ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Lê Thị Tú Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH H ỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN

ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Lê Thị Tú Anh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH H ỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN

ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Văn Tuyến

Hà Nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn

Tuyến, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Xin cảm ơn quỹ NAFOSTED và PGS.TS Trần Minh Hợi chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Mít

(Artocarpus Forst. & Forst. f.), họ Dâu tằm (Moraceae) ở Việt Nam” mã số

106.05.74.09, đã cung cấp kinh phí để thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Nguyễn Bích Thuận, Ths Bá Thị Châm đã

tận tình giúp đỡ và chỉ bảo trong suốt thời gian tôi làm luận văn.

Xin cảm ơn các cô bác, anh chị và bạn đồng nghiệp phòng Hóa Dược và

phòng Thử hoạt tính sinh học, những người đã luôn theo sát, giúp đỡ tôi.

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Hóa học- Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc

gia Hà Nội, các thầy cô trong khoa Sinh học đã tạo mọi điều kiện để tôi học tập,

nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, đã động viên và

giúp đỡ về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt luận văn này!

Học viên: Lê Thị Tú Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm thực vật của loài Artocapus nigrifolius C. Y. Wu ....................... 03

1.2. Ứng dụng trong y học cổ truyền của chi Artocapus .................................... 04

1.3. Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học một số loài thuộc chi Artocapus ..

1.3.1 Hoạt tính kháng sinh ............................................................................. 07

1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư .......................................................... 09

1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa ....................................................................... 14

1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác ............................................................ 18

1.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro ............................ 19

1.4.1 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng sinh in vitro ........................ 19

1.4.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro .... 22

1.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro ................. 23

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất ............................................................... 25

2.1.1. Mẫu thực vật ....................................................................................... 25

2.1.3. Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học ......................................... 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 26

2.2.1. Phương pháp tách chiết ....................................................................... 26

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ........................................................... 26

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học .................................................... 27

2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu .................................................................... 30

2.3. Thực nghiệm ............................................................................................... 30

2.3.1. Chiết mẫu thực vật .............................................................................. 31

2.3.2. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính dịch chiết các bộ phận ................................. 31

2.3.3. Phân lập chất ...................................................................................... 31

2.3.4. Thử hoạt tính các chất ......................................................................... 33

`Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính dịch chiết các bộ phận ............................................... 35

3.2. Thành phần hóa học cây Mít lá đen (Artocapus nigrifolius C. Y. Wu) ...... 39

3.3. Hoạt tính sinh học của các chất ................................................................... 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 52

PHỤ LỤC

DANH M ỤC CÁC KÝ HI ỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance Spectroscopy proton 13C-NMR Carbon – 13 Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Magnetic Resonance cacbon 13

Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Mulitiple Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Bond Coherence nhiều liên kết

HMQC Heteronuclear Single Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Quantum Coherence một liên kết

s singlet

d doublet

t triplet

q quartet

J (Hz) hằng số tương tác tính bằng Hz

δ(ppm) ppm= part per million độ dịch chuyển hóa học tính bằng

ppm

KB human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô

HepG2 hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

human

MCF7 Ardeno carcinoma Ung thư vú

LU Human lung carcinoma Ung thư phổi

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể

ED50 Effective dose 50% Liều hiệu quả đáp ứng 50%

SKC Sắc ký cột

DMSO dimethyl sulfoxide

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm thực vật loài Mít lá đen Artocapus nigrifolius C.Y.Wu 4

Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro 21

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự 22

Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ và thân cây Mít lá đen 32

Hình 2.2: Phân lập các chất từ cao chiết diclometan 33

Hình 3.1 Sắc ký cột cao chiết DCM và SKBM một số phân đoạn cao chiết mẫu vỏ

thân. 40

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng so sánh của ADF2 và β-sitosterol 41

Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo các nồng độ của AFD6 47

Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB 48

Hình 3.5 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 49

Hình 3.6 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư vú MCF7 50

Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư phổi Lu 51

Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống oxy hóa theo phương pháp sử dụng DPPH

của AFD6 52

DANH M ỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu 35

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết Artocarpus nigrifolius

C. Y. Wu 36

Bảng 3.3 Hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu lá, vỏ thân, rễ và cành Artocarpus

nigrifolius C. Y. Wu 38

Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào của các cao dịch chiết các bộ phận loài

Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu 39

Bảng 3.5: 13C – NMR của các chất AFL2 và AFD3 (CDCl3) và (CDCl3 + CD3OD) 44

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh của các chất chiết tách từ loài Artocarpus nigrifolius

C.Y.Wu 46

Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào KB và Hep-G2 của các chất 48

Bảng 3.8 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào MCF7 và Lu của các chất 50

Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa của AFD6 51

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực

vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước

tính. Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều

tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có

3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong thời

gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số

đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng

năm. Như vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn.

Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang

được các nước trên thế giới hết sức quan tâm.

Chi Artocarpus (họ Dâu tằm, Moraceae) là một chi thực vật khá phổ biến ở

Việt Nam với 15 loài. Trong đó, ngoài giá trị làm thực phẩm nhiều loài còn được sử

dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường

như mít (Artocarpus heterophyllus), xa kê (Artocarpus altilis)…Thành phần hóa

học cũng như hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Artocarpus đã được các nhà

khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ lâu, nhiều hợp chất mới với những

hoạt tính tốt đã được công bố [31]. Tuy nhiên, ở Việt Nam mới có một số ít loài

được nghiên cứu như: Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis), Chay lá to

(Artocarpus lakoocha Roxb.) và cây Mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk.). Các

nghiên cứu này cũng đã tìm ra được một số chất thuộc nhóm auronol glucosid có

hoạt tính sinh học tốt có thể ứng dụng vào cuộc sống và là tiền đề cho các nghiên

cứu tiếp theo [6]. Ở Việt Nam loài mít lá đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu mới

được tìm thấy và bổ sung vào danh mục loài của chi mít (Artocarpus) năm 2011 do

nhóm tác giả PGS.TS Trần Minh Hợi, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật . Nhóm

tác giả cũng đã công bố hoạt tính sinh học của cây và cho các kết quả rất đáng quan

tâm. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn loài cây này làm đối tượng nghiên cứu và thực

hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt chất sinh học loài mít lá đen

Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu”.

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thành phần hóa học và phát hiện các

hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu. Để

đạt được mục tiêu trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau:

- Thu hái và định tên cây

- Xử lý mẫu

- Tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc các thành phần hóa học của cây

- Thử hoạt tính sinh học các mẫu cao chiết và các hợp chất tinh sạch được.

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật của loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu

Chi Artocarpus thuộc họ dâu tằm (Moraceae), là một họ thực vật lớn gồm

khoảng 60 chi và hơn 1400 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới châu Á. Trên thế giới chi này gồm khoảng 60 loài, phần lớn là cây thân gỗ, có

nhựa mủ màu trắng. Hoa đơn tính cùng gốc. Hoa đực gồm hai hay bốn phiến, một

nhị với chỉ nhị ở giữa với 2 bao phấn ở hai bên, mở bởi hai kẽ nứt. Hoa cái có màu

hơi xanh, nhỏ phát triển thành gié nạc, ngắn. Sau khi thụ phấn chúng phát triển

thành quả tụ, có thể phát triển rất to. Lá kèm từ nhỏ như ở Artocarpus integer

(Thunb.) Merr (mít tố nữ) và nguyên cho tới lớn và xẻ thùy Artocarpus communis

Forst. & Forst.f. ( Xa kê). Một số loài trong chi có quả ăn được nên được trồng ở

nhiều nước trên thế giới như Artocarpus heterophyllus, Artocarpus integer,

Artocarpus rigidus, Artocarpus tokinensis . Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Artocarpus

ở Việt Nam có 15 loài và dưới loài [4].

Loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu

Cây thân gỗ cao 15m, mọc thẳng, cành nâu sậm, vỏ sần sùi có nếp nhăn dày

1- 2,5 mm. Chồi non ngắn lá có lông màu nâu đen rỉ sắt. Cuống lá đen, mỏng, dài

1,8 -2,8 cm có lông màu nâu đen khi còn non, phiến lá hình elip hoặc elip hẹp, kích

thước 5-11 x 2-4 cm, mỏng như giấy, phía xa gân giữa lá có màu xanh nâu và lông

rất nhỏ màu trắng, phía gần gân giữa lá có màu gần như đen và không lông, gần

cuống lá có hình nêm rộng, gân lá không đối xứng; phần đuôi lá có chóp nhọn dài

0,5-1,5cm. Phần gân lá chính và gân loại 2 nổi rõ ở cả hai mặt lá, gân loại 3 không

lộ. Cụm hoa đơn tính mọc ở nách lá. Cụm hoa đực có kích thước 4-7mm hoa đôi,

cụm hoa cái có màu trắng khi còn non, màu xanh sậm khi khô, hình nón ngược, 5-

9mm, có nốt sần, chỏm cánh hoa có dạng tù, cuống dài 1-1,5 cm, mỏng.

Tiến hành thu mẫu tại các tỉnh: Sơn La, Phú Thọ thu tiêu bản và vật mẫu

cành, lá, quả .

Hình 1.1: Đặc đ ể

Artocarpus nigrifolius

vào hệ sinh vật của nư

cần được nghiên cứu.

1.2 Ứng dụng trong y h

Nhiều loài trong chi

Đông Nam Á để điều trị

chảy. Thịt quả và hạt đư

cây uống để trị bệnh tiêu ch

vú; tro đốt của lá là loại thu

Ở nước ta, dân gian dù

gan vàng da bằng cách n

Đức, lá xa kê còn có th

như gút, sỏi thận, tiểu đ

ặc điểm thực vật loài Mít lá đen Artocarpus

1. Cành Mít lá đen 2. Chồi Mít lá

Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu là một loài mới được nghi

ước ta, do đó, các tài liệu ghi nhận về chúng ch

ng trong y học cổ truy ền của chi Artocarpus

oài trong chi Artocarpus được dùng trong y học cổ

ể đ ều trị các bệnh như kháng viêm, sốt rét, trị ung nh

được sử dụng như thuốc bổ có tác dụng làm mát, h

êu chảy và hạ sốt, lá giúp tăng tiết sữa cho ph

ại thuốc trị giun trong y học cổ truyền nhiều

a, dân gian dùng lá xa kê (Artocarpus altilis) ch

ằng cách nấu là tươi để uống. Ngoài ra, theo lươ

ê còn có thể phối hợp với một số loại thuốc khác trị đ

ậ ểu đường týp 2, chứng huyết áp cao dao động [

nigrifolius C.Y.Wu.

ồi Mít lá đen.

ợc nghiên cứu và bổ sung

ậ ề chúng chưa nhiều; rất

ọc cổ truyền ở các nước

ốt rét, trị ung nhọt, áp xe, tiêu

àm mát, hạ huyết áp, rễ

ế ữa cho phụ nữ, động vật có

ền nhiều nước …[31]

) chữa phù thũng, viêm

ài ra, theo lương y Nguyễn Công

ốc khác trị được một số bệnh

động [2]. Thịt quả xa kê

thường dùng để ăn, quả còn xanh có bột dùng để làm thực phẩm. Hạt xa kê luộc

hoặc rang ăn ngon như hạt rẻ có tác dụng lợi trung tiện, kích dục.

