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| i Evaluación de técnicas de conservación para microorganismos de importancia en microbiología industrial en el Cepario de la Universidad de Santander. Angy Karolina Acosta Ovallos Universidad de Santander UDES Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales Programa de Microbiología Industrial Bucaramanga, Colombia Junio 10 del 2.019
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Evaluación de técnicas de conservación para microorganismos de importancia en
microbiología industrial en el Cepario de la Universidad de Santander.
Angy Karolina Acosta Ovallos
Universidad de Santander UDES
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
Programa de Microbiología Industrial
Bucaramanga, Colombia
Junio 10 del 2.019
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Evaluación de técnicas de conservación para microorganismos de importancia en
microbiología industrial en el Cepario de la Universidad de Santander.
Angy Karolina Acosta Ovallos
Trabajo de Grado para obtener el título de Microbióloga Industrial
Directora
Marithza Pardo Casas
Universidad de Santander UDES
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
Programa de Microbiología Industrial
Bucaramanga, Colombia
Junio 10 del 2.019
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Primeramente, darle gracias a Dios por darme la sabiduría y fuerzas para realizar cada uno de
mis logros, a mis padres por apoyarme en mi carrera profesional ya que ellos fueron mi motor,
mi guía y sustento, sin ellos no lograría este gran sueño que hoy se cumple. Gracias infinitas a
mis hermanas, amigos y profesores que me ayudaron a seguir adelante. También a mi hermosa
hija le dedico este logro porque ella es mi impulso para no caer.
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Agradecimientos
Agradezco a la Universidad de Santander UDES por facilitar sus instalaciones para llevar a cabo
este proyecto.
A mi Directora de tesis la Microbióloga Marithza Pardo Casas por la paciencia y dedicación
incondicional, por la disponibilidad de su tiempo y el soporte académico que me ofreció para que
este proyecto fuera posible.
Al personal del laboratorio de la Universidad, ya que su colaboración fue determinante para el
desarrollo y culminación del proyecto realizado.
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Contenido
Pág.
Introducción................................................................................................................................................ 1
1. Planteamiento del problema .................................................................................................................. 3
2. Justificación............................................................................................................................................. 4
2. Objetivos ................................................................................................................................................. 5
1.1 Objetivo General ........................................................................................................................... 5
1.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................................... 5
2. Marco teórico ......................................................................................................................................... 6
2.1 Estado del Arte. ............................................................................................................................. 7
2.2 Colecciones de Microorganismos .................................................................................................. 8
2.3 Conservación y Preservación de Microorganismos ....................................................................... 9
2.3.1 Métodos de Conservación a largo plazo. .......................................................................... 10
2.3.2 Métodos de conservación a mediano plazo. .................................................................... 12
2.3.3 Métodos de conservación a corto plazo. .......................................................................... 13
2.3.4 Crio protectores. ............................................................................................................... 16
2.4 Curva de Crecimiento Bacteriano ................................................................................................ 17
Figura 1. Curva de crecimiento modelo. Adaptado de (Madigan M. et al. 2003) .............................. 18
2.5 Sistemas de Identificación BD BBL Crystal ................................................................................... 21
Figura 2. Reactivos y principios empleados en el sistema BBL Crystal E/NF ID. ................................ 28
2.6 Mantenimiento y viabilidad en Hongos Filamentosos................................................................. 30
3. Metodología.......................................................................................................................................... 31
3.1 Tipo de Estudio ............................................................................................................................ 31
3.2 Área de Estudio ........................................................................................................................... 31
3.3 Universo ...................................................................................................................................... 31
3.4 Población ..................................................................................................................................... 32
3.5 Material Biológico ....................................................................................................................... 32
Tabla 1. Microorganismos de investigación. ..................................................................................... 32
3.6 Métodos ...................................................................................................................................... 33
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3.6.1 Recuperación de los microorganismos ............................................................................. 33
3.6.2 Cinética de Crecimiento. Se realizó una curva de crecimiento inicial de los
microorganismos a conservar (Bacterias Gram Positivas y Bacterias Gram Negativas). Esta
curva se realizó en base a Pedroza, A., et al., 2007 (Manual de introducción a la biotecnología).
Las condiciones del cultivo fueron: Crecimiento por 24 horas a 37 °C a 120 rpm. Luego se
repicaron las Bacterias en medios de agar BHI. ......................................................................... 34
3.6.3 Conservación de Bacterias Gram Positivas y Bacterias Gram Negativas. Para las bacterias
Gram Positivas y Gram Negativas se probaron 3 métodos de conservación los cuales serán
descritos posteriormente. ......................................................................................................... 35
3.6.4 Conservación de Hongos. Para los hongos filamentosos se evaluaron cuatro métodos de
conservación de los cuales uno de ellos fue sometido a Crio conservación (Leche Descremada
al 20%) y dos restantes a preservación (Papel de Filtro Whatmman y Agua Estéril). ................ 37
3.6.5 Evaluación de los métodos de Conservación. La evaluación se realizó mediante la Pureza
y Viabilidad de cada microorganismo conservado en un intervalo de 3, 6 y 12 meses de
conservación. ............................................................................................................................. 38
3.6.6 Diseño del Manual de protocolos de mantenimiento y preservación de microorganismos
del cepario de la Universidad de Santander .............................................................................. 41
Se realizó un manual con protocolos óptimos de mantenimiento y preservación de
microorganismos, presentes en el cepario de la Universidad de Santander. Para esto, fue
colectada la información referente a las cepas que conforman el cepario y los métodos
actualmente utilizados para su identificación y mantenimiento. También estos procedimientos
fueron seleccionados de acuerdo a su comportamiento y ajuste a las condiciones técnicas,
ambientales y presupuestas del cepario.................................................................................... 41
4. Resultados ............................................................................................................................................ 42
4.1 Curvas de Crecimiento ................................................................................................................ 42
Tabla 2. Fase exponencial tardía de los microorganismos estudiados. ............................................. 42
4.1 Bacterias Gram Negativas ........................................................................................................... 42
4.1.1 Escherichia coli .................................................................................................................. 42
Figura 3. Curva de crecimiento de E. coli. Fuente: Autor. ................................................................. 43
Figura 4. Recuperación a través del tiempo de Escherichia coli. Tres métodos de conservación
fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor. ....................................................................... 44
Figura 5. Resultado de E. coli mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor. ...................... 45
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4.1.2 Pseudomonas aeruginosa ................................................................................................. 45
Figura 6. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Fuente: Autor. .................................. 46
Figura 7. Recuperación a través del tiempo de Pseudomonas aeruginosa. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor. ................................................. 46
Figura 8. Resultado de P. aeruginosa mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor. .......... 47
4.1.3 Citrobacter freundii ........................................................................................................... 47
Figura 9. Curva de crecimiento de C. freundii. Fuente: Autor. .......................................................... 48
Figura 10. Recuperación a través del tiempo de Citrobacter freundii Tres métodos de conservación
fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor. ....................................................................... 49
Figura 11. Resultado de C. freundii mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor. ............. 50
4.1.4 Serratia marcenscens ........................................................................................................ 50
Figura 12. Curva de crecimiento de Serratia marcenscens. Tres métodos de conservación fueron
evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor. ................................................................................... 51
Figura 13. Recuperación a través del tiempo de Serratia marcenscens. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor. ................................................. 52
Figura 14. Resultado de Serratia marcenscens mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor.
.......................................................................................................................................................... 52
Figura 15. Comportamiento de la efectividad de los diferentes métodos a los 0, 3, 6 y 12 meses en
Bacterias Gram Negativas. Fuente: Autor ......................................................................................... 53
Tabla 3. Conteo de células viables en Bacterias Gram Negativas. Fuente: Autor. ............................. 53
Tabla 4. Conteo de células viables a los 12 meses y % de células no viables en Bacterias Gram
Negativas. Fuente: Autor. ................................................................................................................. 54
4.2 Bacterias Gram Positivas ............................................................................................................. 54
4.2.1 Bacillus cereus................................................................................................................... 54
Figura 15. Curva de crecimiento de Bacillus cereus. Fuente: Autor. ................................................. 55
Figura 16. Recuperación a través del tiempo de Bacillus cereus. Fuente: Autor. .............................. 56
Figura 17. Resultado de Bacillus cereus mediante el sistema de ID BBL Crystal GP. ......................... 57
4.2.2 Bacillus licheniformis ........................................................................................................ 57
Figura 18. Curva de crecimiento de Bacillus licheniformis. Fuente: Autor. ....................................... 58
Figura 19. Recuperación a través del tiempo de Bacillus licheniformis Fuente: Autor. ..................... 58
Figura 20. Resultado de Bacillus licheniformis mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor.
.......................................................................................................................................................... 59
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4.2.3 Bacillus thuringiensis ........................................................................................................ 59
Figura 21. Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis. Fuente: Autor. ....................................... 60
Figura 22. Recuperación a través del tiempo de Bacillus thuringiensis. Fuente: Autor. .................... 61
Figura 23. Resultado de Bacillus Thuringiensis mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor.
.......................................................................................................................................................... 61
4.2.4 Listeria monocytogenes .................................................................................................... 62
Figura 24. Curva de crecimiento de Listeria Monocytogenes. Fuente: Autor. ................................... 63
Figura 25. Recuperación a través del tiempo de Listeria monocytogenes. Fuente: Autor. ............... 63
Figura 26. Resultado de Listeria monocytogenes mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente:
Autor. ................................................................................................................................................ 64
Figura 16. Comportamiento de la efectividad de los diferentes métodos a los 0, 3, 6 y 12 meses en
Bacterias Gram Positivas. Fuente: Autor ........................................................................................... 64
Tabla 4. Conteo de células viables en Bacterias Gram Positivas. Fuente: Autor. .............................. 65
Tabla 5. Conteo de células viables a los 12 meses y % de células no viables en Bacterias Gram
Positivas. Fuente: Autor. ................................................................................................................... 65
4.3 Hongos Filamentosos .................................................................................................................. 66
4.3.1 Evaluación de la morfología macroscópica y microscópica. Teniendo en cuenta las
descripciones morfológicas macroscópicas y microscópicas de los hongos reportados
bibliográficamente, se procedió a la observación e identificación de cada cepa, determinando
así la estabilidad morfológica de cada cepa............................................................................... 66
4.3.1.1 Descripción Macroscópica ........................................................................................................... 66
Tabla 2. Características Macroscópicas de las cepas evaluadas. ....................................................... 67
4.3.1.2 Descripción Microscópica ............................................................................................................ 68
Tabla 3. Características microscópicas de las cepas evaluadas ......................................................... 69
4.4 Manual de protocolos de mantenimiento, preservación y verificación de microorganismos del
cepario de la Universidad de Santander. (Ver Apéndice A) ............................................................... 71
5. Discusión ............................................................................................................................................... 71
6. Conclusiones ......................................................................................................................................... 75
7. Recomendaciones ................................................................................................................................. 77
Referencias ............................................................................................................................................... 79
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Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Curva de crecimiento modelo. ...................................................................................... 18
Figura 2. Reactivos y principios empleados en el sistema BBL Crystal E/NF ID. ...................... 28
Figura 3. Curva de crecimiento de E. coli. ................................................................................... 43
Figura 4. Recuperación a través del tiempo de Escherichia coli. Tres métodos de conservación
fueron evaluados en cuatro tiempos. ............................................................................................. 44
Figura 5. Resultado de E. coli mediante el sistema de ID BBL Crystal. ..................................... 45
Figura 6. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. .................................................... 46
Figura 7. Recuperación a través del tiempo de Pseudomonas aeruginosa. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. ....................................................................... 46
Figura 8. Resultado de P. aeruginosa mediante el sistema de ID BBL Crystal. ......................... 47
Figura 9. Curva de crecimiento de C. freundii. ............................................................................ 48
Figura 10. Recuperación a través del tiempo de Citrobacter freundii Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. ....................................................................... 49
Figura 11. Resultado de C. freundii mediante el sistema de ID BBL Crystal. ............................ 50
Figura 12. Curva de crecimiento de Serratia marcenscens. Tres métodos de conservación fueron
evaluados en cuatro tiempos. ........................................................................................................ 51
Figura 13. Recuperación a través del tiempo de Serratia marcenscens. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. ....................................................................... 52
Figura 14. Resultado de Serratia marcenscens mediante el sistema de ID BBL Crystal. ........... 52
Figura 15. Curva de crecimiento de Bacillus cereus. ................................................................... 55
Figura 16. Recuperación a través del tiempo de Bacillus cereus. ................................................ 56
Figura 17. Resultado de Bacillus cereus mediante el sistema de ID BBL Crystal GP. ............... 57
Figura 18. Curva de crecimiento de Bacillus licheniformins. ...................................................... 58
Figura 19. Recuperación a través del tiempo de Bacillus licheniformins r. ................................. 58
Figura 20. Resultado de Bacillus licheniformins mediante el sistema de ID BBL Crystal.......... 59
Figura 21. Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis. ........................................................ 60
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Figura 22. Recuperación a través del tiempo de Bacillus thuringiensis. ..................................... 61
Figura 23. Resultado de Bacillus Thuringiensis mediante el sistema de ID BBL Crystal. .......... 61
Figura 24. Curva de crecimiento de Listeria Monocytogenes. ..................................................... 63
Figura 25. Recuperación a través del tiempo de Listeria monocytogenes.. ................................. 63
Figura 26. Resultado de Listeria monocytogenes mediante el sistema de ID BBL Crystal. ........ 64
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Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Microorganismos de investigación. ................................................................................ 32
Tabla 2. Características Macroscópicas de las cepas evaluadas................................................. 67
Tabla 3. Características microscópicas de las cepas evaluadas .................................................. 69
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Glosario
Bacteria: microorganismo unicelular procarionte que puede provocar enfermedades,
fermentaciones o putrefacción en los seres vivos o materias orgánicas.
