ID Micro Curs

8/12/2019 ID Micro Curs

1/168

MICRONMULIREAPLANTELOR HORTICOLE

@2013

Lect. univ, prof. dr. Adrian Peticil


2/168

ISTORICUL CULTURILOR DE CELULEI ESUTURI VEGETALE

aurul verde ; surs de hran i energie pentru om i animale; purificator al atmosferei; materii prime pentru unele industrii (alimentar, textil, farmaceutic) ;

Rolul plantelor n viaa i echilibrul planetei .

Secolul XX: celula vegetal conine n nucleulsu totalitatea informaiei genetice necesardezvoltrii unui organism complet.

Ea se supune principiului clasic al totipotenei .


3/168

Celul haploid sau diploid

Regenerarea plantelor

Tehnica nmulirii plantelor i n vitro


4/168

(28 noiembrie 1854 - 30 ianuarie 1945)

1902 - lucrarea Kultu rve rsuc he m itiso lie rte n Pfla nzen ze lle ;

orice celul diploid sau haploidconine informaia genetic ereditarimprimat n genom.

1926 - teoria este respin de botanitiicontemporani - E.K s t e r.

Pionierii

Gottlieb Haberlandt


5/168

1839 - Vchting i Rechingerau iniiat experimente pentru determinarea limitelor de divizibilitate ale

materialului vegetal, fr pierderea capacitii regenerative.

1904 - Hanninga obinut plantule la crucifere pornind de la embrioni extrai din

semine imature la Raphanus sativus, R.landra, R.candatus i Cochlearia danica,a certificat creterea pe medii artificiale cu adaos de zaharoz a unorfragmente de plante;1934 - R. J . Cautheret

a obinut calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun i morcovpe c are le- a stimulat cu auxine i le -a repicat n medii sterile;1939 - Wihte

a reuit s obin calus din vrfurile rdcinilorde tomate;1939 - Schleiden i Schwann

schieaz conceptul totipotenei celulare lansat

ulterior de Haberlandt;

Hermann Vc hting

Pionierii


6/168

1957 - W. D. Stewart

elaboreaz prima metodologie de cultivare in vitro a esuturilor vegetale pe medii nutritive coninnd hormoni de cretere .

1925, 1929 -Laibachdemonstreazutilitateapractica tehnicii de nmulirein vitro

pentru ameliorarea plantelor, izolnd embrionii dinsemineneviabiledin ncruciarealui Linum perene cu Linum austriacum i cultivndu-i pemedii nutritive.

1934 -Kgl, Haagen SmitiErxlebenprimul fitohormon (acidul indolil acetic) deschide o nou

etap n succesul cultivriiin vitro a explantelor,

Pionierii

White (1938), Gautheret i Nobecourt au pus bazele cultivrii in vitro a explantelorvegetale: organe, esuturi i celule. Totodat, ei i -au adus contribuia i n domeniul

alctuirii mediilor de cultur privind compoziia, concentraia n macro imicroelemente eseniale pentru nutriia explantelor, prezena unei surse de C i N

organic, a unor vitamine i auxine.

--------------------------------------------------------------------------------------------


7/168

1955 - Miller i colab.izoleaz din sperma de heringi, chinetina

1957- Skoog i Miller avanseaz ipoteza balanei hormonale a raportului dintre auxin

i citochinin care favorizeaz iniierea de rdcini i mugurai dintr-ocultur de calus.

1977i1978 -Murashigemultiplicarea prin subculturi succesivein vitro dintr-un

singur meristem de orhidee afcut posibil obinereaa 4 milioane deexemplare, copii fidele ale plantei donatoarei a demonstrat ieficiena economica metodei prin care se face economie de materialbiologic.

Pionierii


8/168

ETAPELE ISTORICE ALE DEZVOLTARIITEHNICILOR DE MULTIPLICARE IN VITRO

1.1939 1902;teoria unitii structurale fundamentale a lumii vii (Schleiden i Schwann,1939) iar celula a fost acceptat ca unitate structural de baz a organismelor vii, fiind apoiemis postulatul conceptului de totipotenialitate (omnipotenialitate) celular a luiHaberlandt, 1902 .

2.1902 1920;o perioad de stagnare a cercetrilor n domeniu

3.1920 1939;primele succese n domeniul creteriiin vitro a embrionilor, ardcinilor, a obinerii de calus, esuturi care cultivate apoi pe medii aseptice isubcultivate periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal.(White, Gautheret i Nobecourt).

4.1939 1966;studii efectuate de numeroi cercettori privind comportamentuldiferitelor explante cultivate pe diferite medii de cultur, pentru cunoaterea i afactorilor implicai n procesele de nmulire i difereniere a celulelor, gradul lor deautonomie funcie de substrat, condiiile de cultur, proveniena i naturaexplantului.

5.1966i pn n zilele noastre; extinderea larg a utilizrii explantelor pentrumultiplicare, dezvoltarea citologiei, citofiziologiei, biologiei moleculare, geneticii iameliorrii la nivel ultrastructural i molecular, biochimiei, fiziologiei.


9/168

Subramuri de biotehnologii vegetaleCitofitotehnologii

nmulirea i clonarea cultivarilor valoroi ; micropropagarea i generarea de material vegetal sntos ; elaborarea de tehnologii de modificare a genomului unor specii cormofite; exploatarea capacitii de biosintez a celulelor izolate n condiii de culturintensiv ; obinerea de embrioni somatici, producerea de semine artificiale; clonarea rapid a unor soiuri rezultate din lucrrile de ameliorare.


10/168

Prezene romneti

1975 - au fost abordate cercetri sistematice privind problemele nmulirii plantelor in vitro fiind amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul deCercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice din Bucureti, nunitile de cercetare agricol i horticol de la Fundulea, Vidra, Mrcineni,tefneti, n unitile de nvmnt superior agricol din Cluj Napoca, Bucureti,Iai, Facultatea de Biologie din Bucureti, Facultatea de Farmacie din Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere Codlea (1988).

1984 - apare prima monografie de profil intitulat Culturi de celule i esuturivegetale aplicaii n agricultur Ed.Ceres, autori Cachi C.D., Raicu P. iBadea M.E.

1985 1988- primele cursuri n domeniul culturilor de celulei esuturivegetale dinmediul universitar au luatfiinla Institutul AgronomicN.Blcescudin Bucuretisub form de cursuri postuniversitare.

1987 - acest curs s-a introdus subform opionalla seciilede biologiei lafacultilede horticulturdin ar.

1985 se introduce laBucureti, n cadrul USAMV, Facultatea de Biotehnologie curamuri ale biotehnologiei vegetale, si devine disciplina fundamentala independenta.


11/168

1972 - ia fiin International Association for Plant Tissue Culture la care Romnia aaderat n anul 1975.

La noi n ar se nfiineaz Asociaia Romn de Culturi de esuturi i CeluleVegetale.

1989 - Institutul de Cercetri Biologice din Cluj Napoca organizeaz al IV -leaSimpozion Naional de Culturi de Explante.

noiembrie 2000 - se organizeaz la Universitatea Babe Bolyai Facultatea deBiologie din Cluj Napoca al X- lea Simpozion de Culturi de esuturi i Celule Vegetalecare marcheaz 25 de ani de la iniierea primelor cercetri n domeniul culturilor decelule i esuturi n Romnia.

Prezene romneti


12/168

SUNPRIDERoyal Base Corporation


13/168

CULTURILE DE TESUTURI DEPLANTE

Propagareain vitroTehnica rapid (comparativ cu nmulirea vegetativ)

Folosite pentru:1. Micropropagare2. Regenerare


14/168

form rapid de multiplicare;proces asexuat de creare de noi plante, identice;conservarea germoplasmei, prin meninereaheterozigotismului, care s-ar pierde prin semine.obinerea de plante libere de virusuri;proces continuu, nedifereniat de anotimpuri saucondiii de clim

dintr-o singur plant se producmulte clone identice genetic

Micropropagarea


15/168

Un singursegment nodal vaproduce un explant cu 4-6noduri n decurs de 4-6sptmni.Fiecare explant se multiplic,producnd alte 4-7 explante.


16/168

Sute de plante pot fi produse astfeldintr-un singur segment nodal.

Plantele obinute sunt clone aleplantei mam.


17/168

Specii care permit micropropagarea

arbuti ornamentali, coleus,difenbachia, ficus, caladium, pomifructiferi, semiarbuti, via-de-vie,trandafiri, orhidee, clematis, liliac,

begonia, frezia, iris, narcisa,mucata, petunia, lalelele,

rododendron, azalea, mutar,porumb, soia, gru, orez, bumbac,

tomate, cartofi, citrice, gazon,ceap, asparagus, varz, castravei,

mazre, fasole.

A j l i ii


18/168

Avantajele micropropagrii

Tehnologie care economisete spaiul i timpul;Rezultat favorabil - se pot produce milioane despecii florale uniforme genetic;

African Biotechnologies produce anual peste 6

milioane de bananei plante de interior la ghiveceLa bulboase: dac se produc 5-7 bulbi/an prin metodeconvenionale, micropropagarea poate ridicaproducia la 1000/an la iris, gladiol, narcis,Hyacinthus sau Amaryllis

Liber de virusuri;Conservarea speciilor cu caractere excepionale.


19/168

Avantaje globale

Facilitarea circulaiei n siguran agermoplasmei ntre naiuni- asigur schimbulde material organic vegetal ntre ri frpericolul bolilor sau molimelor.

Ideal pentru:Culturi cu reproducere vegetativ;Culturi cu producie mic de semine sau cuprocent mare de semine heterozigote


20/168

Limitri

Costul/unitate poate s l depeasc pe cel almetodelor convenionale de propagare, din cauzafacilitilor, a mentenanei i a costurilor de la borator

Multe specii sunt recalcitrante la aceast metodApariiai variaiei somacloanle urmare a instabilitiiunor plante (schimbri de epigenetic i genetic)


21/168


22/168

Regenerarea este posibil urmare a caracteristicii plantelorde a fi t otipotente , prin folosirea hormonilor

Culturi difereniate : segmente nodale, frunze, rdcinietc.

Culturile de celule nedifereniate (embriogenez ) sunttotipotente: pot deveni o planta complet noua prindifereniere.


23/168

Aciunea diferiilor hormoni/regulatori aspra plantelor nu este unaidentic:

plante diferite raspund diferit la acelai stimul chimic diferite pri de plant reacioneaz diferit la acelasi

stimul chimic

Hormonii sunt regulatori chimici naturali care se gsesc n plante icare influeneaz creterea plantelor.

Regulatorii de cretere sunt versiunea sintetic a hormonilor dinplante.

Citochininele induc creterea vegetativ.

Auxinele induc rizogeneza.


24/168

Etapele micropropagrii

esutul trebuie s fiesteril, complet liberde microorganisme.

esutul de iniiere se numeteexplant si este format din celuledifereniate, care se vor transforma n esuturi difereniate: radcini,frunze, ovare, cotiledoane etc)


25/168

Planta donor

Transfer in vivo

Pepiniera

Aclim atizare

From: Plant Propagation Concepts and Laboratory Exercises. Beyl& Trigiano, CRC Press2008.

