HUGO GER\IAIS

Étude moléculaire du champignon ph ?topa thogèoe It~oiiotrts ttwtteiitosus

Mimoire présent,

à la Frtcultii des itudes supt;ricurcs de I'u'niversitk Laml

pour l'obtention du yradc de maître ès scicnccs ( 41 .S~. )

Dipartement des sciences du bois cl de la forêt F:\CKI-TE DE FORESTERIE El" DE: tjEO\I:\ T[QCE

CS[VERSITE L:\L';\ L

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Résumé

1.c prtiscnt niinioire Je niaitrise rapports unc panic riss trivaux ctTrctuEs sur Ir

cl i i inipigon phytopaihogène ltzonorrts tonirrirosics. Le premier aspect de mon Ctude a

pan? sur 1s tasonomie des diffkrentes r spkes au sein du genre hiouorus. Cette Crude a

r t h x l i iiiic ddimitation tasinomique cntrc Ics espéces infectant des hôtes différents. De -

pliis. iiiic séparation t~xinomique importante a été obsenke entre les espitces infectant les

soiii t k s cr celles infectant les sspéces feuillues. Les séquences d'ADN générées Jans

ccrrc <itudc. ont permis de fabriquer des amorces spécifiques à 1'1. ~onietztosiis. Le second

:ispccl de nion ktudt. consistait h utiliser des marqueurs moléculaires de gènes codants

p w r Giudicr la génétique d'unc population d'f. ronwtrrosics dans une planration

d'2pincttc.s blanches situtic au nord-ouest de blontrkd. Cette Ztude. basCe sur I'utilisation

LIS ~ C U S &es rnitochondriaus et d'un $ne nucliaire. mt'ne j. croire que la propagation

thris I i i plantation cst principdenicnt effectui-r' par voic clonalc.

Louis Bernier

Directeur de recherche

This thrsis report represents a portion of Our studies on the phytopathogenic fungus

1izoilotrr.s roirzerrtosiu. In the first put of Our study we focus on the phylogenic

rslritionships within the genus Inonotiu. The study reveds tminomic differences between

spsçies infecting diffrrent hosts and identifies important phyiogenetic differences

obscmd brtwrrn sprcies infecting deciduous trees versus coniferous trees. Srquencing

data gtinrcitrd by this project were then used to design pnmers specific to I. tomrntosiis.

In the w ~ n d part of Our study. we used molecular markers from coding genes to study

rhc population structure of I. tomrntoa~s in a white spruce stand located northwest of

Montrcal. This study. which was based on the use of two mitochondrial markers and one

nuçlrx rnuker. suggested that the spread of I. tomenruslis within the plantation was

niostly clonal.

Hugo Germain

Cmdidrir

Louis Bernier

Directeur de recherche

Table des matières:

............................................................................................. 1' \ \ i \ i )\III. 1- 1- I!)IN I'lFI('\ T I O N 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ ) i \ i I< ! i \ l i Io\ i:I . l l i j l ' t2i 1 1

................................................................................................................ II, 1 1 )!. r~' i \ i :! :(- 1 IOS I S C ' K ~ i l \ . ; . \ \ c ' i : LI! c ' t~ .wi3~c;? ;0x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......................................................... ib

...................................................................................................................... I\!i'.\c I i i.O\O\IIQClS l 7 ........................................................................... >l.\i<(.ii -1.1 ,us t ;~ i~ t : . r i~~ : t : s .................+.................. 13

................................................................................................... I . .I : I., ' 1 i \ ~ c > i . r : PCR r:.r SES DF.KIL.F.S 10 1 7 .......................................................................................................... ... ( i l - \ ! : 1 lur i. I1l.S POPIL \ iYONS -- 1 i I';! tl, J 1.1 L * - -

? ! . s : l q l i c , 2 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I j l i ~ i I( II ~!<..\l>lllt. )U

[)1..\(;';()~.rf<: p c K A S S . ~ ~ ' FOR THE IDE'("I'IFIC.4TION OF ILYO:C'OTCL$ TOMEIVTOS&:S FR051 ( ' 1 '[..i'['Kk:.:èi OR FRllIT BODY. ......................................................................-........................................ 32

I )EWLOPPEJIEST D'A3IORCES DI.AGSOSTIQCES POC'R L'IDESTIFICATION DE ..................... I.'I.f'O.\'OTC'S fO.VE;VTOSL:S .i P.i\RTIR DE CULTURES OC DE C-LRPOPHORE. 33

> > . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ICl.\i \II. " ................................................................................................................... I \ I ici c . 1 . 1 0 ~ >4

* - \ > l1.1 ri:iii l i '; \ % r , MI:I '~IUDS ....................................................................................................... - -

B l o i r ~ q t ~ t l / n ~ i i r ~ ~ r t t ~ l . . .; j . . . . . . . . . . . . . . . ' 4 O ~ U . . . . . . . . . 35

( 'if i r l l r l q rlfld ~ c ~ y ~ c w i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . j 3 t i ~ t 1 r d r r 1 - i F r i f - 4 r d t id p c p r . . . . . . . . 38

11 \ i \ .\S:\I \ . s i s .................................................................................................................................. 39 U1.4 t I rs ......................................................................................................... --.- 59 .................................

................................................................ I)l';<.I s';los .... ........................................................................ 47 [ - : 1 i - X . 4 r i Kt; r . l tET ! .................................................................. ............................-...................... 49 ..........

(; E: S E'I'IC \'XKI.ATIOX 1.i ISOSOTFS TOhlESTOSt'S U'ITHIS A WHITE SPRUCE I'l..A.\T.ATIOS REIvE.4LS IRRECCLAR ALLELIC C ~ ~ I P O S I T I O ~ ' FOR MITOCHONDRIAL .\Y D SLCLEXR GESES ....................................................................................................................... ....52

I.'EI'L'DE DE L.4 \'.ARIATiOS CESETIQLE CHEZ I.VO.YOTLS TO,%fE,VTOSUS DAYS C'SE 131.~V1' . .~T10S D*EPISETTE BLASCHE I3DIQf E U S E COMPOSITION ALLÉLIQLIE \SOK.\IXI-E CHEZ DES CESES SI*CLEXIRES ET 311-TOCHOSDRI.4VS ........................ ..,,... 53

Listc des tablcaus

I'hlcciu 1 : Liste des espécrs pouvant ;ire infect2es par I ' I rotmtirosiis (Tiré de Whitney.

............................................................................................................. 19") 13

I-;ibicliii 2 . Strriin idcntification. Genbrink accession nurnbsr and host for e x h spccie

uscd ........................................................................................................................... 36

[~ihleaii 3: Rdcrence nunibcr and ongin of the isolates icsted with it-ITS-IO'?-rand it-

................................................................................................................. ITS-'00-rc 4 1

T ~ h l c a ~ i 4: Frcqucncies of the di fferent genotypcs found in a Itio~rorus tonte)zrosiis

popiilation in ;t white sprucr. stand of western Quebec .............................................. 64

hb lc : iu 5 : .-4lli'Jic tiequencies for ML. SIS and beta-rubulin loci. found in a I ~ ~ o > i o r i ~ s

............................................ ro~1~~~zros1i.s population of Hamngton. Western Qusbcc 66

1-~hlcciii 6: GcnBank accession nuniber for the alleles squenced at ML, MS and beta-

........................................... ciihiilin loci. in the basidiomycete Itio,rartis ronrrtrrosiïs. 68

Liste des figures

Figiirc I : .\iiipliiication product obrainrd with the specific pnnirrs ITS-?O9t:ITS-700-rc

............................................................................... 311d n.ih ITS- 1 t: ITS4 (iiniwrsril) 43

Fipiirc 2 :Pli . lo~enctic rclationship m o n g the yenus Inonoius using P I i ~ ~ f f U i i u pUii as 3

outgroup ..................................................................................................................... 45 I:ig~irc 3: Illustration ol'llis pattern obsr.n,ed on the gels indicating r h t recornbination

. \i 2s [lot taking place ar thc bctli-tubulin locus ............................................................ 6 1 Figiirc 1: Craphicül rsprcscnration ofttie mitochondrial haplotypcs found in the

Hrirrinpton plantation ................................................................................................ 70 I-%yi.c. 5 : Phylogs~ieric relationship Iiniong the Hamnyton population ar thc brta-tubulin --- ............................................................................................................................ < t ' I l t ' ! J -

Introduction

1. 'itio>rorris rot~r~~~ltosirs (Fr.) Teng cst un basidioniycite causant

AL col;i~rc l i i i pied chez Ics soni tkes des foréis boria1t.s et sub-bordes de

la cane rouge

I 'Amérique du

'id. . - h i Q~ir'ùcs. Ir. champignon peut s'attaquer i plusieurs risineux mais i l affects

principdciiic'nt I'r'pinctte blanche (Picecl glriirc'i (Mosnch) VOS) et I'epinrtte noirc (Piceri

m i t - ~ u i i i (b1ill.j B.S.P.) . Cr champignon n'est pas le seul à causer des pourritures de

I;ICIIICS c tic% les csscnces cornnierciales qut'bt.coises mais i l est parmi Ics plus importants.

nec I'.-!~-niill~~ri~i spp et Hererohusicfiott wiIzosuni (Fr. :Fr) Bref.. Au Québec. on retrouve

i'i rot>i~~ttrostrs partout dans l'aire de distribution de I'Cpinette. I I est responsable de pertes

2conoiiiiqucs irks importantes dans les plantations d'épinettes. Le mode de propagation

LIc CC c1impiyon patho_rène. par contact racinaire, explique le hit que la maladie soit

plus tiiqiiçnic cii plantation qu'en foret naturelle; /ri promiscuit6 des racines d'arbres

.;cris~hlcs th imsc l'int-txtion de nouveaux arbres.

Lcs programmes de reboisement inrensif visant la rqknération de la forêt

ii;iiuri.llc ton[ nioditicr cic façon dramatique I'hétéroyéniite Je 13 torét quibécoise. Les

pi;intatioris .linsi criees seront des sites propices pour un chanipignon comme 1'1.

ionrcvitosirs. I I est possible que les déstabilisations écologiques engendrées par de telles

pratiques ibrescitircs aient des effets néfastcs sur la bio-diversité. On peut anticiper un

~ccroisscmcni de la prévalence de ce champignon pathogene qui va bénéficier du

pti~norii~iic.. La plantation d'epinette qu i est monomorphe en tout point ne peut que

t;ivoriscr 1'1 n k c r ion par I'l. iometriostis comparativement a la forêt naturelle d'épinette.

yiii Cnisrgc d'une for& mixte et présente une g x d e diversité. tant sur le plan de I'ige de 9

i ( i population que sur les essences que l'on y retrouve. De plus. le reboisement avec des

csscnccs sensibles i la maladie sur des stations déjà colonisées par ce poumdie assurera

Ic rticiintiai JCS populations du ravageur déjé installées et pourra. conduire 1 des infections

n1aSsii.i.s trcs r a p i h .

L'idriir i ticaiion Jc starions infsctics par l'I ru~rri~tos~rs cst rclativernent di lfici lc.

Ccllc-ci l i i t habitiicllement par l'obsrn-ation i I'automne de carpophores dans 13

p1;iritition. par lri prisence de carie dans le bois obscnés suite j. une coupe ou lors ci'un

ctiàblis 011 par Ir prilèvement d'une carotte dans la tige: ce sont tous des indicateurs

d'itikçtions très avancks . De plus. les cultures de I'I. ronie1,ioslcs sont identiques

niorphologiqiicmrnt i celles de I'I. /epporitiirs et quasi-identiques i celles du Phelli~riis

prw. &LIS ;~iitrcs cilün~pigi~ons pathogènes q u i infectent les rnémes hôtcs et qui causent

JCS s ~ ~ i n p t ~ n i c s sini11airc.s.

Lc d?vt.loppr.nient. depuis une quinzaine d'années. de mCthodes rnolCculaires

hiisccs sur I 'ADN rt pcrmeitant de génotyper les organismes de façon précisc 3 produit

iiiic niini-rr'wlution dans notre approche d'études ipid2miolo~iqur.s et Ccolo~iqucs. Les

oblscti tS de cc projet consistent donc 8 : 1 ) dtivelopper un test rapide et efficace i l'aide

il 'iiti niitrquwr rnolticulairc pcmettant de distinguer les rspt;ces 1. tor~re~rtoslrs. 1.

I C ~ ~ ~ W ~ Z L L S . i 't P. pijzi I'unc de l'autre: 2) étudier la bioloeie de 1'1. ronrorrosits. plus

pxticuliircnient la structure d'une popuhtion dans une plantntion. entre autres le mode de

iulonisciiion d'un site par celui-ci. Ceite étude nous permettra d'approfondir nos

i i ~ ~ i t ~ a i ~ s i l n c c ~ rclativement au mode de distribution de ce champignon sn plantation et

JI.\ rait pcrnicitrt. d'identifier cc champignon pathogtne de façon eficace.

CHAPITRE 1

GENÉRALITÉS ET TECHNIQUES D'ÉTUDE DE L'INONOTUS TOMENTOSUS.

