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Hochschule Anhalt (FH)

Hochschule Anhalt (FH)

Fachbereich Angewandte Biowissenschaften und Prozesstechnik

Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung UFZ

Department Seenforschung

Diplomarbeit

CROSS-FLOW-MIKROFILTRATION FÜR DIE AUFKONZENTRIERUNG VON MIKROORGANISMEN AUS GEWÄSSERN

vorgelegt von: Corinna Völkner

geboren am: 25.09.1966

Studiengang: Verfahrenstechnik

1. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Pätz

2. Gutachter: Prof. Dr. Klaus Lorenz

3. Gutachter: Dr. Katrin Wendt-Potthoff

Magdeburg, 01.09.2010

Diese Arbeit widme ich meinem Sohn

Yves Völkner

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Reinhard Pätz und Prof. Dr. Klaus Lorenz für

die Betreuung dieser externen Arbeit meinen Dank aussprechen.

Frau Dr. Katrin Wendt-Potthoff danke ich für die Bereitstellung dieses sehr interessanten

Themas. Vielen Dank für die Betreuung dieser Arbeit und das entgegengebrachte Vertrauen,

was mir den Freiraum für diese Arbeit ließ. Gleichzeitig möchte mich für die vielen

fachlichen Impulse bedanken.

Herrn Dr. Matthias Koschorreck, dem Leiter des Departments Seenforschung, danke ich für

die Möglichkeit zur Durchführung diese Arbeit.

Ich möchte mich bei den Kolleginnen und Kollegen bedanken, die zum Gelingen der Arbeit

beigetragen haben. Ein besonderer Dank gilt Martin Wieprecht für die souveräne

Unterstützung im Labor. Weiterhin danke ich Yvonne Rosenlöcher, Ute Kuhlicke, Ute Link

und Erika Ruschak für die konstruktive Zusammenarbeit.

Herrn Dr. habil. Bertram Böhrer, Herrn Dr. Olaf Büttner, Frau Dr. Barbara Zippel, Frau Dr.

Susanne Angelstein, Herrn Dr. Jörg Tittel, Herrn Dr. habil. Norbert Kamjunke, Herrn Dr.

Wolf von Tümpling und Herrn Dr. Thomas Neu danke ich für die Beantwortung meiner

vielen Fragen.

Telse David danke ich für die hilfreichen Tipps und vielen wertvollen Gespräche.

Ein besonderer Dank geht an Klaus und Renate Görling. Vielen Dank für die viele kostbare

Zeit, die wir zusammen verbracht haben.

Ein ganz liebevoller Dank gilt meiner Mutter, meinem Vater, meiner Familie und meiner

Freundin Manuela Hirschner.

Bibliothekserklärung

Name: Völkner

Vorname: Corinna

Geb.-Datum: 25.09.1966

Matrikel-Nr.: 4043839

Studiengang: Verfahrenstechnik

Zustimmungserklärung

Ich bin damit einverstanden, dass auf Vorschlag meines Betreuers ein Exemplar meiner

Abschlussarbeit der Bibliothek der Hochschule Anhalt (FH) zur Verfügung gestellt und in

den benutzbaren Bestand aufgenommen wird.

Köthen, den 01.09.2010

Corinna Völkner

Selbständigkeitserklärung

Erklärung

Ich versichere, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst, in gleicher oder

ähnlicher Fassung noch nicht in einem anderen Studiengang als Prüfungsleistung vorgelegt

und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen benutzt habe.

Köthen, den 01.09.2010

Corinna Völkner

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis.........................................................................................................I

Abbildungsverzeichnis ..............................................................................................III

Abbildungsverzeichnis Anhang ................................................................................ VI

Tabellenverzeichnis................................................................................................VIII

Tabellenverzeichnis Anhang..................................................................................... IX

Symbolverzeichnis...................................................................................................... X

1 Einleitung..............................................................................................................1

1.1 Problemstellung ............................................................................................................... 1 1.2 Ausgangssituation nach dem Stand der Technik ........................................................ 2 1.3 Konzept der Arbeit ......................................................................................................... 3

2 Verfahrenstechnische Grundlagen....................................................................... 4

2.1 Filtration und Filtrationsverfahren................................................................................ 4 2.2 Mikrofiltrationsverfahren................................................................................................ 6 2.3 Kenngrößen der Mikrofiltration.................................................................................... 7

2.3.1 Transmembrandruck ................................................................................................. 7 2.3.2 Permeabilität ............................................................................................................... 8 2.3.3 Selektivität ................................................................................................................... 8

2.4 Modellierung des Stofftransportes bei der Mikrofiltration........................................ 9 2.4.1 Das Porenmodell........................................................................................................ 9 2.4.2 Diffusionsmodell...................................................................................................... 10 2.4.3 Das Pinch-Modell .................................................................................................... 13 2.4.4 Ablagerungsmodell................................................................................................... 14 2.4.5 Deckschichtmodell................................................................................................... 15

2.5 Membranfouling ............................................................................................................ 17 3 Biotechnologische Grundlagen ..........................................................................19

3.1 Mikroorganismen........................................................................................................... 19 3.1.1 Bakterien.................................................................................................................... 19 3.1.2 Morphologie der Bakterien..................................................................................... 19 3.1.3 Charakterisierung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft mit Biolog-

Mikrotiterplatten ............................................................................................... 20 4 Material und Methoden ..................................................................................... 23

4.1 Untersuchungsgebiete ................................................................................................... 23 4.1.1 Die Elbe..................................................................................................................... 23 4.1.2 Der Sauteich und der Saubach ............................................................................... 24

4.2 Probennahme ................................................................................................................. 24 4.3 Aufbau des Munich Cell Concentrator 1 ................................................................... 25 4.4 Bilanzierung der Filtration............................................................................................ 30 4.5 Durchführung der Filtration ........................................................................................ 32

Inhaltsverzeichnis

II

4.5.1 Vorfiltration .............................................................................................................. 32 4.5.2 Vorbereitung des MCC 1 (Initialisierung) ............................................................ 32 4.5.3 Filtrationsprozess ..................................................................................................... 33 4.5.4 Regenerierung ........................................................................................................... 36

4.6 Biolog-Mikrotiterplatte ................................................................................................. 36 4.6.1 Animpfen................................................................................................................... 38 4.6.2 Inkubation und Vermessung .................................................................................. 38 4.6.3 Auswertung ............................................................................................................... 38

4.7 Mikrobiologische Untersuchungen ............................................................................. 40 4.7.1 Färbung und Mikroskopie ...................................................................................... 40 4.7.2 Bakterienkonzentration ........................................................................................... 41 4.7.3 Bakterienkonzentration der einzelnen Formklassen ........................................... 41 4.7.4 Gesamtbakterienzahl ............................................................................................... 41 4.7.5 Biovolumen der Bakterien ...................................................................................... 42 4.7.6 Biomasse von Bakterien .......................................................................................... 42 4.7.7 Wiederfindungsrate der Bakterien ......................................................................... 42 4.7.8 Anreicherungsfaktor ................................................................................................ 43

4.8 Bestimmung der Proteinkonzentration ...................................................................... 43 5 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................... 45

5.1 Die Wiederfindungsrate der Bakterien, ihr Biovolumen, -masse und die Morphologie ................................................................................................................... 45

5.1.1 Bestimmung des druckkontrollierten Arbeitsbereiches...................................... 45 5.1.2 Bestimmung der Wiederfindungsrate in Abhängigkeit des TMP ..................... 45 5.1.3 Bakterienkonzentration ........................................................................................... 52 5.1.4 Bakterienmorphologie ............................................................................................. 54 5.1.5 Biomasse und Biovolumen ..................................................................................... 55

5.2 Bestimmung der Bakterienzahl durch die Proteinbestimmung .............................. 56 5.3 Spül- und Desinfektionsverfahren des Filtrationsmoduls ....................................... 57 5.4 Auswirkung der Anreicherungsprozesse auf die Substratverwertung.................... 58

5.4.1 Die durchschnittliche Farbentwicklung der einzelnen Fraktionen der Proben............................................................................................................................. 58

6 Zusammenfassung und Ausblick ...................................................................... 65

7 Literaturverzeichnis ........................................................................................... 67

8 Anhang .................................................................................................................. i

Abbildungsverzeichnis

III


Abbildung 1: Arbeitsbereiche von Trennverfahren, modifiziert nach (Gasper 2000).......5

Abbildung 2: Prinzip der statischen und dynamischen Filtration.........................................6

Abbildung 3: Schematische Darstellung einer Anlage zur Cross-Flow-Mikrofiltration....7

Abbildung 4: Abhängigkeit des Filtratvolumenstroms von der transmembranen

Druckdifferenz und der Geschwindigkeit der

Membranüberströmungsgeschwindigkeit v , modifiziert nach (Ripperger

1992).......................................................................................................................9

Abbildung 5: Konzentrationspolarisation an einer Membran A Konzentrationsprofil;

B Druckprofil; C Strömungsprofil; DS Deckschicht; G Grenzschicht;

KS Kernströmung; y Abstand zur Membran; v Membranüberströmung;

p Druck; c Konzentration; δ Konzentrationsgrenzschichtdicke;

δDS Deckschichtdicke, modifiziert nach (Ripperger 1993), (Melin &

Rautenbach 2007) ..............................................................................................11

Abbildung 6: Kräfte an einem Einzelpartikel in einem Querstromfilter im laminaren

Grenzschichtbereich..........................................................................................14

Abbildung 7: Darstellung der Kräfte an einem ruhenden Einzelpartikel ..........................15

Abbildung 8: Verlauf des Filtratflusses als Funktion der Prozessdauer.............................17

Abbildung 9: Foulingmechanismen bei der Filtration mit porösen Membranen.............18

Abbildung 10: Morphologie der Bakterien...............................................................................19

Abbildung 11: Reduktion von Tetrazoliumchlorid zu Formazan.........................................20

Abbildung 12: Farbverlauf in den einzelnen Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten

modifiziert nach Konopka (Konopka, Oliver et al. 1998)...........................21

Abbildung 13: Darstellung der Untersuchungen des physiologischen Profils einer

Bakteriengemeinschaft der einzelnen Fraktionen mit den Biolog-

Mikrotiterplatten. ...............................................................................................21

Abbildung 14: Prinzip der Hauptkomponentenanalyse nach Kessler (Kessler 2007) .......22

Abbildung 15: Einzugsgebiet Elbe und Probennahmestelle km 327 ...................................23

Abbildung 16: a) Lage der Talsperre Muldenberg; b) Probenahmestelle Sauteich.............24

Abbildung 17: Schematischer Aufbau a) eines in der Literatur beschriebenen

Filtrationssystems und b) eines Filtrationssystems mit

Rezirkulationsschleife, modifiziert nach Peskoller (Peskoller 2010) ..........25

Abbildung 18: Aufbau des MCC 1 ............................................................................................26

Abbildung 19: Hohlfaserfiltrationsmodul MiniKros Sampler Plus ...........................................27


IV

Abbildung 20: Softwareoberfläche des Programms LabView 8.2. zur Ansteuerung des

MCC 1 .................................................................................................................28

Abbildung 21: Fließschema des Filtrationsprozesses .............................................................30

Abbildung 22: a) Aufbau der Vorfiltration b) Filtersystem ..................................................32

Abbildung 23: a) Initialisierung des MCC 1 b) schematische Darstellung der

Initialisierung des MCC 1 .................................................................................33

Abbildung 24: MCC 1 während der Filtration.........................................................................33

Abbildung 25: a) Spülung des Systems b) Elution der Bakterien aus der

Rezirkulationsschleife........................................................................................35

Abbildung 26: Anordnung der einzelnen Substrate in den Eco Plates................................37

Abbildung 27: a) Epifluoreszenzmikroskop b) Grid Porton G12........................................40

Abbildung 28: Kalibrierkurve zur Bestimmung der Proteinkonzentration.........................43

Abbildung 29: Lineare Abhängigkeit des Filtratflusses vom TMP.......................................45

Abbildung 30: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und

Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 und Elbe 2 vom 09.11.09 46


Permeabilität über die Zeit der Proben Sauteich 1 und Sauteich 2 vom

09.12.09................................................................................................................47

Abbildung 32: Filtratfluss f (TMP) vom Sauteich 1 und Sauteich 2.......................................48

Abbildung 33: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit

zunehmenden TMP der Proben Elbe vom 09.11.09, der Proben Sauteich

und Saubach vom 09.12.09...............................................................................49


Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10..50

Abbildung 35: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit

zunehmenden TMP der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10..............52

Abbildung 36: Bakterienkonzentration der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der

Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010.....................................................53

Abbildung 37: Morphologie der Bakterien Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10 ........55

Abbildung 38: Biovolumen der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben

Elbe 1 bist Elbe 4 vom 02.02.2010 .................................................................56

Abbildung 39: Biomasse der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1

bist Elbe 4 vom 02.02.2010..............................................................................56


V

Abbildung 40: Grafische Darstellung der Blindwerte der Fraktion Konzentrat mit den

verschiedenen Reinigungslösungen.................................................................58

Abbildung 41: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit in den Fraktionen ORI,

VOR, KON und FIL der Probe Elbe 1 vom 02.02.10 ................................58

Abbildung 42: Grafische Darstellung der AWCD der Proben Elbe 1 bis Elbe 3 vom

02.02.10 und deren Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL.......................59

Abbildung 43: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der

Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10...................................................60

Abbildung 44: Baumdiagramm der Fraktion Original der Probe Elbe 2.............................62

Abbildung 45: Baumdiagramm der Fraktion Konzentrat der Probe Elbe 2.......................62

Abbildungsverzeichnis Anhang

VI


Abbildung A 1: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP,

Permeabilität über die Zeit ................................................................................vi

Abbildung A 2: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Probe Elbe 2 vom

09.11.2009 ..........................................................................................................viii

Abbildung A 3: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Sauteich und

Saubach vom 09.12.2009 ...................................................................................ix

Abbildung A 4: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Elbe 1 bis

Elbe 4 vom 02.02.2010 .......................................................................................x

Abbildung A 5: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der

Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10....................................................xi

Abbildung A 6: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der

Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10...................................................xii

Abbildung A 7: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen

Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10..................................................xiii


Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10..................................................xiv


Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10...................................................xv


Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10..................................................xvi


Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10.................................................xvii


Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10............................................... xviii


Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10..................................................xix


Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10...................................................xx


Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10..................................................xxi


Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10.................................................xxii


VII


Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10................................................xxiii


Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10............................................... xxiv

Tabellenverzeichnis

VIII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Beschreibung der einzelnen Modi ...................................................................26

Tabelle 2: Abkürzungen der einzelnen Fraktionen...........................................................30

Tabelle 3: maximaler TMP für die Optimierung der Elution der verschiedenen

Proben .................................................................................................................34

Tabelle 4: Gegenüberstellung modifiziertes und nichtmodifiziertes Spülen/Elution35

Tabelle 5: Einteilung der Substrate in 6 Substratklassen................................................38

Tabelle 6: Parameter der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10 ...............................51

Tabelle 7: Konzentration der Bakterien in den einzelnen Fraktionen und deren

prozentualer Anteil der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2009...........54

Tabelle 8: Proteingehalte in den Konzentraten der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom

02.02.2010 ...........................................................................................................57

Tabelle 9: Hauptcluster der Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 63

Tabelle 10: Einzel- und Gesamtvarianz der Hauptkomponentenanalyse der

Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 vom 02.02.10......64

Tabellenverzeichnis Anhang

IX

Tabellenverzeichnis Anhang

Tabelle A 1: Chemikalien zur Reinigung des Filtrationsmoduls ..........................................i

Tabelle A 2: Kalibrierdaten der Proteinbestimmung nach Bradford..................................ii

Tabelle A 3: TMP, Filtratfluss, Querstromgeschwindigkeit und Permeabilität des

druckkontrollierten Bereichs des Filtrationsaufbaues mit deionisiertem

Wasser....................................................................................................................ii

Tabelle A 4: Prozessparameter Elbe 1 vom 09.11.2009 ......................................................iii

Tabelle A 5: Prozessparameter Elbe 2 vom 09.11.2009 ......................................................iv

Tabelle A 6: Prozessparameter Sauteich 1 vom 09.12.2009................................................iv

Tabelle A 7: Prozessparameter Sauteich 2 vom 09.12.2009.................................................v

Tabelle A 8: Prozessparameter Saubach 1 vom 09.12.2009.................................................v

Tabelle A 9: Prozessparameter Saubach 2 vom 09.12.2009................................................vi

Tabelle A 10: Parameter der Proben Saubach 1 und 2 .........................................................vii

Tabelle A 11: Prozessparameter Elbe 1 vom 02.02.2010 .....................................................vii

Tabelle A 12: Parameter der Proben Elbe 1 und Elbe 2 .....................................................viii