Inradacinare

ETAPELE MICROPROPAGARII

Prelevare

InitiereProliferare

Gfh

Ptoliferare 2

Explante crescute

Explant inradacinat


26/168

Etapele micropropagrii

etapa 1.Iniierea culturiietapa 2.Multiplicareaetapa 3. nrdcinareaetapa 4.

Aclimatizarea

etapa 1


27/168

etapa 1.Iniierea culturii

Factorii care se iau nconsideraie:

A. Selecia plantei: caracteristicile genetice

(cultivarul, corectitudineagenetic, plantsntoas);

controlul agenilor patogeni n plant;

condiia fiziologic aplantei.


28/168

Factorii care se iau n

consideraie:B. Dezinfecia: fungi, bacterii, pduchi,

mucegai, virui, patogeniinterni,

plante i explante sntoase; perioada din an n care seface recoltarea explantuluipentru iniierea culturii.


29/168

Factorii care se iau n consideraie:

C. Mediul de cultur: diferite reete, n funcie de

specie.


30/168

etapa 2


31/168

etapa 2.Multiplicarea


A. Pstrarea culturii: culturile stabilizate continu

dezvoltarea rapid a noilororgane ;

proliferarea creterilor axilare i

laterale; creterile variaz cu specia icultivarul.


32/168


B. Noi explante: explantul iniial se secioneaz

dnd natere la noi plante;


33/168

Factorii care se iau nconsideraie:C. specia, mediul decultur, reacia lainoculare i condiiile delaborator modific rata demultiplicare;

etapa 3.


34/168

etapa 3.nrdcinarea

Factorii care se iau nconsideraie:

A. Scopul :pregtirea noile plante pentrutransferul din cultura steril; nrdcinarea i aclimatizareasunt considerate stadii limit nmicronmulire; nrdcinarea se poate faceinvitro sau in vivo;necesit mediu de nrdcinarespecial.


35/168


36/168


37/168

D ii


38/168

Dou spa ii

Zona nesteril /generaliti

Def.= spaiul destinat activitilor care se desfoar n condiii nesterile.

Con ine:

spltor;

laboratorul de preparare a mediilor de cultur;camere de cretere;depozit de sticlrie;depozit de substane chimice ncperea cu autoclave.

Zona steril /generaliti


39/168

Def. = ncpere aseptic, steril, n care se execut sterilizarea, prelevareaiinocularea explantelor

Contine:mai multe hote de lucru cu flux laminar orizontal sau vertical de aer steril.

Procese: dezinfectarea materialuluivegetal; prelevare; inoculare explantein vitro; repicare sau subcultivare.

g


40/168

nc peri amenajate facil pentru ntre inere i evacuare ; pardoseal din gresie sau mozaic sau alte materiale moderne; pere ii acoperi i cu faian sau vopsea de ulei, pentru a se putea ntre ine u or i

a fi facil pentru procesele de aseptizare;asigur area unei curenii perfecte n toate compartimentele laboratorului( praf + murdri e =surse de germeni infecii )

Caracteristicile spa iilor laboratorului de micronmul ire

Orice defeciune de lung durat poate provoca perturbaii grave ndesfurarea lucrrilor, stagnnd fluxul operaiunilor bani pierdui.

Dimensionarea


41/168

Dimensionarea

se va face innd cont despecificul activitii;volumul de activitate pe care laboratorul urmeaz s l aib;amploarea personalului care va deservi laboratorul;mobilierul i aparatura folosite.

Ex: culturi de meristemeScop: obinerea in vitro de material devirozat;Specific:prelevarea explantelor se face la stereomicroscop. n

consecin, fiecare operator va lucra la un astfel de aparat, instalat nnia sau boxa steril.Dimensionarea recipientelorde cultur.Inocularea icreterea culturilor.ncpere pentru termoterapie.Laborator profilat pe testarea i certificarea calitii i a strii desntate a plantelor generatein vitro.Camera de cretere.Ser (construcie special n cazul n care se urmrete pstrareaculturii n condiii de protejare de ageni fitopatogeni sau construcieobinuit).

Alcatuirea zonei nesterile


42/168

Alcatuirea zonei nesterile

Spltorulncpere cu ciment pe jos i cu canalizare n pardoseal, ciment mozaicat

sau gresie, cu panta usoara in conditii de scurgere in pardoseala.

Cuprindebazine pentru nmuierea sticlriei i pentru splarea propriu-zis a

acesteia i, eventual, un al treilea bazin pentru limpezirea sticlrieisplate.distilator (de 510 litri)ap cald i recesistem de iluminarerastele pentru uscarea sticlriei.

dulapuri n scopul depozitrii sticlriei, a unor materiale i a reactivilorcare nu necesit condiii speciale de pstrare.cutii pentru gunoi (preferabil cu capac) i un suport pentru periinecesare pentru splarea sticlriei.


43/168

Caracteristici:camer s paioas (s permit accesul concomitent a 3 4 persoane)corespunztor iluminat.Dotat cu instalaii de: canalizare, ap curent (rece i cald), gaze, electricitate,pomp pentru vid etc.

Pardoseala: materiale uor lavabile.

Mesele de lucru vor fi faianate sau vor fi acoperite cu material plastic ori cu foliemelaminat, pentru a putea fi ntreinute uor i pentru a rezista la reactivi.

Aparatura:1 3 agitatoare;1 2 bain marie;

pH-metru;frigider de mare capacitate, cu congelator.balane electronice - subunitide gram (100 10 mg);microscop optic i un stereomicroscop.

Sticlarie

Laboratorul pentru pregtirea mediilor de cultur

Sterilizarea


44/168

Sterilizarea

Ce este sterilizarea?Ce se sterilizeaz: mediul de cultur, apa distilat, instrumentar, sticlariei alte vase decultura, hartia de filtru.

1. Recipientele cu medii de culturse sterilizeaz prin autoclavare la temperatura de 121C, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur.Odat sterilizate, pot fi

pstrate o perioad de timp, n camer frigorific,la ntuneric, pentru a evita degradareasau fotooxidarea vitaminelor i a hormonilor i pentru a prentmpina deshidratareamediilor, prin evaporarea apei.

2.Apa distilat este indispensabil n laborator, att pentru prepararea apeisterilect ipentru splarea materialului biologic sau la cltirea final a sticlriei.Se folosete nprocese de cltire a materialului vegetal, n dezinfectie, in lucrul la hota.

3.Instrumentar - necesar n lucrul la hota, n mediul aseptic, cu material liber devirusurii boli.

4.Sticlaria folosit n cadrul procedurilor de lucru la hota va fi sterilizat.

5.Hrtia de filtru care se folosete tampon ntre materialul vegetal sterilizati suprafaahotei se sterilizeaz.


45/168

SISTEMUL DE ILUMINARE


46/168

tuburi fluorescente amplasate deasupraculturilor, la o distan de 30 40 cm.trebuie s asigure necesarul specificspeciei luate n cultur ; aezareaflacoanelor s fie fcut pe un strat izolator,de exemplu din polistiren expandat pentruprevenirea supranc lzirii mediului i adeshidrat rii acestuia.

Atentie!! Fluctua iile de temperatur producmodificari ale volumului de aer dinrecipientele de cultur formarea unorcuren i din exterior spre interior caretransport germeniinfectarea secundara mediilor de cultur .

Atentie!! Tuburile fluorescente trebuie s asigure iluminarea uniforma i s nu fiesurs de incendiu.

Fotoperioada optim: 16 ore lumin/8 ore ntuneric , la 2-2,6 klucsi.

ROL


47/168

ROL

Asigur condiii controlate necesare etapelor micropropagrii in vitro;Asigur condiiile necesare primei etape din aclimatizarei trecereain vivo.

(Pelargonium sp)

in vitro in vivo

Alctuirea zonei sterile


48/168

Camera steril Def. = camera care folo e te la sterilizarea, prelevarea, inocularea i multiplicarea

explantelor.

CaracteristiciPereii vopsii n ulei sau placai cu faian.Pardoseala din ciment pentru a fi uor lavabil, dar nu va avea canalizare npodea.

Dotarinie sau boxe (hote) cu flux laminar,orizontal, continuu, de aer steril; asepsiaaerului este asigurat prin filtre specialecare rein particulele mai mari de 0,2 mm;periodic, filtrele trebuie schimbate, ntructele se uzeaz ; hotele vor fi orientate peperetele opus uii i ferestrelor, pentru a

evita formarea curenilor de aer. n spaiulpropriu- zis de lucru vor fi aezate suporturipentru instrumente sterile i vor fi montateinstalaii obinuite de iluminat i tuburipentru emanaie de raze ultravioletenecesare sterilizrii.


49/168

Dotarile laboratorului


50/168

Sticlria- se utilizeaz toate tipurile derecipiente din sticldintr-un

laborator de agro sau biochimie.- sunt necesare pipete, cilindriigradai, plnii, baloane cotate (dediferite capaciti), sticle i borcanepentru reactivi (de variate tipuri imrimi), vase Erlenmeyer iBerzelius de dimensiuni diverse,capsule Petri, casolete, baghete,tuburi din sticl, sticlele de ceas, nucifiltrante, filtre Millipor, seringi,exicatoare etc.- recipiente de cultur: pot fi folositebaloanele cu fund plat ori variatevase din sticl incolor, de forme imrimi diferite.Flacoanele cu medii de cultur, nvederea sterilizrii vor fi obturate cudopuri sau capace.

Dotarile laboratorului

Aparatura i dispozitivele


51/168

boxa sau incinta steril, autoclav, aparatul de distilat i bidistilat ap,frigiderele de mare capacitate, agitatoarele magnetice (cu plit pentru nclzirea mediilor), balanele (analitic i tehnic),pH-metrul, etuvele,microscopul i stereomicroscopul, 12 lupe, centrifuga pentrusedimentarea biomasei n suspensiile celulare, compresorul, o pomp devid, dispozitivul de repartizare a mediului, recipientele de cultur, aparatulde fotografiat.

Aparatura i dispozitivele

Instrumentarul


52/168

n tehnicile de culturi de esuturi se lucreazcu instrumentar de tip chirurgical: pense (de

diferite forme i mrimi, mai lungi decteprubetele n care urmeaz s inoculm), ctmai elastice, foarfeci i bisturie, anse, cuite,scalpele, lame de ras, perforatoare (de diferitedimensiuni), care s permit explantarea unorcilindrii de esut, etc.;

Categoria a doua: ace, seringi, ace spatulate,lamp de spirt etc.

Instrumentarul

Materiale diverse


53/168

n laborator snt necesare i alte materiale de mic valoare, i anume: site

cu azbest, clame, trepiede, tuburi din sticl sau din cauciuc, becuri degaz etc.

Vata este necesar n cantiti mariatat pentru dezinfectarea miniloroperatorului, a dezinfectrii i splarii hotelori a suprafeelor de lucructi pentru confecionarea dopurilor.