Taxinomie et identification

L' i . f o r ? t a J f o . s i t s . l'agent respcinsablc de la cane rouge dvColaire du pied. est un

bssidioniyc~tr. de la famille des Polyporacies. il s'agit probablement de la famille de

ctilinipyotis les plus visibles en forêt car ils peuvent ètre obsemés peu importe la saison

ct produisent des liuctiîïcritions rnacroscopiques. Plusieurs Polyporackes forment sur les

xhrcs JCS structures assez caractéristiques. en forme de tablettes. qui sont faciles i

rccoiiiiiiitrc. ils poussent très souvent directement sur les arbres ct peuvent Ztre très

coriaces. Bicn quc ccmins polypores soient des comestibles de choix. la grande majorité

d'cntrc L'LIS sont non-comestibles (Lamoureux et Sicard. 1999). La frilctiticritton de 1'1.

f O / > l ~ ' ~ l f i ~ S l l J , contrciirc'nicnt a la majorité des polypores. pousse habituellement au sol

( Gii licrtsori cc Ryurden. 1993); i l s'agit d'ailleurs d'un cntére permettant dc Ic distinguer

dc 1'1 1cyiori~rir.s ( Fr) Gilbrrtson qui lui ressemble beaucoup mais qui est formé sur le

irotic. L'uliiinc critire morphologique qui permet de diffirencier Ics fnictifications de 1.

roi~i~wmsitr ci I. leporr~rirs est la forme de lcurs soies microscopiques forniées à l'intérieur

iIcs porcs : Ic: premier n'a que des soies droites alors que le second peut avoir des soies

coiirhtics ou droites dans le meme carpophore (Gosselin, 1944). Cependant. le tableau se

compliyuc lorsque l'on tente d'identifier 1'1. tomeritosils à partir dc cultures car celui-ci est

cn m i t point identique a 1'1. leporiniis (Whitney et Bohaychuk. 1977). Un autre

clisnipiyrion J e carie isolé de l'épinette, le P h e l l i i i i t s pirti (Brot. :Fr.) A. Ames (Nobles.

I M 5 ) ressernblc lui nussi en tout point à 1'1. ronientostu sauf que le premier peut produire

dcs çhlam~dosporss ( Hunt. 1996), ce qui peut rendre l'identification très difficile. .Afin de

soiiiiionnc: ce problime d'identification. Hunt a tenté de developper des méthodes

pcnriciiarit d'idcniitier ccs champignons. Ln milieu de culture diffkrentiel (Hunt. 1997).

uii anticorps monoclonal (Hunt. 1999) et I't-lcctrophorèse des protéines (Hunt. 1996) ont

5ti utilis2s niais n'oiit pas permis l'identification de cc paihogène.

Lc genre ltrotroiits renferme plusieurs autres cspkcçs qui sont aussi pathogènes.

Panii i sel le-ci notons : I 1~poritiies. 1. c~eric~rim-is (Bull. :Fr.) P . Karst. 1. glot?trrmts (Pk)

l lur r . r.1 I t-heridcs (Pcrs.} Bond et Sinser. De ces différentes espèces. seul 1'1. leporiticis

iiikcic u s s i Ics coniErrs et peut compiiitionner avec I ' l . ronietimsus au niveau de sa

riici:~ t.cologiqut.. L'I. kporirues cause des

I'I. [ o ~ ) ~ L ~ ~ ~ [ o s I ~ s niais est moins agessivc.

sti;inipignons ne peuvent Stre distingut's

syrnptornes semblables 3 ceux provoquks par .

Tel que rncntionnG précédemment. ces deux

l 'un de l'autre cn culture. Les trois autres

i.spi.çt.s prisentcn t dcs di ffirences notables par rapport i 1' 1. tontetirostes au niveau

i;coloyquc. sr lsitr idsntilication sur le plan des structures sexuées et en culture ne pose

p u dc problc'nie: elks tnfcctrnt les feuillus et aucune n'est considérée aussi qressive que

1'1 [o»ic*,itosir.s. Ces trois autres espèces. I. glonremties. I. ciiilcctfmx et I. rlrrdes.

plaçccs ici cri ordre d2croissant d'agressivité. sont toutes des chanipignons pathoyines. I.

t - l i ~ ~ ~ i ~ k s csi cl lis si;^ par cert3ins auteurs (Dai et al. 1997) dans un sous-genre ciiffkrent:

cllc prbscntc plusieurs difftircnces par rapport aux autres espéccs de cc genre. Notons.

cntrc iiiitrrls. la. formation d'hyplies très branchus et une agressivité moindre. Enfin I.

t-tidi~itir.r (Sowcrhy :Fies) Kanten. est un saprophyte du bois dur d'arbres feuillus.

Lcs symptômes. souvent absents. ne constituent pas un bon critère dans

i'iiicntitication dl: la maladie. Ces symptômes sont : une diminution de croissance

caracttiristir: par unc réduction de la distance intemodale. de petites aiguilles. la mon de la

coiironnc de bas cn haut. un jaunissement du feuillage et une resinose à la base du tronc

( \Vhitricy 1963).

Dis tribu tion et hôtes

* L ' I mroirosw est très largement répandu dans le monde. .-lu Québec. i l est

dispcrs? parmi l'aire de croissance de l'épinette. I[ se retrouve en Outaouais (Blais. 1996).

au Sud Jc la province (Boulet. 1994). sur la basse Côte-Nord (Herbier René-Pomerieau)

ct ; 1 ~ çcntrc dc la province prés de Shawinigan (Herbier René-Pomerleau). Ce poumdik

est LLUSSI trks prisent ailleurs au Canada (Hunt. 1998. Whitney, 1962. Whitney. 1977.

OucIicrit. cr 21.. 1971 ) mais ne s'y limite pas; on le retrouve aussi aux Etars-~nis

I J lycn. 1 9'0). en Inde (Bakshi. 197 1). et à divers endroits en Europe ( Lloyd. iclOS).

Bicn qu 'au Qutibcc les dommages soient le plus souwiit obsenés dans les

pla~irclr~oris d'ipiiictics blrinchrs (Picea gluitcu) ou noires (Piceci ruurimu ). i 1 hut noter

qiic tourcs Ics espciçcs d'épinettes canadiennes et plusieurs sspéces de pins peuvent Gtre

!II kctc 'cs (\Vliitney. 1 c177) (tableau I I .

I'ablcaii 1: Liste des espèces pouvant être infectées par 1' 1. torrrrrrtosrrs (Tiré de

Wii tncy . 1977).

Canada .-l CS ~ J L I M ~ S

P m t s ra1&~

[nde CL*(irzr.s ,ic.otfm-a

P I C ~ Y I snri.[hian<z

Europe PICLW h a L

l Plnus rtlrra

v

Eri ILI%. Whitney et Bohaychuk ont &value la sensibilité de différentes espèces

d'.irhrcs pouvant &rr. infectées par I ' I ronrmtosw et ont coniparc les degrés J'agressivi t i

Jc. i'l. rormNiirosrls ct de I'I leporiirirs. Les conclusions de ces traïaus. menk sur un total

dc atwc cspcccs de coriiRres. indiquent que parmi les kpinettcs. I'kpinettc blanche esr plus

j ~ i i ~ i b l ~ qiie I'ipiiicttc bleue et I'ipinette de Non+ge.

Mode d'infection

Wii tncy ( 1960. 196 1 . 1 962. 1963. 1966, 1977. 1997) est l'auteur des principales

ct~idcs concemani !a maladie cause par 1.1. rmietttosus. 11 3. détermine que la pénétration

Jans Ics r3ciiii.s SC Lit par contact racinaire. d'une racinc infcctkc ct d'une racine non-

inti.ct2c. Lacs poirirs cl'entrkc sont hobitucllt.rnent les points de contact entre deus racines.

Ics cliscoritinuitth de l'icorce, 1'r.nibranchement des racines secondaires (Lewis et

H;inscn. I W 2 ) ct la prisence de blessures de racines. D'ailleurs. les insectes du genre

Uiiuhrits ( LVarrcn. 1956. Whitney. 196 1 ) pcuvcnt causer des blessures racinaires et sonr

p;lrtOis .issocitis iius infections causées par I ' L tonretrrosi<s. Les racines de moins de 0.6

sni dc Ilirinic;rrc sont habituellsmenr infectées les premit:rcs. Le mycdiurn croît le long de

I'&xmx rxini i i rc avant de pénétrer le xylèmc. La progression du mycélium est ensuite

sonstnntc d'nnnL;c en a n n k i un rythme de 3-4 cmiinnée (Whitney, 1962). Les racines

p c u ~ ~ ~ t Ctrc inlfctics sur toute leur longueur et la coloration peut se retrouver dans la

tmc ' dc la souche. Suite à une coupe. le mycélium continue à croître de façon radiale et

pcut s t i rv i~x iusqu'i 30 ans de façon saprophyte dans les racines (Leivis et Hansen.

l O 1 : Tkacz ct Baker. 199 1 ). Cette proprieté de croitre de façon saprophyte peut avoir

Jcs cr~nsc'qcicnces dans les cas du reboisement car elle facilite grandement la colonisation

dcs noiiwaus ssniis. L'infection récente s r cara~térîse par la présence d'une coloration

hriin-roui!eitre b du bois. alors qu'il est possible d'observer des alvéoles blanches ( white

p o d w . s ) di: mycc'lium lors d'infections avancées. De plus. le niveau de dégradation

racin;iirc rie pcut 2tre directcmcnt reliC aus symptômes à la couronne. ce qui explique la

tiir'ficihti tic f4it-e une identification visuelle de l'infection basée sur la symptomatologie

( \ \ ' I I I tney. 1962). Les premikres infections artificielles réussies à partir de basidiospores

o n t Gtt; cffcctut;ès sur du matériel mort. soit : des blocs de bois et du bran de scie

( U'1iirnc.y. 1963). Les m a i s d'inoculation dircctc par des basidiospores. sur dcs racines,

Jcs rigcs avec Ccorct. ou du tissu \rivant. n'ayant que des blessures supcrficicllcs ou pas

dc hlcssurc du tout. ne rt'sultent jamais r.n une infection. Par contre. les blessures

prolandcs de 4.5 c m ct plus mènent ;i une infection (Whitney. 1966). Ces résiiltats

suggr'rcnt que l'ini;.ctiori doit rivoir lieu pnncipalernent par contact racinaire plut& que

par la gcnnination de basidiospores. Ccs résultats ne Fournissent cependant aucune

intbrni;ition sur 13 h p n dont I'inkction primaire, c'est-à-dire I'cippantion dc l'infection

iims iinc nouvcllc station. peut a\.oir lieu. Seiils les travaux de Lewis et Hansen ( 199 1).

hlisc's sur la complitibiliti végétative et I'élrctrophorése des proteines. indiquent que les

sporcs dc 1'I. rovréutosirs constituent uns importante source d'infrction. Merlrr et

a1.i N S S ) ont observé la présence de ronds de sorcières des hctitications de I.

io/>it l , i [r j .s i<s Vilin. rr>lgs). mais n'ont pas émis de conclusion sur la cause de ces

phtrionitincs.

Croissance du champignon

11 est possiblc de réaliser des cultures de I ' I tonie>ltosus i partir de bois infecté. de

hasidiosporc ou de tissus de carpophore (Whitney et Bohaychuk. 1975). Par contre, des

isolcniciits i partir du sol n'ont jamais ett; rcussis (Whitney. 1967). Différents milieux de

iiiltiirc psiivent Ctre utilisés mais le plus frtquemment employé est le iL1~1lt E.i-rrucr Agar

l"O. Ccpcndant. c'est sur ce milieu que Ir plus faible taux de chlamydospores de P. prrri

cst produit (Wiitncy et Bohaychuk. 1975). ce qui peut se révéler désavantageux dans le

C ~ S O l'on veut se semir de Iû culture pour I'identification des isolats. De façon générale.

on pcut dire que Iç champignon pousse tris lentement sur milieu artificiel. soit entre 4.6 ii - - . cm. O ssrnaincs sur . V d r Esrnict .-lgar 2 O.6 a' ZOGC. il produit des pigments pouvant

cilicr du beige pile au brun foncé et les shlarnydospores peuvent Ctre de rares à

nonibrcuscs dans les cultures de 3 semaines et plus (Nobles. 1958). Bien qu'il soit

possible de faire croître le champignon 1 des valeurs de pH variant entre 3.5 et 7. son pH

optimal de croissance se sirue 3 4.5 (Whitney. 1962). ce qui explique son absence en sol

alcalin. De plus. i l faut noter que 1'1. rontetrrosw a la capacité de faire diminuer le pH du

inilicu dans lequel i l pousse lorsqu'ii est cultivé en milieu liquide (Whitney, 1967). La

;mpirririirc uptinialc de croissance de ce champignon est de 20'C. sa liniitr supéricure

ctririt dc N T tnclusivt.rnent et sa iimite infiricure de 0°C inclusivsnient. P x ;lilleurs. Ie

siimipi~non pciit Ctre trr's polyniorphs en culture selon It. rissu dont i l provient (LVhitncy

ci Boti;iyctiuk. l L ) 7 j ) ou parce qu'il a été maintenu en milieu iiniliciel depuis longtemps

(\Vliirncy sr Bohayhuk. 1977). Bien que Ir nombre masimuni de spores soit obtenu i

partir dc ccirpophores ig&s de 3 semaines. ce sont Ics basidiospores de carpophores dc 4

iciiiiiiiics qui ont lc rnrilleur raus de germination (Whitney. 1906).