Symbolverzeichnis

X

Symbolverzeichnis

Lateinische Zeichen

Symbol Physikalische Größe

FritteA Fläche der Fritte

MA Membranfläche

SFA Fläche Sichtfeld

b Breite

cB Konzentration Bakterien

ic Konzentration der Komponente i im Zulauf

iFc , Konzentration der Komponente i im Filtrat

Fritted Durchmesser der Fritte

hd hydraulischer Durchmesser

Pd Partikeldurchmesser

Td Rohrdurchmesser

D Diffusionskoeffizient

effD effektiver Diffusionskoeffizient

F Anreicherungsfaktor

AF Adhäsionskraft

LF Liftkraft

RF Reibungskraft

SF Schleppkraft

H Schichthöhe

FJ Flux

k Stoffübergangskoeffizient

K Membrankonstante

l Länge

L Länge der Kapillare

m Masse

Bm Biomasse

ASFn Anzahl der Sichtfelder

Symbolverzeichnis

XI

Bn Anzahl der gezählten Objekte

p Druck

P Permeabilität

r Koordinate in radialer Richtung

GGr Gleichgewichtsradius bei 0=Pv

DSR Deckschichtwiderstand

MR Membranwiderstand

vS spezifische Oberfläche

t Zeit

T Temperatur

TMP transmembrane Druckdifferenz

VUF Umrechnungsfaktor Volumen

V Volumen

BV Biovolumen

FiltratV Filtratvolumen

FV& Filtratvolumenstrom

Kapv Strömungsgeschwindigkeit in der Kapillare

pv Filtratfluss

Fv spezifischer Filtratstrom

v Überströmgeschwindigkeit

v mittlere axiale Strömungsgeschwindigkeit

y Koordinate senkrecht zur Membran

Griechische Zeichen

Symbol Physikalische Größe

Kρ Dichte des Konzentrats

ε Porosität

η dynamische Viskosität der Flüssigkeit

Fη dynamische Viskosität des Filtrats

Kη dynamische Viskosität des Konzentrates

μ Umwegfaktor

Rµ Reibungskoeffizient

Symbolverzeichnis

XII

wτ Wandschubspannung

ν kinematische Viskosität der Flüssigkeit

Indizes

A Ausgang

E Eingang

S Senke

Dimensionslose Kennzahlen

Re Reynoldszahl

Sc Schmidtzahl

Sh Sherwoodzahl

Natur-Konstanten

Bk Boltzmann-Konstante 1-23101,3806 −⋅⋅ KJ

Abkürzungen

AWCD Mittlere Farbentwicklung

ATP Adenosintriphosphat

CA Clusteranalyse

CMF Cross-Flow-Mikrofiltration

DNA Desoxyribonukleinsäure

FIL Filtrat

GBZ Gesamtbakterienzahl

HKA Hauptkomponentenanalyse

KON Konzentrat

MCC 1 Munich Cell Concentrator 1

OD Optische Dichte

ORI Original (Probe)

PC Polycarbonat

PES Polyethersulfon

PTFE Polytetrafluorethylen

PI Propidiumiodid

TMP Transmembrandruck

VOR Vorfiltrat

VF Vorfilter

WFR Wiederfindungsrate

Einleitung

1

1 Einleitung

In den vergangenen Jahren hat sich die Membranfiltration in den verschiedenen

Industriezweigen zu einem Standardverfahren entwickelt und konnte sich im Vergleich zu

konventionellen Verfahrensstrategien mehr und mehr durchsetzen. Sie findet Anwendung in

der Chemie-, Umwelt- und Medizintechnik. Sie wird in der Wasserversorgung eingesetzt

sowie zur Behandlung innerbetrieblicher Abwässer. Beispielsweise wird sie in der

Biotechnologie zur Sterilfiltration, in der Getränke- und Lebensmittelindustrie zur

Klarfiltration oder Aufkonzentration verwendet. Des Weiteren findet sie Anwendung in der

Elektronikindustrie zur Bereitung hochreiner Gase und Flüssigkeiten. Nahezu konkurrenzlos

ist der Einsatz zur Aufkonzentrierung von Eiweißen. Weiterhin wird sie zur

Meerwasserentsalzung und für die Luftzerlegung in kleineren Anlagen eingesetzt. Das

schnelle Wachstum dieser Technologie ist Ursache einer stetigen Entwicklung von

Membranmaterialien, Modulkonfigurationen, Anlagenkonzepten und deren Betriebsweisen

(Melin & Rautenbach 2007), (Ripperger 1992).

1.1 Problemstellung

Für Kultivierungen, Mikrokosmen-Experimente oder biochemische Analysen, wie z.B.

Pathogennachweis, Substratverwertungstests für Bakteriengemeinschaften, DNA-

Fingerprints, mit Mikroorganismen aus Gewässerproben müssen die vorhandenen Zellen

aufkonzentriert werden, um eine ausreichende Nachweisempfindlichkeit oder hinreichend

repräsentative Messergebnisse zu erreichen. Bei natürlichen Gewässerproben, die

inhomogener als Kulturen sind, können aber technische Probleme auftreten, die zu

wechselnden Wiederfindungsraten und zu Beeinträchtigungen der Aktivität und

Lebensfähigkeit der Zellen führen können. Deshalb werden schonende und

reproduzierbare Konzentrationsverfahren gebraucht. Außerdem ist es notwendig die

Wiederfindungsrate und den Zustand der Zellen schnell zu bestimmen. Als schonendes

Verfahren bietet sich die Cross-Flow-Mikrofiltration (CMF) an.

Einleitung

2

1.2 Ausgangssituation nach dem Stand der Technik

Das Zurückhalten bzw. Abtrennen von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit gehört zu

der Hauptanwendung der Mikrofiltration. Bei der Aufkonzentrierung der Mikroorganismen

mittels Membran kommt häufig die Dead-End-Filtration zum Einsatz. Hierbei werden

jedoch die auf dem Filter aufkonzentrierten Zellen direkt auf der Membran analysiert oder

mit der Membran kultiviert (Musial, Arrowood et al. 1987), (Wang, Hammes et al. 2007).

Weiterhin können die Zellen nicht reproduzierbar von der Membran abgelöst werden und

die Wiederfindungsraten liegen hier zwischen 20 bis 50 % (Melin & Rautenbach 2007),

(Wohlsen, Bates et al. 2004), wobei Lee Wiederfindungen zwischen 20 bis 80 % erreichte

(Lee, Gomez et al. 2004).

Die auf dem Markt für Cross-Flow-Filtration aktiven Firmen haben sich bisher nicht auf

analytische Probleme fokussiert, so dass es keine fertigen Systeme gibt, bei denen

Wiederfindung der Zellen und Reproduzierbarkeit des Prozesses bekannt und

dokumentiert sind. Im Gegensatz zur Anreicherung von Molekülen aus relativ kleinen

Flüssigkeitsvolumina gibt es für die Aufkonzentrierung von Bakterienzellen keine

kommerziellen Systeme. Eine Arbeitsgruppe aus München hat sich mit diesem Problem

befasst und für Escherichia coli (E. coli) in Trinkwasser ohne Verwendung von Zusatzstoffen

eine reproduzierbare Wiederfindung von >90% erreicht (Peskoller, Niessner et al. 2009).

Das System ist prinzipiell auch für natürliche Gewässerbakterien einsetzbar, diese

Anwendungen befinden sich aber noch im Versuchsstadium. Aus der vorangegangenen

Praktikumsarbeit ist bekannt, dass eine Vorfiltration der Wasserproben notwendig ist und

die bei der dort ausgearbeiteten Verfahrensweise auftretenden Zellverluste vernachlässigt

werden können. Außerdem wurde festgestellt, dass es nicht zu einer nachteiligen

Anreicherung von Huminstoffen aus der Probe kommt.

Einleitung

3

1.3 Konzept der Arbeit

Es wurden Gewässerproben von 2 Litern auf etwa 50-100 ml eingeengt. Es wurde ein in

München gebautes Mikrofiltrationssystem für die Anreicherung von Bakterien aus

verschiedenen Gewässerproben getestet. Der Einfluss des Konzentrationsprozesses auf die

Zellzahl, das Biovolumen, die Biomasse und die Substratverwertung der Mikroorganismen-

gemeinschaft war zu untersuchen. Für die Bestimmung der Zellzahl, des Biovolumens und

der Biomasse wurde neben der klassischen Epifluoreszenzmikroskopie eine alternative

Methode getestet und kalibriert. Eine einfache Trübungsmessung ist nicht ausreichend,

weil Gewässerproben außer den Zellen zahlreiche andere Partikel enthalten können.

Folgende Fragen waren im Detail zu beantworten:

1. Wie viele der ursprünglich vorhandenen Bakterienzellen werden wiedergewonnen?

2. Ist das empfohlene Desinfektions- und Spülverfahren für die Filtrationsmodule

ausreichend und nicht schädlich für die Anwendung bei Substratverwertungstests?

3. Kann die relativ mühsame Zählung der Bakterienzellen durch eine photometrische

Proteinbestimmung ersetzt werden?

4. Wie wirkt das Anreichern der Zellen auf das verwertete Substratspektrum und die

Abbaukinetiken?

Verfahrenstechnische Grundlagen

4

2 Verfahrenstechnische Grundlagen

2.1 Filtration und Filtrationsverfahren

Unter Filtration versteht man die Trennung eines Flüssigkeits-Feststoff-Gemisches

(Suspension) in seine Bestandteile. Dies geschieht über ein für die Flüssigkeit durchlässiges

Filtermedium, das den Feststoff zurückhält.

Je nach Suspensionszusammensetzung und Aufgabenstellung der Anwendung wird die

Fest/Flüssigfiltration als Kuchen- oder Klarfiltration bezeichnet. Die Kuchenfiltration

Klarfiltration ist die weitgehend vollständige Abtrennung aller Partikel aus der Suspension

mit geringem Feststoffanteil. Sonderformen sind hier die Anschwemmfiltration (hohe

Feststoffbeladung der Suspension) und die Siebfiltration (Partikel oberhalb einer

bestimmten Trenngrenze werden abgetrennt, Partikel unterhalb dieser Trenngrenze werden

durch das Filtermedium durchgelassen).

Die Ultra- und Mikrofiltration schließen bezüglich des Trennbereiches, d. h. der Größe der

abzutrennenden Partikel bzw. Moleküle, die Lücke zwischen Umkehrosmose und

Nanofiltration auf der einen Seite und Filtration auf der anderen Seite (Melin &

Rautenbach 2007), (Gasper 2000). In Abbildung 1 sind die Arbeitsbereiche verschiedener

Trennverfahren und die Größenbereiche, die Trennursache und die Druckdifferenz der

jeweiligen Verfahren dargestellt.


5

Arbeitsbereiche von Trennverfahren

Bereich

ionogen / nieder- molekular

molekular /

makromolekular

kolloid- bzw.

feindispers

mechanisch

suspendiert

Größen- beispiele

Trenn- Ursache

Ionen

Wasserlösliche Salze

Kolloide

Pyrogene

Viren

Pigmente

Bakterien

Fein-Teststaub

Latex

Hefe

mit bloßem Auge

erkennbar

Konzentrations-

gradient

Molekülgröße

Partikelgröße

µm

Abbildung 1: Arbeitsbereiche von Trennverfahren, modifiziert nach (Gasper 2000)

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 1000

200,00 Umkehrosmose

Nanofiltration

Ultrafiltration

Mikrofiltration

Filtration

0,10

1,00

10,00

100,00

Druckdifferenz Δp [bar]

5


6

2.2 Mikrofiltrationsverfahren

Druckgetriebene Membranfiltrationsverfahren werden zwischen statischen (Dead-End)

und dynamischen (Cross-Flow) Betriebsweisen unterschieden. In Abbildung 2 ist das

Prinzip der statischen und dynamischen Filtration dargestellt.

Abbildung 2: Prinzip der statischen und dynamischen Filtration

Bei der statischen Filtration strömt die Suspension senkrecht zur Membranoberfläche,

wobei sich mit dem wachsenden Filtratvolumen die Deckschicht kontinuierlich vergrößert.

Bei der Cross-Flow-Mikrofiltration wird das Filtermedium während des

Filtrationsvorganges von der Suspension überströmt, sodass zwei Hauptstromrichtungen

orthogonal zueinander bestehen. Die Hauptstromrichtungen sind der Filterstrom durch das

Filtermedium und die Überströmung parallel zum Filtermedium. Dem Aufbau des

Filterkuchens während des Filtrationsvorganges wird durch die Überströmung der

Suspension entgegengewirkt. Eine Deckschichtausbildung auf der Membran kann meist

jedoch nicht ganz verhindert werden. (Ripperger 1992), (Melin & Rautenbach 2007).

Zeit

Dicke der Deckschicht (Filterkuchen)

spezifischer Filtratfluss

statische Filtration Dead-End-Filtration

Zeit

spezifischer Filtratfluss

Dicke der Deckschicht

dynamische Filtration Cross-Flow-Filtration

Zulauf (Feed)

Filtrat (Permeat)

Zulauf (Feed)

Konzentrat (Retentat)

Filtrat (Permeat)

Filterkuchen Filtermedium

Deckschicht Membran


7

2.3 Kenngrößen der Mikrofiltration

2.3.1 Transmembrandruck

Zur Überströmung der Membran sowie zur Filtration wird die Suspension unter Druck

über das Membranmodul gepumpt. Infolge der Membranüberströmung fällt der Druck am

Moduleingang vom Wert p0 auf p1 am Modulausgang ab. Der Druckabfall ist von den

geometrischen Abmessungen des Strömungskanals, der Strömungsgeschwindigkeit im

Modul und den Fließeigenschaften des Konzentrats abhängig. Der Druck p2 auf der

Filtratseite ist wegen der dort vorhandenen, geringen Strömungsgeschwindigkeiten nahezu

konstant. Um die Filtration über die gesamte Länge des Membranmoduls zu gewährleisten,

muss der Druck p2 auf der Filtratseite kleiner sein als der Druck p1 am Modulausgang

(Abbildung 3). Der Druckunterschied zwischen Konzentrat und Filtrat wird als

transmembrane Druckdifferenz (TMP) bezeichnet. Hier wird für die Angabe der

transmembranen Druckdifferenz meistens der arithmetische Mittelwert gebildet (Ripperger

1992).

Abbildung 3: Schematische Darstellung einer Anlage zur Cross-Flow-Mikrofiltration

210

2p

ppTMP −

+= 2-1

TMP : transmembrane Druckdifferenz [ ]bar

0p : Druck am Moduleingang (Probe) [ ]bar

1p : Druck am Modulausgang (Konzentrat) [ ]bar

2p : Druck auf der Filtratseite [ ]bar

p1p2

Hohlfasermodul

t

p0

p1

Konzentrat

Filtrat

p2

p

Probe

p0


8

2.3.2 Permeabilität

Die Durchlässigkeit einer Membran für Gase und Flüssigkeiten wird als Permeabilität P

bezeichnet und in barmhL ⋅⋅ 2 angegeben. Die Permeabilität wird wie folgt berechnet:

TMPAVP

M

F

⋅=

& 2-2

P : Permeabilität [ ]barmhL ⋅⋅ 2

FV& : Filtratvolumenstrom [ ]hL

MA : Membranfläche [ ]2m

Folgende Einflussgrößen sind für den Filtratstrom (Permeatfluss) bei der Cross-Flow-

Mikrofiltration von Bedeutung:

o transmembrane Druckdifferenz entlang des Membranmoduls (TMP);

o Geschwindigkeit der Membranüberströmung v ;

o Geometrie des Strömungskanals;

o Konzentration der abtrennbaren Stoffe c;

o Eigenschaften der abtrennbaren Stoffe (Partikelgröße, Konsistenz);

o Eigenschaften der Flüssigkeit (Viskosität);

o oberflächenaktive Stoffe in Verbindung mit den Oberflächeneigenschaften der

Membran und der Partikel

2.3.3 Selektivität

Der Volumenstrom durch die Membran wird als Filtratvolumenstrom FV& bezeichnet. Die

Abbildung 4 zeigt die Abhängigkeit des Filtratvolumenstroms von der transmembranen

Druckdifferenz. Es werden zwei Regionen unterschieden: die druckkontrollierte Region

und die stofftransferkontrollierte Region. In der druckkontrollierten Region kommt es zu

keiner Deckschichtbildung auf der Membranoberfläche, da der hydrodynamische

Rücktransport der Partikel größer ist als der konvektive Hintransport. Eine wesentliche

Rolle spielen hier die Größe, Art und Konsistenz der abzutrennenden Stoffe (Sethi &

Wiesner 1997). Im Bereich der stofftransferkontrollierten Region hat eine Erhöhung der

transmembranen Druckdifferenz keine Steigerung des Filtratstroms mehr zur Folge

(Altmann & Ripperger 1997).


9

Abbildung 4: Abhängigkeit des Filtratvolumenstroms von der transmembranen Druckdifferenz und der Geschwindigkeit der Membranüberströmungsgeschwindigkeit v , modifiziert nach (Ripperger 1992)

2.4 Modellierung des Stofftransportes bei der Mikrofiltration

Für die Planung und Durchführung von Membranprozessen ist es notwendig Trenn- und

Flussleistungen zu betrachten. Dies geschieht mit Hilfe verschiedener empirischer und

theoretischer Ansätze. Sie dienen nicht nur der Leistungsvorhersage sondern auch dem

Verständnis der stattfindenden Vorgänge. Diese Modelle berücksichtigen hydrodynamische

und thermodynamische Randbedingungen, sowie auch physikalisch-chemische

Eigenschaften der Membranen, der Partikel und die damit auftretenden Wechselwirkungen.