Alte obiecte:trus mecanic termometre de camer, mnui din cauciuc(de uz menajer), folie incolor din polietilen (pentru acoperirea vaselorde cultur), elastice (pentru fixarea foliei de polietilen la gtulrecipientelor), folie din aluminiu (pentru nchiderea sau acoperireaflacoanelor cu mediu), site de metal (pentru strecurarea materialuluivegetal n operaiunea de sterilizare), tvi metalice, couri din srm,casolete metalice, suporturi pentru eprubete, vase i cutii din plastic,perlit, vermiculit, sfoar, a, tifon, hrtie de filtru i de mpachetat etc.

Substanele necesare nlaborator


54/168

laborator

detergenii sau spunurile (solide ori lichide),soda i prafurile de curat de uz menajer;alcoolul utilizat pentru dezinfectare (se poate folosi i spirtul sanitar);acidul clorhidric tehnic;amestecul cromic (folosit n scopul curirii veselei);cloramin;hipoclorit etc.

ntre substanele chimice de uz comun intr i reactivii obinuii din laboratoarelede chimie, i anume: acizi minerali (clorhidric, sulfuric, azotic) i baze (hidroxidulde potasiu, natriu, amoniu, de puritate tehnic i cu grad ridicat de calitate), utilizai n curirea sticlriei i necesari n prepararea unor soluii; acizi organici (acetic,citric, oxalic), alcool etilic (absolut, de 96 sau 70 ), aceton, eter, cloroform (utilizai n cantiti mici), dimetilsulfoxid (DMSO), polietilenglicol (PEG), Tween, ap debrom, clorur mercuric, hipoclorit de natriu sau de calciu, perhidrol etc.

1. Materiale chimice

srurile anorganice i compuii organici utilizai n prepararea soluiilor nutritive,reactivide uz comun (baze i acizi), substane indispensabile pentru sterilizareamaterialului vegetal, si preparate destinate curirii ncperilor i obiectelor.

2. Substanele necesare pentruprepararea mediilor de cultur


55/168

Se analizeazatipul de explant, proveniena lui isezonul n care se recolteaz. Sealeage mediul cel mai echilibrat pentru a se asigura o evoluie bun a inoculilor.

Dac nu ne putem decide, vom face experiene de tatonare, cu diferite medii.Tipuri de concentraii ale compuilor frecvent ntilnii n mediile de cultnr (nmM/L) (dup De Possatd i colab., 1974)

p p

Constituenii Concentraie (n mM/1)Sczut Medie Ridicat

SRURI MINERALE NH 4 NO 3 5 10 20KNO 3 10 20KH SPO 4 0,1

NaH 2PO 4 __ 1 2KC1 1.9 __

CaCl, 1 2 3MgSO 4 0,5 1,5 3H3BO 3 0,01 0,05 0,15MnSO 4 0,01 0,05 0,1ZnSO 4 0,001 0,02 0,04CuSO 4 0,00001 0,0001 0,0015

Na 2Mo0 4 0,00001 0,0001 0,001CoCl 2 0,0001 0,0005 0,001KI 0,0005 0,0025 0,005FeSO 4 0,01 0,05 0,1

Na,EDTA 0,01 0,05 0,1 A UXINE 0,0001 0,001 0,01CITOCHININE 0,0001 0,001 0,01

SUBSTANE ORGANICE Inozitol 0,1 0,3 0,6Acid nicotinic 0,004 0,02 0,04Piridoxin HC1 0,0006 0,003 0,006Tiamin HC1 0,0001 0,002 0,04Biotin 0,00004 0,0002 0,001Acid folie 0,0005 0,001 0,002Pantotenat de calciu 0,0002 0,001 0,005Riboflavin 0,0001 0,001 0,01Acid ascorbic 0,0001 0,001 0,01L-Cistein HC1 0,01 0,06 0,12Glicin 0,0005 0,005 0,05Zaharoz 6 60 120

Sera de acl imatizare


56/168

Spaiu destinat trecerii explantelor de la condiii in vitro la conditiiin vivo cuparametri controlai.



57/168


@2013

Asepsia n culturile vegetaleinvitro


58/168

vitro

ASEPSIZARE = STERILIZAREDef. = procesul, operaiunea de distrugere (cale fizic sau chimic), filtrare, nlturare(fizic), splare sau ultrasonare a micro-organismelori a sporilor acestora;

Ci de sterilizare: A) distrugerea germenilor i B) eliminarea germenilor.

DISTRUGEREA GERMENILORArderea prin flambare;nclzirea cu cldur uscat sau vapori supranclzii;Iradierea cu raze gamma, microunde sau UV;Agenti chimici: alcool etilic, soluii clorurate, oxid sau pentaoxid de etilen(INFLAMABIL!!), apoxigenat, ap bromat.

ELIMINAREA GERMENILORFiltrarea;Splarea n curent de ap sau ap staionar cu ageni spumani.


59/168

INFECIILE PRIMAREPREVENIREA INFECIILOR PRIMARE ESTE CONDIIE

SINE QUA NONN CULTURILE IN VITRO

INFECIILE SECUNDARESe declaneaz dup cteva sptmni de la inoculare.

PREVENIRE:

Respectarea regulilor de asepsie la nivelul materialului vegetal;

Respectarea asepsiei la nivelul recipientelori mediilor de cultur;

Respectarea asepsiei la inoculare, cu instrumentar sterilizat ;Respectarea manipularii flacoanelor, fr contaminare.

CONDITIE


60/168

Personalul trebuie s aib cunotine minime de microbiologie,despre natura germenilor (virusuri, bacterii, alge, drojdii,mucegaiuri) i cile de transmiterei reproducere a acestora.

CONDITIE

STERILIZAREA NCPERILOR, ASUPRAFEELORI

INSTRUMENTARULUI


61/168

INSTRUMENTARULUI

Sterilizarea atmosferei ncperilor, mobilieruluii altor obiecte,cile de acces, niele, incintele.

Sterilizarea hotelor!!! UV !!!Se ntrerup cu 20-30 minute nainte de accesul personalului caredeservete lucrul la hote pericol de contaminare.

Sterilizareacasoletelor, recipientelor cu mediu steril, a instrumentarului,

flacoanele cu inoculi n caz de repasare: la etuv, autoclav, alcool 70,fierbere n baie de ap sau electric, flambare.

nainte de nceperea operaiunilor de lucru la hota:sterilizareainstrumentarului prin introducere n alcool, flambare sau alte substanebactericide.

Sterilizareaperiodic a minilor operatorului prin pulverizare de alcooletilici sterilizarea permanenta a instrumentarului n timpul lucrului.

!!!ATENTIE!!!Instrumentarul sterilizat poate fi fierbinte.Aciunea lui asupra plantelor poate sa le provoace daune totale.

STERILIZAREA RECIPIENTELOR DECULTUR I

DEZINFECTAREA ALTOR OBIECTE


62/168

DEZINFECTAREA ALTOR OBIECTE

Recipientele de cultur - trebuie s fie presterilizate.

!!!ATENTIE!!!Presterilizarea poate produce degradarea calittii sticleiipoate elibera compui toxici care influeneaz negativ culturile.

Dopurile de cauciuc sau din plut sau material plastic

termorezistente, splate, fiertei sterilizate n prealabil.

Dopurile de vat (se prefer) se asepsizeazodat cu mediul de cultur.

Aparatura care se introduce n hota steril se dezinfecteaz cu alcool etilic70

STERILIZAREA LICHIDELOR, A APEII A MEDIILOR DE CULTUR


63/168

Mediul de cultura:porionat, obturatisterilizat.

Dopul sau capacul nu se va nchide etan,pentru

a permite circulaia vaporilor de ap agentsterilizant.

Autoclavare la 120, timp de 20-30 minute,1 atm.

Vasele nu se umplu mai mult de dincapacitate - risc explozie din cauza variaei de

presiune de la sfaritul autoclavrii.Inocularile se opereaz numai dup rcirea

mediului de cultur, la 24-48 h.


64/168

SUPRAAUTOCLAVAREA = se produce o alterare a calit ii mediului

de c ultur prin deteriorarea echilibrul ionic din mediu, afectareacapacit ii de solidificare a agarului, caramelizarea zaharozei .

SUBAUTOCLAVAREA = se dezvolt coloniile de microorganisme, ceeace duce la inutilizarea lotului de mediu.


65/168

Sterilizarea se poate face i n kukta - oala sub presiune- cu capacitatede 8-10 l.

Durata sterilizare: 15-25 minute de la momentul dec lan arii emisiei devapori

Sterilizarea la rece: se poate aplica mediilor lichide, prin filtrare cu nucifiltrante de sticl sau por elan sau filtre Millipor.

Substan ele dezinfectante n mediul de cultur

practic mai putin uzitat inhib dezvoltarea bacteriilor sau ciupercilor (oxidul de propilen ) inhib viru ii (penicilina, streptomicina, cloramfenicol)

RISC: provoac muta ii, inhib organogeneza, stopeaz organogeneza,debilitate c rescut la trecerea plantelor din in v i t ro n in v ivo i scade

capacitatea adaptativ )

Sulfamidele n mediul de cultur

au ac iune bacteriostatic puternic dar nu se folosesc n mediul de cultur

ASEPSIZAREAMATERIALULUI VEGETAL


66/168

MATERIALULUI VEGETAL

Se realizeaz numai cu ageni chimici.Condiie esenial i prim etap n culturilein vitro.

Factori care influeneaz tipulde asepsizare:

1. specia;2. condiiile ecologice;

3. organul;4.

esutul;5. poziia n plant;6. vrsta;

7. fenofaza plantei.


67/168

Succesul asepsizrii depinde de:

selectarea corect a metodei de asepsizare;substanele alese pentru sterilizare;concentraia acestora;durata de timp alocat asepsizrii.

!!!!Organele subterane au cel maimare grad de infectare cu agenipatogeni (parazii, simbioni sausaprofii isporii lor)


68/168

Privire general asupra dezinfectan ilor


69/168

1. aciune suficient de puternic;

2. toxicitatea nu trebuie s distrugesuturi/necroze;

3. trebuie s poat fi ndeprat cuuurin;

4. sterilizarea este doar de suprafa pot s apar infecii la a 2-3 repasare(bacterii, virusuri, micoplasme sau fungiaflate nesuturile din organe)

Tipuri de dezinfectan i


70/168

ALCOOL ETILIC

Concentraii variate: 70, 96 sau absolut.Puternic liposolubilizantCoagulant proteic excelentSe recoamand doar la organele cu pilozitate mare,epiderma cutinizata puternic, muguri bine nchii.Scufundare 5-60 sec.Necesitcltire RAPIDcu ap distilat pentrurehidratare

APA BROMAT mai pu in eficient

CLORURA MERCURIC toxicitate mare


71/168

HIPOCLORIT DE CALCIU sau SODIU (Apa de Javel)

Concentraii variate;

Se recomand submersarea unor poriuni vegetale mai mari,din care se va seleciona ulterior materilaul de inoculat/NECROZARE;

Conin 15-20% Cl se recomand folosirea imediat a dezinfectantului pentrueficien;

Concentraii recomandate: 1-8%;

Probarea eficacitii soluiilor pe baz de clor activ: colorarea n alb a zonelor lezateprin tiere sau nepare;Se recomand splarea ulterioar n aprox. 5 bi succesive (a 10-15 min fiecare) nap distilat, steril.

