese momento ya se
había generado la cantidad de enzima suficiente para realizar cortes internos de la
región amorfa de la celulosa. El posterior incremento en el nivel de transcritos a las
72 y 96 h pudiese estar asociado con la idea de una posible bifuncionalidad de la
enzima codificada por el gen eglS, ya que dicho incremento corresponde con el
tiempo en alcanzar la máxima actividad exoglucanasa (96 y 120 h) (Figura 10A).
Esta relación existente entre la actividad enzimática y el nivel de transcritos pudiese
sugerir que primeramente se expresa el gen eglS para sintetizar enzima para actuar
sobre los enlaces internos de la celulosa, y posteriormente las moléculas generadas
a partir de los cortes realizados por la actividad endoglucanasa estimulan un nuevo
52
incremento en el nivel de transcritos de dicho gen, pero ahora para actuar como
exoglucanasa sobre éstas moléculas, dicho comportamiento coincide con el
mecanismo propuesto por diversos autores, donde inicia la acción de
endoglucanasas sobre los enlaces internos de la celulosa, y posteriormente las
exoglucanasas actúan sobre los extremos no reductores generados por la acción de
las endoglucanasas hasta obtener moléculas de celobiosa (Beguin y Aubert, 1994;
Lynd et al., 2002; Zhang et al., 2006). Por otra parte, diversos autores han
relacionado la actividad enzimática con el nivel de transcritos de un determinado gen,
sugiriendo que dicho gen es el responsable de la actividad y que su regulación es a
nivel transcripcional por el efecto de fuentes de carbono. Por ejemplo, Zhang y
Hutcheson (2011) detectaron en S. degradans actividad endoglucanasa máxima
después de 24 h de crecimiento en medio con avicel como única fuente de carbono,
coincidiendo con el más alto nivel de transcritos de los genes Cel5A, Cel5H y Cel5I,
el cual se presentó después de 24 de inducción bajo la misma condición, sugiriendo
que estos genes pudiesen ser los responsables de dicha actividad. Zhang et al.,
(2011) detectaron actividad β-glucosidasa máxima en fase de crecimiento
exponencial en avicel como única fuente de carbono, de igual manera detectaron un
nivel de transcritos máximos de los genes Bgl3C y Bgl1A en la misma fase de
crecimiento, sugiriéndolos como probables candidatos de la actividad hidrolítica
detectada en S. degradans.
En el caso de RS351, se detectó una tendencia diferente con respecto a
RZ164 y RS273 (Figura 14), presentando un incremento en el nivel de transcrito del
gen eglS a las 24 h, sin embargo, posteriormente este disminuye considerablemente
en los siguientes tiempos de incubación. Esto pudiese tener relación con lo
observado en la curva de crecimiento (conteo de UFC) presentada en la Figura 8A,
ya que la bacteria alcanza su fase estacionaria a las 24 h, indicando que a partir de
este punto ya no existe duplicación de células, y se ve reflejado en una disminución
de la actividad génica ya que en este punto quizás la bacteria ya sintetizó la cantidad
de enzima necesaria para hidrolizar celulosa y conseguir una fuente de carbono mas
disponible (glucosa). Sin embargo, resulta complicado explicar el porqué RS351
presenta una expresión diferente a la de los otros aislados, cuando además presentó
53
la mayor actividad enzimática con una menor expresión génica. Probablemente esté
implicado algún mecanismo postraduccional ausente en los otros aislados, que sea
responsable del incremento en la actividad enzimática. Diversos autores han
encontrado diferencias de actividad entre bacterias del género Bacillus, incluso de la
misma especie, ( Beltrán-Arredondo, 2013; Kim et al., 2012). Sin embargo, no existen
reportes de diferencias en la expresión de un gen ortólogo entre bacterias del género
Bacillus.