Cepa ATCC: son microorganismos certificados para el control de calidad en
microbiología y es utilizado en disciplinas como la clínica, alimenticia, farmacéutica, cosmética
o ambiental. Sus características genotípicas y fenotípicas garantizan la identidad del
microorganismo y al tener esta documentación, el laboratorio evitará realizar pruebas adicionales
para la identificación de las cepas, lo que se traduce en ahorro de tiempo y recursos.
Congelación: procedimiento que consiste en bajar la temperatura de un producto hasta un
nivel en que la mayor parte del agua de constitución se transforma en cristales de hielo. En la
criobiología este método físico químico permite conservar microorganismos viables por un
periodo de tiempo sin sufrir cambios genotípicos.
Crio preservación: proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas
temperaturas (entre -30 °C y -196 °C) permitiendo el mantenimiento de la viabilidad celular por
largos periodos de tiempo.
Crio protector: sustancias utilizadas para la protección de células o tejidos del daño que
se produce durante los procesos de congelación y descongelación debidos principalmente a la
formación de hielo.
Cultivo axenico: cultivo que contiene solamente una especie de microorganismos.
Curva de Crecimiento: incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese
sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la
multiplicación celular.
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Hongos: Los hongos son organismos que tienen células con núcleo (eucariontes) y que
requieren de otros seres vivos para obtener su alimento (son heterótrofos). Sus células poseen
una pared gruesa de un compuesto (polisacárido) llamado quitina, el cual les provee rigidez y
resistencia.
Medios de cultivo: solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en
condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de diversos microorganismos.
S.I. BBL Crystal: El sistema BBL Crystal para la identificación (ID) de bacterias Gram -
positivas (GP) es un método de identificación en miniatura que utiliza substratos convencionales,
fluorogénicos y cromogénicos modificados. Se ha diseñado para la identificación de bacterias
aerobias Gram-positivas aisladas frecuentemente de muestras clínicas.
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Resumen
Evaluación de técnicas de conservación para microorganismos de importancia en
microbiología industrial en el Cepario de la Universidad de Santander
Autor: Acosta, A. K.; Pardo, M.
Palabras Claves: Bacterias Gram Positivas, Bacterias Gram Negativas, Hongos
Filamentosos, Métodos de conservación, Sistema de ID BBL Crystal.
Descripción:La preservación microbiana construye un paso importante para asegurar el
mantenimiento del gran potencial biotecnológico del genoma bacteriano. La correcta
conservación microbiana deberá garantizar la preservación de cultivos axenicos, con altos
porcentajes de viabilidad y estabilidad genética. Objetivo: Evaluar técnicas de conservación para
microorganismos de importancia en microbiología industrial en el cepario de la Universidad de
Santander, mediante la evaluación de la eficiencia de los métodos de conservación (Glicerol al
30%, Leche descremada al 20%, Agua Estéril y papel de filtro) y determinando del porcentaje de
viabilidad y pureza en un periodo de 3,6 y 12 meses en 14 cepas. Métodos: la población objeto
de estudio estuvo constituida por 14 cepas microbianas, 8 de ellas bacterias y 6 cepas de Hongos
Filamentosos sometidas a 3 métodos de conservación cada uno. Resultados: Los métodos de
conservación evaluados mostraron resultados satisfactorios con alta tasa de supervivencia de
1,34 UFC/mL para bacterias Gram Negativas y 1,57 UFC/mL para bacterias Gram Positivas.
Con esta condición de conservación obtuvimos 95,7% para Bacterias Gram Negativas y 98,3%
para Bacterias Gram Positivas de recuperación de viabilidad a los 12 meses de conservación
como resultado promedio. Cabe resaltar que este primer informe de conservación fue muy
eficiente ya que los microorganismos se mantuvieron en todo el proceso. Conclusión: Se
evaluaron métodos exitosos de conservación, para las cepas microbianas estudiadas, incluyendo
los hongos filamentosos que lograron mantenerse con buena esporulación hasta el final. El
metodo de Glicerol permitió una viabilidad del 99,2% en Glicerol al 30%, 98,5% en Leche
descremada al 20% y 93,3% en Papel de filtro a los 12 meses de conservación.
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Abstract
Evaluación de técnicas de conservación para microorganismos de importancia en
microbiología industrial en el Cepario de la Universidad de Santander
Acosta, A. K.; Pardo, M.
Key words: Gram positive bacteria, Gram negative bacteria, filamentous fungi, methods of
conservation, BBL Crystal ID system.
Description: Microbial preservation constructs an important step to ensure the
maintenance of the great biotechnological potential of the bacterial genome. The correct
microbial preservation must guarantee the preservation of axenic cultures, with high percentages
of viability and genetic stability. Objective: To evaluate conservation techniques for
microorganisms of importance in industrial microbiology in the University of Santander stock,
by evaluating the efficiency of conservation methods (30% glycerol, 20% skim milk, sterile
water and waste paper). Filter) and determining the percentage of viability and purity in a period
of 3.6 and 12 months in 14 strains. Methods: the population studied consisted of 14 microbial
strains, 8 of them bacteria and 6 Strains of Filamentous Fungi with 3 conservation methods each.
Results: Conservation methods evaluated satisfactory results with a high survival rate of 1.34
CFU / ml for Gram-negative bacteria and 1.57 CFU / ml for Gram-positive bacteria. With this
conservation condition, we obtained 95.7% for Gram-negative bacteria and 98.3% for Gram-
positive bacteria for recovery of viability at 12 months of conservation as an average result. It
should be noted that this first conservation report was very efficient since microorganisms were
maintained throughout the process. Conclusion: Successful conservation methods were evaluated
for the microbial strains studied, including the filamentous fungi that were achieved with good
sporulation until the final. The Glycerol method allows a viability of 99.2% in Glycerol at 30%,
98.5% in List described at 20% and 93.3% in Filter paper at 12 months of storage.
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Introducción
En la actualidad, el uso de técnicas de conservación ha logrado un potencial para el uso
futuro de especies microbianas, como lo son las colecciones microbianas. Estas colecciones
deben cumplir con premisas de un buen proceso de conservación asegurando su pureza,
viabilidad y estabilidad genética (Uruburu, 2003).
La transferencia periódica es un método en el que los microorganismos permanecen
activos en cortos periodos de tiempo, por eso se reconoce como un método de conservación a
corto plazo, el cual consiste en la inoculación de cultivos adecuados para obtener un crecimiento
bajo condiciones axenicas a temperaturas de 4-6 °C, es por tal razón el elevado riesgo de
contaminación y variabilidad de las características de las cepas, las cuales constituyen sus
principales desventajas. (Castro & Hernández, 2000, pág. 21)
Para el mantenimiento de cepas microbianas se deben estandarizar métodos de
conservación eficaces bajo condiciones que aseguren la estabilidad microscópica, macroscópica,
bioquímica, fisiológica y genética de las cepas a estudiar. (Huertas, S. 2006). No obstante, para
el cumplimiento de estos propósitos se debe tener rigurosidad en la selección de un buen método
de conservación que sea óptimo para cada clase de microorganismo, de bajo costo, que permita
el almacenamiento adecuado y la optimización del espacio de trabajo. (Hernández, 2014)
Por lo tanto, el propósito de este trabajo es evaluar diferentes técnicas de conservación de
microorganismos de importancia en Microbiología Industrial del cepario de Microbiología de la
Universidad de Santander para así estandarizar el mejor método para cada microorganismo.
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El diseño y desarrollo de una manual de conservación que será de alcance a toda la
comunidad donde se definirá el método correcto a emplear en los microorganismos de interés
industrial del programa de Microbiología industrial.
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1. Planteamiento del problema
El creciente uso de microorganismos en las diversas áreas de la microbiología, especialmente
en el área de Biotecnología ha consolidado la necesidad de crear y mantener cepas de
referencias, de manera que las propiedades que las caracterizan y las hacen importantes en esta
área permanezcan estables, construyendo así la base para posteriores investigaciones (Kirsop B,
1991). Puesto que son el resultado de investigaciones realizadas por varios periodos de tiempo y
que conformaran una colección microbiana valiosa para cada centro de investigación (Weng et
al., 2005).
La conservación de microorganismos de importancia en Microbiología Industrial ha
despertado un interés permanente de aislar nuevas especies bacterianas y discutir nuevos
potenciales biotecnológicos que puedan ser aplicados para el beneficio industrial. (Vincent,
1970).
Actualmente los laboratorio de Microbiología Industrial de la Universidad de Santander no
cuenta con un cepario de referencia y el método que se viene utilizando para conservación de los
microorganismos ha sido el de transferencia periódica y preservación por subcultivos en aceite
mineral del cual no se han obtenido los mejores resultados, Estas técnicas de conservación están
fundamentadas en la preservación a corto plazo; método, que aunque económico en términos
generales representa altos costos a largo plazo derivados de gastos en personal, Repiques
frecuentes y contaminación (Ferreti, 2001). Por este motivo se requiere de la implementación de
diferentes métodos de conservación que garanticen la estabilidad genética de los
microorganismos a trabajar, reduciendo de esta manera la pérdida excesiva de cepas, la
contaminación y variabilidad genética de las mismas.
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2. Justificación
El programa de Microbiología Industrial de la Universidad de Santander (UDES),
Bucaramanga - Colombia, desde hace muchos años colecciona una diversidad de
microorganismos, los cuales han sido conservados mediante el uso de técnicas de crio
preservación a -20 °C y subcultivos, con o sin uso de aceite mineral, que se mantienen por cortos
periodos de tiempo a 4°C. Estas metodologías han permitido el mantenimiento de las cepas a
mediano y corto plazo, sin embargo presentan inconvenientes debido a que incrementan la
probabilidad de generar alteraciones genotípicas y fenotípicas asociadas a las resiembras
continuas, contaminación cruzada o pérdida significativa de la viabilidad, que resulta en muerte
celular progresiva.
Los microorganismos juegan un papel importante en las diversas áreas de la biología por lo
cual su aislamiento, caracterización y conservación son importantes. (Hernández, 2014).
Esta observación, generó la necesidad de buscar y valorar métodos más reproducibles y
confiables para la preservación microbiana; que se ajustaran a las condiciones logísticas y
técnicas del Laboratorio de Microbiología Industrial UDES, así como a los tipos de
microorganismos preservados.
En el laboratorio de microbiología se requiere conservar y almacenar el material microbiano
de interés puro y debidamente identificado, por esto es necesario contar con un buen método de
conservación que asegure la estabilidad genética de las cepas permitiendo así obtener un cepario
de referencia que con un buen método de conservación garantice la pureza, viabilidad y
estabilidad de las cepas, prolongando el tiempo de preservación por años y a temperaturas
optimas que conlleven a resultados confiables. Lo que contribuirá a evitar la pérdida de
microrganismos y por ende la compra de nuevas cepas.
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2. Objetivos
1.1 Objetivo General
Evaluar técnicas de conservación en microorganismos de importancia Industrial del
cepario de Microbiología de la Universidad de Santander.
1.2 Objetivos Específicos
Evaluar la eficiencia de los métodos de conservación (Glicerol al 30%, Leche
descremada al 20%, Agua Estéril y Papel de Filtro), en un periodo de 3, 6 y 12 meses en 14
cepas.
Determinar el porcentaje de viabilidad y pureza de los microorganismos conservados
por cada método.
Elaborar un manual con protocolos de mantenimiento y preservación de
microorganismos del cepario de la Universidad de Santander.
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2. Marco teórico
La capacidad de los organismos vivos para sobrevivir a la congelación y descongelación se
determinó por primera vez en 1663 cuando Henry Power congeló y recuperó con éxito
nematodos preservados (Morris, 1981). Sin embargo, los primeros intentos de utilizar la crio
preservación de bacterias sólo se llevaron a cabo hasta los años 1900, mediante el uso de aire
líquido (Macfadyen & Rowland, 1900, pág. 1130) y treinta años después, a través de la
implementación de la crio preservación en nitrógeno líquido (Jahnelm, 1937, págs. 1304–1305).
En el año 1949, Polge y colaboradores se convirtieron en los primeros científicos en reportar la
congelación exitosa y la viabilidad de espermatozoides aviares. Además, estos genios de la
ciencia también informaron sobre la casualidad del descubrimiento de la función crio protectora
del glicerol durante sus estudios de preservación. Cinco años después, Smith extendió estas
observaciones con el fin de crio preservar las células rojas de la sangre en glicerol y nueve años
más tarde, exactamente en el año 1959, Lovelock describió por primera vez el uso del
dimetilsulfóxido como agente crioprotector, con la ventaja de un aumento de la permeabilidad en
comparación con el glicerol para muchos tipos de células. (Hubalek, 2003, págs. 205-229)
Estos informes, identificaron la necesidad de un agente crioprotector, como elemento clave
para la evolución de la preservación. Fue por ello, que, en el año 1970, propusieron el uso de
concentraciones de glicerol al 40% y de temperaturas entre -10ºC y -20ºC para la conservación
de células bacterianas, criterio que fue retomado por (Miller, 1977), el cual propuso añadir esta
sustancia directamente a un cultivo crecido hasta la etapa estacionaria.