Es werden zum Verständnis der Stofftransportvorgänge grundlegende

Gleichgewichtsmodelle für die Cross-Flow-Filtration vorgestellt (Ripperger 1992), (Melin

& Rautenbach 2007), (Schock 1985).

Die nachfolgenden verschiedenen Modelle beschreiben verschiedene Mechanismen.

2.4.1 Das Porenmodell

Im Porenmodell wird der Fluss durch eine poröse Membran analog zur Strömung durch

ein Haufwerk, das aus parallel geschalteten Kapillaren besteht, betrachtet. Es ist ein

Vergleich zur Strömung in Röhren angebracht. Sie wird mit Hilfe der

Widerstandscharakteristik im laminaren Bereich durch das Hagen-Poiseuillesche Gesetz

beschrieben.

druckkontrol-lierte Region

reine Flüssigkeit ◦ höhere Anströmgeschwindigkeit

◦ höhere Temperatur

◦ geringere Konzentration

3v

2v 123 vvv >>

1v stofftransferkontrollierte Region

Transmembrane Druckdifferenz

Filtr

atvo

lum

enst

rom


10

LTMPd

v hKap ⋅

⋅=

η32

2

2-3

Kapv : Strömungsgeschwindigkeit in der Kapillare [m/s]

2hd : hydraulischer Durchmesser [m]

TMP : transmembrane Druckdifferenz [bar]

η : dynamische Viskosität der Flüssigkeit [Pa s]

L : Kapillarlänge [m]

Die Strömungsgeschwindigkeit in einer Kapillare Kapv kann in die Permeatgeschwindigkeit

des Haufwerkes bzw. der Membran pv übertragen werden, indem die Porosität als

Verhältnis der freien Anströmfläche zur Gesamtfläche verwendet wird.

HS

TMPTMPAvv

p⋅⋅−⋅

⋅=⋅=

μεηε

2)1( 22

3

2-4

pv : Filtratfluss

ε : Porosität [ - ]

vS : volumenspezifische Oberfläche [m2/m3]

μ : Umwegfaktor [ -]

H : Schichthöhe [m]

2.4.2 Diffusionsmodell

Das Diffusionsmodell beschreibt die Konzentrationspolarisation bei Membranverfahren.

Aufgrund des Rückhaltevermögens der Membran werden einige konvektiv zur Membran

transportierte Komponenten zurückgehalten. Die Konzentration der abgetrennten

Komponenten erhöht sich zur Membran hin und es bildet sich eine dünne Deckschicht.

Ein Rücktransport der zurückgehaltenen Komponenten in die Kernströmung kann auf

diffusiven oder hydrodynamischen Effekten beruhen, wobei hydrodynamische Effekte

(Scherkraft) aufgrund des Geschwindigkeitsgradienten an der Deckschicht resultieren

(Porter 1972), (Rautenbach & Albrecht 1981). Das Prinzip der Konzentrationspolarisation

und des diffusiven Rücktransports ist in der Abbildung 5 schematisch dargestellt.


11

Abbildung 5: Konzentrationspolarisation an einer Membran A Konzentrationsprofil; B Druckprofil; C Strömungsprofil; DS Deckschicht; G Grenzschicht; KS Kernströmung; y Abstand zur Membran; v Membranüberströmung; p Druck; c Konzentration; δ Konzentrationsgrenzschichtdicke; δDS Deckschichtdicke, modifiziert nach (Ripperger 1993), (Melin & Rautenbach 2007)

Im Diffusionsmodell werden die Transportvorgänge für den einfachen Fall der

Membrankontrolle beschrieben. Unter Berücksichtigung der Teilströme

o konvektiver Hintransport,

o Transport durch die Membran und

o dem diffusiven Rücktransport

ergibt sich folgende Stoffbilanz (Rautenbach & Albrecht 1981):

0, =−⋅+⋅dydcDvcvc FiFFi 2-5

ic : Konzentration der Komponente i im Zulauf (Suspension) [mol/m3]

iFc , : Konzentration der Komponente i im Filtrat [mol/m3]

Fv : spezifischer Filtratstrom [m/s]

D : Diffusionskoeffizient [m2/s]

y : Koordinate senkrecht zur Membran [m]

DS G

KS

M

A B C

c p v

konvektiver Transport

KV&

diffusiver Rücktransport

Fc FV&

y

δDS

δ


12

Nach Integration und Einführung der Konzentrationsgrenzschichtdicke δ, in der die

Konzentration der zu betrachtenden Komponente i auf den Wert der Kernströmung iKc ,

abfällt, erhält man folgende Gleichung.

iFiK

iFiM

iFiK

iFiMF cc

cck

ccccDv

,,

,,

,,

,, lnln−

−⋅=

−

−⋅=

δ 2-6

k : Stoffübergangskoeffizient [m/s]

δ : Konzentrationsgrenzschichtdicke [m]

Die Größe des Stoffübergangskoeffizienten hängt von den Strömungsbedingungen über

der Membran und den Stoffwerten ab. Dieser kann nach den bekannten Produktansätzen,

die meist auf experimentellen Untersuchungen beruhen, ermittelt werden.

Für eine laminare Strömung in einem Strömungskanal der Länge L wurde für den

Stoffübergang folgende Beziehung ermittelt:

31

31

31

Re62,1 ⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⋅⋅⋅⋅=Ld

ScdDk h

h 2-7

Sh : Sherwoodzahl

Re : Reynoldszahl

Sc : Schmidtzahl

hd : hydraulischer Durchmesser des Strömungskanals [m]

Für kugelförmige Partikel und Kolloide wird nach der Stokes-Einstein-Beziehung

folgender Diffusionskoeffizient abgeschätzt.

P

BdTk

D⋅⋅⋅⋅

=ηπ3

2-8

Bk : Boltzmann-Konstante 1-23101,3806 −⋅⋅ KJ

T : Temperatur [K]

η : dynamische Viskosität der Flüssigkeit [Pa s]

Pd : Partikeldurchmesser [m]


13

Die berechnete Diffusion hat ihren Ursprung in der Brownschen-Molekularbewegung,

wodurch ein Partikel seine gerichtete Bewegung erfährt. Die Bewegungsintensität der

Partikel ist von der Temperatur und der Partikelgröße abhängig. Demnach verringert sich

der Filtratstrom mit steigender Partikelgröße. Dies gilt nur bis zu einer Partikelgröße

> 0,1 µm, da auf der Basis der Stokes-Einstein-Beziehung für die Mikrofiltration

ermittelten spezifischen Filtratflüsse niedriger sind als die berechneten Werte (Segré &

Silberberg 1962). Der Filtratstrom erfährt in Abhängigkeit der Partikelgröße in diesem

Bereich ein Minimum und steigt danach wieder an, weil andere Prozesse den Filtratstrom

bestimmen.

Das erweiterte Diffusionsmodell ergänzt den Ansatz des Diffusionsmodells durch

Einführen des effektiven Diffusionskoeffizienten, in welchem die durch die Brownsche

Molekularbewegung hervorgerufene Diffusion durch eine von der Wandschubspannung

induzierte zusätzliche „Diffusion“ erweitert wird. Somit gelingt eine Übertragung auf die

Mikrofiltration.

)(2

iwP

eff cfd

KD ⋅⋅

⋅=ητ

2-9

effD : effektiver Diffusionskoeffizient [m2/s]

wτ : Wandschubspannung [N/m2]

K : Membrankonstante [ - ]

η : dynamische Viskosität [Pa s]

Pd : Partikeldurchmesser [m]

ic : Konzentration der Komponente i [mol/m3]

Der effektive Diffusionskoeffizient ist von der Wandschubspannung und wesentlich von

der Partikelgröße abhängig. In diesem Fall wird der Rücktransport durch Zunahme der

Partikelgröße begünstigt und der Filtratfluss steigt.

2.4.3 Das Pinch-Modell

Der Pinch-Effekt beschreibt in einer Strömung die Querkraftwirkung eines

ungleichförmigen Geschwindigkeitsprofils an einem umströmten Körper, so dass diese

zurück in die Kernströmung transportiert werden (Porter 1972).

Segré und Silberberg beschreiben auf der Grundlage ihrer experimentellen Analysen

folgende Beziehung für die radiale Geschwindigkeitskomponente Pv suspendierter Partikel


14

in einem Rohr (Segré & Silberberg 1962). Bei der Cross-Flow-Mikrofiltration ist dieser

Effekt vor allem bei Partikeln > 5 µm in laminaren Strömungen von Bedeutung (Ripperger

1992).

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−⋅⋅⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅⋅⋅=

GGTT

PP r

rdr

dd

vv 12Re17,084,2

2-10

v : mittlere axiale Strömungsgeschwindigkeit [m/s]

Td : Rohrdurchmesser [m]

r : Koordinate in radialer Richtung [m]

GGr : Gleichgewichtsradius bei 0=Pv [m]

Nach den Gesetzen des Pinch-Effekts ergibt sich, dass sich kleine Partikel nicht aus der

Kernströmung zurückbewegen, sondern sich an der Membranoberfläche ablagern.

2.4.4 Ablagerungsmodell

Das Ablagerungsmodell beschreibt vorwiegend eine Kräftebilanz an einem einzelnen

Partikel auf der Membranoberfläche (Abbildung 6). Die durch die Filtratströmung

hervorgerufene Haftkraft FN, eine aus der Kernströmung resultierende membranparallele

Schleppkraft FS und eine ihr entgegen gesetzte Reibungskraft FR wirken dabei auf einen

Partikel.

Abbildung 6: Kräfte an einem Einzelpartikel in einem Querstromfilter im laminaren Grenzschichtbereich

x

y

w(y)

Membran

Fv&

Partikel

FN

FS

FR


15

Ein Partikel wird sich nicht ablagern, solange die Schleppkraft größer ist als die

Reibungskraft. Wird ein Reibungskoeffizient µ eingeführt, gilt für diesen Fall

NRS FF ⋅> μ 2-11.

Durch unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten ergeben sich für Partikeln

verschiedener Größen unterschiedliche Kräfteverhältnisse. Ebner berücksichtigt hierbei

noch die Wirkung des Filtratdruckes (Ebner 1991). Der auf diese Weise erklärte

Klassierungseffekt von Schock, nach dem kleinere Partikeln bevorzugt abgeschieden

werden, konnte zusammen mit Fischer und Raasch nachgewiesen werden (Schock 1985),

(Fischer & Raasch 1984), (Melin & Rautenbach 2007).

Bei der Betrachtung der Kräfte ist eine Unterscheidung nach Lage der Partikel wichtig. So

kommt bei einem abgelagerten Partikel noch die Adhäsionskraft FA hinzu (Abbildung 7).

Abbildung 7: Darstellung der Kräfte an einem ruhenden Einzelpartikel

Dieses Modell ist für eine Partikelgröße von mehr als 0,2 µm gültig. Bei kleineren Partikeln

wird auch der diffusive Partikeltransport mit in Betracht gezogen.

2.4.5 Deckschichtmodell

Als Grundlage der Deckschichtmodelle gilt die Filtergleichung nach Darcy. Hier wird der

proportionale Zusammenhang des Filtratflusses Fv und dem angelegten Druckgefälle

TMP, sowie die umgekehrt proportionale Abhängigkeit von der dynamischen

x

y

w(y) Reibungskraft FR

Membran

Fv&

Partikel

Liftkraft FL

Adhäsionskraft FA Schleppkraft FSy

Schleppkraft FSw


16

Filtratviskosität Fη und den Widerständen der Membran MR und der Deckschicht DSR

beschrieben.

)( DSMF

F RRTMPv

+⋅=η

2-12

Fη : dynamische Viskosität des Filtrats [Pa s]

Meist ist bei der dynamischen Filtration der Deckschichtwiderstand dominierend. Gernedel

und Kessler fanden für die Cross-Flow-Filtration von Milch und Molke einen empirischen

Zusammenhang, wobei Riesmeier ihn um einen Exponenten erweiterte und ihn erfolgreich

auf eigene Versuchsergebnisse mit Fermenterbrühen anwandte (Gernedel 1980), (Riesmeier

1987).

)(TMPKc

RKW

KKDS ⋅

⋅⋅

=ρτ

η 2-13

DSR : Deckschichtwiderstand [m-1]

Kη : dynamische Viskosität des Konzentrates [Pa s]

Wτ : Wandschubspannung [N/m2]

Kρ : Dichte des Konzentrates [kg/m3]

K : Membrankonstante [ - ]

In der Praxis zeigt sich eine Deckschichtalterung, sodass kein stationärer Zustand nach der

Anfangsphase der Filtration eintritt. Mögliche Ursachen hierfür sind:

o Adsorption von Makromolekülen,

o Ablagerung sehr feiner Partikeln auf der Membran,

o Adhäsion und Wachstum von Mikroorganismen,

o Ausfällungen

o chemische Veränderung der Deckschichtbestandteile.

Diese Mechanismen werden im Abschnitt 2.5 näher erläutert.

Um jedoch das Phänomen der Deckschichtalterung im Deckschichtmodell zu

berücksichtigen, kann ein zeitabhängiger Teil des Widerstandes zur vorhergehenden


17

Gleichung hinzugefügt werden. Hier hat Lotz nach Fane eine Erweiterung vorgenommen

und folgenden Ansatz formuliert:

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛−⋅= ∞

kt

DSDS eRR 1, 2-14

∞,DSR : Deckschichtwiderstand für t=∞ [m-1]

k : Konstante [ - ]

t : Zeit [s]

Dieser Ansatz beschreibt die schnelle Ablagerung von Partikeln zu Filtrationsbeginn, den

langsameren Aufbau einer Ablagerungsschicht auf der Membran und die

Deckschichtalterung (Fane, Fell et al. 1980), (Lotz 1997).

2.5 Membranfouling

Fouling ist die reversible oder irreversible Verschmutzung der Membranoberfläche, die den

Filtratfluss vermindert. Eine einheitliche Definition des Fouling gibt es in der

Membrantechnik nicht, da jeweils unterschiedliche Effekte und Mechanismen stattfinden

(Chmiel, Bauser et al. 1990), (Melin & Rautenbach 2007). Ist die Leistung eines

Membranfiltrationsprozesses im Prozessbetrieb niedriger als erwartet bzw. sinkt die

Leistung stetig ab, wird dies als Fouling bezeichnet (Abbildung 8).

Abbildung 8: Verlauf des Filtratflusses als Funktion der Prozessdauer

Prozessdauer

Filtr

atflu

ss

Konzentrations- polarisation

Membranfouling


18

Grundsätzlich unterscheidet man beim Membranfouling zwischen dem Scaling, dem

Biofouling und dem Fouling im klassischen Sinne. Beim Scaling handelt es sich um die

Ablagerung anorganischer Salze infolge einer Löslichkeitsüberschreitung. Biofouling

entsteht durch das Wachsen eines Biofilms infolge der Adsorption und Wachstum von

Makromolekülen (Proteine, Polysaccharide etc.). Als Fouling wird alles Weitere

zusammengefasst, was nicht eindeutig dem Scaling oder Biofouling zugeordnet werden

kann. Hierzu gehören Ablagerungen von kolloidalen oder von grenzflächenaktiven

Substanzen. In der Abbildung 9 sind die Foulingmechanismen bei der Filtration mit

porösen Membranen dargestellt.

Abbildung 9: Foulingmechanismen bei der Filtration mit porösen Membranen

Die zur Entfernung des Fouling benötigten mechanischen Spülungen und chemischen

Reinigungen werden meist außerhalb des normalen Filtrationsbetriebes durchgeführt

(Ripperger 1992), (Zeman & Zydney 1996), (Pinnekamp & Friedrich 2006). Hierbei werden

die entfernbaren Verschmutzungen als reversibles Fouling aufgefasst. Verschmutzungen,

die sich durch die mechanische oder chemische Reinigung nicht entfernen lassen, stellen

irreversibles Fouling dar.

Bioflouling Mikroorganismen in einem Film aus EPS

Innere Adsorption membrangängige Substanzen mit Affinität zum Membranmaterial

Porenverblockung Partikeldurchmesser ≈ Porendurchmesser

Irreversible Deckschicht Adsorption, Kompaktierung, Einlagerung, Ausfällung, etc.

Membran

Biotechnologische Grundlagen

19

3 Biotechnologische Grundlagen

3.1 Mikroorganismen

Mikroorganismen sind mikroskopisch kleine Lebewesen. Sie werden nach zwei Kriterien

klassifiziert. Zum Einen werden die Mikroorganismen, also ihrer physiologischen

Ähnlichkeit, in Bakterien, Archaea, Pilze, Mikroalgen, Protozoen und Viren eingeteilt

(Fuchs, Wallner et al. 1998). Zum Anderen wird eine Einteilung nach der phylogenetischen

Klassifikation vorgenommen, die darauf beruht die Organismen aufgrund ihrer

Verwandtschaftsverhältnisse zu gruppieren. Die Nukleotidsequenzen der ribosomalen

Ribonukleinsäure (rRNS) werden dafür verglichen. Untersuchungen ergaben einen

Phylogenetischen Stammbaum in ein dreiteiliges Konzept, den Bakteria, Archaea und

Eukarya der von dem vorangegangenen zweiteiligen Konzept in Prokarionten den

Mikroorganismen ohne Zellkern und Eukarionten Mikroorganismen mit Zellkern abgelöst

wurde (Woese & Fox 1977), (Fox, Stackebrandt et al. 1980), (Woese 1987), (Woese,

Kandler et al. 1990).