Impact économique

11 est rclativr.int.nt di ficile d'établir avec prt'cision la valeur rnonéraire du bois qui

s i pcrdu uiniiellcnient i cause dc la maladie causk par l'agent de la caric rougc

.ilv~ol;iirc. du picd. L'sstiniation du volume total de bois perdu annueilemsnt. suitc i une

dcstriiction par Ics rlivrigxrs. Grait de 107 millions de rnitrcs cubes entre 1977 ct 1981

i Stcmer ct Davidson. i 982). Cette estimation représente 61 '31 de la r2colte annuelle

rordc ct 30-47 "'0 dc 13 croissance annuelle totale (hiallet et Volney, I99S), représentant

m s i pris dc trois b i s plus que ce qui est perdu à cause des feus de lorèts pour une même

r d H l . I O . Lc complexe .-lrmdluria spp.. et I'I. tonrelztoszis sont p a m i les

sliiiscs de poumtiircs rxinitires les plus importantes (Mallet et Volney. 1998).

C'cpcndant. d o n mes connaissances. le pourcentage des pertes occasionnées par les

pourri turcs rricinaircs. plus particulièrement par 1'1. tonlerifosirs. versiis Ics autres

ctiainpignons pnthoyéncs n'cst pas disponible. Whitney et Groenewoud (1963) ont

~)bscn.L' une nionaIitG de 33-30 ?G sur 10 ans selon la plantation. La conclusion que ces

.ILiIcurs tircnt de ccs résultats veut que dans une plantation sévèrement infectée. très peu

ii'arhrcs aitcindronc une taille suffisante pour pouvoir ktre utilisés comme bois de sciage

i U'iiitncy. 1003). La diminution de croissance èst évaluée à ?7°4i10 ans pour un arbre

inlcctC (Lactinnce. 107s). Cria peut représenter une perte totale en volume très

importante sur le rcndement à maturité d'une plantation. L'accroissement de 13 surface

rlcs 5itc.s infectes pcut 2rre de pres de I j%/année (Myrcn et Patton. 1970). ce qui permet

~ t i pcithogkne de doohlcr la superficie infectée en moins de 10 ans.

Marqueurs génétiques

C'cnaines cspC;ct.s du monde vivant présentent des caractirisiiqucs

n~acroscopiqucs perniettant d'itudier les interactions entre lcurs gènes. Par escniplr.. ctiez

l'Art. tiuniain la prcscnce de personnes tirrint affectées par des handicaps IitirCditaircs

pcmict I'titude de certains gknes.

Daris It' cas des champignons diploïdes. certaines caraciéristiqucs cornnic la

ciipaciti; 3 utiliscr certains substrats et la couleur des colonies peuvent Ctrr utilistics en

ionihiiiaison avec cies croisr.mcnts ailn de détsmiiner la nature et parfois la position dcs

ccncs in~pliqiiCs. Pour cc Caire. la desccndancc des croisements est utilisie et la

sigrigation de la cciracttinstique ituditie au sein de la descendance informe

l'cxptirinicntatcur quant j. la dominance o u la ricrssiviti du gène ct d'autres

~;lra~tr;t-isriqucs. Dans lc cas de 1'1. to»~ortosiis. i l n'est pas possible d'cffcctuer des

croiscnicnts ut i-ro-o puisque le champignon produit des structures scsuics sç~ilerncnt

Jans son rnilicu naturel Iorsqu'il infecte un arbre. L'utilisation de techniques moléculaires

pcmettant d'amplifier des marqueurs génétiques est particulièrement indiquée pour cette

cspkcc. L'approche rnoliculrtire. utilisant des crirpophores d'une station infcctke. devrait

ioumir dcs riponses j. des questions qu'il ne serait pas possible d'aborder 3 l'aide des

nvithocics rraditionnelles utilisées en laboratoire.

Les rnrirqueurs d'ADN sont de courtes séquences du génome présentant du

polyrnorptiisrnc entre des individus ( Weaver et Hcndrick. 1989). Les premiers marqueurs

A avoir c'tC uti lises etaient basés sur des caraçtsres morphologiques. Ceux-ci pouvaient

Arc dc dcus types. soit monogénique ou polygi-nique. Les caractères monogéniques sont

sous I'inilusnce d'un seul ;ène et sont donc paf le fait méme très informatifs. car ils

procurent dc l'inhrmation par rapport à une séquence d'ADN donnée. Par contre. très peu

cit. locus 3. caractkrt's monogéniques sont obsen.ables et leur traits sont habituellement de

nature dominant ricessil. ce qui ne permet pas de détecter facilement la présence

d'hr't?rozypote au locus en question. Certains auires caractères. par exemple. la taille chez

I'tiomrnc. sont sous l'in tluence de plusieurs génes ( caractère polygénique). I l est dans ce

cas plus difficile de tirer des conchsion quant a un sène en particulier. Un marqueur qui

ii'csr pas dtiniinant rkcssifest par dshut co-dominant. Cn marqueur co-doniiiiant perniet

d 'ohssnn- Iü prcsrncc de plus f u n allde à un locus donne. II est donc possible griçe à

c m proprititC d r ditcrniincir dans une population la proportion d'honiozygutc ci

d ' i i c t ~ r o z ~ y t c . Ces proponions sont imponiintss et nécessaires lorsque I'on w u t

J2icmiiiisr qucllcs sont les forces volu ut ives exerçant leur influence sur une population.

L'utilisation des proiCines dans les annies 1960 n grandement modifié les itudss

dc gcnr'tiyuc des populations. Les protéines ou enzymes sont constituées de chaines

d ' x tdcs ;lrt11nf s cncodis par tes siquencss d'ADN de chaque individu. La gknitiquc

classiq~it. ditErc de 13 génétique rnoliculaire car elle permet la détection de mutants pour

1111 ccirricrtirc donn2. sans que I'on ait aucune notion. u prrori. du mecanisme molkculriire

sous-jriccnt. Par cxcmple. on peut ditecter la présence d'une colonie mutante jaune alors

q i~c I'lilltAc. sauvase cst blanc: à cc stade. i l est absolument impossible de dire i quel

cndroi t dans la nio1t;culc d'.\DX se trouve la mutation. La génétique niolPculairc prockdc

pr;itiquciiicnt i I'in\wsc. c'est-à-dire qu'slle permet de modifier et de manipuler la

~Gqucnce d'un $ne tout cn ignorant sa fonction (Snyder et Charnpnrss. 1997).

Lc pol yniorpliisrne est la présence de di fférences entre des séquences d 'ADN.

Tulis Ics facteurs pouvant causer des modifications au niveau des séquences d'ADN

pcuvcni Ctrç 13 cause de polymorphisme. Ces différences permettent de créer. dans une

populaiion. des yroupes d'individus qui se ressemblent sur le plan génotypique. I I est

donc possible d'utiliser les séquences de protéines ou d'ADN afin d'effectuer des itudes

pli ylogtiriit iques entre les gènes. Ces études utilisent les di fférences entre les séquences

pour &mer la distance cvoliitive entre les taxons. Par exemple. ieandroz et

cullabnrateurs ( 1997) ont Ctudii la variabilité génétique du genre Frn.rintrs (les frênes) au

riil-eau de l 'ADN ribosornique. dans le but de reconstruire la phÿlogénie de ce genre et

J'cn sornprcndre l'histoire bro-siogrriphique.

L'dcctrophorèsc des proriines ne permet cependant pas de détecter toutes Irs

modi tications d u génome car certaines mutations sont silencieuses. c'est-à-dire qu'elles ne

produisent pas de modification de la séquence des acides aminés dans les protéines. Les

I ] ~ c . w L c ' ~ I c ~ des sniyncs de restriction s n tout preniier lieu, et dc la tcchniquc PCR par la

siiitc. noils ont perniis d'uiilissr l'ADN pour divers types d'analyses. Les enzymes de

rcstrirtioii pcrnietteni de couper l'ADN à I'intirieur de sequenccs spkcifiques de 1-6

t1uclCotidt.s gCnEralemcnt. La technique RFLP ( & w i c r ~ ~ t z &ignzetzt ktigth

Po/i.r?rorpirisr~t) (Botstein et al. 1980) fut l'une des premières a erre utilisée et comme son - .

iioni I ' indi y LW. clle cst possible y r k e aux enzymes de restriction. Cette technique .

consistc i dtiçoupsr I'ADN génornique et ;i le faire migrer dans un gel. Les iiagrnents sont

iiinsi stipciris cn fonction de leur prosseUr. Les marqueurs RFLP sont utilisés en

conibinaison avec I'hy bndation Southem (Southem. 1975); i l s'agit d'hybrider un

tirigmnt d'.ADN connu à l'ADN ginornique digéré.

La technique PCR et ses dérivés

Par la suitc. la dticouïenc de la technique PCR (~oiynier~ise ÇIzmir Reuctiort)

[Ssiki ct al. I9Sj) nous a pemiis d'amplifier des millions de fois une séquence d'ADN

(zinc codant ou scqucnccs anonymes) donnée. La technique repose sur la capacitt' d'une

cnzyrnr thsrmostablc (Saiki et al.. 1983). la Tuuy polymérase. à copier un brin d'ADN en

son cornplhent. I l s'agit donc de dénaturer (par chauffage) l'ADN à amplifier. ajouter

Jcs frayiiicnts d'ADN apellés amorces. qui flanquent la région à amplifier en amont et en

aval. Ceux-ci sont hybndés à l'ADN en abaissant la température. et senrent d'amorces a

I'allongcment. de lcurs propres sequences. par ajout de dNTP (disoxyribonucléotide tri-

phosphate). Les amorces allongées par l'enzyme donnent naissance 1 deux nouveau brins

dl.-IDN. Ces trois ;.tapes répétées successivement. une trentaine de fois. mènent à la

synthkse d'un grand nombre de copies du fragment en question. cette réaction étant

csponcntiellc. I l Gut noter qu'il est possible de choisir la séquence des amorces si I'on

veut ampliîïcr dcs régions dtintCr& I I est possible de trouver des séquences spécifiques à

u n organisnic de sonc que I'on puisse détecter sa présence au sein d'un mélange d'ADN.

Lcs banques de données pubiiqurss, tel que GenBank

( !ittp:'. w~~~v.ncb~.nlm.nih.gov!Wcb/Genbank:inde.u.html). permettent maintenant

ii'riccédcr ii un trks grand nombre de sequences chez differents organismes, et même à des

esnomes coniplcts. -

L'dcc2s ;i scs s2quilnces pcmct 1s comparaison dc gènes cntre des millicrs

d ' c s p ~ c c s . Les diff2renct.s observries peuvent étre utilisirs. pour identifier une espèce ou

U I I iii~iit.idu particulier. Les yr'ncs dT.-\DS ribosomiqus (.\niicucci et al. IL19S; Bounou et

, i l . 10W; Hanielin et al.. 1905; Kini et al.. 1999) et le gène 13-tubulins (Royss et Thon.

1 l lL~ l l : O' Donne11 ei al.. 1W3b) ont Gte particulièrement utilisis ii la fois en identification

ci cn phylogtinic.

L a rcchniquc R A P D (Rnmlorn .impli)ed Po!i~twrpliic DiV.4) (Wrlsh ri

\lcClclI~nd. 1990. ii'illiams ci al. 1990) est un dirive de la technique PCR puisqu'elle

t h ~ p p d à l'iitilisation d'une soune amorce (9-10 bases plut& que deux amorces

d ';ipproxiniativcment 20 brises). La séquence aléatoirement choisie de l'amorce s'apparie

i di tkcnts cndroits du ginorne oii se trouvent des skqusnces complémentaires. Puisque

I'liiiiorcc. est courtc. plusieurs rigions d'ADN anonyrncs peuvent Stre amplifiées ;i la fois.

Cct tc rcclinique pcrnict donc unc analyse de type dominant recessif. c'cst-à-dire que l'on

iic p w r Jistiiiguer Ics hi-ttirozy~otrs. Par oppositioii. on dit que l'ancilyse est CO-

~ioniirirititc lorsque ccllc-ci pemct de différencier les individus hétérozygotes des

i ririil icius honiozygotés.

Les minisatellites ci les microsatellites sont de courtes skquenccs d'ADN rcpétées

dans Ic gtinonie. I I est possible d'utiliser les minisatsl~itcs et les microsatellites (Litt ct

Lut) , . IOSO) cvmmc les RAPD: i l s'agit d'utiliser de courtes amorces constituies de

itiociis rkpdks. ex: (GT),:. Unc migration dans un gel de haute resolution permet donc de

dt%mtiiner le nombre de ripétitions dans la séquence. I I est alors possible de détecter la

prtiscncc d'hktérozygotes. Cette technique. comme l'analyse W D , ne requiert pas de

connaissance L I priori sur I t . gi-nome i l'étude. ce gui est un avantage.