En el caso de cepas bacterianas de interés como Escherichia coli, los efectos del estado
fisiológico del cultivo y su susceptibilidad a la muerte por congelación y descongelación repetida
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se estudiaron por primera vez en el año 1955, quienes informaron que cultivos crecidos
aeróbicamente eran más resistentes que los cultivos crecidos en condiciones anaerobias. Además,
describieron que ciclos sucesivos de congelación y descongelación traían como consecuencia un
decrecimiento lineal en el logaritmo del número de células viables en función del número de
ciclos. (Harrison, 1955).
2.1 Estado del Arte.
Estudios posteriores se centraron en la investigación de los medios de transporte para la
adecuada preservación bacteriana. En mayo del año 2010, en la ciudad de Habana, se llevó a
cabo un estudio de la crio preservación de Escherichia coli, con el objetivo de evaluar su
comportamiento a temperaturas de almacenamiento de -20ºC y -70ºC y diversas concentraciones
de glicerol después de ocho ciclos sucesivos de congelación y descongelación. Los resultados
arrojaron, mejor supervivencia de dicha bacteria cuando se utilizó temperatura de
almacenamiento de -70ºC y una concentración de glicerol al 10%. (Reytor & And Espinosa,
2010)
No obstante, no todas las bacterias sobreviven exitosamente a los procesos de congelación;
este es el caso de microorganismos altamente fastidiosos con requerimientos nutricionales
exigentes tales como Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. En 1998,
implementaron el uso del medio huevo de Dorset para el mantenimiento de 45 cepas de
Streptococcus pneumoniae; en donde las cepas objeto de estudio fueron inoculadas en dicho
medio y se mantuvieron a temperatura ambiente. En este estudio, se obtuvo una viabilidad de 44
días de las cepas preservadas a temperatura ambiente y se llegó a la conclusión de recomendar el
uso del medio huevo de Dorset para el mantenimiento del neumococo. De igual manera, en el
año de 1999 estos investigadores implementaron la misma metodología para el mantenimiento y
| 8
transporte de Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae, con resultados de viabilidad del
100% hasta por tres semanas de los microorganismos congelados (Wasas, et al, 1998).
2.2 Colecciones de Microorganismos
En Colombia, a lo largo del siglo XX la tradición institucional de la investigación
microbiológica ha estado centrada en brindar soluciones a problemas en los campos de salud y
agricultura, dejando un invaluable legado y un conjunto de colecciones de microorganismos que
constituyen la base de futuras investigaciones, destacando principalmente el banco de cepas y
genes del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, la colección de
bacterias de la Universidad de los Andes y la colección biológica de microorganismos de la
Pontificia Universidad Javeriana, entre otros (Mazur, 1970).
En los últimos tiempos, se ha visto un incremento en la apreciación del valor de las
colecciones de cultivos de microorganismos, tanto para la conservación de recursos genéticos y
la biodiversidad, como para proveer la fuente esencial para el desarrollo biotecnológico mundial.
Por estas razones, muchos países han apoyado el establecimiento de colecciones de cultivos que
brinden servicios en su país o en la región y que desarrollen sus propios programas de
investigación. De igual forma, numerosas instituciones mantienen colecciones de
microorganismos, ya sea con fines pedagógicos, investigativos o para disponer de cepas patrones
útiles en el aseguramiento de la calidad de múltiples procesos industriales, evaluación de
materias primas, productos y tecnologías. En la actualidad, para la conservación de estos cultivos
por largos períodos de tiempo se emplean la liofilización y la crio preservación, como métodos
| 9
de elección que aseguran la viabilidad, pureza y estabilidad de las cepas. (García & And
Uruburu, 2000)
La preservación bacteriana se basa en la inactivación metabólica del microorganismo
(Mazur, 1970, págs. 939-949) por diferentes metodologías, entre las cuales destacamos la
preservación a corto, mediano y largo plazo en donde es indispensable considerar tres
recomendaciones generales para su correcta preservación: 1) se deben evitar contaminaciones
durante el proceso de conservación, 2) durante el tiempo en que los microorganismos
permanezcan conservados conviene que sobrevivan al menos el 70% de las células por un
periodo considerable de tiempo en una densidad elevada, 3) permaneciendo genéticamente
estables. (García & And Uruburu, 2000, págs. 12-16)
Es importante mencionar que la forma de preservar a las bacterias ha sido poco explorada y
mucho del conocimiento que se tiene recaudado en la actualidad se ha obtenido de forma
empírica. (García & And Uruburu, 2000)
2.3 Conservación y Preservación de Microorganismos
En los últimos tiempos, se ha visto un incremento en la apreciación del valor de las
colecciones de cultivos de microorganismos, tanto para la conservación de recursos genéticos y
la biodiversidad, como para proveer la fuente esencial para el desarrollo biotecnológico mundial.
Por estas razones, muchos países han apoyado el establecimiento de colecciones de cultivos que
brinden servicios en su país o en la región y que desarrollen sus propios programas de
investigación. De igual forma, numerosas instituciones mantienen colecciones de
microorganismos, ya sea con fines pedagógicos, investigativos o para disponer de cepas patrones
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útiles en el aseguramiento de la calidad de múltiples procesos industriales, evaluación de
materias primas, productos y tecnologías. En la actualidad, para la conservación de estos cultivos
por largos períodos de tiempo se emplean la liofilización y la crio preservación, como métodos
de elección que aseguran la viabilidad, pureza y estabilidad de las cepas.
La preservación bacteriana se basa en la inactivación metabólica del microorganismo
(Mazur, 1970) por diferentes metodologías, entre las cuales destacamos la preservación a corto,
mediano y largo plazo en donde es indispensable considerar tres recomendaciones generales para
su correcta preservación:
1) Se deben evitar contaminaciones durante el proceso de conservación.
2) Durante el tiempo en que los microorganismos permanezcan conservados conviene que
sobrevivan al menos el 70% de las células por un periodo considerable de tiempo en una
densidad elevada.
3) Permaneciendo genéticamente estables. (García & And Uruburu, 2000)
4) Es importante mencionar que la forma de preservar a las bacterias ha sido poco
explorada y mucho del conocimiento que se tiene recaudado en la actualidad se ha obtenido de
forma empírica. (García & And Uruburu, 2000)
2.3.1 Métodos de Conservación a largo plazo.
2.3.1.1 Crio congelación:
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La sobrevivencia de los microorganismos conservados por congelamiento puede ser
aumentada usando temperaturas ultrajabas, las que pueden ser conseguidas con el uso de
nitrógeno en la fase de vapor (-196°C) o en la fase líquida (-150 a -180°C). Estas temperaturas
permiten el almacenamiento por periodos prolongados y la mayoría de bacterias pueden ser
recuperadas con un 90-100% de sobrevivencia (Zuberer, 1987), Esto, debido a que el cultivo
puede sufrir pérdidas de viabilidad durante las etapas de congelación y descongelación pero no
durante el periodo de almacenamiento. (Stanbury et al, 1995) propuso la congelación con
nitrógeno líquido como la técnica idónea o alternativa para conservar por largos periodos de
tiempo aquellas células que no sobreviven al proceso de liofilización.
2.3.1.2 Liofilización:
La liofilización o criodesecación, es uno de los métodos más utilizados para la
conservación de cepas bacterianas (Zuberer, 1987). Fue introducido en 1903 cuando
Vansteenberghe liofilizó el virus de la rabia sobre ácido sulfúrico bajo vacío. Su principio básico,
consiste fundamentalmente en extraer por sublimación, bajo condiciones de alto vacío, el agua
de las células congeladas que pasan directamente a un estado de vapor debido a que no hay
presión molecular que lo impida (Date, 1987).
En este método, las muestras que contienen la suspensión de microorganismos, son
previamente congeladas (usando nitrógeno líquido) e inmediatamente expuestas al vacío. El
vapor de agua extraído es atrapado por un condensador de refrigeración que opera a - 110°C. El
vacío debe ser casi absoluto (menos de 10mTorr; 10μm de Hg), lo que provoca la evaporación
del hielo con la consiguiente pérdida de calor que se produce en el proceso (Palmfeldt et al.,
2003). Después de la “desecación”, las células bacterianas se mantienen en viales individuales o
| 12
en ampollas y bajo condiciones de vacío o se les aplica un gas inerte. Una vez que se liofilizan,
los microorganismos pueden permanecer en un lugar fresco a una temperatura que oscile entre
los 15ºC a los 25°C, esto significa guardar a las muestras liofilizadas a temperatura ambiente, lo
que reduce en gran medida los costos energéticos que se requieren para mantener las bajas
temperaturas de un ultracongelador (Manzanera et al., 2002).
2.3.2 Métodos de conservación a mediano plazo.
2.3.2.1 Congelación Bacteriana:
La congelación bacteriana es un método físico-químico que permite conservar
microorganismos viables a temperaturas entre -20ºC y -80ºC por un tiempo sin sufrir cambios
genotípicos (Allievi, 1993). En este proceso se involucra el agua como microambiente y es ella
la que cambia su estado líquido a sólido. Las bacterias inmersas en este medio deben adaptarse a
las condiciones de este nuevo ambiente, transformar la velocidad de su metabolismo, conservar
su viabilidad y evitar los daños ocasionados por la aparición de cristales de hielo formados por el
cambio de temperatura (James, 1984).
Para su desarrollo, primero se cultiva al microorganismos en cuestión y se deja crecer hasta
la fase estacionaria temprana, las células del cultivo se lavan o no, con una solución tampón y
después son adicionadas con un volumen equivalente de una suspensión que contiene una
sustancia que deberá funcionar como protectora de las células a la congelación (Perry, 1995).
Esta sustancia conocida con el nombre de crioprotector, evita la formación de cristales de hielo y
el estrés osmótico generado por la baja disponibilidad de agua, durante el proceso de congelación
(Perry, 1995).
| 13
2.3.3 Métodos de conservación a corto plazo.
Estos procedimientos son frecuentemente usados en laboratorios de primer nivel con ceparios
pequeños, donde no se cuenta con la infraestructura adecuada ni el presupuesto para la
preservación bacteriana. Ayudan al mantenimiento de las cepas, generalmente para el uso
frecuente donde se requiera la cepa activa. Dentro de ellos, se incluyen los subcultivos o el cultivo
seriado, preservación en aceite mineral o agua destilada estéril y otro grupo de métodos de
preservación denominados métodos restringidos, basados en la paralización del crecimiento
bacteriano mediante la eliminación del agua disponible de la célula (García, 1991). Entre ellos se
destacan la conservación en suelo y la desecación haciendo uso de papel filtro, sal gorda y bolitas
de alginato.
2.3.3.1 Subcultivos:
El método comúnmente usado es el cultivo seriado o subcultivo. En éste, el
microorganismo en cuestión se siembra en su medio adecuado y una vez crecido se guarda a
4°C, donde se mantiene unos días para su uso y se vuelve a resembrar en un tiempo no mayor a
un mes. El gran problema de este procedimiento, es que se puede generar mutaciones por cada
transferencia con pérdida de las características del microorganismos (García y Uruburu, 2000),
riesgo de contaminación y adaptaciones al medio de cultivo, lo que termina generando cepas
“domesticadas” cuyo comportamiento ya no representa a la especie inicialmente aislada (Cooper,
2002).
2.3.3.2 Conservación por suspensión en agua estéril:
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Este método alternativo y muy utilizado debido a su bajo presupuesto, fue descrito
originalmente por Castellani en 1939 (Jong y Atkins, 1985). Ofrece altos porcentajes de
viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y
algunas bacterias poco exigentes (Devay, 1963). Según (Crist et al, 1984) en este método la cepa
es cultivada en un medio líquido y después de concentrada por centrifugación es re suspendida
en un volumen igual de agua destilada estéril, conservándose a temperatura ambiente en
oscuridad y/o en refrigeración, con una concentración celular no superior a 104 – 105 células/mL
para bacterias y levaduras (Lacobellis, 1986).
2.3.3.3 Conservación con aceite mineral estéril:
Este método que actualmente sigue teniendo vigencia en las colecciones internacionales,
fue usado por primera vez por Buell y Weston en 1947 y luego fue ampliamente utilizado por
Dade y Fenell en 1960 y Smith y Onions en 1994 con resultados exitosos. Consiste en recubrir
con aceite mineral estéril un cultivo que se encuentra en condiciones óptimas de crecimiento.
Generalmente se utiliza aceite mineral de alta calidad de grado medicinal (Jong, 1985).
2.3.3.4 Desecación en papel filtro:
Es un método de conservación que reduce drásticamente el metabolismo bacteriano. Este,
implica la utilización de papel absorbente preferentemente Whatmann número 3, al cual se le
aplica una suspensión fuerte de más de 108 células, que posteriormente se desecan a temperatura
ambiente en condiciones estériles o si es posible utilizando un liofilizador sin congelación previa
de las células para utilizar el vacío y desecar mejor el papel (Morales et al., 2010).
2.3.3.5 Desecación con sal gorda:
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La desecación en sal, es un método usado para halobacterias (García y Uruburu, 2000), en
el cual, las células se mezclan con una solución de sal gorda y se secan aprovechando la
higroscopicidad de la sal. En este protocolo, la desecación no es total, pero las células dejan de
multiplicarse por el nivel insuficiente de agua disponible en el medio, aunque pueden contener
un poco de sustrato e incluso humedad. Aun así el tiempo en que las bacterias se mantienen es un
periodo corto, no superior a los 6 meses (Bashan, 1998).