En lo que respecta al análisis en avicel como única fuente de carbono, RS273
y RZ164 presentan tendencias similares en el nivel de transcritos del gen eglS,
presentando una inducción a las 48 h y una posterior disminución hacia las 72, 96 y
120 h (Figura 15). Esto nos permite sugerir que a las 48 h se alcanza el nivel de
transcrito necesario para sintetizar la enzima suficiente para alcanzar la actividad
endo y exoglucanasa máxima detectada a las 96 h (Figuras 9B y 10B), y que
probablmente el gen y la enzima correspondiente no presentan la misma estabilidad.
RS351 presenta nuevamente una tendencia diferente con respecto a los otros
aislados, presentando un incremento en el nivel de transcritos a las 48 h, un
descenso a las 72 y de nuevo un incemento hacia las 96 y 120 h. Esto tiene relación
con lo detectado para este aislado en actividad endo y exoglucanasa en avicel como
única fuente de carbono (Figuras 9B y 10B). A su vez, esta tendencia en la
expresión del gen eglS, la obsevaron Di Pascua et al. (2014) para un gen ortólogo en
B. amyloliquefaciens (BglC) en avicel como única fuente de carbono, donde la
expresión del gen incrementó en fase lag, disminuyó en fase exponencial y
finalmente incrementó en fase estacionaria, tal como se observó en este
experimento.
Algo importante de notar, es que en CMC la inducción del gen se presenta en
menor tiempo que en avicel (24 y 48 h respectivamente), esto es debido a que avicel
presenta una estructura microcristalina, la cual es más compleja para ser hidrolizada
(Soares et al., 2012).
54
En la Figura 16 se propone un modelo general de acción del gen eglS en
CMC y avicel como única fuente de carbono, indicando los cambios en el nivel de
transcritos antes mencionados y el efecto de las moléculas presentes.
Figura 16. Mecanismo general de acción del gen eglS en CMC y avicel como única fuente de carbono propuesto en este estudio.
Resulta evidente que la actividad enzimática y la expresión del gen no
muestran el mismo comportamiento. Sin embargo, presentan una relación justificable
y coincide con lo reportado por Wei et al. (2012), quienes mencionan que el patrón de
expresión de la actividad celulolítica tiene lugar de una manera coordinada que
puede mejorar la eficiencia total de la degradación de celulosa. Por lo tanto, eglS
55
puede ser el responsbable de la actividad endo y exoglucanasa en los aislados de
Bacillus, y sería interesante comprobarlo mediante pruebas funcionales en el futuro.
Es interesante resaltar las celulasas producidas por los aislados analizados
en este estudio, ya que presentan actividad celulolítica a niveles comparables con la
de estudios previos y pudiesen cumplir con los requerimientos a nivel industrial en
tiempos cortos, presentando actividad en celulosa amorfa y celulosa cristalina. Se ha
reportado que la endoglucanasa producida por la cepa B. subtilis 168 se expresa en
muy bajo nivel, siendo esta mejorada mediante expresión heteróloga ( Zhang et al.,
2011). Por lo tanto, la expresión heteróloga del gen eglS puede ser una alternativa
para una futura aplicación biotecnológica de esta proteína, en vista que presenta
propiedades bioquímicas y catalíticas interesantes.
56
9. CONCLUSIONES
• Los aislados de interés en este estudio son de B. subtilis, una especie que ha
sido objeto de estudio durante muchos años y se considera con potencial
celulolítico, además de presentar características favorables para aplicaciones
a nivel industrial.
• A través del análisis y selección mediante herramientas bioinformáticas se
sugiere a eglS como responsable de la actividad endo y posible exoglucanasa,
ya que B. subtilis 168 no presenta un gen que codifique para ésta última, y a
bglC, bglA y bglH como betaglucosidasas, sugiriendo que estos genes
pudiesen codificar para la actividad celulolítica en bacterias del género Bacillus
y probablemente permitan la degradación completa de la celulosa.
• Las celulasas del género Bacillus se encuentran muy conservadas,
especialmente en sitios implicados en la catálisis, así como en aminoácidos
que intervienen en la interacción con celulosa, sugiriendo funcionalidad
conservada dentro del género, sobre todo en la especie subtilis.