La technique SSCP ($ttglc-~trmrd Co>i/or+t~icrtio~i eolimorphism) (Onta. et d l . .

IOSO) pemet l'analyse CO-dominante de fragments PCR. Les produits PCR arnplifi5s

sont J2naturés t.1 placis sur sel d'acrylamide. La vitesse de leur migration dans la matnct.

cst tbnction de leur grosseur et de la conformation qu'ils adoptent. Puisque leur

conforniation est fonction de leur séquence. les fragments de différentes skquences

iiiigrilront j. des vitcsscs diffcrentes. I l sera donc possible d'obscnw deus bandes pour les

iionio~ygotes et quatre pour les hétérozygotes. soit chacun des brins d'ADN pour chacun

des dlt;lcs.

D'ciuires variantes de la rnéihodr. PCR existent. C r lles-ci permettent toutes de

+iic.rc.r iiri ccrtain nombre de fragnents. Lcur utilisation vane rilors en fonction de cc que .

l'on V L > L I ~ t i t r e de ccs tiagmcnts, du nombre Lie fragnicnt nicessaires et du type de

lilignicnts qui nous intkrcsse.

Génétique des populations

L'iin des grands principes i la base de toute la génrtique des populations est le

priiicipc de Hardy-Weinberg. En termes mathématiques. celui-ci implique que les

iiGqiicriccs gknotviques pour un gkne ayant deus alléles soient une fonction binomiale

dc Li ti2qiicncc alléliquc. Le principe de Hardy-Weinberg est particuiikrcrnent utile

piiisqii ' i 1 iitilisc les fie quences allé1 iques et non les fréquences ginotyiques. Le principe

dc Hardy-Weinberg suppose que les gamètes mâles et femelles se rencontrent ei

i'iiriisscnt dc hçon aléatoire pour Cornier un zygote. I l est donc possible de mesurer l'écart

p.ir rapport i I'iquilibre dans le cas où les gamètes mâles et knielles d'une population

ri'oiit pas dcs probabilités aléatoires de se rencontrer: i l s'agit donc d'écart d'héterozygotie.

iclins peuvent etre causés par plusieurs facteurs que l'on appelle forces (.volutives.

Lacs dil'fc;rcntcs forces évolutives sont les suivantes: la consanguinite, les mutations. la

J 2 r i w ~cnCi iquc . le flux génique et la sélection naturelle ( Weaver et Hendrick, 1989).

La consanguinité est la rencontre npn aléatoire de gamètes d'individus

giiic.tiqucm~nt rapprochés. Poussée a l'extrême, la consanguinité est l'autofenilisation.

Dans cc cas. un individu a. la capacité de se ficonder lui-même. ce qui provoque une

~liriiiriutioti de I'héterozyotie au sein de la population. II en résulte des lignées hautement

iii)!iioi> soies. L'inverse peut aussi se produire. Des gamètes d'individus génétiquement

proclics peuw-it avoir moins de chance de se rencontrer que s'ils le faisaient de façon

aiCatuir-c. C'est soiivent Ir. cas dans les populations Iiuniaineç où les nianagcs entre

iridii idiis de ni2nic hniille ne sont pas encouragés.

LCS mut3iions sont à la hssrs du polymorphisme ginétique et leur prisence est

iibsoluriicni nt;cc.ssairr. pour toute étude de genitiqus des populations. Cependant. les

iiiiitarioiis sorit dcç evinernents rares (cependant ce taus n'est pas uniforme dans tout le -

@noriic) ci lcur dfct par génération sera faible sur la fréquence aildique. -4 long tcme

p r ~ m r c . les niutations pourront mener à la Formation de nouveau nllèlcs et avoir un

ct'lci nujcur au nivcau des populations.

La di;riw jénitique peut aussi avoir un effet très important sur les frtiquences

~dldiq~ies dans lcs petites populations. Celle-ci est causCe par l'échantillonnage des alléles

3 clictyur gt;ntiration et pciit mener jusqu'i 13 tisation allélique ou la disparition d'allt;lrs.

D'aillciirs. ics esp6ccs en vois d'estinction constituent un bon exemple de dérive

g2ni.tiquc. Lc goulot d'itranglement causé par une baisse importante de la taille de la

popiiliition peut mcncr i un niveau d'homo~yyotic Clsvi..

Le flux génique est caracténsi par I'cntrie d'un nouvel allèle. en provenance de

I'csririeur. dans une population. L'exemple le plus simple consiste i imaginer une

popdation vivant sur une île et n'ayant Iiiicun contact avec l'extérieur. L'amvcc d'un

nouvcl indi1,idu portant de nouveaux alleles peut changer les fréquences aliiliques de la

population en quelques genérations.

La compréhension des effets de la sélection naturelle est basée sur la

coniprihension dc la notion de "fir~iess". Cdlr-ci peut être expliquée comme un t'acteur

confirant un avantagc ou un désavantage a un génotype particulier. Un a k l e conférant

un dc'sai.mtaye i un individu lorsqu'il est à l'état homozygote tendra a être éliminé. Ce

plic'nom~ne 3 pour effet : de mener ii I'dimination des allèles 'désavantageux'. de

conduire i la tisation alldique et de diminuer la variabilité rénétique dans la population.

On peut donc ciire que la selection naturelle agit contre l'homozygotie et en faveur de

I ' tiktProzygotic.

I l cst donc possible de mesurer les tiéquencrs alldiques et l'hktkrozygotie d'une

popiilatiori aliii d'cstinier quelles sont les principales forces évolutives ayant ou ayant ru

i i i i inipacr sur 13 population. Dc cette faqon i l sera possible de déterminer les

~iriiçiiir;itions i i-lad. 198s) de meme que les patrons de reproduction de I'espice Ctudiér.

Les dit'firtxits principes et tlitiories mentionnes plus haut sont utilisés de façon

roiitirii?rc Jins l'r'tudc de la ;&ni-tiy ue des populations chez di ffkrents organismes.

iris liurir Ics chanipignons patho$ncs des arbres. Les travaux de Horbrrg et al. ( 1995 ) sur

I . ~ ) r ? ! i i ~ p s i s p i t 1 1 d u (Swruiz :Fr.) Krirsi permirent, ~ r i c e 3 I'utilisation dcs RAPD.

~i ' t3; i luc.r 13 prkscncc de t lus senique existant entre des populations fongiques de

I ~ i i i l m & ct de Sut;&. Cne autrc ;itudc plus ricente du meme auteur (Hogberg ci al. 1999)

.i pc'niiis Jc. rcnixqucr i'nbscncc dc diffërenciation entre des populations de F. pirricokr

scpu-i'cs $O-raphiqucrnent par unc trc's grande distance. Trois sous-populatic'ns faisaient

p m c dc cetic citude; une en Lithuanie. une seconde en Russie et une troisiéme en Suède.

ILS ~nalyscs si-nctiqucs hrent effcctui-es sur ces sous-populations à partir de matériel

t i . ipl~ïd~ issu de carpophore. Toutes Ics sous-populations de mime quc la population

!oili lc s'a\.tirc'rc.nt Ptrc en équilibre avec les fréquences de Hardy - Weinberg attendues.

Or1 ne peur passer sous silence Ics travaux de Smith et ai. (1992) qui, i l'aide de

riiiiryucurs R.-\PD et WLP. évaluèrent i 1500 ans l'âge d'un genet d' ArniiZl<rriu htrlbosa

i Rxla i Ki lc et LVlitling. pesant selon leurs estimations plus de 10 000 kg.

a

Lcs ditfkrcntcs techniques molt.culaires mentionnées plus haut peuvent être

iirilistks pour une variété d'autres applications. Ces techniques peuvent, entre autres,

ptnmm-c dc dktscter la présence d'sspkces hybrides (Dawson et al.. 1996). de détecter la

pr?scricc dc vinis chez des souches de champignons (Hong et al.. 1999) ou Stre utilisées

LCS 111t3I1oCltls nlolCculaires perniettcnt d'Studicr 1c.s organismes ct d'obtenir une

t i ~ l c dc retmignsnients qu'il serait parfois impossible d'obtenir a l'aide de méthodes

corn criiioriiit'I1t's. Lkbjclctif de cette étude cst donc d'utiliser les techniques reccrnment

dc\cluppir 's cn biologie moléculaire sur Ic plan de la détection de mutations et de

1 '~na l )sc dc s iq~imcc nuclCotidiqucs afin d'açcroim les connaissances que nous avons

sur lcs populations cit. I'cspcce I. rontenrosiu et sur [es relations piiylogéntitiques entre les

di t't2rcntr.s cspC.ccs plithogines au sein du genre horiorils.

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pol ymorphisms ampl t fied by arbi trac- pnmers are useful as genetic rnarkers. Nucleic

ricid research. 1 S: 65: i -6535

CHAPITRE 2

( ' c ilicipitrc est rtiiligi en anglais. I I sera L-vrnturllement soumis i une revue scientifique.

Diagnostic PCR assay for t he identification of lnonotus fomentosus from cultures

or fruit body.

Hugo ijcrmainl. Gaston ~ a f l a m r n e ' , Louis ~rmier ' , Richard C. ~arne l in '

1 i b r i i r a l Rc.ssources Canada. Canadian Forest Ssn.içc. Laurentian Forestry Centre.

1055 du P.E.P.S.. Sainte-Foy. Quibec. Canada. G IL* 4C7: 2 ) Centre de recherche en

hioiogic hresti;lre. Cnivcrsiti Lavai. Citi universitaire. Quebec. Canada, G 1 K 7P-L.

Summary

Spcc 1 tic PCR primers wcrç developed for the intemal transcnbed spacçr (ITS) region of

itic ri1S.A gcnc of Iriotroti<s tonrrtitoszrs. the causai agent of the tomeniosus root rot of

itjriit.~rs. PCR amplification was carricd out successfully from DNA cxtracted from fruit

hodv or culrures. No cross-rciiction was obsewed with DNA of several other species of

ilic same p u s . with Phellirtus ptttt or with white spmce (Picea glatrco). The primers

w r c dcsignrd io di fferentiate I. tonreniostls from Inotioizis leporinus. which is

iii~~rphulogically identical in culture and Phelliriiis pitrr S. lum. which is very sirnilar.

Ph! logcrictiî analysis of the ITS region for ~ i s specirs of Irionotz<s suggests that

di ~,crscnt spccics rcquirinç di fferent scological niches evolved Ji fferently. It appean that

~ii~.crgcnt cvolution of an ancrstor inkcting different scological niches ied to a speciation

pmccss. \\.hich conferred specificity to either conifcrous or deciduous species.

Developpemsnt d'amorces diagnostiques pour I'iden tification de I'lnonotus

tomenlosus à partir de cultures ou de carpophore.

Résumé

Dcs iiiriorccs PCR spécifiques ont i té développées pour la rkgion ITS ( ~ m m d

~~.: i t , .~~, , . ihr~d sp ico - ) de l'.ADN nbosomique de 1'0ro)zotris ronretztosiis. l'agent causal di: la

csric rousc rilvt'olairc du pied chez les coniferes. L'amplification PCR est possible i

prinir ci'.-\DY extrait de cultures ou de carpophores. .Aucune réaction croiste n'a i t t ;

~ h s ~ r v c c conrrc d'îutrts sspkccs du mcme genre et contre P h d h i t s prrii ou i't'pinetts

blanc hc ( PKLU girrltcc~ ). Les amorces ont itrit mises au point pour distinguer I. tonzeritosirs

tic / I,;r>o)-i~~iis ct dr: P. prnr qu i sont très semblables en culture. Cnc analyse

pli! loyi;tictiqur. des sc'quencrs ITS indique une évolution divergente cntrc les c.spt;ces

ii;ii iscint dcs nichcs 6coloyiques di fférentes.

Introduction

The piithoycnic Fungus Irzo~or~ls rotwirtosirs (Fr.) Teng infects sevrral 'iortli

-\mcricciri conifcrous species (Whitney. 1977). Tlir root aiid butt rot caused by ttiis

tüt iys is responsibls for major sconomic losses. paniculariy in white spnicr stands. The

s! riiploriis rcsultins from an infection of I. [onierirosrrs are very sirnilar to those cciused by

! !L'POJ-IIIIIS ( Fr) Gilbertson and Pllriiirilts prrii ( Brot. :Fr.) .A. Xrnt-s, other pathogsnic

i i in r i that cciust. root rot disease to white spnice. Growing the hngi in pure culture docs

riot hcilitats identification since I. tottientoscts and I. leporirztrs are indistinguishable from

cadi othcr in culture (Whitney and Bohaychuk. 1977). I. romentosus and P. pini arc also

.ilriiost idmticcil in culturt.: howevrr. P. pi,,, sometimes produces chlarnydospore-like

jtructiircs in culture. ~ n d has thicker setal-like hyphae (Nobles. 195s). Differential culture

nicdiii <Hunt . 1097). polyclonal antibodies (Hunt. 10W) or protcin slectroplioresis (Hunt.

