HPLCHigh Performance Liquid Chromatography

Nejdokonalejší LC:

• účinnost N>104; Rf = ≥ 10-2

• Detekční limit 1 : 109 -1015

• Použití: analytické - ng x preparativní – 100g • Vysoká reprodukovatelnost• Vyšší T• I netěkavé látky

Vznik • Teorie • Přístrojová technika (GC, detektory)• Sorbenty

Srovnání HPLC a LC

Průměr částice (silikagel) (μm)

3 ± 1; 5, 8 ± 2 5 – 500

Průtok (ml/min) 1 – 20 (30) 0,2

Tlak (MPa) 1- 40 (60) 0,1

Teplota ≤ 70o r.t.

Průměr kolony (mm) 2 – 8 (103 ) 10 – 40 (200)

HPLC chromatograf

Peristaltické čerpadlo

• Tok: 0.01 – 10.0 (max.30) ml/min• Tlak: 28 - 42 MPa

Výhody:• Jednoduchá konstrukce• Sterilita

• Ne styk FM s kovem

Nevýhody: • Tlakové rázy

Druhé čerpadlo s opačným rázem

Short Column Chromatography

Biotechnologické provozy

CoulArray – elektrochemický detektor

• 4,8,12 nebo 16 senzorů v serii• Potenciálový rozsah ± 2 V v 1 mV

krocích• Pracovní V 0,5 μl• Proudový rozsah 10 pA -1mA• Citlivost pg –ng ox./red. látky

na elektrodě

3D detekce

Příklad 3D-detekce 27 látekCoulArray ESA,Inc

T (min.)

Discovery Zr – High pH + High T HPLC

3 μm a 5 μm částice ZrO2

Zr vázané fáze:

• Zr-C18 - jako silicaC18

• Zr-PBD – polybutadien, jako silicaC18

• Zr-PS - polystyren

ZrO2 jako iontoměnič

Zr – elektrofil,

Lewisova HA

Váže Lewisovy BOH

(PO4 3- , F- ,citrát)

2 druhy interakce:

• ω nebo KD

• q

Rychlé dělení nesteroidních protizánětlivých léků na Zr-CarbonC18

Monolitické FS - nová éra LC

ChromolithTM - monolitický silikagel

Struktura:

• Makropóry – 2 μm, propustné pro FM

• Mikropóry – 13 nm, plocha adsorpce

Výhody:• Vysoké průtoky (9ml/min)• Rychlost (min)• Účinnost (N = 104)• Vysoká reprodukovatelnost

Chromolith – rychlost dělení

Testování účinnosti kolon Chromolithu

CIM monolytyConvective Interaction Media

IEC, RP, AfC

Analytické i preparativní, pro velké biomolekuly

CLC – (Conjoint LC) multidimensionální, 4 disky

Výhody:

• Rychlé

• Vysoké rozlišení

• Nízký tlak

• Vysoká reprodukovatelnost

• Jednoduché zacházení

• pH 1 - 14Polymer na bázi methakrylátu nebo polystyrenu

Příklad dělení oligonukleotidů na CIM

Použití HPLC

• Univerzální – preparativní i analytické • Všechny principy LC

Jediná podmínka - rozpustnost v FM

Výroba léků (inzulin, monoklonální protilátky, Ig)

Rutinní analýzy• Potravinářský průmysl (obsah vitaminů, pesticidů, transMK)• Farmaceutický průmysl (rutinní výstupní kontroly)• Klinická biochemie (kontrola metabolizmu, HC)• Doping sportovců• Ekologie (pitná voda, freony v ledovcích)

Monoklonální protilátky

FPLC (Fast Protein, Polypeptide, Polynucleotide LC)

Speciální silikagel pro IEC, agarosa pro AfC

MAbs• Čištění z ascitu• Čištění z malého množství bakteriální

kultury• Monitorování fermentace a produkce Protein A Sepharosa pro FPLC Výhody Protein A Superosy:• Vysoce specifické – v jednom kroku

požadovaná čistota• Snadno se čistí a regenerují

Výroba insulinu

Provozní kontrola obsahu proinsulinu

v kritických frakcích insulinu pomocí FPLC (Polyanion SI HR5/5)

SPESolid Phase Extraction

Příprava vzorků pro rutinní analýzu,náhrada vytřepáváníPro: HPLC, TLC, GC, ElFo, RIA, spektromerii

Princip:Selektivní adsorpce, μl – l, jednorázové

Výhody:• Rychlé• Práce v serii (12, 24, …)• Vysoká reprodukovatelnost• Levné , malé množství odpadu,

ekologické• databáze

Postup SPE

Použití

Univerzální• Farmaceutický průmysl• Potravinářský průmysl• Klinická biochemie

(narkotika v moči, HC, ..)