3.1.1 Bakterien

Bakterien sind Prokaryoten. Ihre DNA ist nicht in einem abgegrenzten Zellkern enthalten

wie bei Eukaryoten. Bei ihnen liegt die DNA vielmehr wie bei allen Prokaryoten frei im

Cytoplasma und zwar zusammengedrängt in einem engen Raum, dem Nucleoid.

3.1.2 Morphologie der Bakterien

Die Bakterien können in drei Morphologieklassen eingeteilt werden; den Kokken, Stäbchen

und Spirillen (Abbildung 10).

Abbildung 10: Morphologie der Bakterien

Kokken Stäbchen Spirillen


20

3.1.3 Charakterisierung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft mit Biolog-

Mikrotiterplatten

Die ersten Biolog-Mikrotiterplatten kamen 1989 auf den Markt und wurden für die

Identifizierung und Charakterisierung von Isolaten entwickelt. In den Biolog-

Mikrotiterplatten befinden sich 96 Vertiefungen. Sie enthalten jeweils ein Kohlenstoff-

substrat und den Redoxfarbstoff Tetrazoliumchlorid (TTC). Wird das Substrat einer

Vertiefung umgesetzt, dient Tetrazoliumchlorid als Elektronenakzeptor und zeigt im

reduzierten Zustand eine violette Färbung und infolge dessen die direkte oxidative

Verwertung des Substrats (Bochner 1989), (Abbildung 11).

Abbildung 11: Reduktion von Tetrazoliumchlorid zu Formazan

Zusätzlich zur Identifizierung von Reinkulturen können die Biolog-Mikrotiterplatten

genutzt werden, um die funktionellen Möglichkeiten einer gesamten Bakteriengemeinschaft

zu ermitteln. Mit Hilfe der Biolog-Mikrotiterplatten kann das physiologische Profil einer

Bakteriengemeinschaft annähernd dargestellt werden. Garland und Mills haben als erste die

Biolog-Mikrotiterplatten auf diese Weise genutzt und konnten Unterschiede zwischen den

Populationen verschiedener Lebensräume nachweisen (Garland & Mills 1991).

Untersuchungen von anaeroben Gewässerproben wurden von Christian durchgeführt

(Christian & Lind 2006).

Nach dem Animpfen der Biolog-Mikrotiterplatten und in regelmäßigen Zeitabständen

während der Inkubation wird die Farbentwicklung in den verschiedenen Vertiefungen

photometrisch bestimmt. Die Abbildung 12 zeigt einen typischen Farbverlauf in den

Vertiefungen der Mikrotiterplatten.


21

Plateaubildung durch Substrataufbrauch

Zeit

Abs

orpt

ion

Reduktion von TTC durchOxidation des Subtrats

Lag-PhaseWachstum der Zellen bis 108

Abbildung 12: Farbverlauf in den einzelnen Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten modifiziert nach Konopka (Konopka, Oliver et al. 1998)

In dieser Arbeit soll diese Methode zur Charakterisierung des physiologischen Profils der

Bakteriengemeinschaft vor und nach dem Anreicherungsprozess mit der CMF angewandt

werden. Weiterhin soll die Gesamtrate und Stärke der Farbentwicklung der

unterschiedlichen Substratklassen untersucht werden. Die Clusteranalyse (CA) und die

Hauptkomponentenanalyse (HKA) einer Probe der Fraktionen Original und Konzentrat

über die einzelnen Substrate soll Aufschluss über die Ähnlichkeit dieser Fraktionen geben

(Abbildung 13).

Abbildung 13: Darstellung der Untersuchungen des physiologischen Profils einer Bakteriengemeinschaft der einzelnen Fraktionen mit den Biolog-Mikrotiterplatten.

A

B

C

D

E

F

G

H

Charakterisierung des physiologischen Profils der Bakteriengemeinschaft in den einzelnen Fraktionen durch die:

Gesamtrate der Farbentwicklung

Stärke der Farbentwicklung der unterschiedlichen Substratklassen

CMF

VF

Wasserprobe

Vorfiltrat

Konzentrat

Filtrat

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

CA und HKA für eine Probe in den Fraktionen ORI und KON über die Substrate


22

Bei der Clusteranalyse werden Objekte an Hand der Ähnlichkeit ihrer Merkmale

schrittweise zu verschiedenen Gruppen bzw. Cluster zusammengefasst. Unter Verwendung

der Ward Methode, die als Proximitätsmaß die quadrierte Euklidische Distanz zu Grunde

legt, werden die Cluster so aggregiert, dass ein minimales Anwachsen der

Fehlerquadratsumme innerhalb eines Clusters resultiert (Otto 1997). Sind die Cluster in

etwa gleich groß, spiegelt dieses Verfahren die reale Struktur des Datensatzes gut wider.

Diese Methode ist neben der Average Linkage die Wahl und sollte bei vollkommen

unbekannter Datenstruktur zuerst angewandt werden (Einax, Zwanziger et al. 1997).

Bei der Hauptkomponentenanalyse, ist die Datenreduktion das wichtigste Ziel. Viele

beobachtete Merkmale (Variablen V1-V10) werden zu Hauptkomponenten

zusammengefasst, mit denen die Objekte (Faktoren 1-3) beschrieben werden (Beispiel

Abbildung 14) (Kessler 2007).

Abbildung 14: Prinzip der Hauptkomponentenanalyse nach Kessler (Kessler 2007)

Ausgangspunkt Viele Objekte, viele Daten Unübersichtlich Informationen bleiben versteckt Variablen der Ausgangsmatrix: V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 Zielpunkt: Weniger unabhängige Übersichtlich Einflussgrößen Information wird herausgehoben

V1 V7 V8 V10 V2 V4 V3 V5 V6 V9

Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3

Faktoren sind Hintergrundgrößen, die aus den Vordergrundgrößen,

den Variablen berechnet werden.

Jedes Objekt wird im Faktorraum beschrieben Datenreduktion

Material und Methoden

23

4 Material und Methoden

4.1 Untersuchungsgebiete

Für die Optimierung des MCC 1 wurden Proben aus verschiedenen Gewässern

genommen. Hierbei handelt es sich um Proben aus der Elbe sowie dem Sauteich und dem

Saubach.

4.1.1 Die Elbe

Die Elbe ist mit einer Länge von 1 094 km von der Quelle im Riesengebirge bis zur

Mündung in die Nordsee bei Cuxhaven und einem Einzugsgebiet von 148 268 km2 das

viertgrößte Flussgebiet Mitteleuropas (Abbildung 15). Im Einzugsgebiet der Elbe leben

24,5 Mio. Einwohner. Zu den wichtigsten Nebenflüssen der Elbe gehören die Moldau,

Saale, Havel, Mulde, Schwarze Elster und Eger.

Abbildung 15: Einzugsgebiet Elbe und Probennahmestelle km 327

Probenahmestelle km 327 links

Magdeburg

Nordsee

1km


24

4.1.2 Der Sauteich und der Saubach

Die Talsperre Muldenberg befindet sich im Vogtlandkreis des Freistaates Sachsen und ihre

nächstgelegene Stadt ist Schöneck (Abbildung 16). Die Talsperre wurde 1925 in Betrieb

genommen und staut die Rote Mulde, die Weiße Mulde und den Saubach (einen Abfluss

des Sauteichs). Sie dient der Rohwasserbereitstellung für die Trinkwasserversorgung und

darüber hinaus dem Hochwasserschutz. Das Einzugsgebiet der Talsperre Muldenberg

besteht zum größten Teil aus Hochmoor, was einen Huminstoffeintrag in den

Wasserkörper bewirkt. Die Talsperre hat einen niedrigen pH-Wert der natürlichen

Ursprungs ist (Sieber 1992).

Abbildung 16: a) Lage der Talsperre Muldenberg; b) Probenahmestelle Sauteich

4.2 Probennahme

Die Probennahmen erfolgten mittels Stielschöpfer bzw. Probenschöpfer in einem

autoklavierten 10 L Kanister aus Polypropylen. Die Proben wurden gekühlt bei 4 °C und

abgedunkelt transportiert.

Rote Mulde Weiße Mulde

Auslauf Talsperre

Sauteich

1km

Saubach

a) b)


25

4.3 Aufbau des Munich Cell Concentrator 1 Der Munich Cell Concentrator wurde für die Anreicherung von Bakterien in Wasserproben

entwickelt (Peskoller, Niessner et al. 2009). Er wurde so konstruiert, dass das Konzentrat

nicht, wie in der Literatur beschrieben, in den Probenbehälter zurückgeführt wird, sondern

eine Aufkonzentrierung durch kontinuierliche Mehrfachüberspülung in einer

Zirkulationsschleife stattfindet (Nagata, Herouvis et al. 1989), (Abbildung 17). Der Vorteil

besteht darin, dass Zellen aus der Probe, die sich nach der Anreicherung noch auf der

Membran befinden, durch gezielte Spülvorgänge aus dem System nahezu vollständig

wiedergewonnen werden können. Der MCC 1 zeichnet sich auch durch ein geringes

Volumen der Zirkulationsschleife und einen dadurch erreichbaren höheren

Anreicherungsfaktor aus. Aufgrund seiner robusten Bauweise ist er nicht nur für den

Einsatz im Labor sondern auch für die Anreicherung im Feld geeignet.

Abbildung 17: Schematischer Aufbau a) eines in der Literatur beschriebenen Filtrationssystems und b) eines Filtrationssystems mit Rezirkulationsschleife, modifiziert nach Peskoller (Peskoller 2010)

p1 p2p0

Probe

Filtrat

Hohlfasermodul

Konzentrat

V1

p1 p2p0

V2

V3

Eluat

Hohlfasermodul

Probe

Filtrat

pi Drucksensoren

Durchflusssensor

Drei-Wege-Regelventil

Magnetventile Vi

Schlauchpumpe

Rezirkulationsschleife

b)a)


26

Für die Realisierung des Filtrationsprozesses wurden zusätzlich drei Ventile, die mittels

Computer angesteuert werden, eingebaut. Dies ermöglicht eine automatisierte Ansteuerung

des MCC 1 in den verschiedenen Modi (Tabelle 1).

Tabelle 1: Beschreibung der einzelnen Modi

*Austausch des Zirkulationsschlauches mit dem Filtratschlauch

Abbildung 18: Aufbau des MCC 1

Modus Pump-

richtung U/ min

Ventilstellung Ventil 1 Ventil 2 Ventil 3

Konditionierung RL 350 Befüllen-Elution offen geschlossen offen

Dead-End RL 200 Dead-End offen geschlossen geschlossen

Anreicherung RL 350 Filtration offen offen geschlossen

Elution RL 350 Befüllen-Elution offen geschlossen offen

Spülen RL 400 Spülen geschlossen offen geschlossen

Rückwärtsspülen RR 400 Rückwärtsspülen geschlossen offen geschlossen

Rückspülung* RR 100 Rückspülung geschlossen offen geschlossen

p0 p1

p2

V1 V3

V2

Hohlfasermodul

Konzentrat


27

Die Abbildungen 17b und 18 zeigen den Aufbau des MCC 1. Das Gehäuse besteht aus

eloxiertem Metall. An den Seiten sind Tragegriffe angebracht, um den Transport im Feld

zu erleichtern. Die Schläuche bestehen aus Marprene und haben einen Innendurchmesser

von 6,4 mm. Sie lassen Flüsse von 1,6 L/min zu und werden vorwiegend für biologische

Prozesse eingesetzt. Des Weiteren ist der MCC 1 so konzipiert, dass sich Filtrationsmodul

und Schläuche leicht wechseln lassen. Mittels der Einkanalschlauchpumpe, welche eine

Fördermenge bis zu 2 L/min und einen Druck von 2 bar zulässt, wird die Probe mittels

Schlauch in die Rezirkulationsschleife und durch das Hohlfasermodul befördert. Im Modul

findet die Trennung in Filtrat- und Konzentratstrom statt. Das Filtrat wird in ein separates

Gefäß geleitet und das Konzentrat verbleibt zur stetigen Aufkonzentrierung in der

Rezirkulationsschleife, wobei eine kontinuierliche Probenzufuhr die Zirkulation im

Kreislauf ermöglicht. Der Filtratfluss wird mittels Durchflussmesser POM Opto, einem

Durchfluss-Impulsgeber für besonders durchscheinende Flüssigkeiten, gemessen. Der

Messbereich liegt zwischen 0,025 und 2,5 L/min. Für die Filtration wird ein

Hohlfasermodul mit einem Membranmaterial aus Polyethylensulfon (PES) und einer

Membranfläche von 365 cm2 verwendet (Abbildung 19). Das Material der Membran

zeichnet sich durch hydrophile Eigenschaften aus und wird häufig für die Filtration von

biologischen Suspensionen verwendet. Der Kapillarinnendurchmesser der Hohlfasern des

Moduls beträgt 0,5 mm und der Porendurchmesser 0,5 µm. Der TMP des Moduls ist auf

maximal 2 bar ausgelegt.

Abbildung 19: Hohlfaserfiltrationsmodul MiniKros Sampler Plus

Der Filtrationsprozess kann durch drei Magnetventile, dem Probenventil (V1), dem

Rezirkulationsventil (V2) und dem Elutionsventil (V3) in verschiedenen Modi (Tabelle 1)

gesteuert werden. Ein elektromagnetischer Aktuator betätigt die Schlauchklemme des

Ventils und kann den Durchfluss der Probe durch Abklemmen oder Freigeben des

eingelegten Schlauches regulieren. Zur Bestimmung der transmembranen Druckdifferenz


28

sind am Moduleingang, am Modulausgang und am Filtratausgang Drucksensoren

angebracht. Hier wurde jeweils ein Flashmount-Transmitter mit einer frontbündigen

Membran verwendet und an eine Flusszelle aus PTFE (Polytetrafluorethylen) mit zwei

Schlauchanschlüssen angebracht.

Mit Hilfe des Restriktionsventils wird manuell die Filtrationsgeschwindigkeit geregelt und

somit der Arbeitsdruck (die transmembrane Druckdifferenz) im Filtrationsmodul.

In einem sterilen 125 ml Probengefäß kann das Konzentrat über den Elutionsschlauch

überführt werden.

Die automatisierte Ansteuerung und Erfassung der Messwerte erfolgte mittels externen

Laptop über das Programm LabView 8.2. In der Abbildung 20 ist die Softwareoberfläche

dargestellt.

Abbildung 20: Softwareoberfläche des Programms LabView 8.2. zur Ansteuerung des MCC 1

Ventil aktiv


29

Nachdem die Geräte eingeschaltet sind, wird durch das Drücken der Mode-Taste der

Digitalmodus der Pumpe aktiviert. Im Feld „Befehl“ können die gewünschten Parameter

wie Geschwindigkeit und Drehrichtung der Pumpe eingegeben werden, die durch Drücken

der Taste „Start“ oder „Stop“ aktiviert bzw. deaktiviert werden können. Die

verschiedenen Ventilstellungen der Ventile V1, V2 und V3 können im Feld „Ventile“

(Tabelle 2) ausgewählt und somit aktiviert werden. Die aktivierten Ventile sind mit einer

anderen Farbe unterlegt.

Des Weiteren werden die während der Filtration auftretenden Drücke am Moduleingang,

am Modulausgang und am Filtratausgang, sowie der errechnete TMP angezeigt. Außerdem

wird der Filtratfluss in ml min-1 numerisch wiedergegeben und in der Grafik gezeigt. Durch

die Eingabe der Membranfläche in cm2 wird der Flux in L h-1 m-2 und die Permeabilität in

L h-1 m-2 bar-1 berechnet und angezeigt. Im Dateipfad werden die Daten in einer Datei im

ASCII-Format abgespeichert. Mit der Taste Stopp kann das Programm beendet werden.


30

(3) Vorfiltrat

CFM

(1) Probe

(3) Vorfiltrat

(2) Vorfiltrat- überschuss

(4) Konzentrat (Eluat)

(5) Filtrat

(Permeat)

Bilanzraum 1 Vorfiltration

Bilanzraum 2 Cross-Flow-Mikrofiltration

Senke 1 Senke 2

Vorfilter

(Original)

4.4 Bilanzierung der Filtration

Zur Beschreibung des Filtrationsprozess wurde eine Bilanz aufgestellt. In Abbildung 21 ist

ein Fließschema des Filtrationsprozesses dargestellt. Hier werden die Bilanzräume

Vorfiltration, Cross-Flow-Mikrofiltration und deren einzelnen Ströme gezeigt.

Abbildung 21: Fließschema des Filtrationsprozesses

Im weiteren Verlauf werden die einzelnen Fraktionen Original, Vorfiltrat, Konzentrat und

Filtrat mit den Abkürzungen ORI, VOR, KON, FIL (Tabelle 2) versehen.