• Las propiedades estructurales y perfiles de actividad observados postulan a
las celulasas de B. subtilis como atractivas para enfoques en mejoramiento en
la producción de enzimas de este tipo, esto, aunado al hecho que su
regulación es a nivel transcripcional por el efecto de fuentes de carbono,
aporta bases para futuros proyectos o escalamientos a nivel biotecnológico.
57
10. BIBLIOGRAFÍA
Afzal S., Saleem M., Yasmin R., Naz M., Imran M. 2010. Pre and post cloning characterization of a b-1,4-endoglucanase from Bacillus sp. Mol Biol Rep. 37: 1717–1723.
Annamalai N., Thavasi R., Vijayalakshmi S., Balasubramanian T. 2011. A novel thermostable and halostable carboxymethylcellulase from marine bacterium
Bacillus licheniformis AU01. World J Microbiol Biotechnol. 27: 2111–2115. Anuj K., Chandel O., V. 2011. Weedy lignocellulosic feedstock and microbial
metabolic engineering: advancing the generation of ‘Biofuel’. Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 89, Number 5, Page 1289
Asha B., Sakthivel N. 2014. Production, purification and characterization of a new
cellulase from Bacillus subtilis that exhibit halophilic, alkalophilic and solvent-tolerant properties. Ann Microbiol 64:1839–1848 DOI 10.1007/s13213-014-0835-x
Asha B. M., Pathma J., Sakthivel N. 2015. Isolation and characterization of a novel
thermostable β-glucosidase from Bacillus subtilis SU40. Applied Biochemistry and Microbiology, 51(1), 21-26.
Assareh R., Zahiri H.S., Noghabi K.A., Aminzadeh S., Bakhshi K. 2012.
Characterization of the newly isolated Geobacillus sp. T1, the efficient cellulase-producer on untreated barley and wheat straws. Bioresource Technology. 120: 99-105.
Barbe V., Cruveiller S., Kunst F., Lenoble P., Meurice G., Sekowska A., Vallenet D., Wang T., Moszer I. 2009. From a consortium sequence to a unified sequence: the Bacillus subtilis 168 reference genome a decade later. Microbiology 155, 1758–1775.
Beckham G. T., Matthews J. F., Peters B., Bomble Y. J., Himmel M. E., Crowley M. F. 2011. Molecular-Level Origins of Biomass Recalcitrance: Decrystallization Free Energies for Four Common Cellulose Polymorphs. J. Phys. Chem.115, 4118−4127.
Beguin P., Aubert J. 1994. The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews. 13: 25-58.
Beg Q. K., Kapoor, M., Mahajan L. y Hoondal G. S. 2001. Microbial xylanases and their industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:326–338.
Beltrán-Arredondo L.I. 2013. Caracterización y estudio cinético de microorganismos productores de celulasas, aislados del municipio de Guasave y su potencial
58
aplicación en la producción de bioetanol. Tesis de Maestría en Recursos Naturales y Medio Ambiente CIIDIR-IPN-SINALOA.
Ben-Ghedalia D., Miron J. 1981. The effect of combined chemical and enzyme
treatments on the saccharification and in vitro digestion rate of wheat straw. Biotechnology and Bioengineering. 23:823-831.
Berlemont R. Y., Martiny A. 2013. Phylogenetic Distribution of Potential Cellulases
in Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 79:5 1545-1554;
Bhat M. 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. Adv., 18, pp. 355–383
Bhat M. K., Bhat S. 1997. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications. Biotechnology Advances. 15:583-601.
Bischoff K. M., Rooney A. P., Li X. L., Liu S., Hughes S. R. 2006. Purification and characterization of a family 5 endoglucanase from a moderately thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Biotechnology letters. 28(21), 1761-1765.