! W O ) do not rtllo\v clcar idcntitication and diffcrcnt~iitton o i I. ronieritosrts and I.

I ~ ~ p o r i ~ i r i s . Thc cstcnsivc damage caused by /. roniertrosirs justifies the development of a

rcliriblc. cspedicrit and user friendly diagnostic test.

The polymçrase chain rcaction (PCR) (Saiki and al.. 19S5) and analysis of

rmdorti mpliiied polymorphic DNA (RAPD) (Willianis and al.. 1990). which have been

i i sd cstcnsivcly in DNA identification. offers tlic opponunity to selectively arnplily

DY:\ iiorn an oryanism. The interna1 tnnscrïbed spacer region (ITS) is in the ribosomal

D L \ genes. I t is located on each side of the highly conserved 5.8s region between the

i ivo Iaqc nuclcar ribosornal subunits. The ITS region shows a high level of intersprcific

pulyriiorphisrn and miiltiple copies are present in the cells making it amplifiable [rom

riiiriute iirnounts ofD'i.L\ (Gardes and Bruns. 1993). Thesr features make the iTS region a a

g u d candidats for designing specific primer pairs. ILS regions have been used

c\[cnsively in identification of Forest fungi (Kim and al.. 1999), pathogens of crops

i Rounou and al.. 1999). edible mushrooms (Amicucci and al.. 199s) and for phylosenetic

xidysis ( Rous and al.. 1999).

Tlic objcstivcs of thc prsscnt study were to : 1) drvelop a set of PCR pri~icrs

ipccilic t i , the ITS region of I. rotmtirostc and 2 ) study the phylogenetic relationships

miong scwrd specics of ttic gcnus I~iotiorlrs to determine if the morphological similiirity

bci~rccn I. ro»retztosl<s and I. leporiti~ts is retlscied at the rnolecular 1wr.l.

Ma terials and methods

Biologiciil riiaterid

Tlic toiloti iris q m 5 t . s were uscd: 1. ~ O I ? ~ L ' ~ Z I O S I I S . I. ieporitii~s. I. C I ~ I I C I ~ U I - z s ( Bull. :Fr.) P.

Kiirsl. 1. ~ I O I ~ I ~ ~ - L I I ~ I S (P.K.) Murr., I. r d i m t s (Sowrby : Fries ) Karsten and I. rliedes

( P m . 1 Bond and Sifiger. Two strains of I. tottietzrosiis rvcre used : one originated from a

t n i i t bud) collected in a white sprucs plantation of western Quebec. whcreas the second

onc \vas a pure culturc from Bntish Columbia (culture : 05-10-07. B.C.. Canada). Al1

niaterid t i sd LUS diploid. The strain uscd, the main host on which the basidiocarp can

ibund aici thc GcnBank accession number arc found in table 1 for cach specic used.

D A isolation

DL\ \vas atracted directly liom fruit body tissue or mycelium using a modified version

oi'tlic nicthod dcscribed by Zolan and Pukkila ( 1986). Approxiniatcly 5 mg of fruit body

tissue N ris trikcn froni the sporocarp using a scalpel and piaced in a 1.5 ml Eppendorf

~ 1 . For niycdiiim. 3 w e k old cultures w r e filtered on a double laycr of Whatman 2

tiltcr pciper which had prcviously bcen rinsed twice with distillcd watrr. and placed in

I .S ml Eppendorf vial. Approximatcly the same quantity of diatoniaceous eanh (Sigma

Clicmicd Co.. St-Louis. MO. US.) and 100 ul of extraction buffer (100 miM Tris-HCI

pH '1.5. 2" ,, CT.-\B. 1.4 hl NaCl. I % polycrhylene glycol 6000. 20 miM EDTA and 0.25%

I)-2-niercaptorthanol) w r e added and the mixture was ground for 3 minutes using

disposab l c Kontes pes t le ( V WR-Canlab. Toronto. ON. Canada). Three hundred pl of

extraction but'fcr \vas added and the tubes were incubated at 65 'C for one hour. Samples

~ e r c é ~ ~ r x t c l f using 490 pl phenol:chlorofom:isoarnyl alcohol (25:Z-k l ) , vorteseci and

sentntiigcd at I 0 000 S J for O minutes. The upper phase was transferred in a l .j ml

Eppcndort't-ial and DNA was precipitated using 7.5 M amonium acetate and 600 i l cold

'PabIctiu 2: Strain identification, Genbank accession number and host for each

spccie uscd.

Spccic 1 Strain Host on \\.hich i t w;is round. GenBank acc.7 ;

. - 1 1 - t s QB - S c .-lccr sp. AFZ4796S

ir crc dao ps rhn i id uaing universal primcrs ITS-I F and ITS-4 to escludc amplification

t>ilurc duc to poor DS.\ quality.

Data analysis

Phylogcneric analysis \vas used to drterminr if rnolecuiar data would support ihr

niorpliologiçd triformation indicatinj iliat I ronre~irosits and /. Irpor~rrrix arc closely

r-ci~iicd. --\ pl~cnogrini u ~ s infered uith P h U P ( LVisconsin Package Version 10.0, Genrtic

(3iiputr.r Group i GCG). Madison. W. C7.S.1 using maximum parsiniony analysis and

h r m ç h siippon ucis calculated using a bootstrap (500) method. P. p r ~ Kas used as an

ouigoup to provide rooting of the trce. Sequences were manually edited and îlignrd

usin2 CliistalW I S . This alignment \vas use therealter to design the pnmers specific to I

r t ~ m ~ ~ i t o s i ~ ~ ancf to d r w t ht. phenogram.

Results

l'lic D S A cstraction protocol. describcd by Zolan and Pukkila. u s successful for

al1 species anri tissues uscd in this study.

D M ampli tications using the universal primers (ITS-1 F. ITS-4). werc successful

ibr the D N A cstractcd Iiom the fruit body or cultures and resulted in o PCR produci of

approsini;itcly SOO bp. Lcngth polyrnorphism c m be observed in figure 1 between the

di ifkrcnt spccics of lrrotroiils ampli fied th the universal primers. These pnmers were

icstcd rigainst 10 pure cultures from diffcrent locations in Canada and in the CS.

(Rcntmccster. R.. CS. Depanement of .Agriculture. Forest Service. WI. U.S.). .Al1

speci niens. cul turcs or carpophores. previously identified as I. tonzeiz~oszls. tested positive a

(tlihlc 1). fdsc ricgative were not obscwed. The ampiification with the universal primer

rcsiiltcd in iiniplification of a PCR product for nll the species used in this study.

Elcctrophorcsis of the PCR products jenerated with specific ptimen (it-ITS-209-

i: it-LTS-NO-rc) revealed a 491 bp aniplification product for the two strains of I.

roi~iC~irosiis and no xnplification product for any of the other species (figure 1) . This

ri.;iiIi indicares lhat this protocol can bc used to idcntiQ specirnens from fmit body.

inLiking the tiriir consiinitnp step. oE gro~vin= the fungus on a petri dish unnscessary.

Thc phcnvgrrim inkred from the ahgrnent indicates that I. ronitJ~~roszts and I.

iqwr!triw arc hoth on a branch strongly supportcd by the bootstrap value. and cipan froni

al! uiiicr spcocs. Trçc lcngth and consistrncy indices arcre 115 and O . S l j S . respectively

f i g ~ ~ r c : 21.

I X ~ l e a u 3: Reference number and origin of the isolates tested rvith it-ITS-209-f and

i t - t TS-700-rc

1 I jud- 1 5 56 1 Ontario i Bud- 1-03 -.A I Ontario j Llii~t- 1 S4S 1 Ontario

~ i rp- I O ~ C I : 1 - j p I Ontario 1 197 f ] Picert glnucn 1 - 1 i ~ p - 1 0 ~ 1 ~ 1 -.r I Ontario I 1971 1 ~ t c d t t giurrcer 1 - f

194s

194s 194s

!FI)- lOOiS5-Sp 1 Saskatchewan Il:['- 1 (j#l&Sp

I

I Ontario r [-.p- 1 11o11y-s~ I Ontario

t

i Fr!)- 1024 1'1 1 New York 1 I990 [ Pinris strohlrs 1 1

i I96S 1 PICLYJ ~ I ~ I I I C L I 1 -

; l..p- 1 ( }002S-T t ! i z [ ' - ; 1 W 2 9 - s ~

I Pic~.a tmtrturru PI ceci gl~l i ~ i t

.-î hrcs hcilsiuntu

197 1 1971

197 1

197 1 197 1

Ontario Ontario

- - -

1

FP- 1 0 0 ~ ) - r I Ontario

-

1 [ . t h ) - 1 ? - S t l - ( h i Pensylvaiiia 1 193 1 ' Plnirs rigrtkt 1 -

Prceu yl~zrlccr -

; I L - ~ I W 1

! i r - Q ~ ~ h t . c - W

Piceu y liz uclt Prcve<i gkzucn P~CCCLZ gloucu Picca E T ~ I I I C L I

r ; \ t . i~i -549- r i SIinnesota 1'2-2-R ! Ont3rio

; l)-?-i< 1 Ontario

- - - -

1923 1968

i 063

P I C ~ ~ I niaricrrrct P I C ~ gluuc<j PICL'CI Y ~ ~ ~ U C L I

Quebec Quebec

s t 1 - ~ 5 - 0 - I Onmrio / F!)OOOS? -5p Colorado

.. - -

' l 1 1 -W l Que bec 1 \f:-W 1 I Qucbec i

1969 1945

-

- ,

1999 1999

/ \ 1 ~ - 9 9 : \1-!-00

- ..

Picélu yIuuca Picca glultca

i 999

1999

Qucbec Qusbec

P m i s ~~~~~~~~r Picctj mgdtnntrrr

PICLJU ~ ~ i u ~ ~ c i t Picru gierttc<r

- -

4

1999 1999

Plcrn giuitctt 1 - Prcen gltrrica 1 -

Figure 1 : .Amplification product obtained with the specific primers ITS-209VITS-

700-rc and with ITS-l f/ ITS4 (universal)

1 .mes 1. I 1. Gibco Brl 100 pb DNA ladder. Lanes 2- 10 show amplification with speci fîc 9

pririicrs. Lanes 12-20 show amplification with universal primers. Each lane contained

DY.-! tioni: llrnes 2. 12 I. iornentostis (culture. 05-10-07. BC): lane 3. 13 rornertiostts

i iriii t ho& Oc): lans 4. 14 I. feponti~~s; lanc 5. 15 I. cuticdrrris: lane 6. 16 1.

.;rhtmv-,irics: lanc 7 . 1 7 I- rcrdiattis;, lane S, 1 Y I. rlreacft?: . lane 9. 1 9 Phellinrts pini;. Ime

l i 1 . 3 1 tiegtive control.

Figure ? : Phylogenetic relationship among the genus honotus using Plreiiiitr<spitri

as a outgroup

.A rootcd irce using niasimum parsimon? analys14 of [TS 1. 5,s S and ITS 2 DN.4

scquenccs rcveded that 105 characiers werr parsimony-in formative. Branch lengths were

drriu n proportional to the number of changes. Buotstrap values are indicated on branches.

Thc Hornop llisy index = 0.1542

Deciduous spec1t.s

Outgroup

Discussion

Tlic root rot caused by I. ro/~lerirosiu is arnong the most important root rot that

aitkct soniferous specics of the nonhem hemisphere. The symptonis caused by the

iiingus are not spccific to tliis fungus. rherefore these cannot bc usrd to diagnose a i.

iot,~~~utoslrs inlecrion. The srvual stage of the fungus, whrn the fmit body is produce. can

providc niatcrial for identification of the fungus but i t is very sphemeral, and nevcr occur

;it clic sanie tirne froni one year to anothcr and may not occur at all. III rlitro cultures of the

!unyiis arc r.stri.rncly siniilar to other root rot pathogcns cultures making identification

tloni crilturcs vttw difficult. For these reasons, a rnolecular technique was used to help

i d s n t i i y n g ;l f u n y that is vcry hard to idcntify using traditional methoci.

Thc PCR cxperimcnt revcalcd ttiat the set of primers dcsigned for 1. ronrurrosrrs

1s spccitic to ihis species. Arnplitication was positive for I. rorwiroscu h m the

pro\.inces ot' Bntish Columbia and Qucbec. This indicates thnt both cultured tissue or

tn i i r body tissue from different o n ~ i n s a n be arnplified using these prirners. No cross-

rcxtion \\-as obscrvcd usinr this PCR reaction with any of the other species of Inortotiis.

or tvitli P. pltrr. or their host. Piceci gluiiccr wood samples (data not shown). Positive

control tcst with universal ITS allowcd the exclusion of PCR hilure due to poor DNA.

The pliylogrnetic trcr slaborated is well supportcd by ecological data.