Artocarpus altilis không chỉ làm thức ăn chăn nuôi, lá của nó được sử dụng

để điều trị xơ gan, tăng huyết áp và bệnh tiểu đường ở Indonesia [30].

Ở Tân đảo, rễ cây được dùng để trị hen và các rối loạn dạ dày, ruột, một số

rối loạn khi mang thai, đau răng miệng và trị bệnh về da.

Ở Papua Niu- Guinea, vỏ cây được dùng để trị bệnh ghẻ; nhựa cây được pha

loãng uống trị ỉa chảy và lỵ; lá dùng phối hợp với lá đu đủ giã với vôi cho đến khi

có màu vàng, lấy hỗn hợp này đắp trị sưng háng, lá cũng được dùng trị đinh nhọt,

sưng háng [3].

Thân và rễ loài Artocarpus altilis đã được sử dụng ở Đài Loan từ lâu để điều

trị bệnh xơ gan và chứng tăng huyết áp. Ngoài ra chúng còn được dùng để kháng

viêm, giải độc.

Ở Ấn Độ, trong một nghiên cứu sàng lọc tác dụng dược lý của cao khô chiết

từ vỏ và lá xa kê bằng cồn 500, các tác giả nhận thấy cao thô có tác dụng lợi tiểu rõ

rệt trong thí nghiệm với chuột cống trắng so với lô đối chứng.

Ở Trinidad và Banhamas, người ta dùng nước sắc lá xa kê để hạ huyết áp và

trị hen suyễn, lá giã nát đắp trị tưa lưỡi, nước ép từ lá dùng như thuốc nhỏ tai, tro

đốt từ lá dùng bôi lên da chữa nhiễm trùng và bột lá khô dùng để điều trị lá lách mở

rộng. Quả giã nát làm thuốc đắp lên vết sưng tấy giúp mau mưng mủ, hoa chữa đau

răng bằng cách hơ nóng chà lên niếu xung quanh chỗ đau. Nhựa cây dùng để chữa

trị bệnh về da và giảm đau thần kinh tọa, pha loãng uống trị tiêu chảy.

Ở nước ta, hạt mít dai ( A. heterophyllus) được dùng trị ghẻ lở, sản hậu ít

sữa. Múi mít dùng chữa sốt rét rừng và giải say rượu [1]. Hạt mít nướng hay luộc ăn

thì hạ khí, thông trung tiện. Lá mít được dùng làm thuốc lợi sữa, chữa ăn uống

không tiêu, ỉa chảy, và trị huyết áp cao. Lá mít giã đắp cũng làm mụn nhọt bớt sưng

đau. Gỗ và lá mít còn được dùng làm thuốc an thần, chữa huyết áp cao hay những

trường hợp co quắp: mài gỗ mít lên miếng đá nháp hay chỗ nháp của trôn bát, cho

thêm ít nước đến khi nước trở nên đục nhiều thì uống với li ều hàng ngày là 6-10g.

Gỗ và nhựa mít làm tiêu sưng, giải độc, chữa sưng tấy, mụn nhọt, dưới dạng sắc

nước uống (gỗ) và bôi (nhựa). Rễ cây sắc nước uống trị ỉa chảy và cùng với vỏ trị

các loại viêm gây sốt. Dịch nhựa cây thường được dùng đắp rút mủ mụn nhọt, còn

dùng trị bệnh giang mai và trừ giun. Dái mít dùng chữa sa dạ con và lõi mít có tính

gây sảy thai[2]. Ở Ấn Độ người ta dùng lá chữa các bệnh ngoài da và trị rắn cắn

[31]. Rễ sắc uống trị tiêu chảy và vàng da. Dịch ép của cây đắp vào chỗ sưng hạch

và áp xe để làm mưng mủ. Quả xanh có tác dụng làm săn, quả chin nhuận tràng.

Nhựa mủ bôi trị vết thương [2].

Ở Indonesia, dịch ép quả mít non có trong thành phần một thuốc uống trị sốt.

Quả non trộn với cao khô từ lá cây Uncaria gambir ăn trị đau bụng. Lá hoặc quả có

trong thành phần bài thuốc chữa uồng trị tiêu chảy, nước sắc lá giã nát dùng làm

thuốc chữa đau răng.

Hạt Chay lá to (Artocarpus lakocha) ở Ấn Độ được dùng làm thuốc xổ, vỏ

cây dùng tán bột đắp vết thương để rút mủ hoặc pha thuốc đắp mụn nhọt và các vết

nứt nẻ ở da. Ở Thái Lan, nạc của trái được xem như thuốc bổ gan, gỗ, quả chay sắc

nước uống dùng trị giun kim, giun đũa, sán xơ mít và dùng ngoài da trị ghẻ. Ở nước

ta, vỏ, mủ trị đau lá lách; hột làm thuốc xổ.

Các loại trái cây Artocarpus lakocha thường được ăn tươi. Bột trái cây ăn

được và dùng như là một loại thuốc bổ cho gan. Ở Thái Lan, bột Artocarpus

lakoocha Roxb còn gọi là Puag-Haad được sử dụng làm thuốc trị sán dây truyền

thống [8].Vỏ cây có chứa 8,5% tannin được nhai như trầu và cũng được sử dụng để

điều trị bệnh về da.

Chay Bắc bộ (Artocarpus tonkinensis) có quả dùng để chữa phổi nóng, ho ra

máu, thổ huyết, chảy máu mũi, đau họng, dạ dày thiếu toan, kém ăn. Nếu không có

quả chay tươi có thể dùng quả chay khô hay rễ chay sắc uống. Rễ chay dùng chữa tê

thấp, đau lưng, mỏi gối và chữa rong kinh, bạch đới; còn dùng làm chắc chân răng.

Liều dùng 20-40g dạng thuốc sắc.

Ngoài ra, những loài khác trong chi Artocarpus cũng được sử dụng trong y

học dân gian ở các nước Đông Nam Á từ lâu: nhựa từ Artocarpus lowii truyền

thống được sử dụng như một loại dầu ăn và thuốc mỡ trong y học dân gian.

Artocarpus chempeden là một trong các loại thuốc dân tộc Indonesia; hạt cây đã

được sử dụng để chống lại tiêu chảy và rễ của nó chống lại bệnh sốt rét. Phía Tây

Java, Artocarpus elasticus Reinw. ex Blume đã được sử dụng để điều trị viêm,

tránh thai cho nữ (vỏ cây), bệnh lỵ và lá non cho điều trị bệnh lao. Bên cạnh việc sử

dụng làm thuốc, các loài trong chi Artocarpus được sử dụng như một loại thực

phẩm và vật liệu xây dựng nhà ở [31].

1.3 Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của một số loài thuộc chi

Artocarpus

Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền, chi

Artocarpus đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới để ý. Từ chi này, rất nhiều

các hợp chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng lọc hoạt tính và

nhiều trong số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được áp dụng vào thực tiễn.

Các hoạt tính thường được thăm dò là: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, gây độc

với các tế bào ung thư và khả năng chống các gốc oxy hóa. Ngoài ra, tùy theo

những tác dụng của loài trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các nhóm chất,

người ta có thể thăm dò các hoạt tính khác như: tính kháng virus, ức chế các

enzyme, chống tiểu đường… Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu về những hoạt tính

sinh học của các hợp chất đã được tách từ các loài thuộc chi Artocarpus.

1.3.1 Hoạt tính kháng sinh:

Cao chiết methanol vỏ cây loài Artocarpus communis và một số hợp chất tự

nhiên tinh sạch được từ loài này như artonin E (1), 2-[(3,5-dihydroxyl)-(Z)-4-(3-

methylbut-1-enyl) phenyl]benzofuran-6-ol (2) có khả năng kháng nhiều chủng vi

sinh vật như : P.seudomonas stuartii (ATCC29916), P.aeruginosa (PAO1),

Klebsiella pneumonia (ATCC11296); S.aureus (ATCC25922), S.typhi

(ATCC6539), E.coli (ATCC8739), C.albican (W3100). Trong đó (1) và (2) cho giá

trị MIC là 32 µg/ml với P.aeruginosa, giá trị này cao hơn cả chất kháng sinh đối

chiếu là chloramphenicol [32].

(1) (2)

Từ vỏ cây loài Artocarpus rigida Blume người ta cũng tìm thấy hợp chất

artonin E (1) với hoạt tính kháng sinh rất tốt tương đương với các chất kháng sinh

đối chứng. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của artonin E trong thực tế như

một chất kháng sinh [28].

Hợp chất pyranocycloartobiloxanthone A (3) được tìm thấy ở loài

Artocarpus obtusus thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt với một số chủng vi sinh vật

như: Staphylococcus aureus kháng methicillin (ATCC33591) với đường kính

vòng vô khuẩn là 20mm tương đương với hoạt tính của chất đối chứng là

streptomycin sulfat, hay kháng Bacillus subtilis với đường kính vòng vô khuẩn là

12mm, ngoài ra nó cũng thể hiện hoạt tính với các chủng B.subtillis (ATCC 6633),

E.coli (ATCC 25922), S.aureus (ATCC 6538) và Salmonella typhimurium (S865B)

với đường kính nhỏ hơn 10 mm. Mặc dù không cao như tính kháng khuẩn,

Pyranocycloartobiloxanthone A cũng thể hiện hoạt tính kháng nấm trên các chủng

Candida albicans (ATCC 1023) và Saccharomyces cerevisiae (S617) với đường

kính vùng ức chế lần lượt là 7 và 8 mm [19].

OO

OHHO

OH O CH3

OH

(3)

Cao chiết thô methanol của thân, vỏ thân, vỏ rễ, lá, hạt, quả, gỗ của

Artocarpus heterophyllus và các phân đoạn dịch chiết sau đó với dichloromethane,

ethyl acetate và butanol

Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei,

Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus,

S.epiderepidermidis, Streptococcus fa

tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli,

Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,

marcescens, Trichomonas vaginalis.

4mg/đĩa) vỏ rễ và quả

chiết nước của loài c

(15mm), E. faecalis (14 mm

1.3.2 Hoạt tính gây độ

Suhartati và cộ

Artocarpus rotunda là

artonin O (6), cycloartobiloxanthone

tính gây độc tế bào đố

0,6; 7,9; 0,06; 4,6 và 0,9

Từ loài Artocarpus lanceifolius,

artobiloxanthone (8), artoindonesianin P

(10) các chất này đều có kh

là 5,9; 1,7; 4,6; 100 µg/ml. C

thân Artocarpus kemando

người) với giá trị IC50

(4)

ethyl acetate và butanol đã cho phổ kháng vi sinh vật rộng vớ

Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei,

Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus,

S.epiderepidermidis, Streptococcus faecalis, St.pneumoniae, Agrobacterium

tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli,

Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,

marcescens, Trichomonas vaginalis. Trong đó, phân đoạn butanol (n

ả của Artocarpus heterophyllus có hoạt tính t

ài cũng thể hiện hoạt tính ức chế với các chủ

(14 mm), S. typhimurium (13 mm) và E. coli

độc tế bào

ộng sự đã tách được một số hợp chất

là artoindonesianin L (4), artonin M (5)

cycloartobiloxanthone (7) . Những hợp chất này đ

ối với dòng tế bào P388 bạch cầu chuột vớ

0,6; 7,9; 0,06; 4,6 và 0,9 µg/ml [27].