Cazemier A.E., Verdoes J.C., Op den Camp H.J., Hackstein J.H.P., Ooyen van A.J.J. 1999. A β-1,4-endoglucanase-encoding gene from Cellulomonas pachnodae. Appl Microbiol Biotech. 52:232–239
Chaoning L., Yanfen X., Marco F., Rodríguez-Ropero F., Cheng Z., Ulrich S., Yanhe M. 2010. Cloning and characterization of a thermostable and halo-tolerant endoglucanase from Thermoanaerobacter tengcongensis MB4. Appl Microbiol Biotechnol. 89:315–326
Chen X, Luo Y, Yu H, Sun Y,Wu H, Song S,HuS,DongZ. 2014. Transcriptional profiling of biomass degradation- related genes during Trichoderma reesei growth on different carbon sources. J Biotechnol 173:59–64
Chun J., Bae K.S. 2000. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences. Antonie van Leeuwenhoek 78, 123–127.
Cole J. R., Chai B., Marsh T. L., Farris R. J., Wang Q., Kulam S. A., Tiedje J. M. 2003. The Ribosomal Database Project (RDP-II): previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy. Nucleic acids research, 31(1), 442-443.
Cruz N., Castellanos D., Argüello H. 2009. Degradación de celulosa y xilano por microorganismos aislados de dos tipos de compost de residuos agrícolas en la sabana de Bogotá. Rev. Colomb. Cienc. Hortíc. 3(2): 237-249.
59
Cullen D., Kersten P. 1992. Fungal enzymes for lignocellulose degradation. In Kinghorn J.R, Turner G., eds. Applied molecular genetics of filamentous fungi. New York: Chapman and Hall. Chapter 4:100-131.
Di Pasqua R., Ventorino V., Aliberti A., Robertiello A., Faraco V., Viscardi S., Pepe O. 2014. Influence of different lignocellulose sources on endo-1,4-β-Glucanase gene expression and enzymatic activity of Bacillus amyloliquefaciens B31C. Bioresources 9(1), 1303-1310
Dhillon N., Chibber S., Saxena M., Pajni S., Vadehra D. 1985. A constitutiveendoglucanase (CMCase) from Bacilluslicheniformis-1. Biotechnol. Lett., 7pp. 695697
Dongowski G., Sembries S., Bauckhage K., Will F., Dietrich H. 2002. Degradation of apple cell wall material by commercial enzyme preparations. Nahrung/ Food. 46:105-111.
Eriksson K. E., Wood T. M. 1985. Biodegradation of cellulose: biosynthesis and biodegradation of wood components. Higuchi T (ed). Academic Press, New York. 469-503 pp.
Félix C. R., Ljungdahl L. G. 1993. The Cellulosome: the exocellular organelle of Clostridium. Rev. Microbiolol. Athens, Georgia. 47:791-819.
Fendri I., Abdou L., Trotter V., Dedieu L., Maamar H. 2013. Regulation of cel Genes of C. cellulolyticum: Identification of GlyR2, a Transcriptional Regulator Regulating cel5D Gene Expression. PLoS ONE 8(1): e44708. doi:10.1371/journal.pone.0044708.
Fontes C. M., Gilbert H. J. 2010. Cellulosomes: highly efficient nanomachines designed to deconstruct plant cell wall complex carbohydrates Annu Rev Biochem, 79, pp. 655–681
Forsberg C. W., Groleau D. 1982. Stability of the endo-β-1,4-glucanase and β-1,4-glucosidase from Bacteroides succinogenes. Canadian Journal of Microbiology. 28:144-148.
Furukawa T., Kitagami N., Shida Y, Morikawa Y., Ogasawara W. 2012. Overexpression of ACEII,and transcriptional analysis of cellulase genes in Trichoderma reeseiPC-3-7. Department ofBioengineering, Nagaoka University of Technology. Transactions on GIGAKU 1(2012)01031/1-6
Gaitán D., Pérez L. 2007. Aislamiento y Evaluación de microorganismos celulolíticos a partir de residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora). Trabajo de grado para optar el
60
título de Microbiologia Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogota. Colombia. 16:23.
Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R. D., Bairoch A. 2003. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic acids research. 31(13), 3784-3788.
Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A. 1991. Domains in microbial beta-1, 4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families. Microbiol Rev. 55(2):303–315.
Gutiérrez-Nava A., Herrera-Herrera A., Mayorga-Reyes L., Salgado L.M., Ponce-Noyola T. 2003. Expression and Characterization of the celcflB Gene from Cellulomonas flavigena Encoding an Endo-β-1,4-Glucanase. Current Microbiology. 47(1): 359–363.
Haibo L., Huan P., Wenkun H., Gaofeng W., Bingli G., Maurice M., Deliang P. 2012. Identification and molecular characterization of a new β-1,4- endoglucanase gene (Ha-eng-1a) in the cereal cyst nematode Heterodera avenae. Eur J Plant Pathol. 134:391–400.
Han S., Yoo Y., Kang H. 1995. Characterization of a bifunctionalcellulase and its structural gene J. Biol. Chem., 270, pp. 2601226019
Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemesle L., Mornon J. P. 1989. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. Gene 81 (1): 83–95.
Henrrisat B., Davies G. 1997. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. IUBMB. Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:637-644
Herrera-Herrera J. A., Pérez-Avalos O., Salgado L. M, Ponce-Noyola T. 2009. Cyclic AMP regulates the biosynthesis of cellobiohydrolase in Cellulomonas Xavigena growing in sugar cane bagasse. Arch Microbiol.191:745-50
Ho T. D., Hastie J. L., Intile P. J., Ellermeier C. D. 2011. The Bacillus subtilis extracytoplasmic function σ factor σV is induced by lysozyme and provides resistance to lysozyme. Journal of bacteriology. 193(22), 6215-6222.
Horikoshi K., Nakao M., Kurono Y., Sashihara N. 1984. Cellulase of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil Can. J. Microbiol. 30 (1984), pp. 774–779
Howard R. L., Abotsi E., Jansen van Rensburg E. L., Howard S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology. 2:602-619.
61
Jianjun P., Qian P., Linguo Z., Song F., Hao S. 2012. Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum β-glucosidase: a glucose-tolerant enzyme with high specific activity for cellobiose. Biotechnology for Biofuels. 5:31
Kim Y. K., Lee C., Cho Y., Oh H., Ko Y. 2012. Isolation of Cellulolytic Bacillus Subtilis Strains from Agricultural Environments. ISRN Microbiology. doi:10.5402/2012/650563
Kim B., Lee B., Lee Y., Jin I., Chung C., Lee J. 2009. Purification and characterization of carboxymethylcellulase isolated from a marine bacterium, Bacillus subtilis subsp. subtilis A-53. Enzyme and Microbial Technology. 44: 411–416
Kim C. 1995. Characterization and substrate specificity of an endo-β-1,4-D glucanase I (Avicelase I) from an extracellular multienzyme complex ofBacillus circulans. Appl. Environ. Microbiol., 61, pp. 959–965
Kim S., Dale B. E. 2004. Global potential bioethanol production from wastedcrops and crop residues. Biomass and Bioenergy, 26, pp. 361–375
Koeck D. E., Pechtl A., Zverlov V. V., Schwarz W. H. 2014. Genomics of cellulolytic
bacteria. Current opinion in biotechnology. 29, 171-183. Koeck D. E., Koellmeier T., Zverlov V. V., Liebl W., Schwarz W. H. 2015.
Differences in biomass degradation between newly isolated environmental strains of Clostridium thermocellum and heterogeneity in the size of the cellulosomal scaffoldin. Systematic and applied microbiology. 38(6), 424-432.
Kurasin M., Valjamae P. 2011. Processivity of Cellobiohydrolases Is Limited by the Substrate. The Journal of Biological Chemistry, 286, 169-177.
Lamed R., Bayer E. A. 1988. The cellulosome of Clostridium thermocellum. Advances in Applied Microbiology. 33:1-46.