Pliylogcnctic annlysis indicated the presence of two different groups within the genus

i l l f ~ i i ~ . . ro~?letitosirs and I leporiuirs make one clade. which is supported by a

hootstrap \.;ilus of 100. and the other is composrd of 1. rudiunis. I. gfonzerci~irs. 1. rhendes

cind I c.irriczliu>-rs. All these species have the ability to cause white roi decay, which is a

chiirilc~crized by a degradation of the lignin of the tree. Ecological data and

niurpiiologicril criteria aiso support the fact that forneriroszis and I. leporims are

scparated liom al1 other taxa within this genus: both are pathogenic funsi of coniferous

spccics a.ticrcas dl four other specics are associated io deciduous tree species (Gilbertson

and R>rvarden. 1'336). Even thougti the? share a common ancestor with the other species.

1. roi~riror~is and 1. leporinus cvol~xd differently. This enablçd them to occupy 3

JilTcrciit ccoloijcül niche. 1. t-ii&irirs is also ecologically riiffercnt from al1 othcr taxa

iricliidsd n.ithin this cinalysis. It is the only truly saprophytic fungus of deciduous trees. I t

w I I m a c k trscs only when the tissue is dead. and will oftrn colonise wood \\.hm

rlccriidliiion is already w l l undenva? (Gilbsnson and Ryvarden. 1986). Its main role is

io r c q clc woody material of deciduous trres like birches and sldçrs. The ottier three

jpccics u.itliin rh i s cl;ide. I- glonrrturrrs. I t-izedrs. and I. ctrticirlru-is cause heanwood .

dcca!- of dsciduous trecs and cause progressive elimination of old trecs (Boulet. 1995).

Of those itircr decciy fungi, I. gloniemtw is the most agyressive. particulxly on maple

aiid bcccii. I cilricitlm-is is an opponunist decay fungus of living hardwood. rnainl y elms.

\vlic.rcas I . )-lz~udcs is panicularly aygressivr on asprns. The sporocarps o l I t-lieudes

Iiaw (i granular core \vit11 highly branched hyphae (sclerids). This. however. is not

piirrailcicd by diSferrncrs in the molecular sequences analyzed in Our study. This

chciracicristic is not ençountered in other sprcies of this renrra. Based on morpholopical

widciicc. this fiingus is sometimes classified in a different sub-genus (Dai et al.. 1997).

Tlic grotiping of I. cl<riculat-is and I. rlrccides could be the only arnbipuity between

c c o l o $ d and ntolecular data of this phylogenetic tres. The analysis olanothcr locus or

ihc an;ilysis of a different character could help in resolving this ambiguity.

I'lic jpccitic primers devcloped in this study will allow reliable. sensitive and

cspcdicni identification of I. tonie>itosus cultures or fruit bodies. This rnolecular

idctiti ticaiion process ( DNA extraction. amplification and revelation ) can be completed

wit t i in 1 days. It leads to unarnbi~uous results and provides a valuable identification test

for phyropathologists. The phylogenetic results indicate that the genus Inonofus is

iiioriupti~~lr.tiç. Ecological niches appear to have played a major role in the speciation and

c\.olution proccss of these fungi. Evolutioo of a? ancestor inrecting different ecological

niclics appcars to have led to a speciation process. which conferred specificity to either

corii t-crocs or deciduous species.

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CHAPITRE 3

Cc cliiipiw cst rr'digk en anylais. Il sera éventuellement soumis it iinc revue scientifique.

Genetic variation in lnonotus tomentosus within a white spruce plantation reveals

irregular allelic composition for mitochondrial and nuclear genes.

. 1 IHu-o Gcni~iiin . Gaston ~atlarnrne', Louis ~ernier', Richard C. ~a rne l i n ' .

Slir~irul Rcsuurctx Canada. Canadian Forest Service. Laurentian F o r e s e Centre. 1 055 du

P.E.P.S. . Sainte-Foy. Québec GlV 4C7. Canada: 2) Centre de rechcrchc en biologie

ti~rcstic'rc. Cni\,crsitG Laval. Saintc-Foy. Québec. G 1 K 7P1. Canada.

Abstract

Thc gcnctic diversity of the forest pathogen Itrorrottcs ronzetttosus was rvaluated

i o r ttircc coding genes; the large and small mitochondrial ribosomal subunit and the P- iiibulin ycnc. DY.-\ was estractcd direcrly from 315 carpophores taken from a white

spnicc (PicLw giiritcci) stand and the position of each carpophores \vas plotted on a map

iising .-\rçVicn. Wc used SSCP (single-strand conformation polymorphism) analysis to

citiributc allclcs to eacti carpophore and the rnap was redrawn with the jenotypes of each

carpophores and their position. The P-tubulin genr showed a high level of polymorphism

cornparcd wtti iIic niitochondrial genes. The objective of this study was to perform an

Lwtoçorrs!ntiori rin;ilysis in order to determine the pathway of propagation of this fungus.

r\briormlilit). in the allelic composition at the P-tubulin loci did not allow this type of

mrilysis. .-4lthough auto-correlation analysis could not be perfomcd. visual inspection of

ihe üllelic Jistribution tvithin the plantation does suggest clonal propagation of the fungi.

L'étude de la variation génétique chez lnonotus tomentosus dans une plantation

d'épinette blanche indique une composition allélique anormale chez des gènes

nucléaires et mitochondriaux.

Résumé

L a clivcrsitti senétique du champignon pathogène des soniferrs honorlrs

ioi~izrrloszts 3 c'te C\.aluCr pour trois gèncs codsnts. la petite et la gosse sous-unité

rihosoniiquc rnitochondriale et le @ne P-tubuline. L 'ADN fut extrait directement à partir

dc 3 1 S carpophores rccoltés dans une plantation d'épinettes blanches (Piceci y h t c u ) . La

position dc çIi;tcun des carpophores a eté notes et ceux-ci ont Cté placés sur une carte à

1';iidc du logici4 .r\rcVit.w. La technique SSCP a été utilisée pour I'identification des

~ l l c ' l c s de cliacun des carpophores et la localisation de chacun des génotypes est

rcpcrtoric'c. sur 13. c91-t~. Le gène P-tubuiinc a montré un niveau de polymorphisme ileve

dors que lcs 2 $ncs rnirochondriauv utilisis ont montré un faible niveau de

polymorphisme. L'objectif de cette étude était d'effectuer une analyse d'autocorrélation

spritiale pcrmcttant de déterminer le mode de propaqtion du champignon. Cependant la

priscncc d'anormalitCs dans la composition allélique au locus P-tubuline n'a pas permis

dc rrialiscr cette analyse. Bien que cette dernière n'ait pas été effectuée. l'inspection

~ . i s u c l l c du patron de distribution des penoiypes dans la plantation semble indiquer un

mode de propay ntion clonal.

Introduction

Fungal iorest pathogens are irnponnnt components of forest ccosystenis. Forest

p;it t io~u~s. siidi 3s Hrterohosiciion mtiosiou (Fr. :Fr) Bref. and .-lruziilumi spp. and

/.rot?r~vrcos~s ( F r . ) Teng. c m cause severe disturbances that affect ceveral parameters in

rhc toresr siicli as spccies diversitics and forest yield. Other wood decay funyi play a

bcneticid rolc ol' recyciing.

1. ro~~~e~rtosirs is a basidiomycete which causes root-rot disease. In Nonh ;\mericri.

i t is capciblc df i n tècting a wide variety of conikrous specics. but important dama, ucs arc

riiostly rcponcd on the senus Picea (Whitney. 1977). Since th<: prcsencc of fniitiny

tidics 1s oticn cplicrncral and syniptoms crin be very ambiguous. or confused with abiotic

stress. discrise incidence and severity are often evaluated only once the disease is well

cstsblislicd or uhsn trees are harvested. This is panicalarly important Cor a trec crop that

rcquires at l e s t 5 0 y e m until rnaturity. Knowiedge of the presence of an inrestation

ioçiis in a plantation bcfore or at the beginning of the plantation could provide betier

sill-ici~lttiral çontrol of this disease. in particular if spatial infonnation on the presence of

tIic pathogcn 1s availablc. Sincc spmcr and othrr conifers are favored species t'or

rciorcstarion in Canada and othrr countries of the northern hrmisphere. incidence of this

discrisr. could increase significantly in the future.

Cnderstanding the undrrlying rnechanism of dispersal o f this fungus may provide

important inforniation in controiling the propagation of the disease. One of the main

questions ttiat 1s iinanswered is whether or not'sites are already pre-colonized by the

Îung~is. or u-hcther the fungus invades a site Following reforestation with the susceptible

host-spccies. In the former case. a desirable control strategy would consist oldetermining

nliether sites arc considered infcsted or not and if so. to plant tree species that are less

siiscr.ptible. In ttis latter case, since the site as such is not infested. control methods wodd

hwe ro relu upon silvicultural approaches.

SOIIK O( the bsst studied b ; l s i i o n c t s are root rot fun$ such as .-Irrrtilhi~r spp.

aiJ / l L ~ r ~ * ~ ~ o / ~ ~ ~ s ~ ~ i i o r 1 ~ I ~ I ~ o s ~ . Colonisation of sites by different individuals followed by

j ~ \ l ~ ; t l and iisesual reproduction l a d s to thc forniarion of gmcts. Thrse senets mnsd in

iizc koni ii icw centimetres in Locccruru s p p (Gherbi et al.. 1999) to several kilornetres in

. - l r id i~ imr golleo (Smith et al.. 1992) to. The s i x and spatial distribution of these genrts

c m dcpeiid on the dispersal pattern of thc fun jus and the tirne since establishment on the -

site Eacti p i e t is potrntially genetically different and could react differently with its

ciiuronnwr:t or have dilferent virulence or host adaptation ctiaracteristics. In an c.xtrcme

:SC whcrc ;i massive new invasion took place rccrntly via basidiospore germination. one

w u l d c\pcct to îïnd a large numbcr of small geneticülly different gcnets. In the case of

ai old inicstation. one would expect lower numbers of lar_oe genets.

Tiic study of the relationship betwcen genctic vanability and physical distance O C

~ I I C S C gcncts n u y be vev inforniativc to determine the genetic sinicture and (Garbolrtto

ci :il . I OW) thc dispersal pattern of a panicullir fungus ( Lewis et Hansen. 199 1). Auto-

corrclation nnalysis. which allows to establish the relationship between the genetic

disicincc and the physical distance between individuals. is vcry useful to determine the

dispcrsnl pattern (Gherbi et al.. 1999). Genet clusterin% or random dispersai of the p e t s

\vittiin (t stcirid rnay indicatr clonai or sporal distribution rcspectively.

Ft.w studies have addressed these issues in I. tonwrttosrn. In one study in western

Snnli :\rncnca. protein profiles were studied in populations of 1. tontentoszcs. The large

ii~i.i.rsity of the profiles was interpretcd to be an indication that basidiospores played an

irnponcini role in site invasion in this fungus (Lewis et Hansen. 1991). However. the

spatial p3ttc.m was not cleariy established and thy genetic hcntability and repetability of

protriin profiles is difficult to establish.

The goal of this study was to investigate the spatial genetic diversity of 1.

!oi>izirtosrrs in a white spnicc plantation. In order to euluate genetic polymorphism

wttiin the population. DNA sequence polyrnorphisms were assayed using PCR

(polymerase c h a i reaction) of one nuclear (P-tubulin) and two mitochondrial genes. the

ni!~oçiiondrial ribosoiiial small sub-unit ( M S ) and the niitociiondrial large ribosonial sub-

iinit. Population ssqurncr polymorphisrns were detcrmined by SSCP (single-strand

con forniaiion polpmorphisrn), followiny by systernatic sequrncing o l the most largrly

rc.prcscntcd allclcs . The analysis of SSCP is a very sensitive method based on singlc

jtriiiid confoniiation (Oritci et al.. 19St)). This technique allows the detrction of point

mutations alid [lie codominant analysis of molscuiar markers. The use of this detedon

iiicrtiod ~ i l o w s scarching polymorphism in coding gencs. which is niuch less frequent

tlim pol!morphisrn in non-coding seyuences (Hanl. 1988). Thrre coding gcnss were

iound to bc polymorphic. Two of these three senr are mitochondnal. one is nuclcar.

Jl i t~~hcindrial gcnss are always found in the haploid state in fungi since the mitochondria

.ire iissunid to be transmitted by only one parent. This characteristic resuits in the fact

ttiiit ; i l1 individual appciirs to b r homozygous at al1 mitochondrial loci. Thus. the use of a

niiclcar mrirkcr lvas justifièd since it aIlowed the detection o r individuals in the

t i e tc t ro /~~~ous stats. and would complernent the information obtained with the

rnitoctiondrial markers.

Materials and methods

Fruiting bodics of l ronzetirosics were collected from the gound of a 40 years old

ivhite spruce (P. yluiicci) plantation ai the faIl of 1997. This stand is located in

Hrirrington. which is aprrosimately 150 km North-West of Montreal. Qc. Canada. The

sitc \vas convened from a mixea furest to a white spnice plantation. The stand was

di\.idc.d in 14 sections and fmiting bodies wrre sarnpled in each section. Fmitinj bodies

wcre indi~.idiially packed in paper bags and the X, Y coordinates of each fmiting body

w r c notcd ai the nearest meter. These coordinat& wrre plottrd on a map using ArcView

3.1. ( ES RI. Rrdlands. CA. US.). .A second sampling of 45 inviduals was done in the fail

of 19ClS; h i t i n g bodies w r e taken froni the infection centres localised in 1997. Fruit

bodics ircrc k p t in their hags ai air tcniperature during transportation. They were stored

indi~.iJually ai -70°C in brown paper bass. In 1997, 315 fmitins bodies were analysed

and JO n.t.rc analysed in 1999.