Artocarpus lanceifolius, Euis và cộng sự

, artoindonesianin P (9), cycloartobiloxanthone

ều có khả năng ức chế dòng tế bào P388 với giá tr

6; 100 µg/ml. Các hợp chất (1) and (6), (7) và (8)

Artocarpus kemando thể hiện hoạt tính gây độc tế bào KB (ung th

lần lượt là 3,0; 0,5; 3,5; 2,5 µg/ml [31].

(4)

ậ ộng với nhiều chủng như:

Bacillus cereus, B.coagulans, B.megaterium, B.subtilis, Lactobacillus casei,

Micrococcus luteus, M.roseus, Staphylococcus albus, S.aureus,

ecalis, St.pneumoniae, Agrobacterium

tumaefaciens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli,

Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, P.vulgaris,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia

ạn butanol (nồng độ

ạt tính tốt nhất . Dịch

ới các chủng như S.aureus

E. coli (11,3 mm) [16].

ợp chất phenol từ rễ cây

(5), artonin E (1) và

ày đều thể hiện hoạt

ầ ột với LC50 lần lượt là

ộng sự đã tách được

, cycloartobiloxanthone (7) và artonol B

ới giá trị IC50 lần lượt

(8) được tách chiết từ

ào KB (ung thư biểu mô

(7)

(6)

Một số hợp như

tính ức chế dòng tế b

(12), có hoạt tính kháng d

cycloartobiloxanthone

tế bào ung thư phổi ng

nhất với IC50 1,26µg/ml

(5)

(6)

(10)

ư cycloartobiloxanthone (7), artoindonesianin C

ế bào ung thư biểu mô (KB); hợp chất (7),

ạt tính kháng dòng ung thư vú (BC); xanthone artonol

ne (7) và artoindonesianin C (11) có khả nă

ổi người (NCI-H187) , đặc biệt hợp chất artonol

µg/ml trong khi chất đối chứng ellipticine đạt giá tr

(8)

(9)

(10)

, artoindonesianin C (11) có hoạt

, (11), artorigidusin

xanthone artonol B (10),

ả năng gây độc với các

artonol có hoạt tính tốt

đạt giá trị IC50 lần lượt

với các dòng tế bào trên là at 1,33; 1,46; 0,

được tìm thấy ở rễ loài

(11)

Năm 2004, Syah và c

artoindonesianin U (13)

chempeden, chúng thể hi

với IC50 lần lượt là 2,0 và 0,

đó tiếp tục tách được các h

heterophyllin (16), cudraflavone C

chloroform Artocarpus chempeden

dòng tế bào bạch cầu chu

7,33µg/ml [30].

(13)

ào trên là at 1,33; 1,46; 0,39 µg/ml. Tất cả các h

ài Artocarpus rigidus Blume [20].

OO

OH O

m 2004, Syah và cộng sự đã tách được hai hợp chất isoprenyl flavones l

(13) và artoindonesianin V (14) từ lõi thân

ể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng t

à 2,0 và 0,5µg/ml (Syah và cộng sự, 2004). N

ợc các hợp chất artoindonesianin A-2, artoindonesianin

, cudraflavone C (17), artoindonesianin T

Artocarpus chempeden; các hợp chất này đều thể hiệ

ạ ầu chuột P388 với giá trị IC50 lần lượt là 3,66; 5,45; 4,50;

(13)

ấ ả các hợp chất trên đã

O

OH

(12)

ợ ất isoprenyl flavones là

õi thân Artocarpus

ên dòng tế bào P388

). Nhóm nghiên cứu sau

artoindonesianin A-3 (15),

, artoindonesianin T (18) từ dịch chiết

ề ể hiện hoạt tính ức chế

à 3,66; 5,45; 4,50; 4,50;

(14)

(15)

(17)

Chín loại prenyl flavones tách chi

cycloartocarpin (19), artocarpin

(23), cycloartobiloxanthone

artobiloxanthone (8); các h

dòng KB, BC và Vero v

(19)

(15)

ại prenyl flavones tách chiết từ Artocarpus altilis

, artocarpin (20), chaplashin (21), morusin (22)

, cycloartobiloxanthone (7), artonin E (1), cudraflavone C

; các hợp chất này thể hiện khả năng gây độ

dòng KB, BC và Vero với giá trị IC50 tương tự nhau từ 2,9–14,7 µ

(19)

(16)

(18)

Artocarpus altilis viz. là

(22), cudraflavone B

, cudraflavone C (17),

ăng gây độc tế bào với các

7 µg/ml [33].

(20)

(21)

Từ trái xa k

trihydroxychalcone (24

thể hiện hoạt tính ức chế

vitro [trên các dòng ung th

(HT-29, COLO 205), ung th

(21)

(23)

trái xa kê (Artocarpus communis) các chất 5’

(24) và 3,4,2’,4’-tetrahydroxy-3’-geranyldihydrochalcone

ức chế nhiều dòng tế bào ung thư trong nghiên c

vitro [trên các dòng ung thư nguyên bào gan (HepG2, Hep3B), ung th

), ung thư gan (PLC5, Huh7)] [32].

OH O

O

(24) HO

OOH

(25)

(22)

ất 5’-geranyl-2’,4’,4-

geranyldihydrochalcone (25)

trong nghiên cứu thử nghiệm in

(HepG2, Hep3B), ung thư trực tràng

OH

OH

OH

(26)

Yong-Hong Wang và cộng sự (2004) tiến hành tách chiết và thử hoạt tính

gây độc tế bào các chất artochamin C (26), artocarpin (20), artonin E (1) từ loài

Artocarpus chama trên một số dòng tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu cho thấy,

artochamin C (26) có hoạt tính ức chế mạnh trên các dòng MCF-7, 1A9, HCT-8 và

SKMEL-2 với giá trị ED50 trong khoảng 2,0-2,3 µg/mL; yếu hơn với A549, KB,

KB-VIN với ED50 là 3,0-3,4 µg/mL, tuy nhiên (26) không thể hiện hoạt tính đáng

kể nào với các dòng tế bào CAKI-1, U-87-MG, PC-3, MDA-MB- 231 khi ED50

của chúng đều lớn hơn 4,0 µg/mL. Artocarpin (20) cũng có hoạt tính ở mức trung

bình với các dòng tế bào thử nghiệm như A549, MCF-7, 1A9, HCT-8, U-87-MG,

MDA-MB-231, KB, và KB-VIN với giá trị ED50 trong khoảng 3,2-3,8 µg/mL, và

cũng không thể hiện hoạt tính trên các dòng CAKI-1, SK-MEL-2, PC-3 ở nồng độ

dưới 4,0 µg/mL. Artonin E (1) gây độc mạnh với dòng tế bào 1A9 (ED50 < 1,25

µg/ml), MCF-7 (ED50 = 2,2 µg/ml), gây độc yếu hơn trên các dòng HCT-8,

MDAMB-231 (lần lượt ED50 = 3,3 và 3,0 µg/ml)

1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật ngày càng thu hút

sự quan tâm của các nhà khoa học do khả năng tăng cường sức khỏe, giảm các bệnh

tật kinh niên của chúng. Thành phần hóa học của loài thuộc chi Artocarpus chứa

nhiều hợp chất phenol là nhóm hợp chất có tính chống oxy hóa cao, có khả năng

ứng dụng vào thực tiễn như là thực phẩm bổ sung. Do đó, việc phân lập các chất có

hoạt tính này từ các loài trong chi đã được tiến hành từ lâu và cho nhiều kết quả khả

quan.

Các chất cycloheterophyllin

thấy trong một số loài thu

dịch treo mô não chuộ

peroxyl O22-, gốc hydroxyl OH

dihydrochloride và hệ

cứu từ lâu. [31]

(27)

Hoạt tính chống oxy hóa c

Artocarpus nobilis đã

hóa của các hợp chất đ

pháp sinh tự ký TLC ( TLC bio

đều thể hiện vết trắng nh

geranyl - 2, 3’, 4, 4’

trihydroxyflavon (31) và isonymphaeol

TLC ngay cả khi ở nồng

các chất này được so sánh v

cycloheterophyllin (27), artonin A (28), artonin B

ài thuộc chi Artocarpus ức chế sự peroxy hóa lipi

ột, loại bỏ 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH)

ốc hydroxyl OH- được tạo ra bởi 2,2’-azobis (2

ệ Fe3+–ascorbate–EDTA–H2O2 đã được Ko v

(28)

(29)

ống oxy hóa của các hợp chất geranyl flavonoid phân l

ã được Jayasinghe và cộng sự nghiên cứu. Tính ch

ợ ất được đánh giá bằng khả năng loại bỏ gốc DPPH theo ph

TLC ( TLC bio-autography method) của Takao. Tấ

ế ắng nhạt trên nền màu tía ở nồng độ 1,0 µg/m

4’ - tetrehydroxychalcon (30), 8 – geranyl

) và isonymphaeol-B (32) cho thấy vết trắ

ả ở nồng độ thấp là 0,1 µg/ml. Do đó, tính chất ch

ợc so sánh với α-tocopherol bằng phương pháp đ

, artonin B (29) được tìm

peroxy hóa lipid do sắt trong

picrylhydrazyl (DPPH) và các gốc

azobis (2-amidinopropane)

ợc Ko và cộng sự nghiên

(29)

t geranyl flavonoid phân lập từ quả

ứu. Tính chất chống oxi

ạ ỏ ốc DPPH theo phương

ủa Takao. Tất cả các hợp chất

g/ml. Các hợp chất 3 -

geranyl - 3’, 4’, 7 -

ấ ết trắng nhạt mạnh trên

ất chống oxy hóa của

ương pháp đo ảnh phổ. Giá trị

EC50 của các chất được xác định: 30 (5 µg/ml), 31 (6,3 µg/ml), 32 (4,4 µg/ml), α-

tocopherol (13,8 µg/ml). Kết quả này cho thấy các chất này đều có hoạt tính mạnh

hơn so với chất đối chứng α-tocopherol. Do đó, quả loài A. nobilis có thể giúp ích

cho con người như là nguồn giàu chất chống oxy hóa tự nhiên.[15].

(30)

(31)

(32)

Trong một nghiên cứu khác của Lin và cộng sự năm 2009, các chất

prenylflavonoid được phân lập từ vỏ rễ loài Artocarpus communis bao gồm:

cyclogeracommunin (33), artoflavone A (34), artomunoisoxanthone (35),

artocommunol CC (36), artochamin D (37), artochamin B (38),

dihydroartomunoxanthone (39), và các prenylflavonoid từ Artocarpus elasticus

như cycloartelastoxanthone (40), artelastoheterol (41), artonol A (42),

cycloartobiloxanthone (7) tất cả đều thể hiện hoạt tính ức chế các tác nhân gây oxy

hóa. Đặc biệt là các chất (34), (40), (41), (7) có hoạt tính khá cao trong thử nghiệm

chống oxy hóa DPPH với EC50 lần lượt là 24,2±0.8; 18,7±2.2; 42,2±2,8, 26,8±1,2

µM.

(33) (34)

(35) (36)

(37) (38)

(39) (40)

(41) (42)

1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác:

Ngoài hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào trên các dòng ung thư, chống oxy

hóa; những hợp chất được tách chiết từ chi Artocarpus còn có nhiều hoạt tính khác

có thể ứng dụng trong lĩnh vực y dược học.