Tabelle 2: Abkürzungen der einzelnen Fraktionen Fraktion Abkürzung

Original ORI

Vorfiltrat VOR

Konzentrat KON

Filtrat FIL

Allgemeine Massenbilanz einer Prozesseinheit

01 11

=−−∑ ∑∑= ==

a

i

s

i

Si

Ai

e

i

Ei mmm 4-1

Mit ρ⋅=Vm 4-1a

m Masse [g]

V Volumen [L]


31

ρ Dichte [g · L-1] Annahme ρ =konstant

Für einen Bilanzraum gelten folgende allgemeine Bilanzen:

Eingangsvolumen (E) – Ausgangsvolumen (A) - Senke (S) = 0

Volumenbilanz : 0111

=−− ∑∑∑===

s

i

Swi

a

i

Awi

e

i

Ewi VVV 4-2

Mit: VW i Wasser im Strom i [L]

Bakterienzahl Eingang (E) – Bakterienzahl Ausgang (A) - Senke (S) = 0

Bilanz der GBZ: 0111

=⋅−⋅−⋅ ∑∑∑===

s

i

SBi

SWi

a

i

ABi

AWi

e

i

EBi

EWi cVcVcV 4-3

Mit: cB i Konzentration Bakterien im Strom i [Zellen L-1]

GBZ Gesamtbakterienzahl [Zellen]

Bilanzgleichungen der Bilanzräume:

Bilanzraum für die Vorfiltration:

0321 =−−− WSWWW VVVV [ 1 ]

011332211 =⋅−⋅−⋅−⋅ BSWSBWBWBW cVcVcVcV [ 2 ]

Bilanzraum für die Cross-Flow-Mikrofiltration:

02543 =−−− WSWWW VVVV [ 3 ]

022554433 =⋅−⋅−⋅−⋅ BSWSBWBWBW cVcVcVcV [ 4 ]


32

4.5 Durchführung der Filtration

4.5.1 Vorfiltration

Für die Filtration wurde die Probe homogenisiert und jeweils in Zweiliterflaschen abgefüllt.

Durch Wägung wurde das Volumen bestimmt unter Annahme der Dichte gleich 1. Es

erfolgte eine Vorfiltration (Abbildung 22a) mittels Schlauchquetschpumpe über ein

Filtersystem mit einem Oberteil aus Polypropylen, dem Unterteil aus Trogamid und dem

Filtermodul aus Nylon 50 µm in einen neuen Behälter mit einer Flussrate von 1,6-2 L min-1

(Abbildung 22b). Aufgrund des transparenten Filtergehäuses des Filtersystems konnte

Einblick auf das Filterelement genommen werden. Um eine Kontamination der Probe zu

vermeiden, wurde die Vorfiltrationseinheit autoklaviert und der Nylonfilter mit Ethanol

desinfiziert und anschließend unter der Sterilbank eingesetzt.

Abbildung 22: a) Aufbau der Vorfiltration b) Filtersystem

4.5.2 Vorbereitung des MCC 1 (Initialisierung)

Die einzelnen Modi sind in der Tabelle 2 erläutert.

Zur Durchführung des Anreicherungsprozesses wurde der MCC 1 initialisiert. Deshalb

wurde die Anlage im Konditionierungsmodus „Befüllen-Elution“ mit vollständig

geöffnetem Restriktionsventil befüllt. Dazu wurden der Probenahme-, Filtrat- und

Konzentrationsstrom in das Vorratsgefäß geleitet (Abbildung 23a und 23b). Nach dem

Starten der Pumpe wurden die Schläuche sowie das Filtrationsmodul solange befüllt, bis

alle Luftblasen im Zirkulationssystem entwichen waren. Das Entlüften des Modulausgangs

erfolgte für 30 Sekunden im Dead-End-Modus. Um die restlichen Luftblasen aus dem

Zirkulationsmodul zu entfernen, wurde für 30 Sekunden der Filtrationsmodus und

anschließend für 30 Sekunden der Elutions-Modus verwendet. Dazu wurden die Ventile

a) b)


33

auf „Filtration“ und anschließend „Befüllen-Elution“ bei laufender Pumpe gestellt. Dieser

Vorgang wurde zweimal wiederholt. Anschließend war das Gerät bereit für die Filtration.

Abbildung 23: a) Initialisierung des MCC 1 b) schematische Darstellung der Initialisierung des MCC 1

4.5.3 Filtrationsprozess

Für die Filtration wurde der Filtrationsschlauch in ein separates Gefäß geleitet. Unter dem

Elutionsschlauch wurde ein gewogenes 125 ml Gefäß gestellt (Abbildung 24).

Abbildung 24: MCC 1 während der Filtration

V1

p1 p2p0

V2

V3

Hohlfasermodul

Probe

Filtrat

b)a)


34

Nach dem Starten der Filtration im Anreicherungsmodus wurde das Restriktionsventil so

eingestellt, dass der gewünschte TMP erreicht wurde. Für die einzelnen

Anreicherungsversuche wurde mit verschiedenen maximalen TMP gearbeitet (Tabelle 3),

um eine optimale Elution der Bakterien von der Membran für natürliche Gewässerproben

zu erzielen.

Tabelle 3: maximaler TMP für die Optimierung der Elution der verschiedenen Proben

Probe Datum maximaler TMP [bar]

Spülung modifiziert 2. Elution

Elbe 1 09.11.2009 0,083 - -

Elbe 2 ″ 0,076 - -

Moritzteich 1 19.11.2009 0,083 - -

Moritzteich 2 ″ 0,083 - -

Saubach 1 09.12.2009 0,232 - -

Saubach 2 ″ 0,340 - -

Sauteich 1 ″ 0,318 - -

Sauteich 2 ″ 0,200 - -

Elbe 3 02.02.2010 0,033 x x

Elbe 4 ″ 0,041 x x

Elbe 5 ″ 0,051 x x

Elbe 6 ″ 0,084 x x

Während der Filtration wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen in das System

gelangten. Es wurden die Prozessparameter Filtratfluss, TMP notiert und die Permeabilität

nach Gleichung 2-2 berechnet. Nachdem sich noch ca. 100 ml der Probe im Gefäß

befanden, wurde die Pumpe gestoppt, das Restriktionsventil geschlossen und die Ventile

sofort auf den Modus „Spülen“ gestellt. Das Spülen der Rezirkulationsschleife

(Abbildung 25a) erfolgte nach einer Minute, die Pumpe wurde gestartet und für eine

Minute in diesem Modus betrieben. Danach erfolgte bei laufender Pumpe ein

Pumpenrichtungswechsel. Für eine Minute wurde die Rückwärtsspülung vorgenommen

und anschließend gestoppt. Die Elution (Gewinn des Konzentrats, Abbildung 25b) erfolgte

durch das Öffnen des Elutionsventils durch den Modus „Befüllen-Elution“ und dem

Pumprichtungswechsel „RL“. Der Elutionsmodus lief für drei Sekunden. Das

Elutionsgefäß wurde somit befüllt und zurück gewogen. Aus der Differenz konnte die

Menge an Flüssigkeit im Konzentrat bestimmt werden.


35

Abbildung 25: a) Spülung des Systems b) Elution der Bakterien aus der Rezirkulationsschleife

Für die Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010 wurde ein modifiziertes Spülen/Elution

vorgenommen. Dies ist in der Tabelle 4 dem nichtmodifiziertem Spülen/Elution

gegenübergestellt.

Tabelle 4: Gegenüberstellung modifiziertes und nichtmodifiziertes Spülen/Elution Spülen/Elution Spülen/Elution modifiziert

Modi Pumprichtung/Drehzahl

Zeit [s] Modi Pumprichtung/

Drehzahl Zeit [s]

Ruhen - 60 Ruhen - 60

Spülung RL 400 60 Rückwärtsspülung RR 400 10

Rückwärtsspülung RR 400 60 Ruhen - 10

Elution RL 350 3 Rückwärtsspülung RR 400 10

Ruhen - 10

Rückwärtsspülung RR 400 10

Ruhen - 10

Rückwärtsspülung RR 400 30

Spülung RL 400 60

Elution RL 350 3

V1

p1 p2p0

V2

Eluat

V3

Hohlfasermodul

Probe

Filtrat

b)

V1

p1 p2p0

V2

V3

Eluat

Hohlfasermodul

Probe

Filtrat

a)


36

4.5.4 Regenerierung

Zur Regenerierung der Cross-Flow-Mikrofiltrationsanlage wurde eine 0,5 %ige alkalische

Detergenzlösung Hellmanex II verwendet, welche hauptsächlich zur Entfernung von

organischem und biologischem Fouling dient (Flemming 1995). Hierzu wurde die Lösung

in ein Gefäß vorgelegt, der Proben-, Elutions- und Filtrationsschlauch eingetaucht und der

MCC 1 für 15 Minuten im Konditionsmodus betrieben. Danach erfolgte die Rückspülung

für 5 Minuten im Rückspülmodus, indem durch Öffnen der Schlauchhalterung der Pumpe

der Zirkulationsschlauch mit dem Filtrationsschlauch ausgetauscht wurde. Im Anschluss

wurde die Spüllösung durch autoklaviertes deionisiertes Wasser ersetzt, der

Zirkulationsschlauch wieder mit den Filtrationsschlauch ausgetauscht, der Proben- und der

Elutionsschlauch in ein leeres Gefäß geleitet und für weitere 5 Minuten im

Konditionsmodus konditioniert. Anschließend war die Cross-Flow-Mikrofiltration für die

nächste Probe zur Initialisierung bereit.

Jedoch zeigte sich, dass eine Regenerierung mit 0,5 %iger alkalische Detergenzlösung

Hellmanex II nicht ausreicht. Deshalb wurde das Filtrationsmodul mit den Lösungen

0,05% Natriumhypochloritlösung und 0,5 N Natriumhydroxid-Lösung für jeweils 20

Minuten gespült. Weitere Spülschritte sind mit den in der Tabelle A1 aufgeführten

Chemikalien möglich. Die Filtrationseinheit war nun für den nächsten

Anreicherungsprozess bereit.

4.6 Biolog-Mikrotiterplatte

Die Charakterisierung des physiologischen Profils der Bakteriengemeinschaften in den

unterschiedlichen Fraktionen wurde mit Hilfe von Mikrotiterplatten der Firma BIOLOG

durchgeführt. Es wurden Platten des Typs EcoPlate eingesetzt. Die 96 Vertiefungen dieser

Platten enthalten in dreifacher Ausführung je 31 verschiedene Kohlenstoffsubstrate und

den Redoxfarbstoff Tetrazoliumchlorid, sowie ein Kontrollfeld ohne Substrat. Die

Anordnung der einzelnen Substrate ist in Abbildung 26 dargestellt. Die EcoPlates wurden

speziell für die Analyse von Umweltproben entwickelt.


37

A1 Wasser

A2 β-methyl-D- Glucosid

A3 D-Galcton- Säure γ-Lacton

A4 L-Arginin

A1 Wasser



A4 L-Arginin

A1 Wasser



A4 L-Arginin

B1 Methyl- pyruvat

B2 D-Xylose

B3 D- Galakturon- säure

B4 L-Asparagin

B1 Methyl- pyruvat

B2 D-Xylose


B4 L-Asparagin

B1 Methyl- pyruvat

B2 D-Xylose


B4 L-Asparagin

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy- Benzoat

C4 L-Phenyl- alanin

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol


C4 L-Phenyl- alanin

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol


C4 L-Phenyl- alanin

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy- Benzoat

D4 L-Serin

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol


D4 L-Serin

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol


D4 L-Serin

E1 α-Cyclodextrin

E2 N-acetyl-D- Glukosamin

E3 γ-Hydroxy- Buttersäure

E4 L-Threonin

E1 α-Cyclodextrin



E4 L-Threonin

E1 α-Cyclodextrin



E4 L-Threonin

F1 Glycogen

F2 D- Glukosamin- säure

F3 Itaconsäure

F4 Glycyl-L- Glutamin- säure

F1 Glycogen


F3 Itaconsäure


F1 Glycogen


F3 Itaconsäure


G1 D-Cellobiose

G2 Glucose-1- Phosphat

G3 α-keto- Glutarsäure

G4 Phenyl- Ethylamin

G1 D-Cellobiose




G1 D-Cellobiose




H1 α-D-Lactose

H2 D,L- α- Glycerol- phosphat

H3 D-Apfelsäure

H4 Putrescin

H1 α-D-Lactose


H3 D-Apfelsäure

H4 Putrescin

H1 α-D-Lactose


H3 D-Apfelsäure

H4 Putrescin

Abbildung 26: Anordnung der einzelnen Substrate in den Eco Plates

37


38

Die 31 Substrate wurden nach Insam in 6 Substratklassen eingeteilt (Insam 1997). Diese

Einteilung ist in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5: Einteilung der Substrate in 6 Substratklassen Amine Aminosäuren Kohlenhydrate Karbonsäuren Polymere Phenolische

Verbindungen

Putrescin L-Arginin α-D-Lactose α-keto- Glutarsäure

α-Cyclodextrin

2-Hydroxy- Benzoat

Phenyl- Ethylamin L-Asparagin β-methyl-D-

Glucosid D- Galakturonsäure Glycogen 4-Hydroxy-

Benzoat

L-Phenylalanin D-Cellobiose D-

Glukosaminsäure Tween 40

L-Serin D-Mannitol D-Apfelsäure Tween 80

L-Threonin i-Erythritol Itaconsäure

Glycyl-L- Glutaminsäure

Glucose-1- Phosphat

Methylpyruvat

D-Xylose γ-Hydroxy- Buttersäure

D-Galcton- Säure γ-Lacton

N-acetyl-D- Glukosamin

D,L- α- Glycerolphosphat

4.6.1 Animpfen

Die Biolog-Platten wurden direkt mit den Fraktionen Original, Vorfiltrat, Konzentrat und

Filtrat beimpft. Dazu wurden 150 µl der Fraktion mittels elektronischer Mehrkanalpipette

in die 96 Vertiefungen pipettiert. Diese Arbeit fand unter einer Sterilbank statt, um

Kontaminationen zu vermeiden.

4.6.2 Inkubation und Vermessung

Die Inkubation der Mikrotiterplatten erfolgte bei einer Temperatur von 20°C im

Brutschrank. Die Farbentwicklung in den verschiedenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte

wurde sofort und in zeitlichen Abständen mittels Mikrotiterplatten-Photometer (Multiskan

RC) bei einer Wellenlänge von 595 nm vermessen.

4.6.3 Auswertung

Um Hintergrundsignale die durch Substrate oder durch die Aufkonzentration der Bakterien

ausgelöst werden zu entfernen, wurden die vom Photometer für die einzelnen Substrate


39

gemessenen Rohwerte der optischen Dichte (OD) zweifach korrigiert. Zunächst wurden

von allen Rohwerten die Messwerte der ersten Messung direkt nach dem Ansetzen der

Platten (zum Zeitpunkt t=0) und allen Rohwerten einer Platte der Mittelwert der 3

Kontrollfelder ohne Substrat (Hintergrundsignal) abgezogen (Girvan, Bullimore et al.

2003). Entstanden dabei für ein Feld negative Werte, erhielten diese den Wert 0.

Zur Normalisierung der Daten wurde für jeden Messzeitpunkt die durchschnittliche

Farbentwicklung („average well colour development“ AWCD) der jeweils

zusammengehörenden 31 Substrate einer Parallele berechnet. Für die 31

zusammengehörigen Substrate der Parallele j, die zum Zeitpunkt t gemessen wurden,

berechnet er sich wie folgt:

),,(311 31

1, tjiODAWCD

ikortj ∑

=

= 4-4

wobei ODkor(i,j,t) die korrigierte OD für die Vertiefung i der Parallele j zum Messzeitpunkt

t ist. Um den Einfluss eventuell ungleichmäßiger Verteilung der Bakterien durch

Bakterienaggregate zu minimieren, wurden alle für die Umsetzung der einzelnen Substrate

erhaltenen OD-Werte einer Normalisierung unterzogen (Garland 1996). Das heißt, die

OD-Werte der einzelnen Substrate wurden durch den AWCD-Wert der jeweils

zugehörigen 31 Substrate einer Parallele geteilt. Die normalisierten Werte für jeden

Messwert errechnen sich dann wie folgt:

),(),,(

),,(tjAWCDtjiOD

tjiOD kornorm =

4-5

Diese normalisierten Werte waren die Grundlage für die weiteren Auswertungen.

Für den Vergleich der verschiedenen Fraktionen wurden

o die Gesamtraten der Farbentwicklung

o die Farbentwicklung der 6 Substratklassen verglichen.

Weiterhin wurde eine Clusteranalyse und eine Hauptkomponentenanalyse der Fraktionen

Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 durchgeführt. Die 31 Substrate wurden mittels

der Hauptkomponentenanalyse auf eine überschaubare Anzahl an Hauptkomponenten

reduziert. Möglichst wenig der durch die ursprünglichen Muster gegebenen Varianz soll

dabei verloren gehen. Dies wird durch eine lineare Transformation auf eine neue Menge

von Mustern erreicht. Die erste Hauptkomponente repräsentiert hierbei die größte Varianz

der 31 Substrate (Hackett & Griffiths 1997).