PROCEDURIRECOMANDATE


72/168

Fructe

PRESTERILIZARE: alcool etilic absolutSTERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na 2%, 10 minute.POSTSTERILIZARE: cltiri n ap steril cu extragereaesuturilor careintereseaz.PROCEDUR: cultura de ovule.

FloriPRESTERILIZARE: alcool etilic 70-90%, 1 minutSTERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na 2-5%, 15-20 de minute.POSTSTERILIZARE: cca. 5 cltiri n ap sterilPROCEDURA: cultur

de antere, multiplicare, propagare, ini

iere cultur

calus.

PROCEDURI RECOMANDATE


73/168

Frunze

PRESTERILIZARE: tergere suprafa limb cu alcool etilic absolut.STERILIZARE: clorurmercur 0,1%, cca 1 minut..POSTSTERILIZARE: cca 5 clatiri n ap steril s i tamponare exces ap cuhrtie filtru steril.PROCEDUR: cultur calus, probeleme de difereniere - cere prezenanervurii principale.

OBSERVAII: greu de sterilizat, necrozeaz usor.

Fragmente de tulpinPRESTERILIZARE: cltire ap curgtoarei alcool etilic absolut.STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (2-5%, pn la 10%), 15-30 deminute; apdistilat, 1 or.POSTSTERILIZARE: cca. 3 cltiri n ap steril.PROCEDUR: cultur de calus, multiplicare, propagare. Pentru culturade neoplantule.OBSERVAII: respectarea polaritii naturale.

PROCEDURIRECOMANDATE


74/168

Semin e

PRESTERILIZARE: alcool etilic absolut, 10 sec., splare ap distilat steril.STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (10%), timp de 20-30 min./apa bromat(1%), 5 min./clorurde mercur (15-30%)%, 15-20 min./fenol (5%).POSTSTERILIZARE: cca 5 cltiri n ap sterilPROCEDUR: cultur de rdcini, cultur de calus, nugurai i organe pentruregenerare neoplantule..

OBSERVAII: germinare pe hrtie de filtru, umectare constant.

Organe de rezerv

PRESTERILIZARE: apcurgtoare cu agitare.STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (2%),20-30 de minute.POSTSTERILIZARE: cca. 3 cltiri n ap steril.PROCEDUR: cultur de calus, cultur de neoplantule.


75/168



76/168


@2013

MEDIILE DE CULTUR


77/168

Def.:Medii aseptice, compozitie chimica de natura complexa, carepot inlocui partial organismul matern al explantei, asigurand hrana

acestuia in conditii modificate.Suportul fizico chimic necesar cresterii si dezvoltarii explantelor.

CATEGORII

Lichide, semisolide si solide.

CRITERII DE SELECTARE A MEDIULUI DE CULTUR:

Tipul de explant, modul de cultivare, provenien a, stadiul de dezvoltarea explantului, specia, soiul, marimea, sezonul (important mai alespentru muguri), scopul culturii.

GENERALITI


78/168

Dac nu exist cercetri referitoare la multiplicarein vitro pe o specie,se fac tatonari pe mediile standard cunoscute modificari deconcentratie auxine, citochinine reactia plantei.

Mediile de cultur ajung la propriet ile finale numai dupsterilizarei autoclavare

Cei care au studiat necesarul de elemente chimice pentru hranaexplantelori evolutia lor: fiziologi specializa i in nutri ia plantelor.

Recomandri:Cultur de calus- Gamborg (B5), Gautheret, Heller, Murashige-Shoog(MS).Cultur de rddcini White.Cultur diverse organe Gamborg, Murashige-Shoog.Cultur antere- Nitsch.

COMPOZIIE


79/168

COMPUI ANORGANICI: ap, sruri minerale (macroi micro elemente)

COMPUI ORGANICI: glucide, vitamine, regulatori de cretere, agar etc.COMPU II ANORGANICI

1. APA

Existen a far ap?Procesele vitale n plante; metabolismul plantelori apa.

Procesul de prelevareInoculareCultura in sineAclimatizare

Depind de cantitateade ap.

Reechilibrare osmotic prin imersie n concentra ie salina moderat.

COMPOZIIE


80/168

COMPU II ANORGANICI1. APA

Apa n recipietele de cultur: circuit nchis.Reglarea temperaturii n camera de cretere;

Condensul din recipientei pierderea acestuia prin neetaneizarearecipientelor

dezechilibrarea hidric a explantelor.

apa bidistilat sau distilat vs. apa pur sau ultrapur

considerat apmoart saunebiologic.

optim pentrurealizareamediului decultur.

COMPOZIIE


81/168

COMPU II ANORGANICI2. SRURILEMINERALE

.Cele mai frecvente saruri folosite sunt fosfatii, azotatii, clorurile sisulfatii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na.

MICROELEMENTEFe, Mn, Zn, Al, B, Cu, Mo, Na, Co, I.

Rolul fiziologic al fiecarui element din mediul de culturavariaza in functie de concentratie, natura explantelor,specificul culturii etc.

MACROELEMENTEC, O, H, N, P, S, K, Ca, Mg

Proportiile lor in mediile de cultura se aleg conform cu scopul urmarit, fiefolosind retele deja consacrate, fie prin tatonari personale.

COMPOZIIE


82/168

COMPU II ANORGANICIMACROELEMENTE

.Rolul macroelementelor in compozitia mediului

Exemple:omitereaN, Ssau P in cazul culturilor de liber secundar la morcovprovoaca moartea inoculilor in cca 2 luni de la inoculare.Lipsa cationului de K duce la incetinirea cresterii culturilor.Marirea concentratiei cationului de K duce la marirea ratei cresteriiculturilor de tutun si vita de vie salbatica.Carentele de Ca si Mg genereaza tulburari vegetative culturilor, panala moartea celulelor.AbsentaNH4NO3pt culturile deLactuca sativa genereaza doar calus,fara sa se produca diferentierea mugurasilor.Tesuturile senescente sau ameliorate cer medii cu continut de Casuplimentar.

COMPOZIIE


83/168

COMPU II ANORGANICIMICROELEMENTE

.Rolul microelementelor in compozitia mediului

Exemple:Fe intervine in metabolizarea intranucleara, sintezaARNsi sintezaproteica; necesita a fi administrat sub forme chelatizate, deoarece estegreu de asimilat.LipsaZnmodifica sinteza auxinei.Mn participa la proteosinteza si formareaARN-ului in celuleleradacinilor de mazareB are rol in procesele de diviziune si crestere celularaAl este catalizator al multor reactii chimice.

OMITEREA totala a microelementelor din mediile de cutura conduce lareducerea cresterii celulare cu 40%in final, dupa a 3-a repasare la

decesul culturii.

MEDIILE RECOMANDATE


84/168

WHITE (1943) recomandat pentru culturile de tesuturi tumorale.

HELER (1953) recomandat pentru multe culturi, mai putin tutun.KNUDSON (1925) recomandat pentru orhidee si ferigi.MURASHIGE-SKOOG (1962) recomandat pt culturi de calus latutun si culturi de celule la majoritatea speciilor. Numit mediuuniversal.GAMBORG (1968) recomandat in germinarea in conditii aseptice a

semintelor.

AGARUL

Produs natural extras din alegele marine aduce un procent

suplimentar de elemente chimice (Ca si Mn).Influenteaza potentialul osmotic si difuzia nutrientilor.

pH-ul mediului de cultura MS


85/168

Ph-ul si precipitarea mediilor de cultura

Mediul MS standard autoclavare turbiditate in urma precipitarii siscaderii pH-ului cu 0,2-0,5 unitati.

Cauza: ionii bivalenti de Fe, in precipitare oxideaza in Fe trivalent ceprecipita sub forma de ion fosfat feric.

Corectiilese fac cu citrat de Na ( variatia este limitata la 0.15 unitatipH).

Cercetarile continua.

COMPU II ORGANICI


86/168

COMPU II ORGANICIROL

1934 WHITE - zaharoza si extractul neautolizat de drojdie(contine glicina/aminoacizi si tiamina/vitamine) aducsuperioritate nutritionala mediilor de cultura.

1934 s-a descoperit pricipiul de actiuneal AUXINELOR.

1938 ROBBINS SI SCHMIDT piridoxina si acidul nicotinic suntadaugate in mediu.

COMPU II ORGANICI


87/168

CARBONUL ORGANICZAHAROZA

Culturile vegetale evolueaza optim la o concentratie a zaharozei de2-3% (3% glucoza doar pentru culturi de meristeme la unele speciilemnoase).Variatiile intre 1,2% - 8% (cartof): infunctie de naturaexplantului, tipul de cultura, specie si scopul culturii.

Mediul de cultura contine adaos de carbon glucidic, ceea ceasigura substrat respirator pentru culturi ( prin degradareaglucidelor se obtine energia necasara proceselor vitale,multiplicarii, cresterii si diferentierii celulare).Polimerizarea glucozei duce la celuloza, compus de baza alperetelui celular.

Zaharozaprezinta eficienta maxima in procesele metabolice lanivelul culturilorin vitro ( alte surse: glucoza, fructoza, maltoza,rafinoza, amidonul).Excesul de zaharoza: celulele plasmolizeaza din cauza presiuniiosmotice

COMPU II ORGANICI


88/168

CARBONUL ORGANICALCOOLI

GLICEROLUL poate fi folosit ca sursa energetica, potentand efectulglucidelor.MONOALCOOLII (metanol, etanol, propanol, butanol) nu pot fiutilizati, fiind toxici (chiar si la dilutii mari).

AZOTUL ORGANICTesuturile vegetale sunt autotrofe fata de azot, preluandu-l dinsubstantele anorganice.1939, WHITE ---GLICINA imbunatateste cresterea radacinilor latomate.

UREEA si UNELE BAZE AZOTATE----surse eficiente de azot organic.1981, BIONDI si THORPE--- utilizarea aminoacizilor in mediile decultura are efecte bune in conditiile in care urmarim formareacalusului; atentioneaza asupra faptului ca sursele de azot organic inculturi pot fi toxice.

COMPU II ORGANICI


89/168

VITAMINELEAvantajele vitaminelor in cultura explantelor s-au descoperitintamplator (1922-1940) dupa WHITE.Orice mediu de cultura contine vitamine la aceasta data, fiindconsiderate indispensabile.

VITAMINA B1(TIAMINA)

Valoare biologica

importanta.Stimuleaza crestereaceluleor si tesuturilor.

VITAMINA B6(PIRIDOXINA)Precursor alenzimelor.

ACIDUL FOLICEfect stimulant asupratesuturilor tumorale

dar si efect toxicurmare adescompunerii in acidp-aminobenzoic (factorde crestere insa).ACIDUL

NICOTINICUtilizat inca din1938;indispensabil.

VITAMINA H(BIOTINA)

Utilizata inca din

1946 (Morel).Exercita efectstimulator asupraculturilor de celule.