Trong nghiên cứu chất kháng vi khuẩn lao, những hợp chất prenyl flavon

được tách ra từ rễ Artocarpus altilis gồm: cycloartocarpin (19), artocarpin (20),

chaplashin (21) , cudraflavone B (23), cycloartobiloxanthone (7), artonin E (1),

cudraflavone C (17), artobiloxanthone (8) đều thể hiện khả năng kháng lại vi khuẩn

lao Mycobacterium tuberculosis H37Ra với MIC trong khoảng từ 3.12 đến

100µg/ml, đây là một giá trị tương đối tốt khi so sánh với chất hiện đang dùng làm

thuốc lao là kanamycin với giá trị MIC đạt 2,5µg/ml [31].

Tác dụng bảo vệ tế bào, chống xơ vữa động mạch đã được chứng minh với

dịch chiết ethyl acetate của loài Artocarpus altilis, nhóm nghiên cứu cũng đã phát

hiện ra nhóm chất chính mang lại hiệu quả này trong dịch chiết là flavonoid trong

đó có β-sitosterol [33].

Bằng những thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã bước đầu chứng

minh được khả năng làm tăng đường huyết, giảm tác hại tiểu đường type II của dịch

chiết nước A.communis.

Năm 2005, Goncalves và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng rotavirut in

vitro của các loại thuốc truyền thống từ thực vật, trong đó có loài Artocarpus

integrifolia Lamk. Nhóm nghiên cứu nhận thấy, loài cây này có tác dụng đặc biệt

với các chủng rotavirut của người (HCR 3) và khỉ (SA-11). Ở nồng độ 480µg/ml

dịch chiết, 99,2% virut HCR 3 và 96,4% SA-11 bị ức chế. Do đó, dịch chiết của loài

này rất có tiềm năng ứng dụng để ngăn chặn dịch ỉa chảy nếu nguyên nhân được

xác định là do rotavirut.

1.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro:

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển

nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro cho kết quả chính xác cao và

thời gian thực hiện tương đối ngắn. Ở phần tiếp theo, chúng tôi sẽ đề cập đến những

phép thử phổ biến nhất.

1.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro:

Có nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro. Có thể phân

loại các phương pháp này bằng kỹ thuật đưa chất thử vào hệ thử [5].

� Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc:

Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được

tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi

khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng chất. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của

thuốc càng mạnh.

� Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc:

Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được

cho vào ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở

xung quanh ống trụ. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.

(a) (b)

(c) (d)

Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro

(a) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (b) Phương pháp dùng ống

trụ trên môi trường đặc; (c) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng;

(d)Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng

� Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng:

Nguyên tắc của phương pháp là dùng hang loạt ống nghiệm chứa môi trường

lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu.

Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các

ống. Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của

vi khuẩn. Nồng độ này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal

inhibitory concentration). Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng

2 lần liên tiếp hoặc phương pháp hệ nồng độ.

� Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth

microtitre technique)

Phương pháp này, về nguyên tắc, chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng

2 lần liên tiếp, nhưng phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent

assay: thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn,

tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ

thông thường ở chỗ:

• Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi

ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm.

• Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khác nhau của chất thử còn ở

đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng.

• Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ

thị TTC), nhưng ở đây, được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng

492 nm của dàn máy ELISA.

� Phương pháp sinh tự ký ( Bioautography)

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng

kháng sinh in vitro sinh ký tự

Phương pháp này sử dụng khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một

dược liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và

muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu này có tác dụng.

Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử dụng môi trường đặc, sau khi

chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản mỏng, tiến hành láng môi trường

thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h để xác định vùng vết chất làm vi

khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn

mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl tetrazolium Chloride)

1.4.2 Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào

Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng

tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai

phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.

� Phương pháp MTT:

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng

phổ biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp

chí Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được

dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng

phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám

chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu

vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ

và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu,

khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.

. Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím)

� Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để

đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng

dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu

của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế

bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào

pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường

axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào

đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base

để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.

1.4.3. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của chất:

Oxy không thể thiếu với sự sống, khi đi vào cơ thể, oxy tham gia nhiều quá

trình sinh hóa học. Trong quá trình đó, chúng tạo ra những tiểu phân trung gian gọi

là gốc tự do. Các gốc này có thể gây hại cho sức khỏe, do đó trong cơ thể cần thiết

duy trì sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa. Đó là

trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi. Tuy nhiên, do nhiều tác động, cân bằng này

di chuyển theo hướng gia tăng dạng oxy hoạt động. Vì vậy việc bổ sung vào cơ thể

các dạng chất chống oxy hóa là cần thiết.

Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một

số phương pháp sau:

� Phương pháp sử dụng DPPH

Nguyên tắc: 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do

được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa

của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc giảm màu của

DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước song λ = 517nm.

� Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II

Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc

tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện

qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở

trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể

hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl

(thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II).

� Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2*-

Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của

chất nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2*- . Gốc

superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được

định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức

chất có màu tím được đo ở bước song λ = 550nm. Hoạt tính của mẫu thử được thể

hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím.

� Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2

Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2*- và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ

thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể

nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2 ,*OH là phân tử và gốc có

khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các

peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa

của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng

màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản

ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase ).

Chương 2 - THỰC NGHIỆM

2.1. Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất

2.1.1 Mẫu thực vật

Mẫu thực vật loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu thu tại khu Bảo tồn thiên

nhiên Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào tháng 6 năm 2010. Số hiệu mẫu

PVT 419. Tiêu bản do TS. Nguyễn Tiến Hiệp định tên và được lưu giữ tại Phòng

tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

Mẫu lá, cành, rễ và vỏ thân sau khi thu được phơi trong bóng râm và xử lý sơ

bộ trước khi tách chiết.

2.1.2 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật

Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60

F254 Merk, độ dày 0,2mmm.

Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 0,063- 0,1 mm

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 0,040- 0,063 mm.

Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.

Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó

hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4) (thành phần); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanilin

1,2g; MeOH 200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)

Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện

Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance

500MHz viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol

đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.

2.1.3 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học

Các môi trường nuôi cấy Merk: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA

(Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi

khuẩn; SDB (Sabouraud Dextro Broth), SDA (Sabouraud Dextro Agar) cho nấm.

Chất tham khảo (Sigma) sử dụng trong phép thử hoạt tính kháng sinh: kháng

sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng Escherichia coli; kháng

sinh streptomycin cho chủng Pseudomonas aeruginosa; kháng sinh amphotericin B

cho nấm.

Môi trường nuôi cấy tế bào: môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào

Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1; huyết thanh bò FBS

Chất tham khảo Ellipticine (Sigma) trong phép thử hoạt tính gây độc tế bào

ung thư.

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH): chất tạo ra gốc tự do

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170);

Tủ cấy sinh học an toàn cấp II;

Máy li tâm (Universal 320R);

Kính hiển vi ngược (Zeizz);

Tủ lạnh sâu -250C,-800C;

Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ);

Máy quang phổ (Genios Tecan);

Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết tách

Mẫu cành, vỏ thân, rễ và lá cây Mít lá đen được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ

400C, xay nhỏ và chiết riêng biệt từng loại nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol.

Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc và loại dung môi dưới

áp suất giảm thu được cao chiết MeOH.

Cao chiết MeOH được chiết lại lần lượt qua các dung môi có độ phân cực

tăng dần n-hexan, diclometan, etyl axetat. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu

được các cao chiết tương ứng.

Phân lập các cao chiết nhận được bằng phương pháp sắc ký cột thường, sắc

ký cột nhanh với các dung môi thích hợp.

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các

phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ

hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-

COSY).

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:

Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC

cung cấp:

- Bacillus subtilis (ATCC 6633): là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử,

thường không gây bệnh.

- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết

thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.

- Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường

tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh,

gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết

niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.

- Candida albicans (ATCC 10231): là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi

ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.

- Lactobacillus fermentum (Lp B14: )gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột

lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.

- Enterococcus faecium (B650): gram (+), vi khuẩn gây bệnh viêm đường

tiết niệu, viêm ruột thừa, viêm màng trong tim, viêm màng não.

Phương pháp tiến hành: thực hiện dựa trên phương pháp vi định lượng trên

môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và

nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các

giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC 50 (nồng độ ức chế

50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)

- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một

dãy 05 nồng độ là 128 µg/ml, 32 µg/ml, 8µg/ml, 2µg/ml, 0,5µg/ml

- Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105CFU/ml khi

tiến hành thử.

- Chuẩn bị mẫu đối chứng: mẫu đối chứng (+) kháng sinh được pha trong

nước cất theo nồng độ 10mg/ml và khử trùng bằng màng lọc Millipore 0,22µm; tiến

hành các bước thì nghiệm tiếp theo tương tự như các chất thử khác . Mẫu đối chứng

(-) chất thử được thay thế bằng nước cất vô trùng.

- Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng

có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật.

- Giá trị IC 50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy

quang phổ TECAN bước sóng λ = 492nm và phần mềm raw data

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.2.3.2 Phương pháp thử độc tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:

- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được

sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.

- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan.

- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.

- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

Phương pháp thử độ độc tế bào: được Viện Ung thư Quốc ga Hoa Kỳ (NCI)

xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự

phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường

nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành

phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng

tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy

chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc

tính.

Thử độc tế bào:

- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml;

2µg/ml; 0,5µg/ml. Bổ xung 200µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế

bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế

bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200

µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.

- Sau 72h thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không

huyết thanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều

đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

GI �%� =OD điều khiển − OD mẫu

OD điều khiểnx 100

GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát

triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để

sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu.

Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được

xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517 nm.

Cách tiến hành:

- Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH).

- Mẫu thử được pha loãng trong DMSO 100% theo dãy nồng độ là 128

µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml.

- Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa

phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. Phần trăm quét gốc tự

do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

�� �%� =�OD mẫu trắng – OD mẫu thử�

ODtrắngx 100

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của

chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu:

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp xác suất thống kê.

Giá trị trung bình: X=∑ xi / n

Phương sai: S2 = ∑( xi – x)2 / (n-1)

Độ sai chuẩn: Sx= S/√�

Sai số tuyệt đối: ∆x = t(α,ƒ).Sx

Kết quả: x= x ± ∆x

Khoảng giới hạn tin cậy: x = t (α,ƒ).Sx

TRong một số trường hợp còn tính sai số tương đối: A= ∆x. 100/x

Trong đó:

xi: giá trị số liệu thực nghiệm

x: trung bình cộng

n: số lần thí nghiệm

t(α,ƒ) tra theo bảng với α = 0,95; ƒ = n-1

2.3 Thực nghiệm chiết tách, tinh chế và số liệu phổ, thử hoạt tính sinh học của các

hợp chất từ loài nghiên cứu

Đồ thị tương quan gi ữa mật độ quang h ọc và nồng độ DPPH

y = 0.3225x + 0.0241

R2 = 0.9938

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

1.6000

1.8000

0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000

Nồng độ DPPH mM

Mật

độ

qua

ng họ

c (O

D)

2.3.1 Chiết mẫu thực vật

Các mẫu lá, vỏ thân, cành, rễ được nghiền nhỏ và tiến hành chiết riêng biệt.