40

4.7 Mikrobiologische Untersuchungen

4.7.1 Färbung und Mikroskopie

Für die Bestimmung der Bakterienkonzentration wurden die Bakterien mit Acridin-Orange

angefärbt. Hierzu wurde eine Filtrationseinheit mit einem Aufsatz von 22 mm

Durchmesser und einer Fritte von 20,1 mm Durchmesser verwendet. Für die Filtration

wurden ein Unterlegfilter und ein schwarzer Nuclepore-Filter (PC; 0,2 µm) jeweils mit

einem Durchmesser von 25 mm eingesetzt. Die Probe wurde 2 Minuten homogenisiert.

Danach wurde 1 ml der Probe auf den Filter gegeben, mit 0,2 ml 3 %iger

Natriumthiosulfatlösung entfärbt und mit einem Unterdruck von maximal 150 hPa filtriert.

Anschließend wurde tröpfchenweise 1 ml Acridin-Orange aufgegeben, die Vakuumpumpe

kurz eingeschaltet, um den Farbstoff anzusaugen. Nach 2 Minuten wurde der Farbstoff

abgesaugt und der Nuclepore-Filter auf einen vorbereiteten Objektträger mit einem

Tropfen Immersionsöl gelegt, ein weiterer Tropfen wurde auf den Filter gegeben und ein

Deckglas aufgelegt (Hobbie, Daley et al. 1977).

Die Bakterien wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Typ: Axiolab, Zeiss) bei

1000facher Vergrößerung gezählt (Abbildung 27a). Die Zählung und Vermessung der

Bakterien erfolgte mit einem Grid Porton G12 (May 1965), (Abbildung 27b).

Abbildung 27: a) Epifluoreszenzmikroskop b) Grid Porton G12

a) b)


41

4.7.2 Bakterienkonzentration

Die Bakterienkonzentration gibt die Zahl der Bakterien in einem Liter der Fraktion an.

Filtrat

V

SFASF

FritteBB V

UFnAAnc ⋅⋅⋅

= 4-6

2

4 FritteFritte dA π=

4-6a

SFSFSF blA ⋅= 4-6b

cB Konzentration Bakterien [Zellen L-1]

nB Anzahl der gezählten Objekte [-]

nASF Anzahl der Sichtfelder [-]

AFritte Fläche der Fritte [mm2]

ASF Fläche Sichtfeld 3,19·10-3[mm2]

VFiltrat Filtratvolumen [ml]

UFV Umrechnungsfaktor Volumen [ml · L-1]

dFritte Durchmesser der Fritte 20,1 [mm]

4.7.3 Bakterienkonzentration der einzelnen Formklassen

Die Bakterienkonzentration der einzelnen Formklassen gibt die Zahl der Bakterienklasse in

einem Liter der Fraktion an.

B

FormklasseBFormklasse n

ncc ∑⋅= 4-7

4.7.4 Gesamtbakterienzahl

Die Gesamtbakterienzahl gibt an, wie viele Bakterien absolut sich in einer Fraktion

befinden.

BiWi cVGBZ ⋅= 4-8 GBZ Gesamtbakterienzahl [Zellen]


42

4.7.5 Biovolumen der Bakterien

Das Biovolumen der Bakterien gibt an, wie viel Volumen die Bakterien in einem Liter der

Fraktion einnehmen

BB n

blbGBZV

∑ ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −⋅⋅⋅

=

− )3

(4

10 29 π

4-9

VB Biovolumen [mm3 L-1]

b Breite Bakterien [µm]

l Länge Bakterien [µm]

nB Anzahl der gezählten Objekte

für Kokken bl = 4-9a

für Spirillen 2bl ⋅

=π

4-9b

4.7.6 Biomasse von Bakterien

Die Biomasse der Bakterien gibt an, wie viel Milligramm Kohlenstoff sich in einem Liter

der Fraktion befindet.

Die Biomasse wurde unter Anwendung einer nichtlinearen Gleichung berechnet (Simon &

Azam 1989).

359,0 1086,06,88 −⋅⋅⋅= BB Vm 4-10

mB Biomasse [mgC L-1]

4.7.7 Wiederfindungsrate der Bakterien

Die Wiederfindungsrate der Bakterien gibt an, wie viel Prozent der Bakterien im

Konzentrat wiedergewonnen wurden.

100

PrPr

⋅⋅⋅

=obeobe

KonzentratKonzentrat

cVcV

WFR 4-11

WFR Wiederfindungsrate [%]


43

4.7.8 Anreicherungsfaktor

Der Anreicherungsfaktor gibt das Verhältnis der Volumen zwischen Probe und Konzentrat

an.

Konzentrat

obe

VV

F Pr= 4-12

F Anreicherungsfaktor [-]

4.8 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentration wurde mit dem Triphenylmethanfarbstoff (TPM) Coomassie-

Brilliant-Blau beruhend auf einer Modifikation der Bestimmung der Proteinkonzentration

nach Bradford bestimmt (Bradford 1976). Der Farbstoff TPM reagiert basisch mit

Aminosäuren. Infolge dessen sich das Absorptionsmaximum von 465 nm hin zu 595 nm

verschiebt.

Für die Kalibrierung wurden verschiedene Proteinkonzentrationen aus BSA (Albumin

Fraktion V) und dem Farbstoff TPM hergestellt. Das Rinderserum-Albumin Fraktion V

hat sich als international anerkannter Standard für die Kalibrierung durchgesetzt. Es wurde

der Quotient aus den optischen Dichten (OD) OD590/OD450 gegen die eingesetzte

Proteinmenge aufgetragen (Abbildung 28, Tabelle A2).

Kalibrierkurve mit Roti-Nanoquant und BSA (Albumin Fraktion V) 0-100 µg/ml

y = 0,01740x + 0,62365R2 = 0,99997

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 20 40 60 80 100 120

µg/ml

OD

590

/450

Abbildung 28: Kalibrierkurve zur Bestimmung der Proteinkonzentration


44

Die analytischen Grenzwerte für diese Kalibriergeraden sind die Nachweisgrenze mit

0,722 µg/ml, die Erfassungsgrenze mit 1,44 µg/ml und die Bestimmungsgrenze mit

2,90 µg/ml. Das Bestimmtheitsmaß dieser Kalibriergeraden beträgt R2=1.

Die Berechnung der Proteinkonzentration wurde mit Hilfe der folgenden Gleichung

bestimmt:

0174,0

)62365,0(450

590

Pr

−=OD

c 4-13

OD : Optische Dichte [nm]

Prc : Proteinkonzentration [µg/ml]

Die Messung der Kalibrierung und der Proben erfolgte am Beckman-Photometer.

Ergebnisse und Diskussion

45

5 Ergebnisse und Diskussion

5.1 Die Wiederfindungsrate der Bakterien, ihr Biovolumen, -masse

und die Morphologie

5.1.1 Bestimmung des druckkontrollierten Arbeitsbereiches

Um eine hohe Wiederfindungsrate zu erzielen, sollte die Filtration im druckkontrollierten

Bereich stattfinden. Es wurde der druckkontrollierte Bereich des Filtrationsaufbaues mit

deionisiertem Wasser bestimmt (Abbildung 29, Tabelle A3). Grundsätzlich gilt, dass der

Filtratfluss linear mit dem TMP ansteigt. Es kann zu einer Komprimierung der

Deckschicht auf der Membran kommen, wenn ein kritischer Druck erreicht ist. Der

Filtratfluss nimmt dabei langsam ab und erreicht meist einen konstanten Wert, welcher als

kritischer Fluss bezeichnet wird.

Abbildung 29: Lineare Abhängigkeit des Filtratflusses vom TMP

5.1.2 Bestimmung der Wiederfindungsrate in Abhängigkeit des TMP

Für die Anreicherung von Mikroorganismen aus Gewässerproben mit dem MCC 1 wurde

mit unterschiedlichen TMP gearbeitet. Hierbei sollte die Reproduzierbarkeit durch

Wiederholungsmessungen von Proben in Bezug auf den TMP und auf die

Wiederfindungsrate getestet werden. Die Prozessparameter Filtratfluss und Permeabilität

wurden ermittelt.

R2 = 0,9956

0

400

800

1200

1600

0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100

TMP [bar]

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]


46

In einem 1. Anreicherungsversuch sollten zwei Elbeproben vom 09.11.2009 mit einem

Druck von 0,075 bar filtriert werden. Es ergaben sich maximale TMP von 0,083 bar

und 0,076 bar. Die Abbildung 30 zeigt die Prozessparameter Filtratfluss, TMP und

Permeabilität als Funktion der Zeit (Tabelle A4 und A5). In der Probe Elbe 1 stieg der

Filtratfluss auf 271,4 ml/min bei einem TMP von 0,083 bar an. Die Permeabilität erreichte

ihr Maximum bei 7590 L/h m2 bar. Während der TMP annähernd gleich blieb, nahmen der

Filtratfluss um 24 % und die Permeabilität um 42 % ab. Es wurden 23% der Bakterien im

Konzentrat wiedergewonnen bei einer Anreicherungszeit von 6,3 Minuten. In der Probe

Elbe 2 stieg der Filtratfluss auf 185,4 ml/min und die Permeabilität auf 5079 L/h m2 bar

bei einem TMP von 0,076 bar an. Der Filtratfluss nahm um 11 % und die Permeabilität um

23 % ab bei einer Anreicherungszeit von 13 Minuten. Es wurden 33% der Bakterien im

Konzentrat wiedergewonnen.

Abbildung 30: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 und Elbe 2 vom 09.11.09

0 2 4 6 8 10 12 14

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

100

150

200

250

300

350

400

TMP

[bar

]

0,000

0,015

0,030

0,045

0,060

0,075

0,090

Perm

eabi

lität

[L/h

m2 b

ar]

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Zeit [min]

0 2 4 6 8 10 12 14

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

100

150

200

250

300

350

400

TMP

[bar

]

0,000

0,015

0,030

0,045

0,060

0,075

0,090

Perm

eabi

lität

[L/h

m2 b

ar]

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Filtratfluss TMPPermeabilität

Elbe 1 WFR: 23%

Elbe 2 WFR: 33%


47

In einem 2. Anreicherungsversuch sollte ebenfalls die Reproduzierbarkeit getestet werden.

Es sollten zwei Sauteichproben mit einem TMP von 0,300 bar filtriert werden. Es wurden

maximale TMP von 0,232 bar bzw. 0,340 bar erreicht. Durch eine schnellere

Überströmung der Membranoberfläche sollte eine Ablagerung von Partikeln verhindert

werden. Die Prozessdaten Filtratfluss, TMP und Permeabilität sind als Funktion der Zeit in

der Abbildung 31 dargestellt (Tabelle A6 und A7). Der TMP wurde jeweils in zwei Stufen,

nach erkennbarer Abnahme des Filtratflusses, erhöht. In der Probe Sauteich 1 zeigte sich,

dass eine Erhöhung des TMP auch eine Steigerung des Filtratflusses zur Folge hatte.

Dennoch nahm nach kurzer Zeit der Filtratfluss wieder leicht ab. Es kam zu einer

Deckschichtbildung. Bei der Probe Sauteich 2 ist gut zu erkennen, dass der Filtratfluss nach

1,7 Minuten sank, während der TMP stieg. Die Wiederfindungsrate der Bakterien in den

Konzentraten von 22 % bzw. 17 % lagen hier niedriger als im ersten Versuch. Es zeigte

sich, dass das Eluieren der Bakterien von der Membran bei einer weiteren Erhöhung des

TMP zunehmend schwieriger wird.

Abbildung 31: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und Permeabilität über die Zeit der Proben Sauteich 1 und Sauteich 2 vom 09.12.09

0 1 2 3 4

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

200

400

600

800

1000

TMP

[bar

]

0 ,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Perm

eabi

lität

[L/h

m2 b

ar]

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Zeit [m in]

0 1 2 3 4

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

200

400

600

800

1000

TMP

[bar

]

0 ,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Perm

eabi

lität

[L/h

m2 b

ar]

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000


Sauteich 1 WFR: 22 %

Sauteich 2 WFR: 17 %

↑ TMP

1. Stufe2. Stufe

1. Stufe

2. Stufe


48

In der Abbildung 32 ist der Filtratfluss als Funktion des TMP aufgetragen. Wie im

Kapitel 2.2.3 und Abbildung 4 beschrieben, hat hier eine Erhöhung des TMP keine

Erhöhung des Filtratflusses mehr zur Folge.

Abbildung 32: Filtratfluss f (TMP) vom Sauteich 1 und Sauteich 2

Da sich die Anreicherungsversuche der Proben Saubach 1 und Saubach 2 mit den

Anreicherungsversuchen der Proben Sauteich 1 und Sauteich 2 in Bezug auf den

maximalen TMP ähneln, sind diese im Anhang in der Abbildung A 1 grafisch dargestellt

und deren Prozessparameter in den Tabellen A 9 und A 10 aufgeführt.

Die Abbildung 33 zeigt die Wiederfindungsrate, den TMP und die Filtrationszeit der bisher

angereicherten Proben. Werden die Proben nach steigendem maximalen TMP aufgetragen,

ist mit dessen Zunahme von 0,076 bar auf 0,340 bar eine gleichzeitige Abnahme der

Wiederfindungsrate der Bakterien und der Filtrationszeit zu erkennen.

Konzentrationspolarisation (Abschnitt 2.4.2, Abbildung 5) und Membranfouling

(Abschnitt 2.5) verbunden mit Deckschichtkomprimierung sind wahrscheinliche Ursachen

für die Abnahme der Wiederfindungsrate der Bakterien während des

Anreicherungsprozesses. Es zeigt sich, dass der maximale TMP ausschlaggebend für die

Wiederfindung der Bakterien ist.

TMP [bar]

0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

300

400

500

600

700

800

Sauteich 1Sauteich 2


49

Proben

Elbe 2

Elbe 1

Sautei

ch 1

Sauba

ch 1

Sauba

ch 2

Sautei

ch 2

Wie

derf

indu

ngsr

ate

[%]

0

25

50

75

100

TMP

[bar

]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Zeit

[min

]

0

2

4

6

8

10

12

14

WFRTMPZeit

Abbildung 33: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit zunehmenden TMP der Proben Elbe vom 09.11.09, der Proben Sauteich und Saubach vom 09.12.09

In einem weiteren Versuch wurden vier Elbeproben vom 02.02.2010 mit unterschiedlichen

maximalen TMP filtriert. Ein maximaler TMP von 0,100 bar sollte dabei nicht

überschritten werden, da hier in den ersten Anreicherungsversuchen die WFR der

Bakterien sehr niedrig war. Um ein nahezu vollständiges Ablösen der Bakterien von der

Membran zu gewährleisten, wurde bei diesen Proben mit einer modifizierten

Spülung/Elution gearbeitet (Abschnitt 4.5.3, Tabelle 4). Eine zweite Elution wurde

durchgeführt, um zu prüfen, ob das Elutionsvolumen ausreichend war. Hier sind allerdings

Verdünnungseffekte zu erwarten. In der Abbildung 34 sind der Filtratfluss, der TMP und

die Permeabilität als Funktion der Zeit aufgetragen.


50

Abbildung 34: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

0

100

200

300

400

500

TMP

[bar

]

0,000,020,040,060,080,100,12

Perm

eabi

lität

[L/h

m2

bar]

0

1e+5

2e+5

3e+5

4e+5

5e+5

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

0

100

200

300

400

500

TMP

[bar

]

0,000,020,040,060,080,100,12

Perm

eabi

lität

[L/h

m2

bar]

0

1e+5

2e+5

3e+5

4e+5

5e+5


0 2 4 6 8 10 12 14 16

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

0

100

200

300

400

500

TMP

[bar

]

0,000,020,040,060,080,100,12

Perm

eabi

lität

[L/h

m2

bar]

0

1e+5

2e+5

3e+5

4e+5

5e+5

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

0

100

200

300

400

500

TMP

[bar

]

0,000,020,040,060,080,100,12

Perm

eabi

lität

[L/h

m2

bar]

0

1e+5

2e+5

3e+5

4e+5

5e+5

Zeit [min]

Elbe 1 WFR: 85%

Elbe 2 WFR: 92%

Elbe 3 WFR: 76%

Elbe 4 WFR: 38%


51

Die höchste Wiederfindungsrate von 92% wurde in der Probe Elbe 2 bei einem maximalen

TMP von 0,041 bar erzielt. Wird dabei nur die Cross-Flow-Mikrofiltration betrachtet und

von 100% der Zellen im Vorfiltrat ausgegangen, beträgt die Wiederfindungsrate 94 %. In

der Tabelle 6 sind die Wiederfindungsraten der einzelnen Proben Elbe 1 bis Elbe 4

aufgeführt. Bei einem maximalen TMP von 0,033 bar in der Probe Elbe 1 und bei einem

maximalen TMP von 0,064 bar in der Probe Elbe 3 sind niedrigere Wiederfindungsraten

von 85 % und 76 % zu verzeichnen. Jedoch kann aufgrund der Variabilität der

Bakterienzählung kein signifikanter Unterschied in den Proben Elbe 1 bis Elbe 3

festgestellt werden (Abbildung 35). Eine deutliche Abnahme der Wiederfindungsrate auf

38 % ist bei einem maximalen TMP von 0,103 bar zu beobachten. In der Abbildung 34 ist

bei der Probe Elbe 4 ein Störpeak zu erkennen. Dieser ist dadurch entstanden, dass die

Probenflasche kurzzeitig angehoben wurde und dieses zu einer Schwankung des

hydrostatischen Drucks führte. Generell ist darauf zu achten, dass diese Einflüsse bei der

Filtration vermieden werden.