Lee Y., Kim B., Lee B., Jo K., Lee N., Chung C., Lee Y, Lee J. 2008. Purification and characterization of cellulase produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull. Bioresource Technology 99 378–386
Lee B. H., Kim B. K., Lee Y. J., Chung C. H., Lee J. W. 2010. Industrial scale of optimization for the production of carboxymethylcellulase from rice bran by a marine bacterium, Bacillus subtilis subsp. subtilis A-53. Enzyme and Microbial Technology. 46(1), 38-42.
Liu T., Wang T., Li X., Liu X. 2008. Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbh1) promoter optimization. Acta Biochim Biophys Sin: 158-165
62
Ljungdahl L. G., Eriksson K. E. 1985. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in Microbiology and Ecology, 8:237-299.
Logan N.A., Turnbull P.C.B. 2003. Bacillus and other aerobic endosporeforming bacteria, p. 445-460. In P.R. Murray et al. (ed.), Manual of clinical microbiology. ASM
Press,Washington, DC
Lynd L. R., Weimer P. J., van Zyl W. H., Pretorius I. S. 2002. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microb Mol Biol Rev. 66:506-577.
Malherbe S., Cloete T. E. 2002. Lignocellulose Biodegradation: Fundamentals and applications. Re/Views in Environmentel Science & Bio/Technology. 1:105-114.
Marsden W. L., Gray P. P.1986. Enzymatic hydrolysis of cellulose in lignocellulosic materials. CRC Critical Reviews in Biotechnology. 3:235-274.
Martínez T. A., Speranza M., Ruiz-Dueñas J. F., Ferreira P., Camarero S., Guillén F., Martínez J .M., Gutiérrez M., Del Río C. J. 2005. Biodegradation of lignocellulosics: microbial, chemical and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin. International Microbiology, 8:195-204.
Murashima K., Kosugi A., Doi R. H. 2002. Synergestic effects on crystalline cellulose degradation between cellulosomal cellulases from Clostridium cellulovorans. J. Bacteriol. 184:5088-5095.
Nurachman Z., Kurniasih S. D., Puspitawati F., Hadi S., Radjasa O. K., Natalia D. 2010. Cloning of the Endoglucanase Gene from a Bacillus amyloliquefaciens/i PSM 3.1 in iEscherichia coli/i Revealed Catalytic Triad Residues Thr-His-Glu.
Oliveira L. R., Barbosa J. B., Martins M., Martins M. A. 2014. Extracellular production of avicelase by the thermophilic soil bacterium Bacillus sp. SMIA-2. Acta Scientiarum. Biological Sciences. Maringá, v. 36, n. 2, p. 215-222 .
Ovando-Chacon S.L., Waliszewski K.N. 2005. Preparaciones de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos. Universidad y Ciencia. 21(42): 111-120.
Ozaki K., Ito S. 1991. Purification and properties of an acid endo-β-1,4-glucanase from Bacillus sp KSM-330 J. Gen. Microbiol., 137 (1991), pp. 41- 48
Paavilainen S., Hellman J., Korpela T. 1993. Purification, Characterization, Gene Cloning, and Sequencing of a New 13-Glucosidase from Bacillus circulans subsp. Alkalophilus. Applied and environmental microbiology, Mar. 1993, p. 927-932
63
Pérez J., Muñoz-Dorado J., Rubia de la T., Martínez J. 2002. Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin. Overview International Microbiology. 5: 53–63.
Polizeli M.L.T.M., Rizzatti A.C.S., Monti R., Terenzi H.F., Jorge J.A., Amorim D.S. 2005. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 67(5): 577-591.
Ryu D.D., Mandels M. 1980. Cellulases: biosynthesis and applications. Enzyme and Microbial Technology. 2: 91-102.
Rabinovich M. L., Melnick M. S., Bolobova A.V. 2002. The structure and mechanism of action of cellulolytic enzymes. Biochemistry (Moscow), 67 (8): 850 -871.