Từng bộ phận của loài được ngâm chiết nhiều lần ở nhiệt độ phòng với methanol.

Gộp các dịch chiết của từng lần và từng loại tương ứng, lọc, loại dung môi dưới áp

suất giảm thu được cao chiết MeOH. Các mẫu chiết được gọi theo tên bộ phận cây sử

dụng.

2.3.2 Sàng lọc hoạt tính các cao chiết bộ phận:

Cao chiết lá, vỏ thân, cành, rễ sau khi loại hết dung môi, làm khô tiến hành cân và

pha loãng theo các nồng độ được sử dụng thử các hoạt tính : kháng sinh, gây độc tế bào

và chống oxy hóa DPPH theo các phương pháp đã trình bày trong phần trên (2.2.3)

2.3.3 Chiết tách và phân lập các chất từ cao chiết vỏ thân:

Tiến hành tách chiết mẫu vỏ thân theo quy trình như sau:

Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ thân cây Mít lá đen

Phân lập các chất từ cao chiết

Tiến hành phân lập các chất từ cặn chiết diclometan thân sử dụng sắc ký cột

với chất hấp phụ silica gel, dung dịch rửa giải là n-Hexan/EtOAc tăng dần tỷ lệ từ

Dịch chiết tổng MeOH 153,7g

Chiết siêu âm (3 lần) trong MeOH

Mẫu vỏ thân nghiền nhỏ 1kg

Cao chiết MeOH 2 95,8g

Cất loại dung môi

Dịch chiết diclometan

Cao chiết diclometan 20,9g

Cất loại dung môi

Cao tổng 1

Cao chiết EtOAc 37g

Chiết diclometan

Cất loại dung môi

Chiết EtOAc

0-100% thu phân đoạn. Sau khi xử lý các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột

lặp lại với các dung môi thích hợp, kết tinh lại thu đươc các hợp chất AFD2, AFL2,

AFD3, AFD6.

Quá trình phân lập các chất từ cao chiết DCM được khái quát theo sơ đồ sau:

Hình 2.2: Phân lập các chất từ cao chiết DCM

Chất AFD2:

Sắc ký cột cao chiết Diclometan bằng hệ dung môi n-hexan: EtOAc với tỷ lệ

tăng dần, ở hệ dung môi n-hexan: EtOAc (95:5) thu được phân đoạn B giàu chất

AFD2 và AFL2. Tiếp tục tiến hành sắc ký cột PĐ B với hệ n-hexan: EtOAc từ 0-

5%, chúng tôi thu được các phân đoạn giàu chất ADF2, chất này sau đó được kết

tinh lại trong n-hexan thu được chất màu trắng, kết tinh dạng chùm hình kim.

AFD2 được xác định là β –sitosterol dựa trên các kết quả sắc ký bản mỏng so sánh

với chất chuẩn Rf = 0,54 (TLC, silica gel, n-hexan: EtOAc = 80:20), điểm nóng

chảy 140-1420C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 3,52 (1H, m, H-3);

5,35 (1H, dd; 3,0 Hz, 3,0 Hz, H-6); 0,68 (3H, s, H-18); 1,01 (3H, s, H-19); 0,93

Cao chiết Diclometan (20g)

SKC silicagel n-hexan: EtOAc (0-100%)

5% EtOAc 15% EtOAc 40% EtOAc

PHĐ B 1,3g

PHĐ C 15mg

PHĐ E 64mg

AFD6 20mg

AFD3 8mg

AFD2 26mg

AFL2 11mg

Kết tinh phân đoạn

SKC silica-gel Kết tinh

phân đoạn

Kết tinh phân đoạn

hệ n-hexan: EtOAc (0-10%)

(3H, d, J = 7,0 Hz, H- 21); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz,

H-27); δH 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H- 29).

Chất AFL2:

Tương tự AFD2, sau khi sắc ký cột PĐ B và tiến hành SKBM kiểm tra các

phân đoạn, để kết tinh thu được tinh thể trắng AFL2, điểm nóng chảy 262 – 2640C;

TLC: Rf 0.78 (n-hexan-EtOAc =6:4); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 0,73

(3H, s, H-24), 0,88 (3H, s, H-25), 0,89 (3H, d, J = 2.7 Hz, H-23), 0,96 (3H, s, H-

30), 1,01 (3H, s, H-26), 1,02 (3H, s, H-27), 1,06 (3H, s, H-28), 1,19 (3H, s, H-29),

1,26 (3H, s, H-30), 1,97 (1H, m, H-1a), 2,28 (2H, m, H-2b, H-4), 2,40 (1H, m, H-

2a), 1,29-1,78 (m);

Chất AFD3:

Khi giải hấp với hệ n-hexan: EtOAc (85:15) thu được phân đoạn C chứa một

cấu tử chính. Tiến hành kết tinh lại nhiều lần bằng EtOAc thu được chất AFD3 dưới

dạng chất rắn hình vảy màu trắng; Rf = 0, 43 (TLC, silica gel, n-hexan: EtOAc =

80:20); điểm nóng chảy 276-2800C.

1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 4;68 (2H, d, J = 32 Hz, H-29); 3,18

(m), 3,02 (m); 2,29(q); 1,96 (d); 1,69 (s, 3H, H-30); 0,76-1,66(m);

Chất AFD6:

Phân đoạn E tiếp tục được phân tách trên cột silicagel bằng hệ dung môi n-

hexan: EtOAc = 60:40 và kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được chất bột vô định

hình màu vàng.

1H NMR (MeOD, 500MHz) δ 12,89 (1H, s, OH-5); 7,18 (1H, s, H-6’), 6,28

(1H, s, H-3’), 6.31 (1H, s, H-6), 6,08 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-11), 5,45 (1H, br d,

J=9.45Hz, H-12), 5,28 (1H, br t, J = 6,5 Hz, H-17), 3,52 (1H, br dd, J = 7,5; 15 Hz,

H-16a), 3,44 (1H, br dd, J = 7,5; 15 Hz, H-16b), 1.93 (3H, br s, H3-15), 1.84 (3H,

br s, H3-20), 1.69 (6H, br s, H3-14, 19);

2.3.4 Thử hoạt tính các chất đã phân lập

Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp đã

nêu trong phần 2.2.

Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150µl) có giếng chất nồng độ

đầu là 20mg/ml. Tiến hành pha loãng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất thử

tiếp theo. Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha loãng về các nồng độ thấp

hơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 mg/ml;

0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml. Sử dụng 10 µl chất thử đã pha loãng cho mỗi giếng thử

nghiệm để được các nồng độ 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml.

Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu.

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính các dịch chiết tổng từ Artocarpus

nigrifolius C. Y. Wu

Tiến hành ngâm chiết riêng các mẫu (theo phương pháp đã nêu ở phần 2.3),

lượng cao chiết mỗi bộ phận thu được như sau:

Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu

STT Tên mẫu Khối lượng mẫu

khô (gam)

Khối lượng cao chiết

thu được (gam)

Hiệu suất

chiết (%)

1 Vỏ thân 40 2,46 6,15

2 Thân 40 1,30 3,25

3 Rễ 40 1,28 3,20

4 Lá 40 2,65 6,62

Vậy, bộ phận lá và vỏ thân cho hiệu suất chiết cao nhất đạt hơn 6%.

Để lựa chọn bộ phận mẫu có khả năng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh

học tốt, chúng tôi tiến hành các phép thử.

3.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng sinh các cao chiết tổng Artocarpus

nigrifolius C. Y. Wu

Theo tài liệu đã công bố chi Artocarpus phân bố ở các nước trên thế giới có

hoạt tính kháng sinh nên chúng tôi tiến hành thử hoạt tính này đối với các bộ phận

khác nhau của cây thu hái ở Việt Nam. Theo phương pháp đã được mô tả ở phần

2.2.3.1 chúng tôi đã thu được các kết quả trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết

Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu

Tên mẫu

Chủng vi sinh vật

IC 50 (µg/ml)

Lá Vỏ thân Cành Rễ

Gram

(+)

Lactobacillus fermentum 4,25 91,4 >128 95,09

Bacillus subtilis 3,65 71,62 >128 64,32

Staphylococcus aureus 5,49 20,97 88,80 74,13

Gram

(-)

Salmonella enterica >128 >128 >128 >128

Escherichia coli >128 >128 >128 >128

Pseudomonas aeruginosa >128 >128 >128 >128

Nấm Candida albican >128 >128 >128 >128

Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các mẫu trên các chủng vi sinh vật gram

(+), gram (-) và nấm được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy mẫu lá, vỏ thân, cành và rễ

đều có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật gram (+) nhưng hầu như không kháng

các chủng vi khuẩn gram (–) và nấm kiểm định trên. Trong đó mẫu lá có hoạt tính

mạnh nhất thể hiện giá trị IC50 nhỏ nhất với chủng Lactobacillus fermentum,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus lần lượt là 4,25; 3,65; 5,49 µg/ml. Ngoài ra

mẫu vỏ thân cũng cho hoạt tính khá tốt, đặc biệt kháng với chủng Staphylococcus

aureus với giá trị IC50 là 20,97µg/ml.

Các nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cao chiết lá, thân, vỏ, rễ của các loài

khác trong chi Artocarpus cũng cho phổ kháng sinh tương đối rộng với nhiều chủng

vi khuẩn. Như kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cao chiết nước loài

Artocarpus heterophyllus của Khan và cộng sự ( 2003) cho thấy hoạt tính ức chế

của cao chiết với các chủng như S.aureus, E. faecalis, S. typhimurium và E. coli.

Kết quả này chứng minh tác dụng kháng viêm của cây này đã đươc dùng

trong y học cổ truyền; góp phần định hướng cho việc sử dụng và khai thác loài như

một kháng sinh thực vật chữa các bệnh do vi khuẩn gram (+) gây ra.

3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống ôxy hoá DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa gần đây được quan tâm nhiều hơn bởi nó như một

chìa khóa vạn năng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học khác. Các chất chống oxy

hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất

trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực

phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phòng và

điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung

thư….Các chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc

điểm lý hóa của chúng như thân thiện với cơ thể, bền nhiệt … các chất này thường

có bản chất là các polyphenon. Theo như tài liệu đã công bố, chi Mít rất giàu

polyphenon và cũng có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao. Do vậy chúng tôi

tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính

chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật. DPPH là gốc tự do có màu tím hấp thụ

cực đại ở bước sóng 517 nm nó đại diện cho các gốc tự do có bản chất hóa học.

Chất thử có khả năng khử gốc tự do này nghĩa là chúng làm mất màu DPPH, quan

sát khả năng làm mất màu DPPH của chất thử nhiều hay ít để có thể đánh giá mức

độ chống oxy hóa của chất thử. Ở đây chúng tôi tiến hành thử khả năng bẫy gốc tự

do DPPH của các cao chiết tổng methanol của lá, vỏ thân, rễ và cành. Kết quả được

chỉ ra sau đây.