2.3.3.6 Desecación con bolitas de alginato:
En este procedimiento las células se encentran en una matriz de alginato la cual se deseca
mediante el tratamiento con soluciones hipertónicas y posteriormente se hace desecación al aire.
Posteriormente, las células son conservadas en tubos estériles, cerrados herméticamente y a una
temperatura de entre 4ºC y 18ºC. Es importante destacar que la desecación en bolitas de alginato
es un procedimiento bastante eficaz de preservación bacteriana (Fages, 1990).
2.3.3.7 Conservación en suelo estéril:
Este método consiste en esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio
absorbente para una pequeña cantidad de inóculo. Debido a que sus nutrientes y humedad son
reducidos considerablemente, limitando no solo el metabolismo bacteriano si no también su
periodo de vida, este siempre se ha tomado como última opción en la conservación de
microorganismos.
En general los métodos de preservación a corto plazo poseen alto riesgo de contaminación
celular debido a que los microorganismos están expuestos a condiciones ambientales normales.
Según (Potts, 1994) en el caso específico de la desecación, las células sufren estrés por oxidación
| 16
y pérdida de agua razón por la que el número de células viables disminuye notablemente,
especialmente para microorganismos sensibles.
2.3.4 Crio protectores.
Los crio protectores son sustancias que se han reportado como solutos compatibles e
hidrosolubles de baja toxicidad, cuyas funciones principales consisten en la disminución del
punto de fusión de una solución dada (Hubálek, 2003), reducción de la concentración intra y
extracelular de electrolitos y evitar la excesiva deshidratación celular a temperaturas bajo cero
(Ciba, 1977); todo ello, basado en: 1) la estabilización de proteínas celulares (Fahy et al., 1987)
2) mantenimiento en equilibrio del potencial químico del agua intra y extracelular (Ciba, 1977);
3) substitución de las moléculas de agua removidas durante la congelación (Meryman, 1966) y
finalmente, 4) bloqueo de toxicidad por parte de otros crio protectores (Fahy et al., 1987).
No obstante, a pesar de sus varias funciones y aun así aplicando óptimas tasas de
enfriamiento y descongelación, la sobrevivencia de los microorganismos a la congelación, no
llega fácilmente al 100% (Fahy, 1986). Esto, debido posiblemente a la toxicidad que ejerce sobre
las células. En este contexto, los crio protectores pueden producir dos tipos de toxicidad: una
directa o bioquímica y otra osmótica. Según Fahy y colaboradores (1987), la toxicidad directa
está relacionada con interacciones entre crioprotector, proteínas y membranas, en donde el
crioprotector tiene la capacidad de producir desnaturalización proteica y/o enzimática,
interferencia con las bombas iónicas y solubilización de lípidos de membrana, generándose así
muerte celular.
| 17
Los crio protectores protegen la célula durante el enfriamiento al estabilizar proteínas. No
obstante, a temperaturas fisiológicas producen desnaturalización proteica. Estas sustancias
poseen características hidrofóbicas e hidrofílicas, las cuales son favorecidas a altas y bajas
temperaturas, respectivamente. Debido a ello, cuando la célula es expuesta a procesos de
descongelación utilizando altas temperaturas, las uniones hidrofóbicas predominan y el
crioprotector se une a la proteína causando desnaturalización. A este, proceso, se le denomina
toxicidad osmótica. (Arakawa et al., 1990).
2.4 Curva de Crecimiento Bacteriano
En la figura se ilustra una curva de crecimiento de una población bacteriana. Esta curva se
divide en cuatro fases denominadas fase de latencia, fase exponencial o fase logarítmica, fase
estacionaria y fase de muerte. (Madigan, el al., 2003).
| 18
Figura 1. Curva de crecimiento modelo. Adaptado de (Madigan M. et al. 2003)
Fase de latencia
Cuando una población bacteriana es inoculada en medio fresco, el crecimiento usualmente
no comienza de inmediato sino después de un tiempo llamado de latencia, que puede ser corto o
largo dependiendo de las condiciones. La fase de latencia representa un periodo de transición
para los microorganismos cuando son transferidos a una nueva condición. En esta fase se
producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente.
(Madigan M. et al., 2003).
En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay gran actividad
metabólica, aumento en el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y
peso seco de las células. Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al
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mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de
latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad. Si el inóculo se toma de un
cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en el mismo medio, generalmente se presenta la fase
de latencia esto se debe a que las células generalmente agotan una serie de coenzimas esenciales
u otros constituyentes celulares y se requiere cierto tiempo para su resíntesis.
También se observa latencia cuando el inóculo está formado por células que han sido
dañadas, pero no muertas, bien sea por tratamiento con calor, radiaciones o sustancias químicas,
puesto que requieren reparar dicho daño. En el caso de que una población se transfiera de un
medio de cultivo rico a un medio pobre, se observa latencia puesto que es necesario que las
células para poder seguir creciendo tengan una serie de enzimas para poder sintetizar algunos
metabolitos esenciales que no están presentes en el medio. (Koneman, 2008).
Fase exponencial o fase logarítmica
Es el período de la curva de crecimiento en el cual el microorganismo crece
exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un tiempo de generación la población se
duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es máxima. Las condiciones
ambientales (temperatura, composición del medio de cultivo, etc.) afectan a la velocidad de
crecimiento exponencial (Koneman, 2008).
Fase estacionaria
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En cultivos en recipientes cerrados una población no puede crecer indefinidamente en
forma exponencial. Las limitaciones del crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algún
nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos, porque se alcance un número de
células elevado para el espacio disponible o por una combinación de las causas anteriores. Este
periodo durante el cual cesa el crecimiento se conoce como fase estacionaria (Koneman, 2008).
Fase de muerte
Si la incubación continúa después de que una población microbiana alcanza la fase
estacionaria, las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero va a comenzar una
disminución progresiva en el número de células viables y cuando esto ocurre se dice que la
población ha entrado en fase de muerte (Madigan M. et al; 2003) y (Koneman, 2008).
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2.5 Sistemas de Identificación BD BBL Crystal
A continuación se adjunta la técnica de identificación BBL Crystal para Entéricas No
Fermentadoras (E/NF) y Gram Positivas (GP) por (Becton, Dickinson and Company, 2012).
BBL Crystal GP:
Uso Previsto: El sistema BBL Crystalpara la identificación (ID) de bacterias gram-
positivas (GP) es un método de identificación en miniatura que utiliza substratos convencionales,
fluorogénicos y cromogénicos modificados. Se ha diseñado para la identificación de bacterias
aerobias gram-positivas aisladas frecuentemente de muestras clínicas.
Resumen y explicación: Ya en 1918 había informes sobre métodos micrométricos para la
identificación bioquímica de microorganismos.3 Varias publicaciones han incluido estudios
sobre el uso de discos de papel impregnados de reactivos y métodos con micro tubos para
diferenciar las bacterias entéricas. El interés en diseñar sistemas de identificación en miniatura
llevó a la introducción de varios sistemas comerciales en los últimos años de la década de 1960,
con las ventajas de menor espacio necesario para el almacenamiento, extensión de la fecha de
caducidad, control de calidad uniforme y facilidad de uso. En general, varios de los
procedimientos de análisis usados en los sistemas BBL Crystal ID son modificaciones de
métodos clásicos, incluyendo pruebas para la fermentación, la oxidación, la degradación y la
hidrólisis de varios substratos. Además, hay substratos ligados a cromógenos y fluorógenos,
como en el panel BBL Crystal GP ID, para la detección de enzimas que son utilizadas por los
microbios para metabolizar varios substratos. El equipo BBL Crystal GP ID incluye (i) tapas del
| 22
panel BBL Crystal GP ID, (ii) bases BBL Crystal y (iii) tubos BBL Crystal ANR, GP RGP, N/H
ID de fluido de inóculo (FI). La tapa contiene 29 substratos deshidratados y un control
fluorescente en las puntas de las púas de plástico. La base tiene 30 pocillos para las reacciones.
El inóculo de la prueba se prepara con el fluido de inóculo y se utiliza para llenar los 30 pocillos
en la base. Cuando la tapa sea línea con la base, y luego se cierra, el inóculo de la prueba
rehidrata los substratos secos e inicia las reacciones de las pruebas. Después de un período de
incubación, se examinan los pocillos para determinar cambios de color o presencia de
fluorescencia que resultan de las actividades metabólicas de los microorganismos. La serie de
colores resultante de las 29 reacciones se convierte en un número de perfil de diez dígitos que se
utiliza como la base de identificación.18 Las series de reacciones bioquímicas y enzimáticas de
los 29 substratos
BBL Crystal GP ID para una gran variedad de microorganismos están almacenadas en la
base de datos BBL Crystal GP ID. La identificación se deriva de un análisis comparativo entre
las series de reacciones del aislado de la prueba y las de la base de datos.
Principios del procedimiento: Los paneles del sistema BBL Crystal GP ID contienen 29
substratos bioquímicos y enzimáticos deshidratados. Para rehidratar los substratos se utilizan una
suspensión de bacterias en el fluido de inóculo. Las pruebas usadas en el sistema se basan en la
utilización y degradación microbiana de substratos específicos detectados por varios sistemas
indicadores. La hidrólisis enzimática de los substratos fluorogénicos que contienen derivados
cumarínicos del 4-metil-umbeliferona (4MU) o del 7-amino-4-metilcumarín (7-AMC) resulta en
un aumento de la fluorescencia que se detecta fácilmente a simple vista con una lámpara de luz
ultravioleta. Los substratos cromogénicos, después de sufrir hidrólisis, producen cambios de
| 23
color que pueden detectarse visualmente. Además, hay pruebas que detectan la capacidad de un
organismo de hidrolizar, degradar, reducir o de alguna forma utilizar un substrato en los sistemas
BBL Crystal ID. El lugar del panel en dichas tablas indica el renglón y la columna donde se
encuentra el pocillo (por ejemplo: 1J indica el renglón 1 en la columna J).
Reactivos: El panel BBL Crystal GP ID contiene 29 substratos enzimáticos y bioquímicos.
Advertencias y precauciones: Para uso diagnóstico invitro. Después de usarse, todos los
materiales infecciosos incluyendo las placas, las torundas de algodón, los tubos de fluido de
inóculo y los paneles deben esterilizarse en una autoclave antes de desecharlos o incinerarlos.
Almacenamiento y manejo/vida útil:
Tapas: Las tapas están envueltas individualmente y deben almacenarse cerradas en un
refrigerador entre 2–8 °C. NO DEBEN CONGELARSE. Inspeccione en forma visual el paquete
para detectar agujeros o roturas en la envoltura de papel de aluminio. No deben usarse si la
envoltura parece estar dañada. Las tapas conservarán la reactividad esperada hasta la fecha de
caducidad si se almacenan en el paquete original de acuerdo con las recomendaciones.
Bases: Las bases están envasadas en dos grupos de diez en las bandejas de incubación
BBL Crystal. Las bases están apiladas bocas abajo para reducir al mínimo la posibilidad de
contaminación por el aire. Almacene en un lugar libre de polvo entre 2–30 °C hasta el momento
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de usarse. Almacene las bases sin usar en la bandeja, en una bolsa plástica. Las bandejas vacías
deben usarse para incubar los paneles inoculados.
Fluido de inóculo: El fluido de inóculo (FI) del sistema BBL Crystal ANR, GP, RGP, N/H
ID está envasado en dos grupos de diez tubos cada uno. Inspecciones visualmente los tubos para
detectar roturas, fugas, etc. No deben usarse si se encuentran fugas, daños en los tubos o las tapas
o si hay indicios evidentes de contaminación (por ejemplo, fluido brumoso o turbio). Almacene
los tubos entre 2–25 °C. La fecha de caducidad está en la etiqueta del tubo. Solamente el fluido
de inóculo BBL Crystal ANR, GP, RGP, N/H puede usarse con los paneles del sistema BBL
Crystal GP ID. Al recibirse, el equipo BBL Crystal GP ID debe almacenarse entre 2–8 °C. Una
vez abierto, solamente deben almacenarse las tapas entre 2–8 °C. El resto de los componentes del
sistema pueden almacenarse entre 2–25 °C. Si se ha almacenado el sistema o cualquiera de sus
componentes en un refrigerador, espere a que estén a temperatura ambiente antes de usarlos.
Recogida y tratamiento de las muestras: Los sistemas BBL Crystal ID no deben utilizarse
directamente con muestras clínicas. Utilice aislados de un medio como agar soja Trypticase con
5% de sangre de cordero (TSA II) o agar Columbia con 5% de sangre de cordero (Columbia).