Tabelle 6: Parameter der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10 Probe Elbe 1 2 3 4 Wiederfindung (gesamt) [%] 85 92 76 38

Wiederfindung (gesamt 2. Elution) [%] 84 93 84 40 Wiederfindung (CMF) [%] 90 94 82 40 Wiederfindung (CFM 2. Elution) [%] 89 95 90 41 Filtrationszeit [min] 5,7 9,7 15 11,3 TMP (maximale) [bar] 0,033 0,041 0,064 0,103 Anreicherung 1: 24 34 29 31 Anreicherung (2. Elution) 1: 17 19 20 17

Wird für die WFR die zweite Elution in die Berechnung mit einbezogen, zeigt sich bei den

Proben Elbe 1, Elbe 2 und Elbe 4, dass keine oder nur sehr wenige Zellen noch von der

Membran eluiert werden können. In der Probe Elbe 3 zeigt sich, dass bei diesem TMP dass

Elutionsvolumen nicht mehr ausreicht, um die Zellen nahezu vollständig von der Membran

zu eluieren. Die WFR steigt von 76% auf 84% an, wobei der Anreicherungsfaktor von 29

auf 20 abnimmt. In der Abbildung 34 ist bei dieser Probe an Hand der Prozessdaten zu

erkennen, dass sich eine zweite Deckschicht bildet (Nagata, Herouvis et al. 1989).

Die Abbildung 35 zeigt die Wiederfindungsraten, den TMP und die Filtrationszeit der

Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010. Mit zunehmendem TMP wird deutlich, dass bei


52

einem TMP kleiner als 0,041 bar die Filtrationszeit nicht weiter steigt, sondern die

Filtrationsdauer wieder abnimmt. Ein positiver Effekt ist, dass die Filtrationszeit bei einem

TMP von 0,041 bar niedriger ist als bei einem TMP von 0,103 bar. Dies kann darauf

zurückgeführt werden, dass die Deckschicht weniger an der Membranoberfläche

komprimiert und somit ein höherer Filtratfluss erreicht wird (Abbildung 34).

Proben

Elbe 1 Elbe 2 Elbe 3 Elbe 4

Wie

derf

indu

ngsr

ate

[%]

0

20

40

60

80

100

120

TMP

[bar

]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Zei

t [m

in]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

WFRTMPZeit

Abbildung 35: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit zunehmenden TMP der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10

Zusammenfassend zeigen die Versuche, dass ein optimaler TMP von maximal 0,41 bar die

beste Wiederfindungsrate liefert. Weiterhin ist eine zweite Elution bei diesem Druck nicht

notwendig, da nahezu alle der Bakterien von der Membran eluiert werden und somit ein

höherer Anreicherungsfaktor erreicht wird.

5.1.3 Bakterienkonzentration

In der Abbildung 36 sind die Bakterienkonzentrationen der Fraktionen ORI, VOR, KON

und FIL der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010 dargestellt. Es zeigt sich, dass die

Bakterienkonzentrationen der einzelnen Proben schwanken. Die Aufteilung der Probe in

die Zweilitergefäße erfolgte somit nicht homogen. Ein Grund hierfür kann die

Inhomogenität durch vorhandene Bakterienaggregate in der Probe sein.


53


Bakt

erie

nkon

zent

ratio

n [Z

ellen

/L]

0

2e+9

4e+9

6e+9

8e+9

ORI VOR KON FIL

Abbildung 36: Bakterienkonzentration der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010

Werden die Zellverluste im Vorfilter in den Proben Elbe 1 und Elbe 3 angeschaut, ist zu

erkennen, dass ein Wechseln des Vorfilters hätte stattfinden können. Hier lagen auch die

höchsten Bakterienkonzentrationen in der Originalprobe vor. Jedoch ist bei den Proben

Elbe 1 bis Elbe 3 kein wesentlicher Zellverlust aufgrund der Variabilität der

Bakterienzählung vom Original hin zum Konzentrat zu erkennen.


54

Tabelle 7: Konzentration der Bakterien in den einzelnen Fraktionen und deren prozentualer Anteil der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2009

Elbe 1 Elbe 2

Fraktion Bakterien- konzentration Anteil Bakterien-

konzentration Anteil

[Zellen/L] [%] [Zellen/L] [%]

ORI 6,78E+09 100 1,73E+09 100

VOR 6,41E+09 94 1,69E+09 97

KON 5,79E+09 85 1,59E+09 92

FIL 4,79E+09 0,7 8,61E+07 5 Vorfilter (Senke 1) 3,76E+08 6 4,91E+07 3

CFM (Senke 2) 6,19E+08 10 9,38E+07 6

Elbe 3 Elbe 4




ORI 4,25E+09 100 1,71E+09 100

VOR 3,96E+09 93 1,65E+09 97

KON 3,23E+09 76 6,54E+08 38

FIL 3,48E+07 0,8 0,00E+00 0 Vorfilter (Senke 1) 2,89E+08 7 5,57E+07 3

CFM (Senke 2) 7,30E+08 18 9,97E+08 60

5.1.4 Bakterienmorphologie

Ein wesentlicher Aspekt bei der Anreicherung von Bakterien durch die Cross-Flow-

Mikrofiltration ist die Morphologie der Bakterien. Werden wie in der Probe Elbe 4 nur

38% der Zellen wiedergewonnen, ist eine Aussage über die Zellverluste wesentlich. In der

Abbildung 37 ist die Morphologie der Zellen in den Proben Elbe 1 bis Elbe 4 über die

Fraktionen aufgetragen. Bei der Probe Elbe 4 wurden 46±9,8 % der Kokken, 35±16,6 %

der Stäbchen und 11±173 % der Spirillen wiedergewonnen. Die hohe Abweichung für die

Zählung der Spirillen ist darauf zurückzuführen, dass nur wenige Spirillen in der Probe

vorhanden waren. Es ist zweckmäßig eine höhere Anzahl dieser Bakterien zu vermessen.


55

Jedoch ist der Verlust umso höher, je komplexer die Zellen in der Probe sind. Ein Einfluss

der Zellformen auf die Wiederfindung der Bakterien war nicht zu beobachten.

Elbe 1

[Zel

len/

L]

0

1e+9

2e+9

3e+9

4e+9

5e+9 Elbe 2

0

5e+8

1e+9

2e+9

2e+95e+9

Original Vorfiltrat Konzentrat Filtrat

Elbe 3

Formklassen

Kokken Stäbchen Spirillen

[Zell

en/L

]

0

1e+9

2e+9

3e+9

4e+9

5e+9 Elbe 4

Kokken Stäbchen Spirillen0

5e+8

1e+9

2e+9

2e+95e+9

Abbildung 37: Morphologie der Bakterien Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10

5.1.5 Biomasse und Biovolumen

Werden z. B. für Mikrokosmen-Experimente die aufkonzentrierten Bakterien eingesetzt, ist

für die Bilanzierung der Kohlenstoffgehalt von Interesse. Nachfolgend sind die

Biovolumina (Abbildung 38) und die Biomasse (Abbildung 39) der Proben Elbe 1 bis Elbe

4 vom 02.02.10 dargestellt. Ändert sich durch den Anreicherungsprozess die Morphologie

der Bakterien im Konzentrat, so findet eine Ab- bzw. Zunahme der Biomasse und des

Biovolumens statt. Bei der Probe Elbe 3 ist zu erkennen, dass die Biomasse in der Fraktion

Original geringer ist als in den anderen Fraktionen. Hier wurden mehr Kokken als

Stäbchen gezählt (Abbildung 37) und somit verringern sich das Biovolumen sowie die

Biomasse (Abbildung 38, Abbildung 39).


56

Abbildung 38: Biovolumen der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1 bist Elbe 4 vom 02.02.2010


Biom

asse

[mgC

/L]

0,000,020,040,060,080,100,120,140,160,18

ORI VOR KON FIL

Abbildung 39: Biomasse der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1 bist Elbe 4 vom 02.02.2010

5.2 Bestimmung der Bakterienzahl durch die Proteinbestimmung

Es wurde untersucht, ob eine Proteinbestimmung die aufwendige Bakterienzählung

ersetzen kann. Da eine einfache Trübungsmessung zur Bestimmung der Bakterienzahl

nicht ausreicht, wurde eine photometrische Proteinbestimmung nach Bradford

durchgeführt. Das Zählen der Bakterien durch eine photometrische Proteinbestimmung zu

ersetzen war nicht möglich, da schon der Proteingehalt der aufkonzentrierten Proben unter

der Bestimmungsgrenze (BG=2,90 µg/ml) der Proteinbestimmung von 1-100 µg/ml lag


Biov

olum

en [m

m3 /L

]

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

ORI VOR KON FIL


57

(Tabelle 8). Die Bestimmungsgrenze kann durch eine Kalibrierung im Bereich von 1-

5 µg/ml zwar verbessert und die Empfindlichkeit durch eine 5 cm Küvette erhöht werden,

jedoch würde es zu keinen Ergebnissen in den Fraktionen Original und Vorfiltrat führen.

Aus diesem Grund kann eine Bestimmung der Bakterienzahl durch eine Bestimmung der

Proteinkonzentration nicht ersetzt werden.

Tabelle 8: Proteingehalte in den Konzentraten der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010

Proben Proteingehalt [µg/ml] Zellen im Konzentrat

Elbe 1 1,04 1,18E+13

Elbe 2 1,60 3,07E+12

Elbe 3 1,70 6,43E+12

Elbe 4 1,80 1,32E+12

5.3 Spül- und Desinfektionsverfahren des Filtrationsmoduls

Um zu prüfen, ob sich die Filtrationseinheit mittels Spülung reinigen bzw. sterilisieren lässt,

wurde mit verschiedenen Reinigungslösungen gearbeitet. Es wurde nach der Reinigung eine

Aufkonzentrierung mit steril filtriertem autoklavierten Reinstwasser als Blindwert

durchgeführt. Danach wurden die Biolog-Mikrotiterplatten mit diesen Blindwerten

beimpft. Das empfohlene Spül- und Desinfektionsverfahren mit der 0,5 %igen alkalischen

Detergenzlösung Hellmanex II ist für Umweltproben nicht ausreichend. Zum Einen ist bei

einigen Proben eine sichtbare Färbung der Hohlfasern im Filtrationsmodul zu erkennen

und zum Anderen lagert sich Biofilm auf der Membran ab. Durch eine Modifizierung

konnte dies verbessert werden. Eine Reinigung mit 70 % Ethanol und 1 %

Wasserstoffperoxid zeigt noch eine AWCD von 0,1 im Konzentrat (Abbildung 40). Die

Reinigung mit 0,05 %iger aktiver Natriumhypochloritlösung ist am zweckmäßigsten. Somit

sollte eine Reinigung mit dieser Lösung stattfinden und das Modul anschließend wieder mit

der 0,5 %igen alkalischen Detergenzlösung Helmanex II regeneriert werden.


58

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2Hellmanex IIEthanol, WasserstoffperoxidNatriumhypochlorid

Abbildung 40: Grafische Darstellung der Blindwerte der Fraktion Konzentrat mit den verschiedenen Reinigungslösungen

5.4 Auswirkung der Anreicherungsprozesse auf die

Substratverwertung

5.4.1 Die durchschnittliche Farbentwicklung der einzelnen Fraktionen der Proben

Für jeden Anreichungsprozess wurden die einzelnen Fraktionen ORI, VOR, KON und

FIL jeder Probe in die Biolog-Mikrotiterplatten pipettiert. Wird die durchschnittliche

mittlere Farbentwicklung (AWCD) als Parameter der Substratverwertung über die Zeit

betrachtet, ist grundsätzlich während bzw. nach der Lag-Phase eine höhere AWCD in den

Konzentraten zu erkennen (Abbildung 41, Abbildungen A2-A4). Im weiteren Verlauf steigt

die AWCD bzw. die Substratverwertung im KON weniger stark an als in ORI und VOR.

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2ORI 1VOR 1KON 1FIL 1

Abbildung 41: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit in den Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Probe Elbe 1 vom 02.02.10


59

Da die höchsten WFR bei den Proben Elbe 1 bis Elbe 3 vom 02.02.10 gefunden wurden,

werden nachfolgend nur noch diese betrachtet. Bei diesen Versuchen nimmt die Steigung

der AWCD im Konzentrat schneller ab als im Original. Ein frühzeitiger Substratverbrauch

und ein eventueller Sauerstoffmangel durch die hohe Bakteriendichte am Boden der

Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten können die Ursache sein. Die Abbildung 42

zeigt den Verlauf der AWCD der einzelnen Fraktionen der drei Elbeproben. Um die

Bakteriengemeinschaft aller Fraktionen zu vergleichen, wäre es daher angemessen, das

Konzentrat um den Anreicherungsfaktor zu verdünnen.

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2ORI VOR KONFIL

Abbildung 42: Grafische Darstellung der AWCD der Proben Elbe 1 bis Elbe 3 vom 02.02.10 und deren Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL

Eine Einteilung der 31 Substrate in die 6 Substratklassen nach Insam (Kapitel 4.6,

Tabelle 5) zeigt Unterschiede in der AWCD zwischen Original und Vorfiltrat mit dem

Konzentrat. Im Filtrat findet keine oder eine sehr geringe Farbentwicklung statt. In den

Abbildungen 43, A5 und A6 sind die Farbentwicklungen der 6 Substratklassen über die

AWCD aufgetragen. Deutlich wird hier, dass die AWCD im Konzentrat geringer ist als im

Original und im Vorfiltrat. Die Substratgruppen Polymere und Kohlenhydrate weisen

einen hohen Umsatz auf und liegen über den Aminosäuren und Karbonsäuren. Die

Substrate aus der Gruppe der phenolischen Verbindungen weisen hierbei den geringsten

Umsatz auf. Die Substratgruppe Amine zeigt zu einem späteren Zeitpunkt einen hohen

Umsatz.


60

ORI 1Fa

rben

twick

lung

(OD

kor 5

95) d

er e

inze

lnen

Sub

tratk

lasse

n

0,00,20,40,60,81,01,21,4

VOR 1

0,00,20,40,60,81,01,21,4

KON 1

0,00,20,40,60,81,01,21,4

FIL 1

Mittelwert der Farbentwicklung (ODkor 595)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0,00,20,40,60,81,01,21,4

Amine Aminosäuren Kohlenhydrate Karbonsäuren Polymere Phenolische Verbindungen

Abbildung 43: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10


61

Werden die Farbentwicklungen für die einzelnen Substrate betrachtet, benötigen sie

unterschiedliche Inkubationszeiten bis ein erster Umsatz durch beginnende

Farbentwicklung angezeigt wird. Die einzelnen Substrate der Proben Elbe 1 bis Elbe 3 sind

in den Abbildungen A 7 bis A 18 dargestellt.

Mit Hilfe der normalisierten Daten (Kapitel 4.6.3) wurde für die Fraktionen Original und

Konzentrat der Probe Elbe 2 vom 02.02.10 mit dem Programm Statistika eine

Clusteranalyse durchgeführt, welche die AWCD der 31 Substrate vergleicht und zu

Gruppen zusammenfasst (Abbildung 44, Abbilung 45). Hierbei wurde die Ward-Methode

(Otto 1997), (Einax, Zwanziger et al. 1997) genutzt. Es sind jeweils zwei Hauptcluster zu

erkennen. Die Distanz des Gesamtclusters im Original beträgt 185, wobei die Distanz im

Konzentrat nur noch 108 beträgt. Die Abnahme der Distanz weist auf eine größere

Ähnlichkeit der AWCD der einzelnen Substrate im Konzentrat hin und somit auf einen

höheren Anteil verwertungsfähiger Bakterien. In der Tabelle 9 sind die zwei Hauptcluster

der Fraktionen Original und Konzentrat gegenübergestellt. Die Substrate L-Arginin, D-

Galcton-Säure γ-Lacton und Glucose-1-Phosphat werden in den beiden Fraktionen

unterschiedlichen Gruppen zugeordnet.

Eine Übereinstimmung dieser Gruppen mit den Substratklassen nach Insam ist nicht zu

erkennen, da die Substrate in den einzelnen Klassen verschieden verwertet werden.

Bei der Interpretation dieser Ergebnisse ist darauf zu achten, dass diese Methode kein

in situ Verfahren darstellt. Die Farbentwicklung auf den Platten ist somit auch durch ein

Wachstum der Bakterien auf den Platten beeinflusst. Es können nur Zellen zur

Auswertung beitragen, die auf flüssigem Medium wachsen, oder zumindest ihren

Stoffwechsel aufrecht erhalten können. Der auf den Platten vollzogene Substratumsatz

wird hauptsächlich durch Organismen beeinflusst, die in der Lage sind, unter den auf der

Platte herrschenden Bedingungen schnell zu wachsen (Degens & Harris 1997).