Bảng 3.3. Hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu lá, vỏ thân, rễ và cành

Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu

STT Ký hiệu mẫu EC50

(µµµµg/ml)

1 Vỏ thân 42,08

2 Lá 80,09

3 Rễ 61,05

4 Cành >128

Đối chứng dương Resveratrol 8,50

Kết quả ở bảng trên cho thấy, cao chiết methanol của mẫu vỏ thân, lá, rễ có

hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Đặc biệt, mẫu vỏ thân có hoạt tính mạnh nhất thể

hiện ở nồng độ có hiệu quả bẫy gốc tự do DPPH (EC50) là 42,08 µg/ml. Kết quả

này gấp 5 lần so với chất tham khảo là resveratrol (chất này được sử dụng như là

một chất chống oxy hóa hiệu quả). Do đó có thể tiến tới nghiên cứu sâu hơn để tìm

kiếm hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa có giá trị như resveratrol đã được tìm

thấy trong quả nho từ dịch chiết vỏ thân của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu

này.

Theo nghiên cứu của Lin và cộng sự năm 2009, nhóm nghiên cứu cũng đã

phân lập được các chất prenylflavonoid từ cao chiết vỏ rễ loài Artocarpus

communis có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với giá trị ED50 đạt từ 18,7 đến 45µM.

3.1.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào

Rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư đã được phân

lập từ chi Artocarpus, hứa hẹn khả năng ứng dụng của chúng trong việc chữa trị

ung thư, một căn bệnh nan y hiện nay.

Tiến hành sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết các bộ phận cây

theo phương pháp đã mô tả ở phần 2.2.3.2, chúng tôi đã thu được những kết quả

như sau:

Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao dịch chiết các bộ phận

loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu

Kết quả bảng 3.3 và hình 3.1 chỉ ra rằng bốn cao chiết methanol từ vỏ thân,

lá, cành và rễ của Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu đều thể hiện hoạt tính gây độc

tế bào trên cả 4 dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2, Lu và MCF7 sau 72 h nuôi

cấy. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu thử phụ thuộc vào nồng độ, nồng độ

càng cao thì khả năng gây độc càng mạnh. Giá trị IC50 của các mẫu thử đối với cả

bốn dòng tế bào trên trong khoảng 10µg/ml – 86µg/ml. Trong đó, cao chiết

methanol từ cành có hoạt tính tốt thể hiện ở giá trị IC50 thấp nhất lần lượt là 10,06

và 19,21 µg/ml trên dòng tế bào HepG2 và KB. Cao chiết methanol từ rễ cho hoạt

tính yếu thể hiện ở giá trị IC50 lớn hơn là 55,62 - 86,64 µg/ml. Cao chiết vỏ thân có

TT Tên mẫu

IC 50 (µg/ml)

KB HepG2 Lu MCF7

1 Vỏ thân 21,03 52,45 56,20 20,10

2 Lá 24,20 50,28 35,84 22,68

3 Rễ 55,62 54,48 86,64 75,46

4 Cành 19,21 10,06 71,66 46,03

ĐC Ellipticine 0,51-1,25

hoạt tính trung bình nh

KB và MCF7 thể hiện ở

IC50 trên dòng HepG2, Lu.

Như vậy, kết quả

C.Y.Wu thể hiện hoạt tính t

chống oxy hóa hệ DPPH

cứu sâu hơn về thành ph

nhằm tìm kiếm các chấ

phòng và điều trị bệnh.

3.2. Thành phần hóa họ

Chọn phần mẫu vỏ

phân lập các chất theo các b

silica-gel cao chiết dichlometan

EtOAc theo tỷ lệ tăng dầ

ADF3, ADF6.

Hình 3.1 S

ình nhưng đặc biệt có hoạt tính gây độc chọn lọ

ể ện ở giá IC50 là 21,03 và 20,10 µg/ml thấp h

trên dòng HepG2, Lu.

ậ ết quả cho thấy bộ phận vỏ thân loài Artocarpus nigrifol

ệ ạt tính tốt với cả ba hoạt tính : kháng sinh

ệ DPPH. Do đó, chúng tôi quyết định chọn bộ ph

ành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các ch

ếm các chất có hoạt tính sinh học cao có khả nă

ị ệnh.

ần hóa học của loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu:

ầ ẫu vỏ thân để phân lập các chất, chúng tôi tiế

theo các bước đã được đưa ra trong phần thực nghi

ết dichlometan với hệ dung môi rửa giải là h

ỷ ệ ăng dần EtOAc (0-100%) thu được các hợp ch

Sắc ký cột cao chiết DCM và SKBM một số

chiết mẫu vỏ thân

độ ọn lọc với 2 dòng tế bào

ấp hơn so với giá trị

Artocarpus nigrifolius

t tính : kháng sinh, gây độc tế bào và

ọn bộ phận này để nghiên

ọ ủa các chất đã tách được

ả năng ứng dụng trong

C.Y.Wu:

t, chúng tôi tiến hành quy trình

ực nghiệm. Sắc ký cột

à hỗn hợp n-hexan:

ợp chất: AFD2, AFL2,

ột số phân đoạn cao

• Chất AFD2: β –

HO

Chất thu được d

và EtOAc. Dựa trên các k

được từ cao chiết thân AFD2

silica gel, n-hexan: EtOAc = 80:20

sitosterol chuẩn: có tín hi

trưng cho H-6. Vậy, hợ

steroid tồn tại phổ biến trong th

Hình 3.2

• Chất AFL2 : friedelan

Phổ 1H-NMR cho bi

hiệu của 8 nhóm metyl bao g

1,05, 1,18 cùng với 1 tín hi1H-NMR còn cho thấy các tín hi

–sitosterol

H

H H

H

3

6

ợc dưới dạng kết tinh hình kim màu trắng trong h

ên các kết quả sắc ký bản mỏng so sánh nhận th

ết thân AFD2 với mẫu β-sitosterol chuẩn cùng có R

hexan: EtOAc = 80:20). Phổ 1H-NMR của AFD2 tr

ẩn: có tín hiệu δ= 3,52 ppm đặc trưng cho H-3 và

ậy, hợp chất AFD2 được xác định là β-sitosterol,

ổ biến trong thực vật.

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng so sánh của ADF2 và

t AFL2 : friedelan -3-one

NMR cho biết đây là một triterpen khung friedelan th

a 8 nhóm metyl bao gồm 7 tín hiệu singlet ở δH 0,73, 0,87, 0,96, 1,00, 1,01,

ới 1 tín hiệu double ở δH 0,88 (3H, d; J=6,4 Hz

ấy các tín hiệu tại 2,39 (1H, ddd; J = 2,0; 5,0 & 13,8 Hz

AFD2 β

β-sitosterol

ắng trong hỗn hợp n-hexan

ận thấy hợp chất tách

cùng có Rf = 0,54 (TLC,

a AFD2 trùng với phổ của β-

và δ= 5,35 ppm đặc

sitosterol, một hợp chất

à β-sitosterol

t triterpen khung friedelan thể hiện qua tín

,73, 0,87, 0,96, 1,00, 1,01,

6,4 Hz; H-23). Trên phổ

2,0; 5,0 & 13,8 Hz) được

sitosterol

gán cho 2H-a và 2,30 (1H, dd; J=7,2 & 13,0Hz) được gán cho 2H-b ; 2,24 (1H, q;

J=6,5 Hz) cho H4.

Phổ 13C-NMR được nêu trong bảng 3.4 cho thấy phân tử AFL2 có 30 nguyên

tử carbon bao gồm 7 carbon bậc 4 trong đó có tín hiệu của một nhóm carbonyl ở δC

= 213,1ppm ; 4 tín hiệu CH, 11 tín hiệu CH2 và 8 tín hiệu CH3. Ngoài tín hiệu ở

213,1 ppm, tất cả các tín hiệu của các carbon còn lại đều ở trong vùng từ 6,82 –

59,54 ppm cho thấy trong phân tử chỉ có một nhóm chức carbonyl.

Các số liệu phổ thu được hoàn toàn đồng nhất với số liệu phổ của friedelan-

3-one trong tài liệu [22]. Do đó, cấu trúc của hợp chất được xác định là friedelan-

3-one (friedelin). Trong một nghiên cứu gần đây, thử nghiệm hoạt tính gây độc tế

bào cho thấy friedelan-3-one có hoạt tính gây độc với dòng tế bào lympho T (T-

lymphoblastic leukemia, CEMSS) ở giá trị LD50 là 5,8 µg/ml [25]. Ngoài ra, các

nghiên cứu khác cũng cho thấy chất này có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ

sốt trên chuột thực nghiệm [25].

• Chất AFD3: axit betulinic

Đây là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình kim không màu trong MeOH,

không hấp thụ tia tử ngoại, điểm nóng chảy 276-280oC.

Friedelan-3-one

Phổ 1H- NMR cho các thấy sự hiện diện của hai proton nhóm exometylen [

δH 4,61 (1H, br s, H-29) và 4,74 (1H, br s, H=29)], một tín hiệu OH [ δH = 3,19

(1H, dd, J =11,3 và 4,8 Hz, H-3)], một proton allyl [ δH 3,00 (1H, dt, J =11,0 và

4,8 Hz,H-19)], một nhóm metyl vinyl [ δH 1,69 (3H, s, H3-30)], và 5 nhóm metyl

bậc ba [ δH 0,76 (3H, s, H3-24), 0,83 (3H, s, H3-25), 0,94 (3H, s, H3-23), 0,97 (3H,

s, H3-26) và 0,98 (3H, s, H3-27)].

Phổ 13C - NMR cho các pic cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 30

carbon, trong đó có hai carbon của nhóm exometylen [ δc 151,0(s, C-20) và

109,5(t, C-29)], một carbon của nhóm –COOH [ δc 179,4(s, C-28)] và một carbon

sp3 mang oxygen [ δc 78,9(d, C-3)].

Tổng hợp các số liệu trên cho thấy chất AFD3 có công thức phân tử là

C30H48O3 với độ bất bão hòa bằng 7. Trừ đi một nối đôi C=C của nhóm

exometylen và một nhóm –COOH thì hợp chất này phải có 5 vòng. Do đó có thể

kết luận hợp chất này là một triterpen acid mang một nhóm exometylen, một

nhóm metyl vinyl, một nhóm –OH tự do và 6 nhóm metyl. Ngoài ra sự hiện diện

của nối đôi exometylen và một nhóm metyl vinyl cho thấy trong phân tử có nhóm

isopropenyl [δc 151,0(s, C-20) và 109,5(t, C-29) và 19,1(q, C-30)].

Các số liệu phổ trên phù hợp với số liệu phổ của acid bentulinic trong các

tài liệu [14].

Axít bentulinic được phân lập từ rất nhiều loài thực vật như Cornus florida,

Zizyphus vulgaris, Arbutus menziesii,… Gần đây người ta đã phát hiện ra nhiều

Axit betulinic

hoạt tính sinh học lý thú của nó như hoạt tính kháng HIV, kháng khuẩn, kháng

nấm, kháng viêm, kháng sốt rét, chống ung thư. Axit betulinic là tác nhân ức chế

cọn lọc đối với các u ác tính ở người bằng cách gây ra hiện tượng apoptosis.

Trong nghiên cứu kháng khuẩn kháng nấm, axit betulinic ức chế sự phát triển của

nhiều loại nấm khác nhau với MIC trong vùng 12-47 µg/ml. Tốt nhất với chủng

Microsporum canis (12 µg/ml) [14].