VITAMINA C(ACIDUL ASCORBIC)

Actiune antioxidanta.

INOZITOL(glucid/vitamina)Obligatoriu in mediulde cultura dar nu secunoaste clar rolulfiziologic.

COMPU II ORGANICI


90/168

FITOHORMONII/FITOREGULATORIIStimuelaza, inhiba sau modificacalitativsi cantitativ cresterea sidezvoltarea explantelor.Concentratii foarte mici, de ordinul 1mM sauM.

FITOHORMONIIproduc modificari la nivelul proceselor demorfogeneza, organogeneza, embriogeneza, cu urmari in dezvoltareacelulara, tisulara, organica,diferentierea celularasau la nivelul intregiiplante.FITOREGULATORIIregulatori chimici, organici, compusi de sintezacare imita efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili inbiotehnologiile vegetale.

INFLUENTA FITOHORMONILOR(raspunsul imediat sau intarziatal plantei) depinde destarea fiziologicaa centrilor receptori (celule,tesuturi, organe),stadiul de dezvoltare al organelor plantei,natura sinivelul semnalului , interactiile acestuia cu alti fithormoni,conditiile de

mediu s.a.m.d.

COMPU II ORGANICI


91/168

FITOHORMONII/FITOREGULATORIIMultiplicarea si cresterea celulara - fenomene complexe- pot producereactii particulare urmare a interactiunii dintre fitohormonii explantei sifitoregulatorii administrati in mediul de cultura.

CINCI MARI CATEGORII DE FITOHORMONIAUXINE, CITOCHININE, GIBERELINE, ACIDUL ABSCISIC, ETILENA.

DARWIN 1880Intuieste existenta fitohormonilor.

Peste un secol, inca nu se cunosc mecanismele de interactiune si toateprocesele implicate.

WENT 1928Descoperirea care a lansat fitotehnologia: identifica auxina A in

urina umana.ANII 30

Se descopera actiunea giberelinelor, acidului abscisic si etilenei.SKOOG 1955-1956

Izoleaza din sperma de heringi chinetina (6furfurilaminopurina).STEWARD 1956

Citochininele native din laptele de cocos.

COMPU II ORGANICIAUXINELE


92/168

AUXINELE

In plante, auxinele se gasesclibere (AIA) fielegate -sub multiple forme,sau combinatii ale AIA cu acid aspartic, glutamic sau acid ascorbic

TIPURI DE AUXINEAIA (auxina nativa),AIB (acidul 3-indolilbutiric-nu se gaseste in toate speciilevegetale), ANA(acidul 1-naftilacetic), 2,4-D(acidul 2,4-diclorfenoxiacetic),4ACFA SAU ACPA(acidul 4-clorfenoxiacetic),ANOA (acidul 2-naftoxiacetic),2,4,5-T(acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic),DICAMBA(acidul 3,6-dicloro-2-metoxibenzoic),PICLORAM(acidul 4 amino-3,5,6-tricloro-2-piridincarboxilic) ,

AMCA(acidul 2-metic-4-clorfenoxiacetic).ACTIUNEA FIZIOLOGICA A AUXINELOR

1. Cresterea in lungime a celuleor (marirea plasticitatii peretilor celulari);2. Permeabilizarea membranelor plasmatice;3. Influente pozitive asupra sintezeiARNribozomal;4. Stimuleaza diviziunea celulara (alaturi de citochinine);

5. Influenteaza sinteza de etilena;6. Influenteaza cresterea celulelor in tropisme;7. Implicate in fenomenul de dominanta apicala, caulinara;8. Actiune inhibitoare asupra caderii frunzelor si fructelor;9. Actiune rizogenastimularea butasilor in inmultirea vegetativa;10. Inhiba formarea embrionilor somatici.

COMPU II ORGANICI


93/168

AUXINELE

La concentratiimici: actiune benefica asupra cresterii;

La concentratiimai mari: actiune inhibitoare sau chiar toxica (dicambasau 2,4-D) auxinele de sinteza devinerbicide.

Auxinele de sinteza

ANA SI 2,4-D sunt cele maistabile;

Viteza de degradare si capacitatea de actiune depinde de multifactori:tipul tesutului , natura si concentratia auxinei, fenofaza

plantei,organul supus tratamentului.Radacinile sunt mai receptive la concentratiscazute de auxine;

Tulpinile, frunzele si fructele (in formare) cer concentratii mairidicate de auxine.

COMPU II ORGANICICITOCHININELE


94/168

CITOCHININELE

In absenta citochininelor, CELULELE NU SE DIVID.1955: la 3 luni de la izolarea citochininei, de sintetizazabenzil-adenina/benzilanimopurina/BA/BAP)Citochininele native se regasesc in multe extracte vegetale (drojdie debere, germeni de porumb, lapte din nuca de cocos)

TIPURI DE CITOCHININEK sau KIN(CHINETINAsau KINETINA), Z (ZEATINA), BAsau BAP

(BENZILADENINAsau BENZILAMINOPURINA), 2iP(IZOPENTENILADENINA), TDZ (TIDIAZURON)

PARTICULARITATIBiosinteza citochininelor se realizeaza in radacini si embrioni, in meristeme.

Se folosesc, de regula, in dilutii mari si suporta bine autoclavarea.AUXINE + CITOCHININE = BALANTA HORMONALA

Concentratii sporite deauxine potenteaza rizogeneza.Concentratiile sporite decitochinine potenteaza formarea de muguri si

generarea de tulpinite.Concentratii sporite dinambele potenteazamorfogenezasi procesele de

calusare.

COMPU II ORGANICI


95/168

CITOCHININELE

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A CITOCHININELOR

1. Impulsioneaza diviziunea celulara;2. Stimuleaza formarea de mugurasi si tulpinite, in functie de

concentratie si balanta;3. Stimuleaza proteosinteza (au fost gasite citochininelegate de ARNtransfer);4. Rol in preventia senescentei;5. Efect antagonic auxinelor, anihiland dominanta apicala a mugurelui

terminal;6. Sustine capacitatea de supravietuire a inoculilor;7. Favorizeaza si sustine multiplicarea celulara;

COMPU II ORGANICI


96/168

GIBERELINE

Descoperite in 1926 de KUROSAWA si izolata abia in 1935, cea maiactiva giberelina fiind acidul giberelic (AG3);Importanta mai mica decat auxine si citochinine.

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A GIBERELINELOR

Produc alungirea internodiilor tulpinilor si a rahisuluiinflorescentelor;Ajuta la inlaturarea fenomenului de nanism;Rol in reglarea nivelului endogen de auxina;Suprimarea latentei la nivelul semintelor, mugurilor sauorganelor de rezerva;Actiune complexa in anteza;Rol in formarea fructelor partenocarpice;Rol in germinarea semintelor;AG3 nu exercita vreo actiune asupra rizogenezei.

COMPU II ORGANICI


97/168

GIBERELINE

Biogeneza este localizata in extremitatile radacinilor ,embrionilor, frunzelor foarte tinere si mugurilor activi;

Semintele contin cea mai mare cantitate de gibereline,cele imature fiind cele mai bogate in fitohormoni;Folosirea giberelinelor in culturiin vitro se face cand seurmareste favorizarea alungirii meristemelorcaulinare, apicale;

Absenta giberelinelor in mediul de cultura poategenera un fenomen de crestere globuloasa.

Particularitati

COMPU II ORGANICIETILENA


98/168

ETILENA

Fitohormon recent recunoscut, identificat insa din 1901 deNELJUBOV;Hidrocarbura nesaturata gazoasa, a fost greu de identificat incelule deoarece fructele verzi au un continut mic de etilena (maimare in fructele in coacere);Auxinele naturale stimuleaza biogeneza de etilena.

Mai putin utilizata in culturiin vitro, fiind gazoasa; se folosestesub forma de acid 2-cloroetilfosfonic (ACEP);

Etilena este insa prezenta in recipientele de cultura;

! Explantele care sufera de fenomenul devitrificare (hiperhidrie)au o productie de etilena care duce la lignificarea vaselorlemnoase si rigidizarea peretilor celulari parenchimatici.

---------------

COMPU II ORGANICIETILENA


99/168

ETILENA

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A ETILENEI

-cercetarile continua-

Control asupra cresterii permeabilitatii membranelor plasmatice;Stimuleaza caderea frunzelor, coacerea si caderea fructelor;

Influenteaza deschiderea florilor, ofilirea si decolorarea;Induce senescenta tesuturilor;Intervine in transportul auxinei;Celulele supuse traumelor produc si emana etilena;Stimuleaza rizogeneza adventiva;Inhiba cresterea in lungime a radacinilor;

Influenteaza geotropismul radacinilor;Stimuleaza cresterea izodiametrica a celulelor.

COMPU II ORGANICI


100/168

ACIDUL ABSCISIC (AAB)

ROL important in viata cormofitelor;

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A ACIDULUI ABSCISIC

Produce inhibitie asupra cresterii si dezvoltarii embrionilor,mugurilor si meristemelor;Implicat in procese de latenta a organelor de rezerva, mugurilorsi semintelor;In concentratii scazute AAB inhiba efectele AIA si alegiberelinei;

BIOSINTEZA AAB seafla in frunze (in toate etapele dezvoltariiplantei);Utilizat in mica masura in culturile de tesuturi.

COMPU II FENOLICI


101/168

Compusi toxici, eliberati in special de speciile lemnoase, in conditiide stres, care prin actiunea lor antagonica substantelor de crestere,inhiba reactiile metabolice, oprind cresterea si potentand fenomenulde dormanta indus de AAB, senescenta si necroza.

Eliminarea lor in mediul de cultura se face atata de celulele agresatecat si explantul in general, de celulele din profunzime.

Fenolii se eliminaoxideazareabrunifcarea mediului necrozarea celulelormoartea inoculilor.

PREVENTIAse realizeaza:1. Operarea a 2-3 culturi succesive, repasari, mediu nou;2. Precultivarea meristemelor pe medii de cultura lichide, 3 zile,

15C, lumina continua la 500 lucsi, mediusolid;3. Adaugarea in mediul de cultura a unor substante antioxidante:

cisteina HCl, acid ascorbic, acid citric, DDT(ditiotreitol);4. Adaugarea in mediul de cultura de carbunevegetal;5. Pastrarea in intuneric a explantelor inoculate pentru o perioada

scurta de timp.

EXTRACTELE VEGETALE


102/168

Extract drojdie de bere, hidrolizat de cazeina, suc de portocale, sucde tomate, lapte din nuca de cocos, extract de malt, extract deendosperm imatur de porumb etc.

Se utilizeaza in concentratii scazute (de 0,1-1 g.l).

Exista reactii necunoscute ale acestora urmare a necunoasteriicomplete a compozitiei chimice.

COMPUSI ANTIVIRALI


103/168

Scop: obtinere de culturi libere de viroze;

Procedura este putin folosita in practica curenta;

Exemple: ribavirina, DHT (2,4-dioxohexahydro - 1,2,5-triazina);

Studii facute peCymbidium, Prunus sp ., Malus sp.;

Prezinta fitotoxicitate iar eficacitatea este conditionata de tipul devirus, specia virusata si chiar cultivar (BOXUX 1995).