Robson M., Chambliss G. 1984. Characterization of the cellulolytic Activity of a Bacillus isolate Appl. Environ. Microbiol., 47 (1984), pp. 10391046
Robson L. M., Chambliss, G. H. 1987. Endo-beta-1, 4-glucanase gene of Bacillus subtilis DLG. Journal of bacteriology. 169(5), 2017-2025.
Sadaie Y., Nakadate H., Fukui R., Yee L. M., Asai K. 2008. Glucomannan utilization operon of Bacillus subtilis. FEMS microbiology letters. 279(1), 103-109.
Saibi W., Abdeljalil S., Gargouri A. 2011. Carbon source directs the differential expression of β-glucosidases in Stachybotrys microspore. World J Microbiol Biotechnol 27:1765-1774
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. In Molecular Cloning: A Labolatoratory Manual, (2nd ed.). Cold Spring Habor Laboratory Press, Boston, MA, USA.
Sandgren M., Wu M., Karkehabadi S., Mitchinson C., Kelemen B. R., Larenas E. A., Hansson H. (2013). The structure of a bacterial cellobiohydrolase: the catalytic core of the Thermobifida fusca family GH6 cellobiohydrolase Cel6B. Journal of molecular biology. 425(3), 622-635.
Sangkharak K., Vangsirikul P., Janthachat S. 2012. Strain improvement and optimization for enhanced production of cellulase in Cellulomonas sp. TSU-03. African Journal of Microbiology Research. 6(5), 1079-1084.
Santos C., Joice, H. P., Mauricio, L. S., Jorge, L. N., Rodrigo, Z. N., Junio, C., Mario, T. M. 2012. Dissecting structure-function-stability relationships of a thermostable GH5-CBM3 cellulase from Bacillus subtilis 168. Biochemical Journal. 441(1), 95-104.
64
Saul D. J., Williams L. C., Grayling R. A., Chamley L. W., Love D. R., Bergquist P. L.1990. celB, a gene coding for a bifunctional cellulase from the extreme thermophile Caldocellum saccharolyticum. Appl Env Microbiol 56:3117–3124.
Schmoll M., Kubicek C. P. 2003. Acta. Microbiol. Immunol. Hung. 50 (2003) 125-145.thermophile. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 10: 444-451.
Setlow B., Cabrera-Hernandez A., Cabrera-Martinez R. M., Setlow P. 2004. Identification of aryl-phospho-β-D-glucosidases in Bacillus subtilis. Archives of microbiology. 181(1), 60-67.
Shoseyov O., Shani Z., Levy I. 2006. Carbohydrate binding modules: biochemical properties and novel applications Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (2006), pp. 283–295
Soares F. L., Melo I. S., Dias A. C. F., Andreote F. D. 2012. Cellulolytic bacteria
from soils in harsh environments. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28(5), 2195-2203.
Sugden C., Bhat M.K. 1994. Cereal straw and pure cellulose as carbon sources for growth and production of plant cell wall degrading enzymes by Sporotrichum thermophile. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 10: 444-451.
Teather R., Wood P.1982. Use of Congo red, polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied Environmental Microbiology. 43 (4): 777-780.
Thayer D.W., David C. A.1978. Growth of "seeded" cellulolytic enrichment cultures on mesquite wood. Appl Environ Micro- biol 36:291-296
Tobisch S., Glaser P., Krüger S., Hecker M. 1997. Identification and characterization of a new beta-glucoside utilization system in Bacillus subtilis. Journal of bacteriology. 179(2), 496-506.
Viviano F., Medina L., Ramos N., Amaíz L., Valbuena O. 2011. Degradación de celulosa por bacterias de aguas termales de Las Trincheras, Venezuela. Rev Lattiinoam Biiottecnoll Amb Allgall 2((1)):18-29
Wachinger G., Bronnenmeier K., Staudenbauer W., Schrempf H.1989. Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli. Appl. Envirom. Microbiol. 55: 2653-2657.
Walid S., Salma A., Ali G. 2012. Carbon source directs the differential expression of b-glucosidases in Stachybotrys microspore. World J Microbiol Biotechnol. 27:1765–1774.