También es aceptable el uso de medios selectivos como agar alcohol fenil etílico con 5% de
sangre de cordero (PEA) o agar Columbia CNA con 5% de sangre de cordero (CNA). No se
deben utilizar los medios que contienen esculina. El aislado para la prueba debe ser un cultivo
puro de no más de 18–24 h para la mayoría de los géneros; cultivos hasta 48 h pueden ser
aceptables para algunos organismos de crecimiento lento. Cuando se usan torundas, solamente
deben usarse torundas con puntas de algodón para preparar las suspensiones del inóculo. Las
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torundas de poliéster pueden causar problemas en la inoculación de los paneles. (Vea
“Limitaciones del procedimiento”). Las tapas deben utilizarse dentro de 1 h una vez retiradas de
los envoltorios sellados con el fin de asegurar un rendimiento apropiado. La cubierta de plástico
debe permanecer en la tapa hasta que se vaya a utilizar. La incubadora utilizada debe ser
humidificada para impedir la evaporación del fluido de los pocillos durante la incubación. La
humedad relativa recomendada es del 40–60%. La utilidad de los sistemas BBL Crystal ID o
cualquier otro procedimiento de diagnóstico a usarse con una muestra clínica están directamente
afectado por la calidad de las mismas muestras. Se recomienda firmemente que los laboratorios
utilicen los métodos discutidos en el Manual of Clinical Microbiology para tomar las muestras,
transportarlas y sembrarlas en medios de aislamiento primario. (Becton, Dickinson and
Company, 2012).
BBL Crystal E/NF:
Uso: El sistema de identificación BBL Crystal (ID) de bacterias entéricas/no fermentadoras
(E/NF) sirve para la identificación de bacterias aerobias gram-negativas que pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae así como también de los bacilos gram Negativos fermentadores y no
fermentadores de glucosa aislados con más frecuencia.
Resumen y explicación: El sistema BBL Crystal E/NF ID es un método miniaturizado de
identificación. Muchos de los análisis utilizados son modificaciones de los métodos clásicos.
Estos incluyen tests para la fermentación, oxidación, degradación e hidrólisis de diversos
sustratos. Además, contienen sustratos unidos a un cromógeno para detectar las enzimas que
| 26
utilizan los microbios para metabolizar distintos sustratos.1-5 El kit BBL Crystal E/NF ID está
compuesto de (i) las tapas del panel BBL Crystal E/NF, (ii) las bases BBL Crystal y (iii) los
tubos de fluido (IF) de inóculo para organismos entéricos/heces BBL Crystal ID. La tapa
contiene 30 sustratos deshidratados en las puntas de los dientes. La base tiene 30 pocillos de
reacción. El inóculo del análisis está preparado con el fluido de inóculo y se utiliza para llenar
los 30 pocillos de la base. Cuando se alinea la tapa con la base y se cierra en su lugar, el inóculo
del análisis rehidrata los sustratos secos e inicia las reacciones del análisis. Después de un
período de incubación, se examinan los pocillos para observar cambios de color. Los cambios de
color se producen como resultado de actividades metabólicas de los microorganismos. El patrón
resultante de las 30 reacciones se convierte en un número de perfil de diez dígitos que se utiliza
como base para la identificación.6 Los patrones de la reacción bioquímica y enzimática de los 30
sustratos BBL Crystal E/NF con una amplia variedad de microorganismos son almacenados en la
base de datos BBL Crystal E/NF ID. La identificación se deriva de un análisis comparativo del
patrón de reacción del aislado del análisis con aquellos que existen en la base de datos. En la
tabla 1 (página 36) se muestra una lista completa de taxones que comprenden la base de datos
E/NF actual.
Principios del procedimiento: Los análisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF ID
están basados en la utilización y degradación de sustratos específicos por parte de los
microorganismos detectados por distintos sistemas indicadores. Las reacciones de fermentación
detectan la capacidad de un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxígeno
atmosférico, y las reacciones de oxidación están basadas en la capacidad de un organismo para
metabolizar el sustrato siendo el oxígeno el aceptor final de electrones. Ambas reacciones se
| 27
detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el sustrato del análisis. Los
sustratos cromógenos al sufrir hidrólisis producen cambios de color que pueden ser detectados
visualmente. Además, existen otros análisis que detectan la capacidad de un organismo para
hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de otro modo un sustrato en el sistema BBL Crystal ID. En
la sección “Reactivos” se describen las reacciones utilizadas por varios sustratos y una breve
explicación de los principios utilizados en el sistema.
Reactivos: El panel BBL Crystal E/NF ID contiene 30 sustratos bioquímicos y
enzimáticos según se describe a continuación. La ubicación del panel indica la fila y la columna
donde se encuentra el pocillo (por ejemplo: 1J se refiere a la fila 1 en la columna J). (Insero
sistema BBL Crystal E/NF)
| 28
Figura 2. Reactivos y principios empleados en el sistema BBL Crystal E/NF ID.
Almacenamiento y manipulación/Tiempo de durabilidad: Después de recibirlo,
almacene el kit BBL Crystal E/NF a 2 – 25 °C. NO CONGELAR. Si el kit o cualquiera de los
componentes se almacenan refrigerado, debe sacarse a temperatura ambiente antes de su uso.
Tapas: Las tapas están envasadas individualmente y deben guardarse sin abrir.
Inspeccione el embalaje visualmente para determinar si hay orificios o grietas en el paquete de
papel aluminio. No utilice el panel si su embalaje parece estar dañado. Si se almacenan de
acuerdo con las recomendaciones, las tapas en el envase original, mantendrán la reactividad
esperada hasta la fecha de caducidad.
| 29
Bases: Las bases vienen envasadas en dos juegos de diez, en bandejas de incubación BBL
Crystal Las bases están apiladas mirando hacia abajo para reducir al mínimo la contaminación
por el aire. Almacene las bases no utilizadas en la bandeja, en una bolsa de plástico. Las bandejas
vacías deben utilizarse para incubar los paneles.
Fluido de inóculo: El fluido de inóculo (IF) para organismos entéricos/heces BBL Crystal
ID viene envasado en dos juegos de diez tubos. Inspeccione visualmente los tubos para
determinar si tienen grietas, fugas, etc. No los utilice sí parecen tener fugas, si el tubo o la tapa
están dañados, o si hay evidencia visual de contaminación (p.e., palidez, turbidez). La fecha de
caducidad se muestra en la etiqueta del tubo. El fluido de inóculo para organismos
entéricos/heces BBL Crystal ID puede utilizarse con los paneles E/NF o RS/E BBL Crystal.
Recogida y procesamiento de las muestras: Los sistemas BBL Crystal ID no están indicados
para utilizarlos directamente con las muestras clínicas. Utilice aislados de una placa de agar
sangre, tal como agar de soja Trypticase con hematíes de oveja al 5%. El uso de una placa agar
MacConkey es también aceptable. El aislado para análisis debe ser un cultivo puro de no más de
24 h. Solamente deben utilizarse las torundas con aplicador de punta de algodón para preparar el
inóculo, ya que algunas torundas de poliéster pueden producir problemas con la inoculación de
los paneles. (Vea “Limitaciones del procedimiento”.) Una vez que se han sacado las tapas de las
bolsas selladas, deben utilizarse en el plazo de 1 h para asegurar un rendimiento adecuado. La
cubierta de plástico debería permanecer sobre la tapa hasta que se use. El incubador utilizado
debe estar humectado para prevenir la evaporación del líquido de los pocillos durante la
incubación. El nivel recomendado de humedad es del 40 – 60%. La utilidad de los sistemas BBL
| 30
Crystal ID o de cualquier otro procedimiento de diagnóstico realizado sobre muestras clínicas
está directamente influenciado por la calidad de las muestras. (Becton, Dickinson and Company,
2012).
2.6 Mantenimiento y viabilidad en Hongos Filamentosos
Para evitar la degeneración y el envejecimiento de las cepas es necesario preservarlas
adecuadamente y retardar, hasta donde sea posible, los cambios degenerativos normales que
ocurren en las células. La declinación en las características deseables de una cepa, se han
atribuido a diferentes factores que actúan en el almacenamiento de la misma, como se enumeran
a continuación: carencia o agotamiento de los nutrientes en el medio de cultivo; acumulación de
secreciones toxicas propias del metabolismo del hongo; alteración del pH en el medio (acidez o
alcalinidad); disminución en la concentración de oxígeno y la consecuente acumulación de CO2
(Gerticem, 2004).
Entre los diversos procedimientos de conservación utilizados para hongos, se destacan
como favoritos el cultivo periódico en cuñas de agar, bajo aceite mineral, conservación de
esporas en tierra, arena o silica gel, cepas liofilizadas, congelación en nitrógeno líquido y en agua
destilada. (García & And Uruburu, 2000)
| 31
3. Metodología
3.1 Tipo de Estudio
Se realizó un análisis descriptivo en el laboratorio central de la universidad de Santander,
cuya población evaluada estuvo constituida por 14 cepas microbianas escogidas al azar
representativo de microorganismos de interés en Microbiología Industrial del cepario de la
Universidad de Santander.
3.2 Área de Estudio
Esta investigación se llevó a cabo en el cepario del laboratorio central del programa de
Bacteriología y Laboratorio clínico del Sótano del Bloque Chibcha de la Universidad de
Santander en un periodo de 12 meses.
3.3 Universo
En la presente investigación estuvo constituido por cepas bacterianas ATCC presentes en
el cepario de la Universidad de Santander.
| 32
3.4 Población
La población representativa de dicha investigación, estuvo conformada por 14 cepas
bacterianas presentes en el cepario, las cuales constituyen el material pedagógico para los
laboratorios prácticos del programa de Microbiología Industrial de la Universidad de Santander.
3.5 Material Biológico
Un total de 14 cepas microbianas ATCC representativas de importancia en Microbiología
Industrial fueron escogidas al azar ya que representan características importantes en diversas
áreas como lo son en alimentos, biotecnología y micología. (Tabla 1). Las cepas fueron
escogidas del cepario del laboratorio central de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la
Universidad de Santander y se clasifica en dos grandes grupos (Bacterias y Hongos
Filamentosos) para la ejecución de dicha investigación.
Tabla 1. Microorganismos de investigación.
Cepas bacterianas ATCC
Bacterias Gram negativas
Escherichia coli 25922
Pseudomonas aeruginosa 27853
Citrobacter freundii 8090
Serratia marcenscens 13880
Bacterias Gram positivas
Bacillus cereus 10876
| 33
Cepas bacterianas ATCC
Bacillus licheniforms 12713
Bacillus thuringiensis 10792
Listeria monocytogenes 13932
Hongos filamentosos
Aspergillus fumigatus Repica en Cepario
Aspergillus niger Repica en Cepario
Aspergillus clavatus Repica en Cepario
Rhizopus stolonifer Repica en Cepario
Bauberia bassiana Repica en Cepario
Penicillium chrysogenum Repica en Cepario
3.6 Métodos
3.6.1 Recuperación de los microorganismos
Bacterias: Para la recuperación de las cepas ATTC que se encuentran liofilizadas,
inicialmente se realizó una siembra en agar BHI y se incubaran a 37°C por 24horas. Pasadas las
24 horas se realizó una siembra en caldo BHI de cada una y serán llevadas nuevamente a la
incubadora a 37°C por 24 horas, luego se siembro en un agar selectivo para cada uno de los
microorganismos y de esta forma fueron utilizadas.
Hongos Filamentosos: Para la recuperación de hongos se realizó una nueva siembra en
agar PDA para Hongos Filamentosos y luego se incubo a 25 °C por 5 días o el tiempo que
requiera cada cepa.
| 34
3.6.2 Cinética de Crecimiento. Se realizó una curva de crecimiento inicial de los
microorganismos a conservar (Bacterias Gram Positivas y Bacterias Gram Negativas). Esta curva
se realizó en base a Pedroza, A., et al., 2007 (Manual de introducción a la biotecnología). Las
condiciones del cultivo fueron: Crecimiento por 24 horas a 37 °C a 120 rpm. Luego se repicaron
las Bacterias en medios de agar BHI.
Pre-Inoculo: En un Erlenmeyer con capacidad de 250 ml se agregaron 90 ml de caldo
BHI (Infusión Cerebro de Corazón), más 10 ml de cultivo microbiano en solución salina 0,85%
(p/v) llevada al tubo N° 4 de la escala de Mc Farland (Concentración 1,2 x109 células/ml.), se
incubo por 24 horas a 37 °C para bacterias a 120 rpm (Shaker) Finalizado el tiempo, se verifico
la pureza mediante Coloración Gram.
Inoculo: En un Erlenmeyer de 500 ml con 180 ml de caldo BHI (Infusión Cerebro de
Corazón), se agregaron 20 ml del Pre-Inoculo de 24 horas de crecimiento. Se tomó la muestra
correspondiente al día 0 para medir la masa microbiana por turbidimetria y recuento de UFC/ml.
La absorbancia se midió en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm,
tomando como blanco Caldo BHI, este procedimiento se realizó a iguales intervalos de tiempo
(cada hora) y se mantuvo por 24 horas a 37 °C a 120 rpm.
Curva Patrón: Se prepararon suspensiones de cada bacteria de acuerdo a la escala N° 4
de Mc Farland en tubos de 5 ml de Solución Salina 0,85%. Una vez preparada, se realiza la
| 35
lectura de la absorbancia a 540 nm de cada una de las diluciones seriadas y se sembró en placa
de agar, así se determinó la ecuación de la línea recta para cada uno de los microorganismos.
3.6.3 Conservación de Bacterias Gram Positivas y Bacterias Gram Negativas. Para las
bacterias Gram Positivas y Gram Negativas se probaron 3 métodos de conservación los cuales
serán descritos posteriormente.
En la conservación se tomó en cuenta la fase logarítmica de cada Bacteria a una
concentración de 1,2 x109 UFC/ml aprox. (escala 4 de Mac Farland) según los resultados
obtenidos en las cinéticas de crecimiento.