Bảng 3.5: 13C – NMR của các chất AFL2 và AFD3 (CDCl3)

và (CDCl3 + CD3OD)

Chất

C

Axit betulinic Friedelan - 3 - one

1 t38,8t 22,3

2 27,1t 41,5t

3 78,9d 213,1s

4 38,7s 58,3d

5 55,3d 42,1s

6 18,3t 41,3t

7 34,3t 18,3t

8 40,7s 53,1d

9 50,5d 37,5s

10 37,1s 59,5d

11 20,9t 35,7t

12 25,5t 30,5t

13 38,3d 39,7s

14 42,4s 38,3s

15 30,6t 32,5t

16 32,2t 36,0t

17 56,2t 30,0s

18 46,9d 42,9d

19 49,5d 35,4t

20 150,6s 28,2s

21 29,6t 32,8t

22 37,2t 39,3t

23 27,9q 6,8q

24 15,3q 14,7q

25 15,9q 17,9q

26 16,0q 20,3q

27 14,6q 18,7q

28 179,3s 32,1q

29 109,4t 35,0q

30 19,3q 31,8q

• Chất AFD6 : artochamin B

AFD6 được tách ra từ cây có dạng bột vàng cấu trúc vô định hình, có công

thức phân tử là C25H24O7 được xác định nhờ các phổ NMR, HMQC,HMBC.

Phổ 1H NMR của AFD6 trùng lặp với phổ 1H-NMR artochamin B [34], có

tín hiệu proton của nhóm hydroxyl δ = 12,89(1H, s,OH), tín hiệu của một nhóm

isoprenyl đóng vòng [δ= 6,08 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-11), δ= 5,45 (1H, br d, J= 9,5

Hz), và hai nhóm metyl singlet ở δ=1,93 và 1,69ppm. Tín hiệu của một nhóm

Artochamin B

isoprenyl không đóng vòng có δ= 5,28ppm (1H, t, J = 6,5 Hz, H-17), tín hiệu δ=

3,52ppm (1H, dd, J = 7,5; 15Hz, H-16a) và 3,44 (1H, dd, J = 7,5; 15Hz, H-16b),

nhóm metyl δ 1,84 và 1,69ppm (mỗi 3H, br s)]. Phổ 1H NMR cũng cho thấy 3 tín

hiệu singlet của vòng thơm tại δ 7,18ppm được gán cho H-4 (1H, s), δ= 6,35 và

6,21ppm được gán cho H-7 và H-10.

Cấu trúc phân tử của AFD6 được khẳng định rõ hơn dựa trên dữ liệu phổ

13C-NMR và các phổ 2D HMQC, HMBC phù hợp với các dữ liệu đã công bố trong

tài liệu [34]. Do đó, cấu trúc phân tử của artochamin B (AFD6) được xác định là:

2,3,8,10-tetrahydroxy-11-(3-methyl-2-butenyl)-6-(2-methyl-1-propenyl)-6H,7H-

[1]benzopyrano[4,3-b][1]benzopyran-7-one.

Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cây Mít lá đen được nghiên cứu ở

Việt Nam. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao chiết

diclometan cho thấy cây có chứa các hợp chất triterpenoid (axit bentulinic,

friedelin), hợp chất steroid (β-sitosterol) và hợp chất flavon (artochamin B). Qua kết

quả thử hoạt tính sinh học của cao chiết và các tài liệu tham khảo về các nhóm chất

trên, có thể hy vọng đây chính là các hợp chất góp phần tạo nên hoạt tính của cây.

3.3. Hoạt tính sinh học của các chất:

Tiến hành thử hoạt tính kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính

chống oxy hóa DPPH của các chất ta thu được những kết quả như sau:

3.3.1 Hoạt tính kháng sinh:

Thử nghiệm với các chủng vi khuẩn gram (-); gram (+) và nấm thu được các

kết quả như trong bảng:

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh của các chất chiết tách từ loài

Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu

TT 1 2 3 4

Tên mẫu AFD2 AFL2 AFD3 AFD6

Gram (+)

Lactobacilus fermentum >128 >128 nt >128

Bacillus subtilis >128 >128 nt 21,79

Staphylococcus aureus >128 >128 nt 25,14

Gram (-)

Salmonella enterica >128 >128 nt >128

Escherichia coli >128 >128 nt >128

Pseudomonas aeruginosa >128 >128 nt >128

Nấm Candida albican >128 >128 nt >128

Bảng kết quả trên cho thấy: Các chất gồm AFD2, AFL2 không thể hiện hoạt

tính trên các chủng vi sinh vật kiểm định ở nồng độ thấp hơn 128µg/ml.

Hợp chất artochamin B (AFD6) có hoạt tính khá mạnh với các dòng Bacillus

subtilis, Staphylococcus aureus với giá trị IC50 đạt được lần lượt là 21,79 và 25,14

µg/ml.

Hoạt tính kháng khuẩn còn thể hiện rõ hơn ở phần trăm ức chế sự phát triển

của vi sinh vật phụ thuộc vào nồng độ chất thử. Nồng độ chất thử càng cao thì phần

trăm ức chế càng lớn. Ở nồng độ 128 µg/ml AFD6 ức chế hoàn toàn sự phát triển

của Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus (hình 3.3).

Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo các nồng độ của AFD6

Theo một số tài liệu axit betulinic (AFD3) cũng có hoạt tính kháng E.coli và

một số chủng khác, tuy nhiên kết quả đưa ra là giá trị MIC tương đối cao

(250µg/ml) [14]. Do vậy AFD3 không phải là hoạt hoạt chất có hoạt tính kháng

sinh chính trong cây này. Kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi dự kiến chất

artochamin B là hoạt chất chính gây hoạt tính kháng sinh của cây Mít lá đen thu hái

ở Việt Nam.

0 0 0

87

100

0 0 0

70

100

0,5 2 8 32 128

nồng độ chất thử (µg/ml)

Bs Sa

3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào:

Tiến hành thử độc tế bào với các chất AFD2 và AFD6 đã phân lập được trên

các dòng tế bào ung thư; chúng tôi thu được các kết quả như sau:

Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào KB và Hep-G2 của các chất

STT Tên mẫu Dòng tế

bào

% ức chế tại nồng độ IC 50

(µg/ml) 128 32 8 2 0,5

1 AFD2 KB 99 75 50 32 11 8

Hep-G2 58 53 49 39 36 14

2 AFD6 KB 100 100 96 90 17 1,18

Hep-G2 99 97 88 35 32 3,6

ĐC Ellipticin KB 0,51

Hep-G2 0,35

Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB

0,5 µg/ml 8 µg/ml

32 µg/ml Ctr+

Hình 3.5 Minh họa ảTừ bảng kết quả

ung thư là khá mạnh,

lượt với các dòng KB và Hep

công bố về hoạt tính gây

AFD2 cũng có khả

cao, ở nồng độ 128 µg/ml AFD2

IC50 tương đối tốt là 8

Hoạt tính gây đ

AFD2 trong thử nghiệ

tính không cao đặc biệ

bào MCF7, artochamin B (AFD6) c

chất thử lớn hơn 8 µg/ml và

Ctr +

8 µg/ml

ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thết quả 3.7 ta nhận thấy: khả năng ức chế của AFD6

ạnh, thể hiện ở giá trị IC50 thấp đạt 3,6 µg/ml

òng KB và Hep-G2. Kết quả này cũng tương đương v

ạt tính gây độc tế bào của các chất tách được từ chi Mít.

ũng có khả năng ức chế dòng Hep-G2, tuy nhiên ho

độ 128 µg/ml AFD2 ức chế được 58% số lượng tế

µg/ml với dòng KB.

gây độc tế bào trên 2 dòng ung thư MCF7 và Lu c

ử nghiệm tiếp theo cũng cho kết quả tương tự:

ặc biệt với dòng tế bào Lu; AFD6 có hoạt tính tố

bào MCF7, artochamin B (AFD6) cũng ức chế hơn 95% lượng tế

ơn 8 µg/ml và đạt giá trị IC50 là 4,59 µg/ml. Trên dòng t

32 µg/ml

0,5 µg/ml

ào ung thư gan Hep-G2 ế ủa AFD6 với các tế bào

t 3,6 µg/ml và 1,18 µg/ml lần

ươ đương với các kết quả đã

ợ ừ chi Mít.

G2, tuy nhiên hoạt tính này không

ợng tế bào Hep-G2 và đạt

ư MCF7 và Lu của AFD6 và

ự: chất ADF2 có hoạt

ạt tính tốt hơn. Với dòng tế

ợng tế bào ở các nồng độ

là 4,59 µg/ml. Trên dòng tế bào Lu thì

hoạt tính của các chất thử

µg/ml . Kết quả thử nghiệ

Bảng 3.8

STT Tên mẫu

1 AFD2 MCF7Lu

2 AFD6 MCF7Lu

ĐC Ellipticin MCF7Lu

Như vậy, ở hoạt tính gây

mạnh.

Các kết quả thử nghi

thư thực nghiệm trên đ

thảo dược trong việc ph

Hình 3.6 Minh h

Ctr+

8 µg/ml

ất thử nghiệm đều thấp hơn, giá trị IC50 củ

ả ử nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây:

ảng 3.8 Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào MCF7 c

Dòng tế bào

% ức chế tại nồng độ

128 32 8 2

MCF7 60 55 45 42Lu 28 17 13 4MCF7 99 96 95 15Lu 99 95 8 5MCF7 Lu

ạt tính gây độc tế bào, hợp chất AFD6 đã thể

ế ả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào đối với các d

ên đây cho phép sử dụng AFD6 như một hoạ

ệc phòng và điều trị ung thư đặc biệt là ung thư

Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào

32 µg/ml

0,5 µg/ml

ủa AFD6 chỉ đạt: 20

ớ đây:

ào MCF7 của các chất

ế ạ ồng độ IC50 (µg/ml) 2 0,5

42 25 20 4 1 >128 15 15 4,59 5 1 20

0,53 0,45

ể hiện hoạt tính khá

ố ới các dòng tế bào ung

ột hoạt chất có nguồn gốc

à ung thư gan.

ào ung thư vú MCF7

Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng của AFD6 trên dòng tế bào ung thư phổi Lu

3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa:

Sử dụng phương pháp thử nghiệm chất chống oxy hóa với 1,1-diphenyl- 2-

picrylhydrazyl (DPPH) là các gốc tự do; chúng tôi tiến hành thử hoạt tính của hợp

chất artochamin B phân lập được từ loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu, thu được

kết quả như sau:

Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa của AFD6

STT Tên mẫu

Hoạt tính chống oxy hóa

% ức chế tại nồng độ EC50(µg/ml)

128 32 8 2 0,5

AFD6 91,4 85,34 30,94 4,6 0 20,51

ĐC Resveratrol 8,50

Ctr+ 32 µg/ml

8 µg/ml 0,5 µg/ml

Hình 3.8

Từ kết quả trên, chúng tôi nh

chống oxy hóa tốt. Giá trị

= 20,51 µg/ml; điều này là b

nhóm chất đã được chứ

Như vậy, qua kế

phân lập từ loài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu có th

tính tốt nhất trong tất cả

biệt tốt với các dòng ung th

và đạt IC50 tốt nhất trên dòng KB là 1,18

Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống oxy hóa theo

phương pháp sử dụng DPPH của AFD6

ên, chúng tôi nhận thấy, artochamin B l

ốt. Giá trị ức chế có hiệu quả các gốc tự do DPPH c

ày là bởi artochamin B là hợp chất thuộc nhóm flavonoid, m

ứng minh có khả năng chống oxy hóa rất hiệ

ậy, qua kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học của các h

ài Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu có thể thấy: artochamin B có ho

ất cả các thử nghiệm. Trong đó, artochamin B có tác

òng ung thư thử nghiệm, nó có khả năng ức chế

ên dòng KB là 1,18 µg/ml.

ng oxy hóa theo

y, artochamin B là chất có khả năng

ự do DPPH của chất đạt EC50

ấ ộc nhóm flavonoid, một

ất hiệu quả.

