Universidad de ConcepcinFACULTAD DE MEDICINA

CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA

Histoqumica de cidos NucleicosT.M. Andrea Dibarrart Vera 2008

DISTRIBUCIN DE LOS AN

ARN

Surcos y Fuerzas de estabilizacin en el ADN.

ESTABILIZACIN DE CIDOS NUCLEICOS.

Nucleoprotenas se estabilizan bien; como la mayora de las protenas. Poseen alto peso molecular (insolubilizacin).

cidos Nucleicos unidos a protenas (ADN y ARN unido a poliribosomas) se conservan, no as los AN libres (ARNm, ARNt) Si el mtodo de tincin requiere de una hidrlisis previa, NO SE DEBE UTILIZAR FIJADORES ACIDOS.Si vamos a identificar ARNr hay que tratar de no destruir membranas (evitar fijadores a base de solventes orgnicos) y de eleccin, clulas con alta sntesis de protenas. CH3COOH, buen precipitador de nucleoprotenas.

HISTOQUIMICA DE ACIDOS NUCLEICOSBase Nitrogenada Pentosa Radical Fosfato

HQ DE AN: IDENTIFICACION POR BASE NITROGENADAABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA DE BASES NITROGENADAS.

El no apilamiento de bases, producto de la desnaturalizacin determina que stas absorvan radiacin UV. Los AN presentan una mayor absorcin de luz UV a 254260 nm debido a la interaccin entre la luz UV y los sistemas de anillos de las purinas y pirimidinas. Cualquier molcula que contenga bases nitrogenadas (nuclesidos; nucletidos y polinucletidos) pueden analizarse utilizando luz UV.Importancia: Localizacin; separacin y caracterizacin de AN (aislamiento luego de separarlos por electroforesis, por ejemplo).

HQ DE AN: IDENTIFICACION POR SU PENTOSAReaccin de Feulgen Hidrlisis cida dbil que puede ser realizada a 60C (HCl 1M) T A. (HCl 5 M). La hidrlisis es capaz de provocar la formacin de grupos aldehdos que Son detectados con el reactivo de Schiff.

REACCIN DE FEULGEN

La hidrlisis cida rompe aquellos enlaces de hidrgeno que une a la doble hlice (desnaturalizacin), lo que provoca la liberacin de bases pricas (A y G) con la formacin de un cido apurnico y la generacin de grupos CHOs en el C1 de la pentosa, donde se hallaba la base nitrogenada.

=

Mtodo de Feulgen consiste en una depurinizacin por hidrlisis cida del ADN, y la posterior utilizacin del reactivo de Schiff (leucobase).

Para obtener el mayor nmero de grupos CHO reactivos, debemos realizar una hidrlisis que libere la mayor cantidad de bases pricas, sin producir despolimerizacin del ADN, ni romper las uniones tipo ster con los fosfatos en los C3 y C5.

HIDROLISIS ACIDA DEL ADN

Variables a considerar: Tiempo de hidrlisis; pH Temperatura Fijador Grado de compactacin de la cromatina.

Cromatina Laxa

Cromatina Compacta

Sin Depolimerizar

5

10

15

20

25

30

35

TIEMPO (HCl 1N/60C)

Reactivos Seudo-Schiff

Distintos colorantes y fluorocromos que en presencia de H2SO3 tambin se decoloran como lo hace la pararosanilina, los que en presencia de grupos CHO del tejido forman compuestos coloreados. Son colorantes bsicos que presentan a lo menos un amino primario y no presentan grupos cidos. Estos compuestos son altamente sensibles y se pueden cuantificar. Los colorantes fluorescentes (fluorocromos) saturados con SO3 emiten una fluorescencia particular en presencia de grupos CHO Ejps: Acridina; Acriflavina; Auramina 0.

FEULGEN

HQ DE AN: IDENTIFICACION DEL RADICAL FOSFATO

Utilizacin de colorantes bsicos a pH cido

Pironina Y ; PM= 302.812 C.I. 45005 Verde de Metilo; PM= 458.488 C.I. 42585

VERDE DE METILO/PIRONINA Y Selectividad en la Tincin1.- El Verde de Metilo sera ms catinico y, por lo tanto presentara una > afinidad por molculas ms polimerizadas (ADN).La Pironina tiene afinidad por molculas menos polimerizadas (ARN). 2.- Basado en un fundamento Estereomtrico: disposicin de la molcula en el espacio. Existira un alineamiento espacial de los grupos aminos (+) del colorante a los radicales fosfato(-) en la doble hlice de ADN.

Nota: Si cambio el pH de la solucin, cambia la afinidad diferencial. El pH en que hay selectividad se encuentra entre 4-5. Por otro lado, la [ ] de ambos colorantes en solucin es crtica: ambos compiten.

VERDE DE METILO/PIRONINA Y

GALOCIANINA CROMOALUMBRE

El carcter de la Galocianina no es ni bsico ni cido. Al asociarse al Alumbre de Cromo forma una LACA CATIONICA. Este mtodo trabaja a pH = 1,5-1,75. La Galocianina Cromo-alumbre dura slo 4 semanas. Conservar a 4C; frasco oscuro. Color en los tejidos: Azul-pizarra.

A pH bajo (