3.6.3.1 Preservación con Papel de Filtro de Whatmman N°4 Estéril: La conservación por
el método en papel de filtro Whatmman se realizó basada en el protocolo propuesto por (Huertas,
S. 2006) para ello se tomaron viales de 2 ml por cada cepa a conservar y 12 viales por cada
microorganismo a evaluar de los cuales 9 corresponderán a la viabilidad de los 3, 6 y 12 meses
(método por triplicado), también se adicionaron a cada uno 15 discos de papel filtro Whatmman
N°4 de 5 mm, los cuales se esterilizaron a 121ºC por 15 minutos en autoclave. Se tomó 0.1ml de
cada uno de los cultivos y se agregaron a los viales previamente preparados realizando una buena
homogenización, posterior a esto se extrajo el exceso de cultivo y se almaceno en nevera a 4ºC.
3.6.3.2 Crioprotector con Glicerol al 30% Estéril: Para la crio conservación a -30 °C Se
prepararon viales de 2 ml por cada cepa y 12 viales por cada microorganismo a evaluar de los
cuales 9 corresponderán a la viabilidad de los 3, 6 y 12 meses (Método por triplicado), en los
| 36
viales se dispenso 0.8 ml de medio de Crio conservación recomendado por (Huertas, S. 2006)
(Caldo Tripticasa de Soya 3g, Glucosa 0.5g, Agente crioprotector (glicerol 30%) Agua destilada
990 ml; esterilizando a 15 libras de presión por 15 min a 121 °C). Posteriormente de cada una de
los cultivos en caldo BHI se tomó 0.8 ml que se centrifugaran a 4000 rpm a una temperatura de
20 – 25 °C durante 20 minutos. Luego se suspende 0.8 ml del medio de preservación
previamente preparado con ayuda de una micro pipeta, realizando luego una homogenización.
Finalmente, los viales serán refrigerados a 4 ºC por 15 minutos para un periodo de equilibrio e
inmediatamente congelarlos a -30 °C.
3.6.3.3 Crioprotector con Leche Desnatada al 20% Estéril: Para la crio conservación a -
30 °C se tomaron viales de 2 ml por cada cepa a conservar y 12 viales por cada microorganismo
a evaluar de los cuales 9 corresponderán a la viabilidad de los 3, 6 y 12 meses (Método por
triplicado), en los viales se dispensaron 0,8 ml de medio de Crio conservación (Leche desnatada
pasteurizada en polvo al 20% esterilizada en autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos a
121 °C). Posteriormente de cada una de los cultivos en caldo BHI se tomó 0.8 ml y se centrifugo
a 4000 rpm a una temperatura de 20 – 25 °C durante 20 minutos. Luego se suspendió 0.8 ml del
medio de crio conservación previamente preparado con ayuda de una micro pipeta, realizando
luego una homogenización. Finalmente, los viales serán refrigerados a 4 ºC por 15 minutos para
un periodo de equilibrio e inmediatamente congelarlos a -30 °C.
| 37
3.6.4 Conservación de Hongos. Para los hongos filamentosos se evaluaron cuatro
métodos de conservación de los cuales uno de ellos fue sometido a Crio conservación (Leche
Descremada al 20%) y dos restantes a preservación (Papel de Filtro Whatmman y Agua Estéril).
Según la metodología propuesta por (Ángel, D. 2006) se realiza el siguiente procedimiento
para la conservación de Hongos Filamentosos.
3.6.4.1 Preservación con Papel de Filtro Whatmman N° 4 Estéril: Se realizaron cultivos
de hongos en caldo PDA y se dejó crecer en un periodo de 5 días aproximadamente. Para ello se
tomaron viales de 2 ml por cada cultivo a conservar y 12 viales por cada microorganismo a
evaluar de los cuales 9 corresponderán a la viabilidad de los 3, 6 y 12 meses (Método por
triplicado), también se adiciono a cada uno 15 discos de papel filtro Whatmman N°4 de 5 mm,
los cuales se esterilizaron a 121ºC por 15 minutos en autoclave. Se tomó 0.1ml de cada uno de
los cultivos y se agregaron a los viales previamente preparados realizando una buena
homogenización y finalmente se almaceno en nevera a 4 ºC.
3.6.4.2 Crioprotector con Agua Destilada Estéril: Para la crio preservación de hongos
filamentosos se prepararon tubos con agar PDA en pico de flauta en los cuales se cultivaron las
cepas y luego se incubaron a 25 °C en un periodo de 5 días aproximadamente presentando buen
crecimiento y esporulación.
A partir de los tubos descritos anteriormente se adiciono 10 ml de agua destilada
esterilizada tres veces en autoclave a 121 °C a 15 libras de presión por 15 minutos. Para la
separación de las conidias se utilizó el vortex y a partir de esta suspensión se tomó 1.8 ml de
cada cepa a conservar y 12 viales por cada microorganismo a evaluar de los cuales 9
| 38
corresponderán a la viabilidad de los 3, 6 y 12 meses (Método por triplicado) en condiciones de
esterilidad y luego se colocaron en nevera a 4 °C.
3.6.4.3 Crioprotector con Leche Desnatada al 20% Estéril: Para la crio preservación de
hongos filamentosos se realizaron tubos con agar PDA en pico de flauta en los cuales se
cultivaron las cepas y se incubaron a 25 °C en un periodo de 5 días aproximadamente
presentando buen crecimiento y esporulación.
A partir de los tubos descritos anteriormente se adicionaron 10 ml de emulsión de leche
descremada (Agua destilada esterilizada tres veces en autoclave y leche descremada High
Calcium al 20%) esterilizada tres veces en autoclave a 121 °C a 15 libras de presión por 15
minutos. Para la separación de las conidias se utilizó el vortex y a partir de esta suspensión se
tomó 1.8 ml de cada cepa a conservar y 12 viales por cada microorganismo a evaluar de los
cuales 9 corresponden a la viabilidad de los 3, 6 y 12 meses (Método por triplicado), en
condiciones de esterilidad y luego se colocaron en refrigeración a 4ºC por 15 minutos para un
periodo de equilibrio e inmediatamente congelarlos a -30°C.
3.6.5 Evaluación de los métodos de Conservación. La evaluación se realizó mediante la
Pureza y Viabilidad de cada microorganismo conservado en un intervalo de 3, 6 y 12 meses de
conservación.
3.6.5.1 Pureza: Para el ensayo de la pureza se realizó por observación macroscópica de las
colonias crecidas (Forma, Tamaño y color) y las características microscópicas del cultivo
obtenido en los medios, teñidos por el método de tinción de Gram para Bacterias y con Azul de
| 39
Lactofenol para Hongos Filamentosos. También se realizaron otras pruebas para una
identificación más confiables utilizando la Prueba de BD BBL Crystal E/NF para Bacterias
Gram Negativas y BD BBL Crystal GP para Bacterias Gram Positivas.
3.6.5.2 Viabilidad de Bacterias: Viabilidad de los métodos de conservación en Bacterias
Gram Positivas y Gram Negativas
Con el objetivo de evaluar la viabilidad de los métodos de conservación se realizó un
seguimiento a las cepas conservadas donde se medió un recuento inicial de cultivo y recuentos a
los tres (3), seis (6) y doce (12) meses de conservación. La siguiente metodología fue basada en
(Pedroza & Quevedo-Hidalgo, 2007)
El numero inicial de células se determinó, realizando diluciones desde 10-2 a 10-6, en agua
peptonada y se sembraron 0.1 ml de las últimas dos diluciones en placas de agar Plate Count para
bacterias por duplicado, extendiéndolas con un asa de Drigalsky por toda la placa hasta una
absorción completa y se incubaron a 37ºC por 24 h.
Para el recuento de las diluciones se multiplicará por el factor de dilución correspondiente
para obtener el resultado en UFC/ml. A las 24 horas de conservación se evaluará el número de
células viables para cada una de las cepas.
Para papel filtro se tomaron dos discos equivalentes a 0.01ml y serán suspendidos en 0.99
ml de caldo BHI y luego incubarlos a 37 °C por 15 minutos. Una vez transcurrido el tiempo se
realizaron diluciones seriadas hasta 10-6.
El procedimiento de descongelación de las cepas se realizó bajando la temperatura de
congelación a refrigeración por 30 minutos y luego a temperatura ambiente.
| 40
3.6.5.3 Viabilidad de Hongos Filamentosos:
Preservación en Agua Destilada Estéril: Se tomaron los viales con 1,8 ml de cultivo
conservado que se encontraran almacenados en refrigeración a 4 °C, de los cuales en condiciones
de esterilidad se sacó 0,1 ml de cada una de las cepas y con ayuda de un escobillón estéril se
sembrara masivamente en cajas con agar PDA, Luego se incubo a 25 °C durante 7 días o el
tiempo que requirió cada cepa; esto se realizara por triplicado.
Conservación con Leche Descremada al 20% Estéril: Se tomarán los viales con 1,8
ml de cultivo conservado que se encontraran almacenados en congelación a -30 °C, de los cuales
en condiciones de esterilidad se sacó 0,1 ml y con ayuda de un escobillón estéril se sembrara
masivamente en cajas con agar PDA, Se incubo a 25 °C durante 7 días o el tiempo que requiera
cada cepa, Esto se realizada por triplicado.
Conservación con Papel de Filtro Whatmman: Se tomaran los frascos de cada cepa y
en condiciones de esterilidad se sacaran de cada uno de ellos 1 sensidisco y se agregaran a tubos
con 9 ml de agua destilada estéril del cual se extraerá 1 ml para seguir realizando diluciones de la
muestra hasta llegar a 10 -3; de este último se obtendrá 0,1 ml y con la ayuda de un escobillón
estéril se sembró masivamente en cajas con agar PDA, Luego se incubara a 25 °C durante 7 días
o el tiempo que requiera cada cepa, esto se realizara por triplicado.
| 41
3.6.6 Diseño del Manual de protocolos de mantenimiento y preservación de
microorganismos del cepario de la Universidad de Santander
Se realizó un manual con protocolos óptimos de mantenimiento y preservación de
microorganismos, presentes en el cepario de la Universidad de Santander. Para esto, fue
colectada la información referente a las cepas que conforman el cepario y los métodos
actualmente utilizados para su identificación y mantenimiento. También estos procedimientos
fueron seleccionados de acuerdo a su comportamiento y ajuste a las condiciones técnicas,
ambientales y presupuestas del cepario.
| 42
4. Resultados
4.1 Curvas de Crecimiento
Todos los microorganismos estudiados en este trabajo, demostraron un comportamiento
similar en las curvas de crecimiento
Microorganismo Fase Exponencial Tardía
Escherichia coli 6 horas
Pseudomonas aeruginosa 6 horas
Citrobacter freundii 8 horas
Serratia marcenscens 4 horas
Bacillus cereus 8 horas
Bacillus licheniformis 4 horas
Bacillus thuringiensis 6 horas
Listeria monocytogenes 6 horas
Tabla 2. Fase exponencial tardía de los microorganismos estudiados.
4.1 Bacterias Gram Negativas
4.1.1 Escherichia coli
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 12 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en las
siguiente Figura 3, el cual se evidencia una tasa máxima de crecimiento bacteriano en la hora 6
| 43
de iniciada la curva de crecimiento, alcanzando una densidad óptica de 2,054 y un recuento de
2,13 X 1012 UFC/mL; Tiempo de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
Figura 3. Curva de crecimiento de E. coli. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Escherichia coli en los diferentes
métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura 4, evidenciando que la mejor
condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Glicerol al 30%. En esta
condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad de 98,7% (2,10 X1012) en Glicerol al 30%, 89,6%
(1,9 X1012) en Leche Descremada al 20% y 76,4% (1,6 X1012) en Papel de filtro Whatmman N°4
a los 12 meses de conservación y preservación.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12
UFC
/mL
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
absorbancia
Recuento (*1012 UFC/mL)
| 44
Figura 4. Recuperación a través del tiempo de Escherichia coli. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal E/NF la cual obtuvo un porcentaje
del 99,9% de pureza para esta cepa bacteriana. En la siguiente imagen se observa el resultado del
sistema de ID BBL Crystal.
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
0 3 6 12
| 45
Figura 5. Resultado de E. coli mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor.
El resultado de la suma de los pocillos fue de 7462646171 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a E. coli con un alto porcentaje.
4.1.2 Pseudomonas aeruginosa
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 6 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 1,071 y un recuento de 1,10 X 1010 UFC/Ml; Tiempo
de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12
UFC
/mL
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
absorbancia
Recuento (*1010 UFC/mL)
| 46
Figura 6. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Pseudomonas aeruginosa en los
diferentes métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que
la mejor condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Glicerol al 30%.
En esta condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 99,5% (1,09 X1010
UFC/Ml) en Glicerol al 30%, 98,5% (1,08 X1010 UFC/Ml) en Leche Descremada al 20% y
82,3% (1,0 X1010 UFC/Ml) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de conservación y
preservación.
Figura 7. Recuperación a través del tiempo de Pseudomonas aeruginosa. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor.
Pureza
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
0 3 6 12
| 47
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal E/NF la cual obtuvo un porcentaje
del 99,3% de pureza para esta cepa bacteriana. En la siguiente Figura se observa el resultado del
sistema de ID BBL Crystal.
Figura 8. Resultado de P. aeruginosa mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente:
Autor.
El resultado de la suma de los pocillos fue de 7403111351 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a P. aeruginosa con un alto porcentaje.