ọc của các hợp chất được

ể ấy: artochamin B có hoạt

artochamin B có tác động đặc

ă ức chế cả 4 dòng tế bào

KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ

1. Về hoạt tính dịch chiết các bộ phận của cây:

Bốn dịch chiết các bộ phận cây mít lá đen gồm: vỏ thân, lá, cành, rễ đều thể

hiện hoạt tính trong các thử nghiệm. Trong đó:

- Hoạt tính kháng sinh: các dịch chiết lá, vỏ thân, cành, rễ đều có hoạt tính

kháng chủng vi sinh vật gram (+) với IC50 trong khoảng 3,65- 95,09 µg/ml.

- Hoạt tính chống ô xy hoá DPPH: ngoài mẫu cành, các mẫu đều có hoạt

tính, đặc biệt mẫu vỏ thân có hoạt tính mạnh nhất với giá trị EC50 là 42,08 µg/ml.

- Hoạt tính gây độc tế bào: bốn cặn chiết đều thể hiện hoạt tính gây độc tế

bào trên cả 4 dòng ung thư thực nghiệm KB, HepG2, Lu và MCF7 với các giá trị

IC50 trong khoảng 10µg/ml – 86µg/ml.

2. Về thành phần hóa học của cây:

Từ vỏ thân loài mít lá đen (Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu) thu hái tại Sơn

La đã phân lập được các chất:

- Hai hợp chất triterpenoid: axit bentulinic, friedelin

- Một hợp chất steroid là β-sitosterol

- Một hợp chất flavon là artochamin B

3. Về hoạt tính sinh học các chất phân lập được:

Các chất phân lập được thể hiện hoạt tính khác nhau trong mỗi thử nghiệm,

trong đó, artochamin B là hợp chất có hoạt tính tốt nhất; với khả năng ức chế

Bacillus subtilis (IC50 là 21,79 µg/ml), Staphylococcus aureus (IC50 là 25,14

µg/ml), gây độc trên cả bốn dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu và MCF7 với các

giá trị IC50 lần lượt là 1,18; 3,6; 20,0; 4,59 µg/ml, hoạt tính chống oxy hóa mạnh với

giá trị EC50 là 20,51 µg/ml.

KIẾN NGHỊ:

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính của các chất, đặc biệt là artochamin

B để có thể áp dụng vào thực tiễn.

Những dịch chiết bộ phận khác của cây cũng có nhiều hoạt tính tốt và cần

tiếp tục được nghiên cứu.

TÀI LI ỆU THAM KH ẢO

Tiếng Việt

1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,

Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội.

2. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.

3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học- Hà Nội.

4. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ - TP. Hồ Chí Minh

5. Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của

thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật- Hà Nội.

6. Nguyễn Chí Bảo (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế

bào của cây Chay lá to (Artocarpus lakoocha Roxb.) và cây Mít dai

(Artocarpus heterophyllus LamK.) ở Việt Nam, Luận văn Tiến sĩ Hóa học ,

Viện Hóa học.

Tiếng Anh

7. Anima Pandey and S.P.Bhatnagar (2009), “Preliminary photochemical screening

and antimicrobial studies on Artocarpus lakoocha Roxb”, Ancient science of

life, Vol 28, No 4, pp. 21-24

8. Charoenlarp, P.Radomyos, P.Harinasuta (1981), “Treatment of taeniasis with

Puag-Haad: a crude extract of Artocarpus lakoocha wood”, The Southeast

Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 12, 568–570.

9. Euis Holisotan Hakima, Asnizara, Yurnawilisa, Norio Aimib, Mariko Kitajimab,

Hiromitsu Takayamab (2002), “Artoindonesianin P, a new prenylated

flavones with cytotoxic activity from Artocarpus lanceifolius”, Fitoterapia,

vol.73, pp. 668–673

10. R.I John Fresney (1993): “Culture of animal Cells: A manual of basis

techniques, 3rd Edition”, Wiley & Sons Inc., New York.

11. Hadacek, F., Greger, H. (2000), “Test of antifungal natural products

methodolagies, comparability of result and assay choise”, Phytochem. Anal.,

90, 137-147.

12. Iqbal Musthapa, Lia D. Juliawaty, Yana M. Syah, Euis H. Hakim, Jalifah Latip,

and Emilio L. Ghisalberti (2009), “An Oxepinoflavone from Artocarpus

elasticus with Cytotoxic Activity Against P-388 Cells”, Arch Pharm Res,

Vol 32, No 2, pp. 191-194

13. Junichi Kitajima, Toru Ishikawa, Eiko Fujimatu, Kyoko Kondho, Tomomi

Takayanagi (2003), “Glycoside of 2-C-methyl-D-erthritol from the fruits of

anise, coriander and cumin”, Phytochemistry, Vol.62, pp.115-120

14. L.J. Shai, L.J.McGaw, M.A.Aderogha, L.K.Mdee, J.N.Eloff (2008), “Four

pentacyclic triterpenoids with antifungal and antibacterial activity from

Curtisia dentate (Burm.f) C.A.Sm.leaves”, Journal of Ethnopharmacology,

vol.119, pp.238-244.

15. Lin, K.W., Liu, C.H., Tu, H.Y., Ko, H.H., Wei, B.L., 2009, “Antioxidant

prenylflavonoids from Artocarpus communis and Artocarpus elasticus”,

Food Chemistry 115, 558–562.

16. M.R. Khan, A.D. Omoloso, M. Kihara (2003), “Antibacterial activity of

Artocarpus heterophyllus”, Fitoterapia , Vol.74, pp. 501–505

17. Manjeshwar Shrinath Baliga, Arnadi Ramachandrayya Shivashankara,

Raghavendra Haniadka, Jerome Dsouza, Harshith P. Bhat (2011),

“Phytochemistry, nutritional and pharmacological properties of Artocarpus

heterophyllus Lam (jackfruit): A review”, Food Research International, vol.

44, pp.1800–1811.

18. Mossmann, T., (1983) “Rapid colorimetric assay for cellular growth and

survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J. Immunol.

Meth.65, 55-63.

19. NajihahMohd Hashim, M. Rahmani, G.Cheng Lian Ee, Mohd A. Sukari, M.

Yahayu, W.Oktima, A. Ali and Rusea Go (2012), “Antiproliferative Activity

of Xanthones Isolated from Artocarpus obtusus”, Journal of Biomedicine

and Biotechnology, Volume 2012, Article ID 130627

20. Namdaung, U., Aroonrerk, N., Suksamrarn, S., Danwisetkanjana, K.,

Saenboonrueng, J., Arjchomphu, W., Suksamrarn, A., (2006), “ Bioactive

constituents of the root bark of Artocarpus rigidus subsp. rigidus”,

Chemical & Pharmaceutical Bulletin, vol.54, pp.1433–1436.

21. Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco Sindambiwe, Arnold J. Vlietinck, Dirk

Vanden Berghe; “ Bioassay for antibacterial and antifungal activities”;

Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of

Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of

Antwerp, Belgium,1-13 (2005)

22. Ratna Asmah Susidarti, M.Rahmani, A.Manaf Ali, M.Aspollah Sukari, Hazar

B.M.Ismail, “ Friedelin from Kelat merah” , Eugenia chlorantha Duthie.

23. Scudiero D. A., Shoemaker R. H., Kenneth D. P., Monks A., et al, (1988),

“Evaluation of a soluable tetrazolium/ formazan assay for cell growth and

drug sensibility in culture using human and other tumor cell lines.”, Cancer

Reaseach. 48: 4827-4833.

24. Shashi B. Mahato and Asish P. Kundu (1994), “13C-NMR spectra of

pentacyclic triterpenoids, a compilation and some salient features”,

Phytochemistry, Vol. 37, No. 6, pp. 1517-1575

25. Sisay Feleke and Abeba Brehane (2005), “ Triterpene compounds from latex of

Ficus sur I”, Chemical Society of Ethiopia, Vol.19(2), pp. 307-310

26. Stefan Berger, Dieter Sicker (2009), “Classic in spectroscopy – Isolation and

structure elucidation of natural products”, Wiley – VCH, pp. 481-499.

27. Suhartati, T., Achmad, S.A., Aimi, N., Hakim, E.H., Kitajima, M., Takayama,

H., Takeya, K., (2001), “Artoindonesianin L, a new prenylated flavone with

cytotoxicity activity from Artocarpus rotunda”, Fitoterapia, vol. 72,

pp.912–918.

28. Suhartati, T., Yandri, Hadi, S. (2008), “ The bioactivity test of artonin E from

the bark of Artocarpus rigida Blume”, European Journal of Scientific

Research, vol.23, pp.330–337.

29. Supawatchara Singhatong, Donrawee Leelarungrayub and Chaiyavat Chaiyasut

(2010), “Antioxidant and toxicity activities of Artocarpus lakoocha Roxb.

heartwood extract”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 4(10), pp.

947-953.

30. Syah, Y.M., Achmad, S.A., Ghisalberti, E.L., Hakim, E.H., Mujahidin, D.

(2004), “ Two new cytotoxic isoprenylated flavones, artoindonesianin U and

V from heartwood of A. chempeden”, Fitoterapia , vol.75, pp. 134–140.

31. U.B. Jagtap, V.A. Bapat (2010), “Artocarpus: A review of its traditional uses,

phytochemistry and pharmacology”, Journal of Ethnopharmacology 129

(2010) 142–166.

32. Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P

Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui and Berhanu M

Abegaz (2011), “Antimicrobial activities of the methanol extract and

compounds from Artocarpus communis (Moraceae)”, BMC Complementary

and Alternative Medicine.

33. Wang, Y., Deng, T., Lin, L., Pan, Y., Zheng, X., (2006), “Bioassay guided

isolation of antiatherosclerotic phytochemicals from Artocarpus altilis”,

Phytotherapy Research 20, 1052–1055

34. Yong-Hong Wang, Ai-Jun Hou, Lei Chen, Dao-Feng Chen, Han-Dong Sun,

Qin-Shi Zhao, Kenneth F. Bastow, Yuka Nakanish, Xi-Hong Wangn, Kuo-

Hsiung Lee (2004), “New Isoprenylated Flavones, Artochamins A-E, and

Cytotoxic Principles from Artocarpus chama”, J. Nat. Prod 67, 757-761

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của chất AFD2 58

Phụ lục 2: Các phổ của chất AFL2 59

Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất AFD3 60

Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của chất AFD6 61

Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR của chất AFD6 62

Phụ lục 7: Phổ 13C CPD & DEPT của chất AFD6 63

Phụ lục 8: Phổ HSQC và HMBC của chất AFD6 64

Phổ HMBC của chất AFD6