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IBMM Proteomic Pla/orm Université Libre de Bruxelles 

Dr. Sabrina Bousbata* Aimable Rengero Lema‡ 

*Head of the pla-orm 

‡Technician of the pla-orm 

2 IBMM Proteomic Pla-orm ‐ 9 March 2010 

Presenta?on Overview 

•  IBMM Proteomic Pla-orm Presenta?on •  Rou?ne Analysis: Protein Separa?on and Iden?fica?on 

•  Research and Development 

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Strategies of IBMM Proteomic Pla-orm 

http://nrpgm.sinica.edu.tw

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IBMM 2‐DE Facility 

IPGPhor Ettan Daltsix

ImageScanner Typhoon 9200

Flatbed 2nd dimension

1. 2-Dimensional gel Electrophoresis in different pH ranges (4-7, 6-11, 3-10, narrow range)

2. Different type of staining in ng sensitivity (coomassie, silver, sypro, proQ)

3.  Image analysis and multivariante data analysis (SameSpot)

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IBMM MS Facility Waters Micromass MALDI-ToF-LR Waters Micromass CapLC Q-ToF ultima Global

1. Protein identification

Fingerprinting Sequencing

only simple samples only with available genomes simple but time consuming

complex samples de novo sequencing complicated but fast

2. Protein/peptide mass determination

with 0.1 % mass accuracy with 0.01 % mass accuracy

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Classical Protein Separa?on and Iden?fica?on 

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P1 P2

P3 P4 P5

P6 P7 P8

P9

Mw IEB

H

SDS‐PAGE Protein Separa?on and Iden?fica?on 

Smeesters P, Drèze PA, Bousbata S, Parikka KJ, Perez-Morga D, Timmery S, Toussaint A, Mahillon J and Van Melderen L (2009) Genomic characterization of the circular prophage IEBH, a siphoviridae infecting Bacillus cereus. Submitted

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4 pH 7

Yan JX et al., Proteomics 2002

DIGE gels

2096 spots > 1500 spots

4 pH 7

IBMM Coomassie gels

2‐DE Protein Separa?on and Iden?fica?on 

All Proteins observed are identifiable

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Differen?al 2D Gels E.coli 

LB medium 

minimum glucose medium 

1.  csrA::kan vs. WT 2.  ΔtldD+ΔtldE vs. WT 3.  csrA::kan+ΔtldD+ΔtldE vs. WT

1.  csrA::kan vs. WT 2.  ΔtldD+ΔtldE vs. WT

22 spots 68 spots 91 spots

39 spots 50 spots

minimum glucose+casamino acids 

1.  csrA::kan vs. WT 2.  ΔtldD+ΔtldE vs. WT 3.  csrA::kan+ΔtldD+ΔtldE vs. WT

16 spots 48 spots 33 spots

All Differential Spots (300) have been identified

Interactomics by TAP‐Tagging  

Galliot S, Brosson S, Bousbata S, Thiry M, Lafontaine D. (2010) Identification of a novel family of silver-stainable nucleolar protein involved in nucleolar morphogenesis and cancer biology. In preparation

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Research and Development 

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Identified by MS and is immunoreactive Immunoreactive Identified by MS

80% sequence coverage to discriminate isoforms with 96% identity

Immuno‐Based Spot Picking and  Protein Streaming Characteriza?on 

Laugesen S, Bak-Jensen KS, Østergaard O, Roepstorff P, Svensson B (2007) Multiple forms of barley α-amylase generated during germination identified by two-dimensional electrophoresis, immunoblotting, and mass spectrometry. FEBS J., 274: 2552-2565

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DNGTY

LSEKGRFF

81 80

4.61

21.3

C‐Terminal Processing Site Determina?on 

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Eluate  

Total 

FT 

Soluble proteins  Triton X‐114 phase  

Total  

FT 

Eluate 

116 

  97 

  55 

  36   31 

  66 

Lysate 

FT  

Eluate  8/9e 

Eluate  1/9e 

49 38 

116 

  97 

  55 

  36   31 

  66 

Fig. 3:  Anti‐Cruzipaïn Western Blot 

Fig. 2:  Enrichissment of T. cruzi Glycoproteins by            Lectin Affinity Chromatography  

Tf  TL   Overlay 

2 min 

20 min 

Fig. 1: Endocytic Pathway Stain of T. cruzi  

a b c

Membrane Protein Enrichement and Lec?n Affinity Chromatography 

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15 Laugesen S, Messinese E, Hem S, Picheraux C, Rossignol M, Grat S, Ranjeva R, Rossignol M, and Bono J-J (2006) Phosphoproteins analysis in plants: A proteomic approach. Phytochemistry 67:2208-2214

Phosphoprotein Enrichment and  Phosphoryla?on site Characteriza?on 

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Research in Progress Gel‐Based Protein Quan?fica?on and ID: 1.  Géné&que des Bactéries: Laurence Van Melderen, Johan Timmermans & Pierre 

Smeesters  2.  IMI: Michel Braun & Kathleen Weatherly 3.  Delphi Gene&cs: Philippe Gabant & Céderic Szpirer 

LC‐MS2 Quan?fica?on and ID: 1.  Parasitologie: E?enne Pays, Luc Vanhamme, Didier Salmon, Sébas?en Brosson & 

Pierrick Uzureau 2.  Embryologie Moléculaire: Eric Bellefroid & Stephen Ghogomu 3.  Service public fédéral Santé publique: Véronique Piehe 

PTMs (Phosphoryla?on and Ubiqui?nyla?on):  1.  Physiologie Moléculaire de la Cellule: Bruno André, Cédric Govaerts & Fabien 

Debailleul  2.  Biologie du Transport Membranaire: Anna Maria Marini & Mélanie Boeckstaens 3.  Biologie Moléculaire du Gène: Véronique Kruys, Cyril Gueydan & Long Vo‐Ngoc