65
Wang Q., Tull D., Meinkes A., Gilkes N. R., Warren R. A. J., Aebersold R. Withers S. G. 1993. Glu280 is the nucleophile in the active site of Clostridium thermocellum CelC, a family A endo-b-1,4-glucanase. J. Biol. Chem. 268, 14096–14102.
Wang X., Peng Y., Zhang L., Li A., Li D. 2012. Directed evolution and structural prediction of cellobiohydrolase II from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum. Appl Microbiol Biotechnol 95:1469–1478.
Wang B., Cai P., Sun W., Li J., Tian C., Ma Y. 2015. A transcriptomic analysis of Neurospora crassa using five major crop residues and the novel role of the sporulation regulator rca-1 in lignocellulase production. Biotechnology for Biofuels 8:21
Warren R.A.J.1996. Microbial hydrolysis of polysaccharide. Annual Review of Microbiology. 50: 183-212.
Wei H., Tucker M. P., Baker J. O., Harris M., Luo Y., Xu Q., Ding S. Y. 2012. Tracking dynamics of plant biomass composting by changes in substrate structure, microbial community, and enzyme activity. Biotechnol Biofuels, 5, 20.
Wood T. M., S. I. McRae. 1979. Synergism between enzymes involved in the solubilization of native cellulose. Adv. Chem. Ser. 181:181-209.
Wood T. M., Bath K. M. 1988. Methods en enzimology, Vol. 160, Wood, W.A.; Kellogg, S.T., Eds., Academics Press., 112-116 pp.
Wood T. M. 1989. Mechanisms of cellulose degradation by enzymes from aerobic and anaerobic fungi. In Enzyme Systems for Lignocellulose Degradation. Elsevier Applied Science London. (pp. 17-35)
Yan Y., Smant G., Stokkermans J., Qin L., Helder J., Baum T. 1998. Genomic organization of four β-1,4-endoglucanase genes in plan-parasitic cyst nematodes and its evolutionary implications. Gene 220:61–70.
Yang D., Weng H., Wang M., Xu W., Li Y., Yang H. 2010. Cloning and expression of a novel thermostable cellulose from newly isolated Bacillus subtilis strain I15. College of Life Science, Henan Agricultural University,Mol Biol Rep 37:1923–1929
Zhang H., et al. 2011. Hydrolytic and phosphorolytic metabolism of cellobiose by the marine aerobic bacterium Saccharophagus degradans 2-40T. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. doi:10.1007/s10295-011-0945-4.
Zhang X. Z., Sathitsuksanoh N., Zhu Z., Percival Zhang Y. H., 2011. One-step production of lactate from cellulose as the sole carbon source without any other
66
organic nutrient by recombinant cellulolytic Bacillus subtilis. Metab. Eng. 13, 364–372.
Zhang H., Hutchenson S. 2011. Complex expression of the cellulolytic transcriptome of Saccharophagus degradans. Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland. Applied and Enviromental Microbiology. P. 5591-5596.
Zhang Y., Himmel M., Mielenz J. 2006. Outlook for cellulase improvement: Screening and selections strategies. Biotechnology Advances. 24: 452-481.
Zhao X. H., Wang W., Wang F. Q., Wei D. Z. 2012. A comparative study of β-1,4endoglucanase (possessing β-1, 4-exoglucanase activity) from Bacillus subtilis LH expressed in Pichia pastoris GS115 and Escherichia coli Rosetta (DE3) Bioresour Technol, 110, pp. 539–54
Zhou Z., Zhou X., Li J., Zhong Z., Li W., Liu X., Peng G. 2015. Transcriptional Regulation and Adaptation to a High-Fiber Environment in Bacillus subtilis HH2 Isolated from Feces of the Giant Panda. PloS one. 10(2), e0116935.
Zhu C., Xu Z., Song R. 2011. The endoglucanase from Bacillus subtilis BEC-1 bears halo-tolerant, acidophilic and dithiothreitol-stimulated enzyme activity. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27(12), 2863-2871.