PREPARAREA MEDIULUI DECULTURA


104/168

Tehnologia de preparare a fost evidentiata in cadrul lucrarilor practice.

Atentionare: folosirea substantelor termolabile a caror sterilizare nu sepate face prin autoclavare, acestea se adauga in mediu ulteriorautoclavarii, cand temperatura mediului are 35-37C.

Se tine cont de toate informatiile referitoare la manipulareasubstantelor chimice intr-un laborator, se lucreaza in curatenie si cuatentie.

PROBLEME:Precipitatele insolubileInfectiile: solutii stoc invechite, vase de cultura nespalate si

nedezinfectate, autoclavare necorespunzatoare, lipsa curateniei incamera de preparare a mediuluiNesolidificarea mediului dupa racire: prea putin agar (sub 5-

6g/l),pH prea mic (sub 5,5),temperatura de autoclavare prea mare

MEDIULUI DE CULTURA


105/168

CATEGORII DE INFECTII DIN MEDIILE DE CULTURA:1. origine micotica: fructificatii de diferite culori (negru Aspergillus

sp., verde-albastru Penicillium)2. origine bacteriana: in mediu si la suprafata lui, in zona de contact cuplanta, halou translucid, de culopare alb galbuie3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emisi de

planta4. vitrificarea/sticlozitatea5. deshidratarea mediului: umiditate defectuoasa.



106/168


@2013

FAZELE PROPAGRII IN VITRO


107/168

ETAPE:1. PREGTIREA MATERIALULUI VEGETAL

2. INI

IEREAI STABILIZAREA CULTURII3. MULTIPLICAREA

4. NRDCINAREA5. ACLIMATIZAREA


1 PREGTIREA MATERIALULUI VEGETAL


108/168

1. PREGTIREA MATERIALULUI VEGETALN VEDEREA PRELEVRII EXPLANTULUI

Etapa documentar crucial pentru desf urarea cu succes aprocesului

Ce informa ii stocam? Tipul de cultur dorit;Natura, m rimea i num rul de inoculi;Natura i provenien a explantului, gradul de dezvoltare a plantei

mam , fenofaza, condi iile de cre tere;Mediul de cultur ales i compozi ia acestuia; varia iile.

Tipul de instrumentar necesar procedurii ce urmeaz a se desf ura netape repetitive;

Regimul culturii: factorii reglabili ca temperatur , umiditate, lumin

fotoperioad ;Particularit i tehnice.

FAZELE PROPAGRII IN VITROcontinuare


109/168

MORFOLOGIA EXPLANTULUI

Explantul trebuie s fie VIU, ideal s con in meristeme, s nu fie

necrozat, modificat sau cu esuturile mecanice distruse.Se noteaz :

Originea explantelor, specia, varietatea, clona, linia;Determinarea ecologic a provenien ei plantei donor: cmp deschis,

sere, solarii, camere de cre tere, depozite sau culturi primare;Expozi ia pe planta donor;

Se tie c :Se recomand ca explantele s fie recoltate din por iunile tinere ale

plantei donor.

Plantele din spa iile nchise au anse de infestare mai mic .Exist o corelare ntre localizarea explantului pe planta mam i

contaminarea cu germeni daun tori (distan a fa de sistemul radicular).

FAZELE PROPAGRII IN VITROcontinuare


110/168

Se tie c :Variabilitate mare de reac ie: n func ie de biotipurile unei specii, de

soiurile alese sau variet i precum i de originea sa biologic (morfologic , func ional sau de fenofaz i sezon)

Variabilitate mare de reac ie la explante din considerente morfo

func ionale:Vrful, mijlocul sau baza ramurii;Ramur umbrit sau nu, solarizat sau nu;La plante lemnoase: zonele mai apropiate de polul radicular sunt

cele mai bine aprovizionate cu ap , hran i hormoni;Prezen a meristemelor: vrfuri r dcini, noduri, bractee,

inflorescen e, apexuri.

Variabilitate n func ie de condi iile ecologice.

GENERALITINATURA ESUTURILOR


111/168

Natura esuturilor componente:

Variabilitate structural i func ional mare

Totipoten a celular

Regenerare la nivelul inoculilor

Diferen iere celular

GENERALITI

VRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAM SAU A


112/168

VRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAM SAU AORGANULUI DIN CARE SE PRELEVEAZ

Cea mai ridicat capacitate regenerativ o au: cotiledoanele,hipocotilele i mugura ii.

GENERALITI


113/168

VRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAM SAU AORGANULUI DIN CARE SE PRELEVEAZ

Metode care pot ajuta prelevarea dinplante donor mature/b trne:

Tratamente termiceStimularea drajonarii (juvenilizarea)Regulatori de cre tereRegim special de iluminareCulturi de plant mam n regim de

termoterapie

Riscul prelev rii din planteb trne: infec ii i viroze mult mai

agresive

Arachis Hypogea

GENERALITI

MOMENTUL DE RECOLTARE


114/168

MOMENTUL DE RECOLTARE

Crucial i LIMITAT, chiar i la o unic fenofaz .

Recoltarea se poate face:n cursul germina iei semin elorUn anumit moment din formarea celulelor generative la nivelul

inflorescen eiPunctual, la un moment dat n timpul cre terii frunzelor, fructelor sau

semin elorn perioada de laten a mugurilor

Plantele lemnoase din climat temperat pun probleme mari ref. la perioadade recoltare a materialului vegetal pentru inoculare, reu ita depinznd desezon , momentul recolt rii i condi iile pedoclimatice.

RECOMANDARERecolatarea explantelor se face conform recomand rilor manualelor despecialitate cu respectarea condi iilor men ionate pentru specia, genul,familia sau cultivarul respectiv, n func ie de sezon.

GENERALITI

MRIMEA EXPLANTELOR


115/168

MRIMEA EXPLANTELOR

Cuno tinte de anatomie vegetal icunoa terea amplas rii esuturilor care se vor

preleva.

INDUSTRIAL:se prefer apexuri, meristeme apicale.

Dimensiunea explantului se cere a fi minim , la limit , dar s se

asigure totipoten a celular ; standardizat pentru fiecare specie, soi, nfunc ie de natura explantului, fenofaza plantei donor sau a organuluidin care se preleveaz .

Explant mare pericolul de infec ie cre te; deshidratarea accentuat .

Regenerare mai rapid n mediu de cultur .Suprafa a de contact a explantului cu mediul de cultur trebuie s fiesuficient de mare pentru a se asigura schimburile gazoase i absorb iahranei i a apei.

DAR

GENERALITI

STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL


116/168

STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL

Succesul asepsiz rii depinde de:

selectarea corect a metodei de asepsizare;substan ele alese pentru sterilizare;concentr a ia acestora;

durata de timp alocat asepsiz rii.

FACTORII care influen eaz tipul de asepsizare:

1. specia;2. condi iile ecologice;3. organul;

4. esutul;5. pozi ia n plant ;6. vrsta;7. fenofaza plantei.

DE RETINUT 1. ac iune suficient de puternic ;2. toxicitatea nu trebuie s distrug esuturi/necroze;3. trebuie s poat fi ndep r at cuu urin ;

4. sterilizarea este doar desuprafa pot s apar infec ii laa 2-3 repasare (bacterii, virusuri,micoplasme sau fungi aflate nesuturile din organe)


117/168



118/168

2. INI IEREA I STABILIZAREA CULTURII

INOCULAREADef. = introducerea explantului sterilizat, aseptic, n medii de cultur sterile.De re inut:

Pornirea hotei se face cu 20 de minute nainte de demararea activit ii, custerilizarea prealabil a suprafe ei de lucru;

Echipament steril (halat, manui, mti);

Dezinfec ia permanent a miniloribra elor;

Activitatea n camera steril ncepe la15-30 minute de la oprirea UV;

Pe perioada activit ii, se evitmicrile inutile, formarea curen ilorde aer iar conversa ia se limiteaz lamaxim;

INI IEREA ISTABILIZAREA CULTURII


119/168

Se face la hot, conformprocedurilor stabilite;

ndeprtarea agentuluisterilizant se face tot la hot, cuap steril, conformprocedurilor agreate ini ial;

Se recomand evitareapstrrii explantului n staresubmers, prevenind astfelnecroza (anaerobioza)

Explantul sterilizat sepstreaz n capsule Petri

sterile sau pe hrtie de filtrusteril umectat cu apsteril;

STERILIZAREA MATERIALULUI BIOLOGIC


INOCULAREA


120/168

! !n momentul inoculrii, minile vor trebui s tin simultan recipientulcu mediu, dopul (capacul sau buoanele speciale), penseta (bisturiul sau ansa)!!

Etaneizarea recipientului se face cu folie polietilen sau aluminiu;Periodic, masa de lucru se elibereaz, pentru a nu ncrca spa iul steril;Fluxul opera iunilor trebuie s se desfoare constant, ritmic, ordonat;

INOCULAREA

REINEM!!Instrumentarul, recipientul saudopul cazute pe suprafa a de lucruse ndeprteaz imediat, fr a maifi refolosite.


INOCULAREA


121/168

Manipularea explantului se face cu grij, cu instrumentar sterilizati RCIT

n prealabil;Se va respecta polaritatea: polul caulinar se plaseaz n afara mediului;Se plaseaz orizontal sau uor oblic (la inoculi meristematici apicali sau

axilari , se va cuta a se pune n contact mediul cu suprafa a sec ionat);Explantul se introduce uor n mediul de cultur, ct s prezinte stabilitatei

s nu se rstoarne;Recipientele se etaneizeaz, se eticheteaz i se trimit n camera de cretere.

INOCULAREA

REINEM!! Explantul scapat din penset pesuprafa a de lucru sau care, ntimpul manipulrii, atinge altesuprafe e n afara hrtiei de filtrusteril pe care se lucreaz, se ndeprteaz imediat, fr a mai firefolosit.


STABILIZAREA CULTURII


122/168

perioada de incubarei cretere a culturilor variaz n func ie de tipulculturii, speciai natura explantului folosit, condi iile din camera de cretere iprotocolul folosit;

!! INFECIILE!!CATEGORII DE INFECII DIN MEDIILE DE CULTUR:1. origine micotic: fructifica ii de diferite culori (negru Aspergillus sp ., verde-albastru Penicillium)2. origine bacterian: n mediui la suprafa a lui, n zona de contact cu planta,halou translucid, de culoare alb galbuie;3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emii de plant;4. vitrificarea/sticlozitatea;5. deshidratarea mediului: umiditate defectuoas.


Culturile se stabilizeaz, de regul, n primele 14zile de la inoculare;

infec iile latente virusurile.




123/168

Eliminarea recipientelor infectate din camera de cretere se face imediat

cum acestea apar;Se urmresc condi iile de mediu din camera de cretere conform cuprotocolul de lucru stabilit ini ial;

Se fac notri zilnice asupra evenimentelor care suvin asupra culturii, pentrueviden ierea succesului sau eecului ini ieriii validit ii protocolului de lucru;


PARTICULARITIo Explantele generatede plante ierboase auprimele manifestrivegetative la 14 zilemaxim de la inoculare;o Explantele provenindde laplantele lemnoasemanifest vegetativ la40-60 de zile.