D\ :\ ~ ~ 3 . 5 cstracted directly from thiting body tissue usiny a niodi fied version of

.i prciicicol describcd by Zolan and Pukkila ( 1486). Approsirnately 5 mg of tissue was

rakcn iioiti elicii carpophore using a scalpel and placed in a I . h l Eppendorf vial.

.+\pprosiiiicitc.ly thc same quantity of diatoniaceous rarth (Sigma Chcmical Co.. St-Louis.

MO. C.S.) 2nd 100 pl o f extraction buffcr (100 rnM Tris-HCI pH 9.5. 7% CTAB. 1.4 M

h C I . 1% pdycthylene glycol 6000, 20 rnM EDTA and 0. 25 ?/n P-2-rnrrcaptorthanoi)

w r c iiddsd and the mixture was ground for 3 minutes using disposable Kontcs pestlcs

il 'KU-Canlsib. Toronto, ON. Canada). Thrce hundred microliters o r cstrriction buffer

u s sddcd 2nd itis tubes uére incubated at 65 'C for I h. Samplcs wcre cstracted using

-i( H )pl ptisliol: cliloroforni: isoamyl alcohol ( 2 j : X 1 ). vonexcd and centnfuged at 10 O00

S 2 tbr 10 niinutes. The upper phase was transtked in 3 1 .j ml Eppsndorf viai and DNA

1x1s prccipiriiied using 7.5 M ammonium acetatc and 600 ul cold isopropanol and placed

at -20°C for I h. DNA was pelleted by centrifugation at 10 000 S y for 10 min and was

i t d i c d t\.rth S I 0 L L I 70% ethanol. Pellet ivas dried in a Spoed-vac for 10 min and

rcsuspcndcd in 31 ul Tris-EDTA pH S ( 10 mhl Tris-HCI, pHS. 1 rnM EDTA). Result of

DN.4 cstrcicticln \vas verified through migration in 0.8% agarose gel. DKA w ï s diluted

I :!O ancf storeci rtt - L O T

PCR pririiers

Tlic PCR products generated using a senes of PCR primers were screened for

SSCP polyniorpliism. The first set of PCR primers found suitable for the analysis was

11 L Y ( CTCGGCAMTTATCCTC.AT.\.AG) and M L 6

i C.-\GT--\G.A.-\(;CTGCC.I\TT4GGGTC) (White and al.. 1990) coding for the large

niiiochorrdriril ribosomal sub-unit. The second set of prirncr rvas MS 1

( C.4GCAGTC.-\.-\G.A,.ITATT.AGTCA.ATG) and hl S Z (GCGG.4TTATCG44A-

TTX.4.4TA.K) ( White and al., 1990) coding for the small mitochondrial ribosornal sub-

unit. The third set of pnmen. it-BT-l j-f (GGAGCCAGCAGTACCGTG) and it-BT-490-

rc (CCTG;\.-\GT.ATGCGTTAGC) i\ as dcsigned froni P-tubulin szquenczs obtainsd from

m p l i tication and sequencing with universril pnmers BT- 1 a

(TTCC'CCCGTCTCC.KTTCTTCATG) and BT- 1 b

i G.ACG.AG.ATCGTTC.ATGTTGA..i\CTC) (Glass and Donaldson, 1995). The

iticniioc~cling conditions for pnmers MLj1ML6. and .LlSl!MS2 were: 36 cycles of 30

';CC 21 97'C. 30 scc at 5j°C. 1 min at '2°C; the reriction uas preceded by a 3 min -

~ii.ii;iruriirioii itcp at 9J'C and followrd by a 10 min slongation stsp at the end. .Annzaling

icriipr'r;lriirc \vas adj usted at 50°C for primers it-BT- 1 5 fiit-BT-49Orc and BT- 1 ai BT- l b.

.-\niph iiciition products neere separated on an agarose gel ( 1 .Y%) in I X TAE (TRIS

tccratc-EDT.4). stainsd in ethidium brornide and visualised under an CV lamp.

DS:\ cinipli fications and preparation of samples for SSCP analysis

D U was amplifird in 3 25 pl volume containmg I O mM Tns-HCl. 50 mM KCI.

1 .i r t i l l llgCIi: pH 8.3. 50 pM of each dNTPs (d.\TP. dCTP. dTTp. dGTP). 1 uM of

c;icti priniers and 1 L of Tcq polymcrase (Boehnnler Gmbh. Manheirn. Grrmany). Five

pl ai' PCR products were added to 3 pl of formamide buffer (0.05% bromophenol blue.

~ . i i Y ' , cyan01 in formamide) in a Safc-Lock Eppendorf 1.5 ml microfuge tube. Tubes

\\cri. pl:iccd in boiling water for 3 minutes and quickly chilled on ice. Six pI of this

prcidiict u s lorideci on the SSCP gel.

SSC P gel and rlectrophoresis parameten

\IDE Hydrolink (Mandel Scienrific. Guelph. ON. Canada) gel was used. Gel

strcnptli \vas 0 . 5 S MDE and 0.6 X TBE (Tns-Boratc-EDTA). Five ml of MDE was

.idd~d to 2.1 ml of TBE buffcr 5 X and 17.6 ml of deionised water. Then, 120 pl o f 4

.ininionium persulfate 10 on and 9.33 pI of TEMED w r c mixed with the first solution

~ n d tiw gcl was câst using 3 peristaltic pump (Bio-Rad. Mississauga, ON, Canada) and

kcpt still for polymerisation for l h ot room temperature. The gel was coated with

tk lhond Pag film membrane ( Pharmacia Biotrch. Uppsala. Swrden).

Horizontal migrations were perfomed in a hlultiphor 2 Pharmücia slectroplioresis

iinii i .-\riicrsliani Phamiscia. Biotech. Uppsala. Swcdcn). Kerosenc was placed bctn-eçn

tlic iiiigration s ~ p p o n and coatinj membrane for higher trmpcrature uniformity. The

coiltitlg nicnibranr makcs handling sasisr dunny the staining procedure. Migation \vas

c m i d out in 0.6 S TBE buffer. under constant temperature and pocvcr. Electrophoresis

u s carricd out at 3W (start 9 rnA; 270 V, end 7 mA; 340V) at 10°C for 15 h for PCR

pruduct ~cncriltcd with prirners it-BT- 15 f-it-BT-190rc. Products ycnerated with pnmers

\ I L S \ I L O tvt'rt' rtxolveil at ?CI; (stan S m.\, 2 2 0 V, end 6 , j mA, Z6W) at 10°C fior

I S II. wticrclis products yencrated with primers 4IS I and MS 2 were resolved under the

s m c conditions as D-tubulin product excepted for temperature which was 4.0°C. Gels

w r t . silver stained with Bio-Rad Silver Stain Kit according to the manufacturer's

instriiçtions.

.-\llcIcs w r e scored nianually. PCR products obtained with pnmers it-BT-l 5f and

11-BT-4Wrc uere sloned using the vector pCR 2.1 according to the manufacturer's

instructiori (Invitrogen. Carlsbad. CA. US.). Each clone was placed on SSCP before

scqumcing in ordcr to malie sure that the propcr Fragment would be sequenced. The

clorics nVcrs wqucncrd using it-BT- 15 f on an AB1 373 automatic scquencer ( Applied

Hiosystcni. Fostcr City. CA. US.). PCR products generated with ML S!ML 6 and

US 1 >fS 2 tvcrc dircctly sequenced on an j73. Al1 sequences were deposited in

GcriBrink (triblc 3).

Results

9

.A total of 70 alleles were observed at the P-tubulin locus. All sequences were

dcposited in GcnBank (Table 3). Ail 3 1 S individuals appeared to be hetrrozygous. On the

cd. tliis phenomcnon appeared as a pattern of four bands for each individual. Xo

rcçomhiriaiion 01' an? of the four band patterns was observed. Ho~vever. there was

competç linkagc bctwen the alleles. for esample allele "a" was always found with "b"

1io.L.r with '-c" or "d" (figure 1). This allslic distribution could be explaineci either by the

pwscncc ~ f t \ v o P-tubulin loci. boih of which are homozyyus.

Figure 3: Illustration of the pattern obskrved on the gels indicating that

recomhination was not taking place ai the beta-tubulin locus

.-\llcics c i iind I j w r e afways found in association wi th each othcr. ir 1vi.1~ never found with

( 7 cir c i ;incf 1 ice versa.

- i wo riiitocliondrirtl alleles were hund at each of the two mitochondriaI loci in the

ti;irririgton plantation. resulting in thrrr niitochondnal haplotypes. Gcnotypic and alldic

ticqiicnçies arc shown in tables 1 and 2 . respectiveiy. As can be obsenzd in tablc I some

m ~ i p l c s sliiircd thci sanie P-tubulin haplutype but dilfercd in their niitochondrial - l i q lotypc. ~ n d lice versa.

TIic spatial distribution of the carpophores and their mitochondrial haplotypr.

gcriot).pc.s is shown (fi;. 2). The clona1 nature o l the fungus is cleariy seen as identical

tiiiplorypcs c m bc idcntitied in clusters in the plantation.

Tableau 4: Frequencies of the different genot!.pes found in a Irioirotirs tortieritosirs

population in a white spruce stand of western Quebec

'Thc genotypr is represented by letters. The first letter corresponds to the mitochondnd

hiiplotypc rit the small sub-unit locus. The second ierter rekrs to the mitochondnal large

u h - u n i t lociis. The third and lounh letter relcrs to the P-tubulin loci. A total of 31s

irilfiuduiils w r e testcd.

--

Gr notypes and t heir tiequencies

Genotyprl Frequcnc y

b b i j 1 O.S6?6

-. I

a a k l 9.5 OO/o

Tahlcau 5: Allelic frcquencies for ML, MS and beta-tubulin loci, found in a

Iiiuirofirs torn~~iitusirs population of Harrington. Western Quebec

1';ihltlau 6: GenBank accession number for the alleles sequenced at ML, M S and

hcta-tubulin Ioci. in the basidiomycete Itrotiotus tonrrntosus.

Xlitochondrirrl sniall subunit

Figure 1: Graphical representation of the Rlitochondrial haplotypes round in the

if arrington plantation

Mitochondnal haplûtype :

% a :

" b :

Cloiiin- and sequencing o i the single strands within a pattern allowed us ro

itc~cniiiiic [tic coiiibination of bands belonging to cach hetsrozygots individual. In ordcr

icr culii;ii<: if [lie 'heterozygote' obssned on the gel cculd in hc t br a double-

tionio/>*gote. pti>logenetic analyscs w r e prrfonned. This hypothesis assunies that sach

indi~idiilil would c a r y two differcnt copies of the samc gcnc. Thr sight sequences

obi;iiiicd N crc nianually edited and aligned using Clustalw (Wisconsin Package Version

1o.0. Gcnctic Cornputer Group (GCG). Madison. Wisc. CS.). Scqucnces were highly

ccinscncd and only 15 polymorphic sites were found. Phylogenetic analysis was done

iisirig PACP (GCG). it neirhbor-pining trec was inferred for the P-tubulin locus using the

Siiiiiira 7 - p a r a n 1 t ~ r option and niidpoint rooting. Branch support was cvalurited by 250-

hootstr;ip. Tito-ii~iridred and fifi): bootstrap werc used to rcduçcd thc compu[inr tirne.

siricc hootstriiping 1s ii randorn statistical resampling of the data set. using a higher

nunihcr of hootstraps w u l d not lead to si_enificantly diffèrent rcsults. Two different

cliidcs w r e o b s m cd Cor this gcnr ( fisure 3).

Tlit. \xiial inspection of the jenotypes within the plantation does suggrst that

clonai distribuiioii ts the prevalent mode of distribution of the tùngus within the stand.

Soniti cliistcr of gcnotypes u-cre ïound to be very tightly grouped while others wouid

coi cr 3 lx, w r arca.

Figure 5 : Phylogenetic relationship nrnong the Harrington population at the beta-

tubulin gcnc

Vciglibor-joinir~g tiee infercd from 8-tubulin ssqusnce using Kimura '-parameters

iiiodcl. Results of the 250 bootstraps indicate branch support. midpoint rooting was usrd.

1:igiirc ! ph y l o g c t ic relat tonship arnong the Harrmgton population at the P-rubulin çenr.

\cibor-jolnrng trcc in kr rd tiom 0-tubulinc sequence using Kirnura ?-parameter rnodcl. Results of

rlic 2 5 0 bi~o~straps indicarc. brrinch support. midpoint roorinz wris uscd.

Discussion

The large nuniber of alleics o b s c n d . 7i) aliclss at the p-tubulin loci and two at

cacii niitoçliondnal loci. is very in fornative. One would espect a old invasion ro rssult in

a siiidt nunibrr of large jenet whereas a reccnt invasion would result in large number of

jniall zcricts. The large number of alleles and gcnotypes encountzrcd in this stand does

stiggcs[ J rccent invasion by the pathogen.