4.1.3 Citrobacter freundii
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
| 48
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 8 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 1,002 y un recuento de 1,3 X 109 UFC/Ml; Tiempo de
crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
Figura 9. Curva de crecimiento de C. freundii. Fuente: Autor.
o Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Citrobacter freundii en los diferentes
métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que la mejor
condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Glicerol al 30%. En esta
condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 99% (1,299 X109 UFC/mL) en
Glicerol al 30%, 99,5% (1,29 X109 UFC/mL) en Leche Descremada al 20% y 85,8% (1,11 X109
UFC/mL) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de conservación y preservación.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 2 4 6 8 10 12
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
UFC
/mL
absorbancia
Recuento (*109 UFC/mL)
| 49
Figura 10. Recuperación a través del tiempo de Citrobacter freundii Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal E/NF la cual obtuvo un porcentaje
del 99% de pureza para esta cepa bacteriana. En la Figura se observa el resultado del sistema de
ID BBL Crystal.
70
75
80
85
90
95
100
0 3 6 12
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
| 50
Figura 11. Resultado de C. freundii mediante el sistema de ID BBL Crystal. Fuente: Autor.
El resultado de la suma de los pocillos fue de 5664656151 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a Citrobacter freundii con un alto porcentaje.
4.1.4 Serratia marcenscens
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 4 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 1,029 y un recuento de 1,35 X 1012 UFC/Ml; Tiempo
de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
| 51
Figura 12. Curva de crecimiento de Serratia marcenscens. Tres métodos de conservación
fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Serratia marcenscens en los
diferentes métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que
la mejor condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Glicerol al
30%%. En esta condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 99,8% (1,34 X1012
UFC/mL) en Glicerol al 30%, 96,5% (1,3 X1012 UFC/mL) en Leche Descremada al 20% y
90,2% (1,21 X1012 UFC/mL) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de conservación
y preservación.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
UFC
/mL
Recuento (*1012 UFC/mL)
absorbancia
| 52
Figura 13. Recuperación a través del tiempo de Serratia marcenscens. Tres métodos de
conservación fueron evaluados en cuatro tiempos. Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal E/NF la cual obtuvo un porcentaje
del 99,8% de pureza para esta cepa bacteriana. En la siguiente Figura se observa el resultado del
sistema de ID BBL Crystal.
Figura 14. Resultado de Serratia marcenscens mediante el sistema de ID BBL Crystal.
Fuente: Autor.
84
86
88
90
92
94
96
98
100
0 3 6 12
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
| 53
El resultado de la suma de los pocillos fue de 3777256557 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a Serratia marcenscens con un alto porcentaje.
Figura 15. Comportamiento de la efectividad de los diferentes métodos a los 0, 3, 6 y 12
meses en Bacterias Gram Negativas. Fuente: Autor
Microorganismo
UFC/mL INICIAL (Mes 0) UFC/ mL FINAL (Mes 12)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
E. coli 2,13X1012 2,13X1012 2,13X1012 2,10X1012 1,9X1012 1,6X1012
P. aeruginosa 1,10X1010 1,10X1010 1,10X1010 1,09X1010 1,08X1010 0,91X1010
C. freundii 1,3X109 1,3X109 1,3X109 1,29X109 1,28X109 1,11X109
S. marcenscens 1,35X1012 1,35X1012 1,35X1012 1,34X1012 1,30X1012 1,21X1012
Tabla 3. Conteo de células viables en Bacterias Gram Negativas. Fuente: Autor.
0
20
40
60
80
100
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
0 3 6 12
E. coli P. aeruginosa C. freundii S. marcenscens
| 54
Microorganismo
Numero de UFC/ mL perdidas a los 12 meses %
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
E. coli 0,03X10
12
0,23X1012
0,53X1012
1,3 10,4 23,6
P. aeruginosa 0,01X10
10
0,02X1010
0,19X1010
0,5 1,5 17,7
C. freundii 0,01X10
9
0,02X109
0,19X109
0,5 1 14,2
S. marcenscens 0,01X10
12
0,05X1012
0,14X1012
0,2 3,4 9,8
Tabla 4. Conteo de células viables a los 12 meses y % de células no viables en Bacterias
Gram Negativas. Fuente: Autor.
El porcentaje de viabilidad para las Bacterias Gram Negativas fue mayor en el método de
conservación por congelación en Glicerol al 30%, con un promedio de 99,3% considerando que
se encuentra por encima 1,3X109 células/mL a los 12 meses de conservación. La viabilidad del
método comprueba la efectividad del método para mantener la cepa por largos periodos de
tiempo (Gutiérrez, 2006). Estos resultados pueden contrastarse con lo evaluado reportados por
(Kirsop, B. 1991), quien menciona que esta técnica favorece la conservación de un alto número
de células, manteniéndose viables hasta de un 85% por años.
4.2 Bacterias Gram Positivas
4.2.1 Bacillus cereus
Curva de Crecimiento
| 55
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 8 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 2,094 y un recuento de 2,12 X 1011 UFC/Ml; Tiempo
de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
Figura 15. Curva de crecimiento de Bacillus cereus. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Bacillus cereus en los diferentes
métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que la mejor
condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Leche Descremada al
20%. En esta condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 99,3% (2,10 X1011
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0 2 4 6 8 10 12
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
UFC
/mL
absorbancia
Recuento (*1011 UFC/mL)
| 56
UFC/mL) en leche descremada al 20%, 97,2% (2,06 X1011 UFC/mL) en Glicerol al 30% y
92,9% (1,96 X1011 UFC/mL) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de conservación
y preservación.
Figura 16. Recuperación a través del tiempo de Bacillus cereus. Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal GP la cual obtuvo un porcentaje del
99,6% de pureza para esta cepa bacteriana. En la Figura se observa el resultado del sistema de
ID BBL Crystal.
84
86
88
90
92
94
96
98
100
0 3 6 12
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
| 57
Figura 17. Resultado de Bacillus cereus mediante el sistema de ID BBL Crystal GP.
El resultado de la suma de los pocillos fue de 3551435743 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a B. cereus con un alto porcentaje.
4.2.2 Bacillus licheniformis
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 4 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 0,742 y un recuento de 1,07 X 1013 UFC/Ml; Tiempo
de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 2 4 6 8 10 12
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
UFC
/mL
absorbancia
Recuento (*1013 UFC/mL)
| 58
Figura 18. Curva de crecimiento de Bacillus licheniformis. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Bacillus licheniformis en los
diferentes métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que
la mejor condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Leche
Descremada al 20%. En esta condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 99,2%
(1,06 X 1013 UFC/mL) en leche descremada al 20%, 98,9% (1,05 X 1013 UFC/mL) en Glicerol
al 30% y 90,8% (0,97 X 1013 UFC/mL) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de
conservación y preservación.
Figura 19. Recuperación a través del tiempo de Bacillus licheniformis Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal GP la cual obtuvo un porcentaje del
86
88
90
92
94
96
98
100
0 3 6 12
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Leche D. 20% Glicerol 30% Papel Filtro
| 59
99,8% de pureza para esta cepa bacteriana. En la Figura se observa el resultado del sistema de
ID BBL Crystal.
Figura 20. Resultado de Bacillus licheniformis mediante el sistema de ID BBL Crystal.
Fuente: Autor.
El resultado de la suma de los pocillos fue de 2704064773 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a B. licheniformis con un alto porcentaje.
4.2.3 Bacillus thuringiensis
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 6 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 0,952 y un recuento de 1,26 X 1010 UFC/Ml; Tiempo
de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
| 60
Figura 21. Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Bacillus thuringiensis en los
diferentes métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que
la mejor condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Leche
Descremada al 20%. En esta condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 98,9%
(1,24 X 1010 UFC/mL) en leche descremada al 20%, 97,6% (1,22 X 1010 UFC/mL) en Glicerol al
30% y 97,3% (1,22 X 1010 UFC/mL) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de
conservación y preservación.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10 12
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (h)
UFC
/mL
Recuento (*1010 UFC/mL)
absorbancia
| 61
Figura 22. Recuperación a través del tiempo de Bacillus thuringiensis. Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal GP la cual obtuvo un porcentaje del
98,6% de pureza para esta cepa bacteriana. En la Figura se observa el resultado del sistema de
ID BBL Crystal.
Figura 23. Resultado de Bacillus Thuringiensis mediante el sistema de ID BBL Crystal.
Fuente: Autor.
95,5
96
96,5
97
97,5
98
98,5
99
99,5
100
0 3 6 12
Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Leche D. 20% Glicerol 30% Papel Filtro
| 62
El resultado de la suma de los pocillos fue de 2774551467 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a B. thuringiensis con un alto porcentaje.
4.2.4 Listeria monocytogenes
Curva de Crecimiento
La curva de crecimiento fue realizada en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Partiendo
de un pre inoculo estático, crecido 24 horas a 37 °C, obteniéndose el resultado presentado en la
Figura, el cual evidencio una tasa máxima de crecimiento bacteriano a las 6 horas de iniciada la
curva, alcanzando una densidad óptica de 1,960 y un recuento de 2,05 X 1011 UFC/Ml; Tiempo
de crecimiento tomado para la respectiva preservación bacteriana.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5A
bso
rban
cia
(nm
)
Tiempo (h)
UFC
/mL
Recuento (*1011 UFC/mL)
absorbancia
| 63
Figura 24. Curva de crecimiento de Listeria Monocytogenes. Fuente: Autor.
Conservación y porcentaje de viabilidad
Después de preservada y conservada la cepa bacteriana Listeria monocytogenes en los
diferentes métodos de conservación, se obtuvieron los resultados en la Figura, evidenciando que
la mejor condición de preservación y conservación fue aquella donde se utilizó Leche
Descremada al 20%. En esta condición se obtuvo un porcentaje de viabilidad promedio de 99,9%
(2,04 X 1011 UFC/mL) en leche descremada al 20%, 99,4% (2,03 X 1011 UFC/mL) en Glicerol al
30% y 95,8% (1,96 X 1011 UFC/mL) en Papel de filtro Whatmman N°4 a los 12 meses de
conservación y preservación.
Figura 25. Recuperación a través del tiempo de Listeria monocytogenes. Fuente: Autor.
Pureza
La verificación de la pureza fue confirmada por la observación microscópica mediante la
coloración Gram y el sistema de identificación BBL Crystal GP la cual obtuvo un porcentaje del
93
94
95
96
97
98
99
100
0 3 6 12Po
rcen
taje
de
Via
bil
idad
Tiempo (Meses)
Leche D. 20% Glicerol 30% Papel Filtro
| 64
99,7% de pureza para esta cepa bacteriana. En la Figura se observa el resultado del sistema de
ID BBL Crystal.
Figura 26. Resultado de Listeria monocytogenes mediante el sistema de ID BBL Crystal.
Fuente: Autor.
El resultado de la suma de los pocillos fue de 2650711662 y mediante un sistema
computarizado se logró identificar que pertenecía a L. monocytogenes con un alto porcentaje.
Figura 16. Comportamiento de la efectividad de los diferentes métodos a los 0, 3, 6 y 12
meses en Bacterias Gram Positivas. Fuente: Autor
0102030405060708090
100
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
Glicerol30%
Leche D.al 20%
Papel deFiltro
0 3 6 12
Po
rcen
taje
B. cereus B. licheniforms B. thuringiensis L. monocytogenes
| 65
Microorganismo
UFC/mL INICIAL (Mes 0) UFC/ mL FINAL (Mes 12)
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
B. cereus 2,12X10
11
2,12X1011
2,12X1011
2,06X1011
2,10X1011
1,96X1011
B. licheniformis 1,07X10
13
1,07X1013
1,07X1013
1,05X1013
1,06X1013
0,97X1013
B. thuringiensis 1,26X10
10
1,26X1010
1,26X1010
1,22X1010
1,24X1010
1,20X1010
L. monocytogenes 2,05X10
11
2,05X1011
2,05X1011
2,03X1011
2,04X1011
1,96X1011
Tabla 4. Conteo de células viables en Bacterias Gram Positivas. Fuente: Autor.
Microorganismo
Numero de UFC/ mL perdidas a los 12 meses %
Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro Glicerol 30% Leche D. 20% Papel Filtro
B. cereus 0,06X10
11
0,02X1011
0,16X1011
2,8 0,7 7,1
B. licheniformis 0,02X10
13
0,01X1013
0,1X1013
1,1 0,8 9,2
B. thuringiensis 0,04X10
10
0,02X1010
0,06X1010
2,4 1,1 2,7
L. monocytogenes 0,02X10
11
0,01X1011
0,09X1011
0,6 0,1 4,2
Tabla 5. Conteo de células viables a los 12 meses y % de células no viables en Bacterias
Gram Positivas. Fuente: Autor.
El efecto protector de la leche descremada al 20% fue observada en Bacterias Gram Positivas al
obtener resultados favorables de viabilidad a los 12 meses por encima de 1,1X109 células/mL,
valores que se igualan al criterio de evaluación establecido en las especificaciones del cepario de
Microbiología de la Universidad de Santander (Viabilidad de 1,2X109 células/mL o Escala 4 de
| 66
Mc Farland) por lo que se considera que el procedimiento evaluado mantuvo la viabilidad de los
cultivos en un promedio de 99,3% a los 12 meses de conservación a -30 °C de temperatura.