Allium cepa - esalota

3. MULTIPLICAREA.



124/168

3. MULTIPLICAREA.SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA

Meristemele apicalei apexurile caulinare tulpini e curdcinu e vitroplantule (similar nmul ire vegetativ butai);

Nod, internodi alte segmente de organe mugura

i tulpini

e;

Multiplicarea: transferul sau pasarea inoculilor pe medii proaspetesau alte medii, cu compozitie diferita (hormoni), prin realizarea de

subculturi; opera iune indispensabil n toate ramurile biotehnologiei.


125/168

MULTIPLICAREA.SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA


126/168

Senescenta culturii. Cauze posibile: Caren e provenite din hrnirea neadecvat a celulelor din mediul de

cultur Epuizarea propriet ilor mediilor de cultur Toxicizarea mediului de cultur.MOMENTULmultiplicrii: se alege n func ie de scopul culturii, de naturaitipul culturiii de particularit ile de reac ie ale explantelor.

Semne ale unei culturi care necesit multiplicare:calusul devine brun, cenuiu sau se usuc,frunzuli ele bazale se nglbenesc,crete gradul de vscozitate al suspensiilor celulare.

MULTIPLICAREASUBCULTIVAREA SAU REPICAREA


127/168

Tehnologie:se realizeaz n condi ii aseptice!! Aten ie deosebit acordat sterilizrii instrumentarului, recipientelor

i condi iilor igienice din camera de inoculare;etichetare cupstrarea datelor importante pentru identificarea

culturilor.


4 NRDCINAREA


128/168

4. NRDCINAREAReprezint etapa de pregtire a materialului vegetal pentru trecerea

in vivo, n spa ii protejate ntii apoi n cmp prin stimulareaaparitiei sistemului radicular.Mediul de nrdcinare folosit: auxine n concentra ii marii

gibereline cu adaos de crbune vegetal.Se produc: limitarea lstririi axilare, stimularea alungirii lstarilor,

inducerea rizogenezeii formarea rdcinilor.

PROBELEME: mediul cu auxine poate produce inhibi ia plantelor; setempereaz printr-un tratament inductiv cu auxine cencentratei apoiintroducerea n mediul de nrdcinare.

ATENIONARE: plantele nrdcinatein vitro aurdcini glabre, fr periori absorban i i foartesensibile.


5 ACLIMATIZAREA


129/168

.

5. ACLIMATIZAREA

Cea mai dificil etap n producerea materialului prin micropropagare.

PROCEDUR:1. Lstarii nrdcina i se plaseaz n substraturi.2. Se depoziteaz n spa ii cu umiditate ridicat i temperatur controlat.3. Fortificare i cretere n cmp, pentru cteva luni.4. Livrare materialului sditor.

Dureaz aproximativ 2 sptmni;La plasarea n substrat, plantele sespal de agar- surs de infec ii;Ghivecelei substratul se

sterilizeaz;Plantele pot intra n repaus tratament cu gibereline 200ppm.

DISCUII


130/168


131/168



132/168


@2013


133/168

ORGANOGENEZA

ORGANOGENEZA


134/168

ORGANOGENEZA

Def.:Capacitateaesuturilor vegetale de a forma organede novo, bazat pe nuireacelulelor somatice specializate de a dediferenia i a se rentoarce la stadiul de celule

meristematice, capabile de diviziune activ cu generare de primordii de organe,lstari, frunze, flori sau pri floarale.

MERISTEMOIZIIDef.:

Celule cu caracteristici meristematice, rezultate n urma diviziunii celularerepetate, cu plasticitate morfogenetic mare (diferite medii de cultur i diferii

factori climatici genereaz diferite primordii de organe)

MICROPROPAGAREA se bazeaz pe regenerarea deLSTARI (CALUGOGENEZ)i

RDCINI (RIZOGENEZ)

ORGANOGENEZA


135/168

ORGANOGENEZA DIRECT /ADVENTIVPrimordiile se dezvolt direct din meristemoizii derivai direct din explantul iniial.

ORGANOGENEZA INDIRECTCelulele explantului iniial se dividi genereaz esut calusal, n care apar

meristemoizii, din care, ulterior dau rdcini adventive.

Explant iniialmeristemoidprimordii de organe(organogenez direct)

Explant iniial calusmeristemoidprimordii de organe (organogenezindirect)

Cea mai rspndit cultur in vitro aplicabil la toate speciile soiurilei cultivarurile

CULTURILE DEAPEXURI


136/168

Cea mai rspndit cultur in vitro, aplicabil la toate speciile, soiurilei cultivarurile,cu excepia plantelor reticente la acest procedeu.

APEX: vrf de cretere al unui lstar; ntlnit la plantele ierboase cti la lemnoase.

Asociat cu termoterapia, se utilizeaz pentru devirozarea portaltoilorisoiurilor: t: 37-39 grade; Apexurile au rata de cretere mai rapid dect viteza de propagare aceluleor virusurilor.

Reacia speciilor la acest tip de cultur este diferita.Ex: Standardii Catalano (1985): Actinidia chinensis culturile de apexuri suntgreu de dezinfectati recomand culturi de meristeme.

CULTURILE DEAPEXURI


137/168

Exemplu: 1952, Morel si Martin: cultivarea varfurilor de crestere la Orhideepe medii de cultura artificiale au o rata de multiplicare de 1: 1.000.000 pe an,

uniforme genetic si libere de virusuri.

Apexurile au crestere nedeterminat in vitro cu modificarea balaneihormonaleneogeneza de lstari (capacitatea de proliferare este nelimitat)

CULTURILE DEMINIBUTASI


138/168

Sunt specificei se recomand speciilor/soiurilor/cultivarurilor care audominana apical pronunat (au internodii lungi)

MICROBUTAIREA: procedeu sau tehnic prin care cultivareaminibutailor se face orizontal n mediul de cultur

Procedura: defolierea pentru stimularea pornirii in

vegetatie a mugurilor axilari

MERISTEMELEDef : esuturi tinere cu activitate celular intens n plant formate din celule

CULTURILE DEMERISTEME


139/168

Def.: esuturi tinere, cu activitate celular intens n plant, formate din celulenespecializate funcional, cu diviziune continu i care asigur creterea n lungimeigrosime, fiind dispuse de obicei terminal, att n partea hipogee cti n partea epigee.

Tipuri de meristeme(dup tipul structurilor pe care le genereaz)

1. PRIMARE(caracter embrionar):Terminale - vrful rdcinilori tulpinilor, n muguride mare

importan la pomii fructiferi;Laterale cambiu

Intercalare - la baza internodiilor de la monocotiledonate;Foliare n frunzele aflate n curs de dezvoltare (rol major norganogenez)

Adventive n rdcinii parte aerian.2. SECUNDARE(influeneaz creterea n grosime)

Cambiui felogen;3. SPECIALE(localizate la nivelul explantelor cultivatein vitro):

Promeristemul faza timpurie de formare a meristemului cuimportan n embriogeneza somatic;Meristemoidul aglomerare meristematic nestructurat care poate da

natere la diferite organe;Embrioidul grup de celule meristematice care genereaz embrioni

somatici.


Tipuri de meristeme(dup zona n care se gsesc meristemele)


140/168

(dup zona n care se gsesc meristemele)

1. RADICULAREStructura mai simplFuncii limitateCategorii: apicale, laterale, adventive.

2. CAULINAREMult mai complexe funcionali morfologic;


Epoca optim de prelevare a meristemelor:a se evita perioadele de dorman


141/168

Epoca optim de prelevare a meristemelor:a se evita perioadele de dorman sau laten a speciilor vizate.

Tehnologia de prelevarei cultivare:se preleveaz din material vegetal sterilizat;

sub lupabinocular;pH-ul mediului se recomand a fi la 5.5 5.8;

concentraia n macroelemente s fie redus la jumtate;la unele specii se recomand inerea meristemelor timp de 3-7 zile la ntuneric,

pentru limitarea oxidarii;temperatura variaz n funcie de specie: 22, 25 saui mai mult (via de vie);

Intensitatea luminoas: variaz de la 2.400-10.000 lucsi (conifere).

Avantajele culturii de meristeme:

1.nmulirea clonal a materialului biologic valoros2. Eliminarea bolilori dauntorilor3. Material nou, juvenilizat, cu capacitate mare de multiplicare4. Bncile de gene.

Tip de cultur in vitro larg utilizat care genereaz material sditor liber de



142/168

p g gvirozeimicoplasmoze.

Dimensiune meristem: 0.1 0.3 mmanse mari de devirozare;

slaba rat de supravieuire n faza de stabilizare.

Teorii privind aciunea antiviral: competiie ntre celulele gazd i parazit saufaptul c celulele agresate sunt capabile s elimine virusurile.

Condiii preliminare pentru o culturde meristeme reuit:1. muguri prelevai de pe ramuri(pomi) sau alte organe care i-ausatisfcut nevoia de frig.2. adugarea de gibereline n mediulde cultur pentru stimularea creteriiielongatiei meristemelor.


143/168

CULTURILE DE CALUS

Trei etape n cultura de calus:


144/168

1. Inducerea formrii calusului/inducie2. Proliferarea calusului/diviziune

3. Regenerarea organic/difereniere1. Inducerea formrii calusului

Reacia explantului la cultura de calus estevariabil n funcie de tipul morfologic alexplantului, putnd varia capacitateaproliferativ, textura, culoarea sau morfologiacelulelor componente.

Stimularea formrii calusului se face prinhormonii specifici, auxine, citochinine sauauxine si citochinine (variaz n funcie despecie)

Tipul de material vegetal folosit: orice tip de organe rdcini, tulpini, frunze,flori,esuturi.Pentru juvenilizare se folosesc cotiledoane, puiet sau embrioni imaturi.

CULTURILE DE CALUS1. Inducerea formarii calusului,continuare


145/168

esuturile meristematice nu au nevoie de procese de difereniere, fiindcapabile de diviziune rapid i formarea de calus.

n faza de inducere de calus,esuturile parenchimatice - care sunt masacalusului - intr intr-un proces de dedifereniere celular.

!!Centrii alcatuii din celule cuactivitate mitotica pot fi numitiMERISTEMOIZI;Celulele lor evolueaza in diferiteorgane: lstari, rdcini sauembrioni somatici.

CULTURILE DE CALUS

2. nmulirea calusului


146/168

Procesul de nmulire al calusului este direct gestionat de balana hormonilor;

Precesul n urma cruia calusul se divide nu este pe deplin cunoscut,presupunndu-se c se formeaz n urma interaciunii hormonilor eliberai decelulele rnite.;

Celulele din alctuirea calusului devin meristematice, se divid activ, rapidiscad n volum.


147/168

MICROALTOIREA

1. Aprut recent, urmare a descoperirii incompatibilitii dintre portaltoi


148/168

1. Aprut recent, urmare a descoperirii incompatibilitii dintre portaltoii altoi la multe specii.

2. Genereaz plante mam libere de virusurii alte boli care ulterior potfi utilizate ca surs de ramuri altoi pentru altoirea tradiional.