.At the rnitochoncirial level only tuu alleles were found at each locus (both

sonsisrcd of point mutations) suggestinj that mutation rate would be relatively constant

snioriy [tic t\vo mitochondnal loci used in this study. Only three mitochondrial

Iiaplotypcs w r e observed. which suggests that mitochondrial recombination is not

~wxiring mithin this plantation. The finding o i the missing haplotypr would sugzest thnt

niitochoricind rccornbination is occuring. This situation has been observeb in other forest

plitliogcris (Srivills and al., 1996, Sriville and al.. 19%)

Ttic mutation rate at the nuclear locus Kas much higher than observed at tlic

rnitochondnrtl loci. Twenty alleles were found rit the P-tubulin locus, al1 alleles differed

by point niutcitions. no indei or other kind o l mutaiions events was observed. These

resiilts w u l d suggest that the types of mutational wents ocurring at the mitochondrial

lind nuclcar genornc are similar.

Mhat W ~ S thou~ht to be a single P-tubulin locus appears to be two P-tubulin loci.

Thc duplication of p-tubulin loci has been obserkd before (Tsai et al. 1994). .Absolutely

rio reconibination was been observed in our sampliny. at these nvo loci. This result could

indiccitc ttictt ihese loci are in tandem repeat or that negative seleciive pressure acts

;lgainst thc recombinant. The previous studies indicatinp the occurrence of more than one

c u p ) o i rhc 0-tubulin gene did not alloa. to draw conclusion regarding the position of

these copies within the genorne. If one would accept the hypothesis that these two genes

rlrc i n ta~idt'tn repcat. ihen anoilisr problsrn anses: tlis lack of hstsrozygotrs. Tlir hct thai

the cntirc piipularion is homozygous at these two P-tubulin loci rrrould indicate that no

riiconibinatioii ( sesud reproduction) occurs within the population. This obsenarion in a

tcintpolar biisidiomycrte would seem rather unlikely. since sexual reproduction can only

occur bctwiien gsnstically different individuals.

In drcfcr ro bc able to draw ri reliable conclusion from an auto-correlation andysis

on r!iis diitli set. one W O L I ~ ~ have to know the real nature of lhcse two P-tubulin loci. Are

t l i t x gcncs linked or not to onc another ? Are thesr txo loci. both functional copies of

the Il-tubulin gcne. Bccriuse rhese questions cannot be answered using our results. the

;i~i!o-corrcllition analysis \vas not psrfotmed. However. visual inspection of the

distribution of the genotypes within the plantation secn~ed to suggest that primary

irifcction wiis the rcsult of spore sennination followed by wgetative growth.

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Discussion et conclusions générales

Nos travails siir le diagnostic rnoli.culaire du champignon pathogène I.

rotwirroszrs nous permettent maintenant d'identifier à partir de son tissu végétatif ou à

partu des carpopliorcs ce champignon. Cette capacirti de pouvoir identifier le champignon -

3 partir d'tkhantillons environnementaux sans rivoir à faire de cultures ;i des

rtipercussions ividrntes. par exemple pour d?teminer si un site est infect6 ou non. Pour

I'idcntificatiiin de carpophores il est préférable d'utiliser des spécimens frais sur pied. La

qualit? dc l 'ADN obteiitie était suffisammeni bonne pour qu'il n'y ait pas d'interfirence

J U riii.eau Je la riaction PCR. Ce protocole a i t k appliqué à d'autres espkces du senre

Iiiotioriu- c l i l'espèce Plreflu~tis prtzi. et i l est donc possible de différencier avec succ;ls. [.

rorw~tro.stts dc ses cspkces saurs.

L'cirnplification de l'ADN de différenrcs espkcrs du genre 1tzorzom a l'aide

d'aniorces dont les siquences avaient préalablement été publiées a permis la fabrication

J'aniorces spécifiques qui permettent l'amplification sélective de l'ADN de i'l.

tovrerrrostts. Cette rkalisation ne constitue pas un fait d'importance en biologie

rriol~culairc puisque la même chose avait déjà i té rkalise pour plusieurs autres espèces. de

gcrircs sanés. Cependant. au niveau mycolojique et sylvicole l'impact de cette

d k ~ o u v ~ n e peut avoir des répercussions importantes. La réalisation du test, c'est-i-dire

dc la recoltc d'un spccimen jusqu'à son identification peut désormais se Faire en moins de

14 hcures. Cela constitue une amélioration substantielle. si l'on compare avec la culture

dit champignon qui a elle seule ne permet pas à coup sûr d'identifier le champignon et

prend un minimum de trois semaines. De plus! ['optimisation de l'extraction d'ADN

directenient à partir de bois infecté permettrait d'appliquer dans les centres de

iransfomation du bois au dans les plantations sur des arbres vivants.

Toutes les siquences générees ont ensuite été utilisées dans une titude

phylogénktique entre différentes espèces au sein du genre ho~iotzis. Les séquences ont été

comparées entre elles afin de déterminer lesquelles présentaient le plus de similitudes.

Lcs ~ ~ I I c I L ~ ~ ~ L ~ ~ ~ s dr: CL'S risultilts indiquent que les espèces I. iorwiirosrrs ct I. lepori~iiis

sont $nit iqucnient rapproc htirs et constituent un groupe distinct des autres cspéces du

gmrc. .Au pllin Ccologique. i l s'agit des deux seules espèccs du genre à avoir la capacité

d'inkctcr les conikrcs. Toutes les autres espéces du yçnrr sont associies aux rsprces

t~~iilliics. Ccpcndant. i. t-mhurirs. qui est isolé des espèces infectant les feuillus. au nivcau

pliylogCnCtique. est Ir: seul i Ztrc un saprophyte et non un parasite. Il est donc apparent .

qiic les espciccs du genre I)ro~iotiu se sont spécialisis sur lcurs hôtes et qu'il est probable

qiic l'on retroiivc un parallèle entre lëvolution des espices d'ltiottotiis et celles de leurs

Iiiitcs. Cepsndant. une telle itude demanderait un nombre beaucoup plus grand

d'csp2cr.s. L'analyse phyloghtitique n'apporte donc rien de nouveau au niveau pratique.

p~iisyu'cllc ne fait que supporter les obsenations ico1ogiqur.s. Il est néiinmoins

intcrcssant de reniarqucr que les différences observées sur le plan écologique se

retrouvent sur lc plan rnolt'culaire. et cela dans un groupe de gènes qui n'est en rien

inipliq~ii daris la digradation du substrat. et qui n'a rien à voir avec la niche t:cologique

oççiiptc. Ceta pourrait indiqiicr que In divergence entre les espèccs est des plus anciennes

puisqui. lcs autres gfncs de l'organisme ont continué i évoluer de façon divergente et

rctlktc ces mémcs différences. De plus, cette analyse suggère que la même approche

p~iissc. Ctrc utiliske pour des espèces dont les niches écolo~iques sont inconnues afin

ci'ci'kctucr des regroupements ciicologiques.

Lc sccond volet de I'itude consistait à itudier le mécanisme de propagation du

ctianipignon. Ce mécanisme peur etre soit sporal ou clona1 ou mixte. Dans le cas d'une

propagation strictement sporale on s'attend 1 ce que tous les différents génotypes trouvés

soieni distnbiiL's aléatoirement dans la plantation et qu'on retrouve différentes

combinaisons d'alléles. Dans le cas d'un mode d~ propagation clonal on s'attend à avoir

un gCnotypc unique pour tous les carpophores. Dans le cas d'un système mixte on

s'attcnd i avoir plusieurs petits foyers de carpophores identiques. Dans le but de

dtk-miner les génotypes. nous avons utilise deux marqueurs mitochondnaun et un

marqueur nucikaire. Les marqueurs mitochondnaus sont toujours présents à l'etat

tiaploïde chez les champipnons puisqu'ils sont transmis par un seul des parents. et

pcmicttent unc analyse simple. Les gènes nucléaires peuvent être observés à l'état

diploïde. et coniportent donc 1 allèles identiques ou différents. Tous les allèles

i t i i toc h a n d i a u s et les allèles nuclCaires retrouvés dans les proportions les plus

iniponantcs ont i t t i sequencés.

Xous connaissons très peu de choses sur la biologie et I'épidémiologie de ce

dixtipignon. pourtant un pathogène d'une espkce ligneuse commercialement importante.

S o m 3pproslic. qui consistait à cartographier chaque carpophores pour pouvoir relier le -

cr'iiotypc 2 1s localisation dans la plantation. nous donne une base de donnies puissante - des s~qutxices au niveau des populations. L'une des hypothèses que nous avons testées

CS: que le champignon se reproduit de façon strictement clonale localement. comme c'est

Ic. 53s pour d'autres basidiomycètes comnie I 'millaire (Ar»iillrrnc~ hlilbos(r) (Smith et

. i l . 1092) . 'iotre Aude nous a permis de rejeter cette hypothCsc.. I I semble plutôt que la

piyulai ion d ' I iorw~itosus itudiCe ait dinvé de spores sssutks suivi de propagation

v2-ciaiivr. En effet. la présence de plusieurs allèles diffircnts au gkne nucléaire de P- riibiilinc cntrc les différents genets est compatible avcc cette hypothèse. En plus. nous

dwns obsrn.C la présence de mitochondries difirentes chez des individus possédant Ir

rnPnic giriot ype nucléaire. Cette observation laisse croire qu'une anastomose a pu se

prodii i rc entrc des hyphes haploïdes possédant di ffcren te combinaisons d'allèles

riiii 1cairc.s ct mi toc hondriaus. Par contre. notre étude niontrc clairement que la

rcpr~duçtion. nprk colonisation. est asexués. En effet. nous avons observé que les

slirpoptiores possédant une composition génétique identique sont généralement regroupés

spiiti~lcnicnt. Cependant. ces genets sont assez restreints si on les compare a ceux de

1'~miillairc qui couvraient plusieurs kilomètres carrés (Smith ct ai.. 1992). Les plus gros

ccncts qui: rious avons observés dans la plantation avaient un diarnktre de 20 mètres. Si

l'on cstirnt. que la croissance radiale du champignon est de 20 centimètres par armée,

coiiiriic c'est le cas pour Pliellimis iveirii (Nelson et Hartrnan. 1975). qui est

gCrii;iiqusnient très proche d'l. [ontenrosia. ont peut estimer la colonisation du site à

~ppro\-mativement 70 u s . Or i l se trouve que ce site quc ce site a été converti en

pliinta~wn d'ipinstte i l y a environ 50 ans ce qui suggère que l'infection au moment

iiiCnic ou avant que les semis n'aient Gte plantés. La préscnce d'un grand nombre de

c?iiot~pes indique qu'il s'agit d'une infection relativement récente. La compétition - intraspt'cifique entre les senets provoque une diminution du nombre genets avec le temps

( Hanscn r.1 Hanielin. 1999). Un des aspects appliqués de notre meilleure connaissance du

processus dc dispersion est de savoir qus le site étudii a été colonisé ;le ~lovo par des

bssidiosporcs. et que la propagation secondaire s'est faite de façon végétative. Unc

conclusion similliirc avait Cté rendue par Lewis et Hansen (1991) en utilisant les profils

protiiqucs.

Lnc analyse phylogénétique a ensuite Cté eflectuie pour le gkne nuclkaire chez

Iqucl lin graiid nombre d'alléle (20) a été trouvé. Cette analyse a révélC la présence de

deus clades pour le gène nucléaire. C'est-à-dire qu'il semble y avoir deux onginrs

dii'ftircntcs pour ce gène dans ce< organisme. indiquant qu'il y aurait présence de deux

gt5ir.s rrks sr.mblab1t.s chez cet organisme. De plus, aucune recombinaison n'a 6ti

obscn.ti entre ces deux génes. L'absence de recombinaison est très surprenante et

wgyirc qu'il existe une pression de sélection négative contre les recombinants ou que les

dciis girics soient placés trks prks l 'un de l'autre. Si les deux gènes sont effectivement

p i ~ i c & ir5s p r k l'un de l'autre. les Cvénemsnts de recombinaison sont alors très rares et i l

csi alors possible que nous n'ayons obsewé aucun de ces rvénemcnts car notre

population cst trop petite ( 3 1 S individus).

.-\fin dc risoudre I'ambiguïtti au niveau du gène P-tubuline. i l serait possible de

procidcr j. unc analyse Southem en utilisant le fragment PCR comme sonde et en

digirant l'ADN génomique à l'aide d'une enzyme de restriction coupant l'ADN en un

scul sitc. C C site Ctant situé dans l'extrémité 3' de la séquence. L'analyse d'un deuxième

riiarqucur nucléaire permettrait peut-ktre de mieux comprendre les résultats obtenus avec

Ic locus P-tubuline evou d'effectuer l'analyse d'quto-corrélation spatiale qu'il n'a pas été

possible d'effectuer i cause du manque d'information sur la nature du gène f3-tubuline

unon. cl ic7 notre champi,

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