4.3 Hongos Filamentosos
Las 6 cepas evaluadas no presentaron problemas en su viabilidad ni contaminaciones con
otros hongos por lo cual su pureza fue óptima y su estabilidad morfológica fue buena.
4.3.1 Evaluación de la morfología macroscópica y microscópica. Teniendo en cuenta las
descripciones morfológicas macroscópicas y microscópicas de los hongos reportados
bibliográficamente, se procedió a la observación e identificación de cada cepa, determinando así
la estabilidad morfológica de cada cepa.
4.3.1.1 Descripción Macroscópica
CEPA Medio Descripción de las colonias
Aspergillus fumigatus PDA
Micelio filamentoso con
hifas hialinas. Sus colonias
pueden tener un aspecto que
va desde aterciopelado a
algodonosa. Su color varía
desde verde botella, gris
verdoso o marrón verdoso.
Fuente: Autor.
| 67
Tabla 2. Características Macroscópicas de las cepas evaluadas.
Aspergillus niger PDA
Colonias de color negro o
marrón oscuro; reverso
incoloro a amarillo; colonia
densa, granular a flocosa.
Fuente: Autor
CEPA Medio Descripción de las colonias
Aspergillus clavatus PDA
Colonias aterciopeladas de
color azul verdoso, con
margen blanco alrededor de
los bordes.
Fuente: Autor.
Rhizopus stolonifer PDA
Colonias densas, presentan
crecimiento a los tres días de
color blanco al principio y
luego grisáceas de textura
algodonosa.
Fuente: Autor.
Bauberia bassiana PDA
Colonias algodonosas
blancas de crecimiento lento.
| 68
Fuente: Autor.
4.3.1.2 Descripción Microscópica
Fuente: Autor.
Penicillium chrysogenum PDA
Colonias de color verde –
gris planas aterciopeladas
fasciculada con producción
de exudados.
Fuente: Autor.
CEPA Reactivo Descripción de las colonias
Aspergillus
fumigatus
Azul de
metileno
Cabezas conidiales uniseriadas y
predominantemente columnares: estipes
hialinos y lisos; vesícula piriforme o en
forma de cuchara; conidios globosos a
ovoides.
Fuente: Autor.
Aspergillus
niger
Azul de
metileno
Cabezas conidiales biseriadas y radiales;
estipes de paredes gruesas, lisos,
hialinos, amarillentos o de color marrón
| 69
Tabla 3. Características microscópicas de las cepas evaluadas
pálido, vesícula casi esféricas y conidios
globosos o de color marrón.
Fuente: Autor
Aspergillus
clavatus
Azul de
metileno
Conidióforos largos y lisos; filaides
uniseriadas; vesículas grandes en forma
de clava.
Fuente: Autor.
| 70
Rhizopus
stolonifer
Azul de
metileno
esporangióforos sin ramificar de color
pardo oscuro que
nacen de un nudo de rizoides bien
desarrollados; Esporangios esféricos
negros con columela Esporangiosporas
negras,
Abundantes rizoides y zigosporas
esféricas de pared
gruesa, desnuda; Clamidosporas ausentes
Fuente: Autor.
Bauberia
bassiana
Azul de
metileno
hifas cenocíticas, lisas, con
células conidiógenas formando racimos
agrupados, fialides
hinchadas y se
adelgazan hacia la parte que sostiene las
esporas
Llamado raquis en forma de zigzag.
Los conidios son hialinos, lisos, de forma
globosa a
Elipsoidal.
Fuente: Autor.
Penicillium
chrysogenum
Azul de
metileno
Hifas septadas hialinas, con conidióforos
simples o ramificadas, metulas, fialides y
conidias, las conidias son redondas no
ramificadas.
Fuente: Autor.
| 71
Se pudo determinar que todas las siembras fúngicas sometidas a conservación y
preservación, luego de ser recuperadas no presentaron ningún tipo de contaminación, puesto que
sus características morfológicas, no varían.
4.4 Manual de protocolos de mantenimiento, preservación y verificación de
microorganismos del cepario de la Universidad de Santander. (Ver Apéndice A)
Se logró la realización de un manual con protocolos de preservación y verificación de
microorganismos que se deseen conservar y preservar, el cual estará a disposición de estudiantes,
profesores e investigadores en el laboratorio Central de Bacteriología y Laboratorio Clínico,
Bloque Chibcha de la Universidad de Santander UDES.
5. Discusión
El índice de supervivencia de los microorganismos conservados suele estar relacionado con
el numero inicial de células y con la edad de los cultivos bacterianos (Nakamura, 1996). Según
(Heckly et al., 1998), un numero alto de células en pre congelación garantiza un mayor
porcentaje de recuperación teniendo en cuenta que la concentración inicial de células debe ser
| 72
por lo menos de 1,2 X109 UFC/ml (Faine et al., 1999). Esta condición compensa la
susceptibilidad al choque por enfriamiento que presentan las bacterias en la fase logarítmica de
crecimiento, debido a su baja concentración de pared celular (Fahey, 1990). En este estudio,
todos los cultivos utilizados para la preservación y conservación microbiana se encontraban en el
tiempo de la fase exponencial tardia con una concentración celular alta equivalente a la escala 4
de Mc Farland Esta condición inicial, permitió en parte la obtención de los altos porcentajes de
viabilidad (99,2% en Glicerol al 30%, 98,5% en Leche descremada al 20% y 93,3% en Papel de
filtro) promedio en bacterias alcanzados en este estudio, incluso en el máximo tiempo de
muestreo (12 meses).
No obstante, el índice de supervivencia post preservación y conservación, no solo se
atribuye a la alta densidad celular del inóculo, sino que también depende del mantenimiento de
las condiciones intracelulares de osmolaridad e hidratación mínima para evitar el
desencadenamiento de la muerte celular (Malik, 1991). Es por ello, que el uso de un
crioprotector se hace indispensable para la conservación de la viabilidad microbiana en
condiciones de congelamiento.
En nuestro estudio, el uso del glicerol al 30% y de Leche Descremada al 20% como
agentes crio protectores, mantuvieron altos porcentajes de viabilidad de las cepas bacterianas
preservadas. Sin embargo, el glicerol evidenció un mejor desempeño al asociarse a mejores
índices de recuperación celular en bacterias Gram Negativas y El de Leche Descremada en
Bacterias Gram Positivas. Estos resultados coinciden con lo reportado por Hubálek (2003) y
Poutou (2002) los cuales son reportados en los resultados.
| 73
Por otra parte, (Mackie y Therion, 1984), indicaron que las bacterias Gram negativas son
más sensibles a los cambios osmolares que las Gram positivas (diferencia relacionada con las
características de su pared bacteriana). Una explicación para este fenómeno es dada por los
cambios sufridos en su estructura física de la pared de las bacterias Gram negativas, en el
proceso de crio preservación. Esto debido a que, durante el proceso de congelación, se produce
dilatación de los poros de la membrana rica en lípidos, lo que provoca la lisis celular. Este
fenómeno sumado, a la ruptura celular, relacionada con la formación de grandes cristales de
hielo de agua intracelular, durante la fase de enfriamiento, ocasionan la precipitación de altas
tasas de lisis en bacterias Gram negativas crio preservadas inadecuadamente (Malik, 1991).
La pureza y viabilidad de las cepas bacterianas evaluadas se mantuvo a lo largo del estudio
(12 meses) con un promedio para las bacterias Gram positivas de: 99,05% en Glicerol al 30%,
99,6% en Leche descremada al 20% y 96,25% en papel de filtro. Y para las Bacterias Gram
negativas de: 99,5% en Glicerol al 30%, 97,4% en Leche descremada al 20% y 90,4% en papel
de filtro.
La conservación y preservación de los Hongos filamentosos fue muy satisfactoria en los
tres métodos empleados, se pudo establecer que este método permitió la viabilidad y pureza para
las cepas fúngicas mencionadas en el estudio. Estos métodos según estudios realizados por
(Panizo et al., 2005), garantizaron la preservación adecuada de hongos filamentosos; así mismo
el estudio realizado por (Bueno y Gallardo, 1996), sobre la preservación de hongos filamentosos
mostraron que estos métodos son seguros, simples, capaz de garantizar la estabilidad y
supervivencia de los diferentes cultivos fúngicos por largos periodos de tiempo. También se
encontraron antecedentes de altos porcentajes de viabilidad en extensos periodos de tiempo los
que fueron reportados en el 2003 por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
| 74
En relación con el método de conservación en Leche Descremada al 20%, se puede decir
que es un agente crioprotector que preserva del daño que se pueda producir en las células
microbianas en el momento de la congelación (Garcia y uruburú, 1991). Este método arrojo
buenos resultados dado que, de 8 cepas, 8 fueron recuperadas en un total de tiempo (12 meses).
En otros estudios realizados por demostraron mejores tasas promedio de supervivencia
para las bacterias Gram Positivas, con respecto a las negativas, a los seis meses de conservación.
Las tasas observadas fueron en promedio de 72,23% y 58,74% para Gram positivas y Gram
negativas, respectivamente.
De acuerdo con lo anterior, y tomando en consideración las condiciones logísticas y
ambientales del laboratorio, se procedió a evaluar métodos de conservación a -30 °C y
preservación a 4 ºC, teniendo en cuenta, que en el laboratorio existe un congelador (Freezer)
apropiado para el mantenimiento de esta temperatura, así como también la de mantener cultivos
a temperatura de refrigeración, como lo descrito anteriormente (Wasas et al. 1998).
Estos protocolos permitirán al Laboratorio Central del Programa de Microbiología
Industrial y Bacteriologia y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander UDES, mantener
un cepario completo de bacterias a menores costos, derivados de la compra de cepas, gastos en
reactivos y personal.
.
| 75
6. Conclusiones
En las curvas de crecimiento se observaron comportamientos similares en los
microorganismos estudiados ya que su porcentaje de células coincidían con las demás
cepas, sabemos que cada bacteria posee características metabólicas diferentes y estas se
diferencian en la hora de la fase exponencial tardía.
Los tres métodos de conservación evaluados en los diferentes microorganismos son
eficaces para la recuperación de microorganismos en un tiempo de 12 meses.
| 76
Los métodos de conservación en Leche descremada al 20% y Glicerol al 30% resultaron
ser los métodos con mejor resultados en cuando al índice celular.
En cuanto al método de papel de filtro mostro resultados poco favorables ya que al
transcurrir del tiempo se va perdiendo la viabilidad por ende este método debe ser
utilizado en periodos de conservaciones cortas.
Los resultados de viabilidad obtenidos en este estudio muestran que las técnicas de
conservación en Glicerol al 30% y Leche descremada al 20% son un metodo de confiable
en la conservación de Bacterias Gram Negativas y Gram Positivas, posteriormente, lo
cual sugiere que podría ser aplicable a todas las especies bacterianas con características
similares del cepario de la Universidad de Santander.
El metodo de Glicerol permitió una viabilidad del 99,2% en Glicerol al 30%, 98,5% en
Leche descremada al 20% y 93,3% en Papel de filtro a los 12 meses de conservación.
Los protocolos de conservación y preservación permitirán solucionar el problema del
mantenimiento tradicional de las cepas exigentes, el cual se hace rutinariamente por pases
seriados, disminuyendo así los altos costos derivados del mantenimiento del cepario.
En el caso de las cepas fúngicas las cuatro metodologías evaluadas, son eficaces en el
mantenimiento de las mismas, sin embargo, el resultado muestra que no es posible
generalizar una sola de estas para todos los aislamientos, es necesario hacer evaluaciones
de viabilidad periódicas, y conservar por lo menos dos métodos diferentes e ir haciendo
la selección técnica más eficiente en cada caso, teniendo en cuenta la biología propia de
cada género de hongo a ser conservado.
Dentro de las debilidades que presenta el mantenimiento de los hongos por repiques
periódicos, están el polimorfismo, la contaminación, la perdida de cultivos por
| 77
contaminación con ácaros (Panizo y Col, 2005). Lo cual hace necesario seguir evaluando
metodologías, que aseguren el mantenimiento de la colección de hongos.
Es necesario evaluar otras técnicas de conservación para hongos filamentosos, tales como
el crioprotector en Glicerol al 30% que en este trabajo se utilizó para la conservación de
Bacterias y que arrojo resultados favorables.
La identificación realizada a los microorganismos permitió asegurar que se conservó la
pureza y se mantuvieron las características fenotípicas y bioquímicas de las cepas.
Con los resultados obtenidos en este estudio se logró diseñar un manual de protocolos de
conservación de cepas microbianas el cual es corroborado con los datos obtuvimos en el
estudio, para la implementación en diversas áreas de Microbiología Industrial.
7. Recomendaciones
Establecer periodos de tiempo más largos (por años) para los métodos de conservación
por congelación ya que por medio de reportes bibliográficos muestran estudios de
conservaciones hasta de 3 años.
Para garantizar una buena calidad en el servicio del cepario se recomienda que este
posea su propia existencia de medios de cultivo, reactivos y material de vidrio.
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Es recomendable hacer seguimiento al método de preservación en papel de filtro ya que
este mostro resultados poco favorables, esto pudo deberse a que este tipo de método es a corto
plazo.
También se debe hacer tener una buena manipulación y esterilidad mediante el uso de
un laboratorio que cumpla con todos los equipos necesarios para esta clase de estudio como lo
son: espectrofotómetro, cámara de flujo laminar, incubadora, freezer, nevera, mechero y shaker.
| 79
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