Primul pom liber de virusuri obtinut prin microaltoire a fost obinut n 1970, prin microaltoirea la Citrus (Murashige i colab.)

Folosit pentru:

1. multiplicarea unor specii care rspund dificil la cultura demeristeme (cire, cais);

2. aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi de virusuri laspeciile: piersic, mr, cais, cire, prun.

MICROALTOIREA


149/168

MICROALTOIREA

TEHNOLOGIE


150/168

Presupune altoirein vitro, n condiii ASEPTICE a unui apex meristematic peun portaltoi obinut din semine sau din minibutai cultivai tot in vitro .

1. OBINEREA PORTALTOIULUIse poate obine din semine, din minibutai sau meristeme apicalei

laterale, toatein vitro.ieirea din dormans (stratificare, tratamente cu citochinine,

gibereline, frig) nlturarea endocarpului cu meninerea tegumentelor seminaleverificarea viabilitii seminelorsterilizarea seminelor n etanol 70% 1 min, hipoclorit de sodiu 0.7%

clor activi Tween20 cu 0.3%, 20 minutecltiri ap distilat sterilinoculare pe mediu MS ( -) pentru germinare; 20Ci intuneric

MICROALTOIREA

2. PREGTIREA ALTOIULUISe poate extrage dintr-un apex meristematic de la lstari crescui nd l i l i b i i


151/168

vitro, sau de la ramuri sau lstariobinuiin vivoSterilizare - dac provine de la plante cultivatein vivo

3. ALTOIREA PROPRIU ZISSe nltur cotiledoanele de la

portaltoii obinui in vitroSe secioneaz transversal portaltoiulApexul meristematic al altoiului se

detaeaz i se plaseaz pe zona inciziei

Se trece ntr-o eprubeta steril, pemediu de cultur steril LICHIDAtmosfera este saturat n umiditate

(asigur limitarea atacului bolilori favorizeazcalusarea)

4. ACLIMATIZAREACnd mini altoiul atinge 1.5 -2 cm lungimeSe trece gradualin vivo, printr-o umiditate relativ a aerului ridicat.

MICROALTOIREA

AVANTAJE:

1. plante altoite n timp relativ scurt;


152/168

2. condiii de cretere (mediul de cultur i

camerele de cretere) controlate eficient;3. util n devirozarea materialului genetic virozatpentru cazurile n care specia nu suporttermoterapia din cauza riscului de apariie amutaiilor genetice sau la speciile care se nmulesc greuin vitro;

4. aplicabil speciilor care se nmulesc uor invitro, dar care nu nrdcineaz

5. avantaj pentru cercetareatiinific privindcompatibilitaile ntre altoii portaltoi.

DEZAVANTAJ

Tehnic pretenioas i preioas, necesitpersonal nalt calificat.


153/168

CULTURA DE EMBRIONI SIENDOSPERM

Embriogeneza somatica seintalneste la nivelul:

Calusului


154/168

CalusuluiIn culturile de celule derivate

din calus sau din culturile deprotoplasti

La nivelul epidermei,La explante din fragmente detulpini, segmente uninodale

Fragmente de pistil,hipocotile sau cotiledoane.

Fig. 1. Mature zygotic embryo of Norwayspruce (Picea abies) (explant) Fig. 2 a,b.Initiation of embryogenic callus on maturezygotic embryo of Norway spruce (Piceaabies). Fig. 3 a,b. Proembryo of Norwayspruce (Picea abies). Fig. 4. Embryogenic

callus multiplication: (a) silver fir (Abiesalba), (b) Norway spruce (Picea abies) onsolid medium, c) Norway spruce (Piceaabies) on filter paper placed on solidmedium Fig. 5. Cotyledonary somaticembryos of (a) European larch (Larixdecidua), and (b) Norway spruce (Piceaabies).


EMBRIOGENEZA SOMATICA DIRECTA


155/168

Embrionii iau nastere din celulele aprtinand tesuturilor plantelor care au servit lainitierea culturii

Embrioni somatici se gasesc in celule nucelare (Citrus sp.), celuleepidermice, hipocotil (Daucus carota) sau in celulele somatice.

MOMENT OPTIMpentru recoltarea izolarea si inocularea embrionilor:

14 zile dupa polnizare.

MEDIUL DE CULTURA: regulatorii de crestere au o importanta vitala inculturile de embrioni somatici.


DE RETINUT:LipsaAUXINELORimpiedica formarea embrionilor somatici;


156/168

LipsaAUXINELORimpiedica formarea embrionilor somatici;In faza de maturare, prezenta auxinelor in mediul de cultura perturba maturarea

acestora, recomandandu-se rducerea sau eliminarea completa a auxinelor dinmediu.

Pentru unele specii, este importanta prezenta in mediu a unui raportauxine/citochinine (2,4-D).

Naturasi concentratia glucidelor: marirea concentratiei de zaharoza poatepreveniGERMINATIA PRECOCE aembrionilor somatici.

Temperatura, lumina si compozitia aerului din vasele de cultura influenteaza

embriogeneza somatica.

PROCEDURA1. Sterilizarea materialuluidonor;2. Excizarea embrionului imatur;

3. Inoculare pe mediu;

4. Diferentierea embrionilor somatici in diferite stadii de dezvoltare (globulara,cordiforma, torpila, cotiledonara) si suprapunerea diferitelor stadii deevolutieimposibilitatea automatizarii culturilor (costuri mari de

manopera)


EMBRIOGENEZA SOMATICA INDIRECTA


157/168

Inseamna regenerarea embrionilor somatici din calus.

DE RETINUTCapacitatea de regenarare depinde de specie (unele specii regenereaza

numai organe, altele numai embrioni somatici si altele din ambelecategorii) si felul explantului;

Conteaza varsta explantului si a planteidonor;Calitatea depinde de numarul de multiplicari;

PROCEDURA1. Initierea culturii de calus;

2. Multiplicarea calusului si identificarea calusuluiEMBRIOGEN(ridica probleme la nivel global, deoarece nu sunt inca date certe

despre criteriile de identificare si proceduri);3. Inductia pe un mediu nou de cultura;4. Formarea embrionilor somatici.


CONDITIONARI ALE EMBRIOGENEZEI SOMATICE1 Auxine in concentratie mare inseamna inductia embrionilor somatici;


158/168

1. Auxine in concentratie mare inseamna inductia embrionilor somatici;2. Acidul abscisic stimuleaza formarea embrionilor in culturile de calus

si celule in suspensie;3. Giberelinele si etilena inhiba procesele de inductie;4. Tesuturile juvenile favorizeaza sansele formarii embrionilor somatici;

5. Temperatura ridicata stimuleaza formarea embrionilor somatici;6. Laptele de cocos, foarte bogat in citochinine, are un rol important in

inductia procesului de embriogeneza somatica.

LIMITARI ALE EMBRIOGENEZEIMaterialul genetic este relativ instabil in procesele embriogenezei

Risc aparitie mutatii;Nerecomandatpentru multiplicarea clonala;

Nu sepoate aplica tuturor speciilor urmare a faptului ca nu toate speciileformeaza embrioni somatici;Culturile repetate duc la deprecierea calusului;

Aparitia fenomenului de dormans.



159/168

IMPORTANTA EMBRIOGENEZEI SOMATICE

Embrionul, ca material inmultitor, este structurat morfofunctional(radacinita, tulpinita, muguras);

Viteza uluitoare de propagare, ceea ce permite la o singurainoculare producerea unui numar foarte mare de plante;

Plantele derivate din embriogeneza somatica sunt identice geneticcu donorul;Cresterea plantelor este uniforma;

Plantele sunt robuste;Embrionii pot fi stocati pentru o lunga perioada de timp in banci de

gene;Prezinta material important de studiu pentru mutageneza

CULTURA EMBRIONILORZIGOTICI

Presupune separarea embrionilor zigorici de tesutul ovular, cultivarea


160/168

p p gacestora in condiii aseptice, pe medii decultura speciale care

potenteaza dezvoltarea ovulului, in conditii speciale care asiguracresterea si diferentierea embrionara normala.

PROBLEMA:avortarea embrionilor intalnita inameliorarea plantelor.CAUZA:dereglari fiziologice in procesul decrestere al semintei si fructului.REZOLVAREA: embriocultura/cultura deembrioni zigorici.

Rapid and high efficiency regeneration system (organogenesis and somaticembryogenesis) from isolated shoot apices in vitro. (A) One day old isolated shootapices with primordial leaves LP = leaf primordia; SM = shoot meristem. (B) One- weekold explant showing bulged meristem portion and expanded primordial leaves. (C)Three- week old meristematic mass showing multiple buds and leaf initials. (D)Individual buds (shown in Fig.1C) producing 2-8 translucent tissue strata. (E) Each ofthe tissue stratum giving rise to many somatic embryos. (F) Meristematic clumpsshowing differentiating buds. (G) Germinating somatic embryos showing shoot apex(SA) surrounded by a pair of primary leaves (PL). (H) Differentiation of somatic embryosinto platelets. (I) Plantlets with well formed roots in magenta box. (J) Acclimatization ofplantlets in the growth chamber. (K) Regenerated plants in greenhouse



161/168

POMICULTURA: cultivarea unor embrioni imaturi proveniti de laincrucisarile soiurilor extratimpurii si timpurii de samburoase.VITICULTURA: imposibilitatea obtinerii unor descendenti hibrizi candgenitorul matern este un soi apirenembrionul avorteaza.

Ce OFERA EMBRIOCULTURA?:

extragerea embrioniului abia format cu oportiune de tesut nuclear sau cultivareaovulului fecundat, depasindu-se astfelbarierele incompatibilitatii.

Figs. 1522. Anthurium embryos at 1624 wk postpollination. Sections stained withPAS (carbohydrates stain pink) and aniline blue-black (proteins stain blue). 15. Overviewof an intact embryo 16 wk postpollination 2 mm in length. 16. Shoot apex and leafprimordium in embryo 20 wk postpollination surrounded by the single cotyledon. 17.

Procambium from cotyledon connecting to shoot apex region of embryo 20 wkpostpollination. 18. Root apex of embryo 20 wk postpollination. 19. Base of embryo withsuspensor 20 wk postpollination. 20. Starch and protein storage products of the cotyledonand endosperm 20 wk postpollination. 21. Calcium oxalate crystal deposits (raphides) inthe cotyledon of an embryo 20 wk postpollination. 22. Tracheary protoxylem in cotyledon24 wk postpollination. In Figs. 16, 17, 18, and 20, bar = 125 m; in Fig. 18, bar = 100 m;and in Figs. 19, 21, and 22, bar = 25 m. Figure Abbreviations: c, cotyledon; em, embryo;en, endosperm; ep, protoderm, lp, leaf primordium; pc, procambium; r, raphides; ra, rootapex, s, suspensor; sa, shoot apex; x, xylem


Initierea culturii:a) variaza de la specie la specie:

ID Micro Curs

Documents

Transcript of ID Micro Curs