Die Biolog-Methode sollte daher hauptsächlich dafür eingesetzt werden, verschiedene

Gemeinschaften miteinander zu vergleichen, anstatt direkte Schlussfolgerungen auf die im

Habitat tatsächlich geleisteten Umsätze zu ziehen (Konopka, Oliver et al. 1998).


62

Abbildung 44: Baumdiagramm der Fraktion Original der Probe Elbe 2

Abbildung 45: Baumdiagramm der Fraktion Konzentrat der Probe Elbe 2


63

Tabelle 9: Hauptcluster der Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 Hauptcluster 1

Original Hauptcluster 1

Konzentrat Hauptcluster 2

Original Hauptcluster 2

Konzentrat β-methyl-D-Glucosid β-methyl-D-Glucosid Methylpyruvat Methylpyruvat

D-Cellobiose D-Cellobiose α-Cyclodextrin α-Cyclodextrin

α-D-Lactose α-D-Lactose Tween 80 Tween 80

L-Asparagin L-Asparagin Putrescin Putrescin

L-Serin L-Serin D-Apfelsäure D-Apfelsäure N-acetyl-D-Glukosamin

N-acetyl-D-Glukosamin D-Xylose D-Xylose

Tween 40 Tween 40 4-Hydroxy-Benzoat

4-Hydroxy-Benzoat

D-Galakturonsäure D-Galakturonsäure Itaconsäure Itaconsäure

D-Mannitol D-Mannitol Phenyl- Ethylamin

Phenyl- Ethylamin

Glycogen Glycogen i-Erythritol i-Erythritol

Glycyl-L-Glutaminsäure


D, L-α-Glycerolphosphat

D, L-α-Glycerolphosphat

2-Hydroxy-Benzoat

2-Hydroxy-Benzoat

L-Phenylalanin L-Phenylalanin γ-Hydroxy-

Buttersäure γ-Hydroxy- Buttersäure

D-Glukosaminsäure

D-Glukosaminsäure

L-Threonin L-Threonin α-keto-Glutarsäure α-keto-Glutarsäure

L-Arginin _ _ L-Arginin D-Galactonic- Säure γ-Lacton _ _ D-Galacton-

Säure γ-Lacton _ Glucose-1-

Phosphat Glucose-1- Phosphat

_

Bei der Aufbereitung der Daten durch die Hauptkomponentenanalyse mit dem Programm

Statistika konnten durch die ersten vier der dabei festgelegten Achsen für die Fraktion

Original 98 % und für die Fraktion Konzentrat 99 % der Gesamtvarianz erklärt werden

(Tabelle 12). Die ersten zwei Achsen erklärten dabei bereits 68,9 % bzw. 75,4 % der

Gesamtvarianz. Weiterhin wurde ein U-Test nach Wilcoxon, Mann und Whitney mit dem

Programm SigmaPlot durchgeführt (Sachs 1993). Nach der Durchführung wurde


64

festgestellt, dass kein signifikanter Unterschied in den Fraktionen Original und Konzentrat

vorliegt. Eine Veränderung der Originalprobe durch den Anreicherungsprozess hat somit

nicht stattgefunden, lediglich die Anzahl an verwertenden Zellen hat zugenommen und

tragen somit zu einem anfänglich schnelleren Wachstum bei.

Tabelle 10: Einzel- und Gesamtvarianz der Hauptkomponentenanalyse der Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 vom 02.02.10

Achsen Varianz [%] Original 2

Varianz [%] Konzentrat 2

Achse 1 47,35 53,47

Achse 2 21,53 21,95

Achse 3 19,34 17,09

Achse 4 9,53 6,33

Gesamtvarianz 97,8 98,8

Zusammenfassung und Ausblick

65

6 Zusammenfassung und Ausblick

Für Kultivierungen, Mikrokosmen-Experimente oder biochemische Analysen mit

Mikroorganismen aus Gewässerproben sollten die vorhandenen Zellen aufkonzentriert

werden, um eine ausreichende Nachweisempfindlichkeit und hinreichend repräsentative

Messergebnisse zu erreichen.

In der vorliegenden Arbeit wurde getestet, ob der Munich Cell Concentrator 1 für die

Anreicherung von Mikroorganismen aus Gewässerproben geeignet ist. Es wurden jeweils

Gewässerproben von 2 Liter auf 50-100 ml aufkonzentriert. Dabei konnte gezeigt werden,

dass der optimale maximale Transmembrandruck bei 0,041 bar liegt. Weiterhin hat sich

eine modifizierte Spülung als geeignet erwiesen. Es konnte eine Wiederfindungsrate von

92±12 % erzielt werden.

Für die Vorfiltration wurde ein Filtersystem mit einem Oberteil aus Polypropylen, dem

Unterteil aus Trogamid und dem Filtermodul aus Nylon 50 µm verwendet und erwies sich

als geeignet. Bei Proben mit einem hohen Partikelgehalt sollte jedoch das Filtermodul

während der Vorfiltration gewechselt werden, um so Zellverluste zu vermeiden.

Da in der vorliegenden Arbeit Proben mit einem Volumen von 2 Liter getestet wurden,

sollte in einer weiterführenden Arbeit geprüft werden, inwieweit sich ein

Anreicherungsprozess mit einem größeren Volumen auf die Wiederfindungsrate auswirkt.

Andernfalls kann bei der gleichen Probe eine Elution erfolgen und das Filtrationsmodul

ohne Regenerierung wieder verwendet werden. Dieser Vorgang kann solange wiederholt

werden, bis die gewünschte Anzahl an Bakterien erreicht ist bzw. das gewünschte Volumen

filtriert wurde.

Weiterhin sind Versuche mit einem Filtrationsmodul geplant, dessen

Hohlfaserinnendurchmesser 1 mm beträgt. Eine Verbesserung zur Regelung TMP kann

durch ein Spindelventil erreicht werden.

Für die Elution der Bakterien von der Membran des Filtrationsmoduls hat sich eine

modifizierte Spülung/Elution als geeignet erwiesen. Die periodische Spülung mit

Ruhezeiten, beginnend mit der Rückwärtsspülung, sorgt für ein nahezu vollständiges

Ablösen der Bakterien von der Membran. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine zweite

Elution bei einem optimalen maximalen TMP nicht notwendig ist, da sich bei der ersten

Elution nahezu alle Zellen von der Membran lösen.

Zusammenfassung und Ausblick

66

Bei der Optimierung des Spül- und Desinfektionsverfahrens hat sich gezeigt, dass eine

0,05 %ige aktive Natriumhypochloritlösung mit einer anschließenden Regenerierung mit

dem Detergenz Hellmanex II die gewünschte Reinigung erzielt.

Mit Hilfe der Biolog-Methode und der Aufbereitung der Daten und die Durchführung

einer Cluster- und der Hauptkomponentenanalyse konnte festgestellt werden, dass keine

oder eine nur sehr geringe Änderung der Bakterienzusammensetzung hinsichtlich des

metabolischen Potentials stattgefunden hat. Es hat sich gezeigt, dass lediglich die Zahl der

verwertungsfähigen Bakterien durch den Anreicherungsprozess zugenommen hat. Hier

kann die Aussage getroffen werden, dass die Vitalität der Zellen nicht wesentlich durch den

Anreicherungsprozess beeinflusst wird. Eine weitere Möglichkeit die Vitalität der

Bakteriengemeinschaft im Original und im Konzentrat zu vergleichen ist, das Konzentrat

um den Anreicherungsfaktor zu verdünnen und die Biolog-Mikrotiterplatten so zu

beimpfen. Hier sollte eine nahezu gleiche Farbentwicklung der einzelnen Substrate

stattfinden. Weiterhin soll bei einem weiteren Versuch eine Sauerstoffmessung mittels

Mikrosensor in den Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten stattfinden, um eine

Hemmung des Bakterienwachstums durch den Sauerstoffverbrauch zu ermitteln.

Die Bestimmung der Vitalität der Zellen kann durch die Messung des ATP

(Adenosintriphosphat)-Gehaltes im Original und im Konzentrat erfolgen. Hier sollte das

Konzentrat mit dem Anreicherungsfaktor verdünnt werden. ATP ist das Molekül, das in

den Zellen aller Lebewesen Energie transportiert, sozusagen ist es die Indikatorsubstanz

für das Leben. In toten Zellen wird es sofort abgebaut. Die Menge an ATP in einer

Umweltprobe spiegelt die aktive Biomasse darin wieder (Karl 1980).

Eine geeignete Methode zur Zählung und zur Bestimmung der Vitalität der Bakterien ist

die Confocale Laser Scanning Microskopie. Die Probe wird, wie in Kapitel 4.5.1

beschrieben, filtriert, nur dass hier eine gezielte Färbung mit Syto 9 und PI

(Propidiumiodid) durchgeführt wird. Die Auswertung erfolgt hier mit Hilfe einer Software

und erspart das mühsame Zählen der Zellen am Epifluoreszenzmikroskop.

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67

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Anhang

i

8 Anhang

Tabelle A 1: Chemikalien zur Reinigung des Filtrationsmoduls Chemikalien empfohlen bedingt anwendbar

Essigsäure (5 %) x

Ammoniumhydroxid x

Benzol x

Amylalkohol x

Borsäure x

Brine (beinahe gesättigte Kochsalzlösung) x

Butylalkohol x

Chloroform x

Cyclohexan x

Dichlormethan x

Ethylalkohol (15 %) x

Ethylalkohol (95 %) x

Ethylenglykol x

Isobutylalkohol x

Isopropanol x

Isobutylalkohol x

Methylalkohol x

Pentan x

Phenol (0,5 %) x

Phenol (10 %) x

Phosphorsäure (25 %) x

Kaliumhydroxid (25-50 %) x

Propanol x

Natriumhydroxid (0,5 N) x

Natriumhypochloritlösung (500 ppm) x

Salzsäure (5-25 %) x

Schwefelsäure (5 %) x

Wasser x

Anhang

ii

Tabelle A 2: Kalibrierdaten der Proteinbestimmung nach Bradford

cP OD 450 OD 450 OD 590 OD 590 MW OD 450

MW OD 590

OD 590/450

[µg/ml]

0 0,7307 0,4524 0,7307 0,4524 0,6191

1 0,7169 0,7199 0,4574 0,4623 0,7184 0,45985 0,6401

10 0,698 0,6945 0,5619 0,5536 0,69625 0,55775 0,8011

50 0,5859 0,5937 0,8804 0,8875 0,5898 0,88395 1,4987

100 0,5047 0,487 1,1655 1,1763 0,49585 1,1709 2,3614

Tabelle A 3: TMP, Filtratfluss, Querstromgeschwindigkeit und Permeabilität des druckkontrollierten Bereichs des Filtrationsaufbaues mit deionisiertem Wasser

TMP [bar]

Filtratfluss [ml/min]

Querstromgeschwindigkeit [L/h· m2]

Permeabilität [L/h m2 bar]

0,013 312,8 0,313 39553

0,022 381,0 0,381 28468

0,033 512,4 0,512 25524

0,043 615,3 0,615 23522

0,058 779,1 0,779 22081

0,072 940,7 0,941 21477

0,086 1146 1,15 21899

Anhang

iii

Tabelle A 4: Prozessparameter Elbe 1 vom 09.11.2009 Zeit [min]


TMP [bar]


0,1 161,9 0,04 6049

0,2 184,7 0,04 7590

0,3 255,4 0,08 5524

0,7 271,4 0,08 5870

1,0 267,7 0,07 6568

1,3 261,4 0,07 6052

1,7 260,7 0,07 5791

2,0 256,6 0,08 5624

2,3 254,2 0,08 5223

2,7 250,8 0,08 5153

3,0 249,2 0,08 5185

3,3 246,0 0,08 5119

3,7 242,4 0,08 4981

4,0 240,2 0,08 4875

4,3 233,9 0,08 4689

4,7 233,4 0,08 4679

5,0 233,4 0,08 4623

5,3 223,7 0,08 4484

5,7 220,2 0,08 4469

6,0 218,6 0,08 4436

6,3 207,2 0,07 4731

Anhang

iv



TMP [bar]


0,2 117,9 0,053 3657

0,5 121,5 0,055 3631

0,8 138,2 0,059 3850

1,2 138,3 0,062 3667

1,5 159,9 0,071 3702

1,8 171,2 0,076 3703

6,2 177,5 0,073 3997

7,2 177,1 0,075 3882

8,5 174,9 0,073 3938

9,7 185,4 0,06 5079

10,8 165,5 0,071 3832

11,0 155,5 0,065 3933

12,0 162,5 0,067 3987

13,0 165,7 0,064 4256

Tabelle A 6: Prozessparameter Sauteich 1 vom 09.12.2009 Zeit [min]


TMP [bar]


0,2 391,9 0,091 7079

0,3 391,9 0,092 7002

0,7 385,5 0,09 7041

1,0 383,1 0,093 6772

1,3 378,2 0,099 6280

1,7 372,9 0,098 6255

2,0 370,4 0,105 5799

2,3 502,4 0,139 5941

2,7 495,1 0,144 5652

3,0 486,4 0,148 5402

3,3 549,4 0,215 4201

3,7 637,4 0,225 4657

4,0 634,1 0,232 4493

Anhang

v

Tabelle A 7: Prozessparameter Sauteich 2 vom 09.12.2009 Zeit [min]


TMP [bar]


0,2 449,6 0,112 6599

0,3 445,2 0,121 6048

0,7 439,1 0,124 5821

1,0 610,1 0,200 5015

1,3 605,1 0,211 4714

1,7 763,9 0,281 4469

2,0 762,8 0,301 4166

2,3 746,3 0,318 3858

2,7 748,1 0,340 3617

Tabelle A 8: Prozessparameter Saubach 1 vom 09.12.2009 Zeit [min]


TMP [bar]


0,2 598,4 0,209 4707

0,3 595,9 0,214 4577

0,7 578,1 0,224 4242

1,0 577,3 0,243 3905

1,3 556,6 0,252 3631

1,7 552,9 0,265 3430

2,0 528,2 0,27 3216

2,3 525 0,283 3050

2,7 516 0,294 2885

3,0 506 0,302 2754

3,3 509,4 0,318 2633

Anhang

vi

Tabelle A 9: Prozessparameter Saubach 2 vom 09.12.2009 Zeit [min]


TMP [bar]


0,2 726,1 0,110 10851

0,3 727,9 0,114 10496

0,7 726,6 0,117 10209

1,0 722,7 0,121 9818

1,3 718,7 0,127 9303

1,7 705,9 0,132 8791

2,0 963,7 0,182 8704

2,3 964,0 0,200 7923

Abbildung A 1: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP, Permeabilität über die Zeit

0 1 2 3 4

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

200

400

600

800

1000

TMP

[bar

]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Perm

eabi

lität

[L/h

m2 b

ar]

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Zeit [min]

0 1 2 3 4

Filtr

atflu

ss [m

l/m

in]

200

400

600

800

1000

TMP

[bar

]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Perm

eabi

lität

[L/h

m2 b

ar]

2000

4000

6000

8000

10000

12000


Saubach 1 WFR: 20 %

Saubach 2 WFR: 18 %

Anhang

vii

Tabelle A 10: Parameter der Proben Saubach 1 und 2

Probe Saubach 1 2

Anreicherung (soll) 1: 22 29

Wiederfindung [%] 20 18

Filtrationszeit [min] 3,3 2,3

TMP (mittlere) [bar] 0,261 0,318

TMP (maximale) [bar] 0,138 0,200

Filtratfluss (mittlere) [ml/min] 549,4 782

Permeabilität (mittlere) [L/h m2 bar] 3548 9512



TMP [bar]


0,2 275,0 0,001 452055

0,3 280,2 0,001 460603

0,7 279,0 0,002 229315

1,0 287,1 0,003 157315

1,3 307,4 0,004 126329

1,7 347,9 0,011 51990

2,0 376,0 0,014 44149

2,3 390,0 0,020 32055

2,7 399,0 0,025 26236

3,0 393,9 0,026 24904

3,3 392,6 0,028 23049

3,7 391,0 0,029 22163

4,0 387,8 0,030 21249

4,3 383,5 0,031 20336

4,7 384,7 0,032 19762

5,0 382,5 0,033 19054

5,3 365,2 0,031 19365

5,7 364,3 0,030 19962

Anhang

viii

Tabelle A 12: Parameter der Proben Elbe 1 und Elbe 2 Elbe 1 Elbe 2




Original 4,75E+09 100 4,75E+09 100

Vorfiltrat 4,69E+09 99 4,65E+09 98

Konzentrat 1,08E+09 23 1,56E+09 33

Permeat 4,53E+08 10 2,74E+07 1 Vorfilter (Senke 1) 6,96E+07 1 1,09E+08 2

CFM (Senke 2) 3,15E+09 66 3,06E+09 64

Elbe 2

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2ORIVOR KON FIL

Abbildung A 2: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Probe Elbe 2 vom 09.11.2009

Anhang

ix

Sauteich 1

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2ORI 1 VOR 1KON 1FIL 1

Sauteich 2

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

ORI 2 VOR 2KON 2FIL 2

Saubach 1

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Saubach 2

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Abbildung A 3: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Sauteich und Saubach vom 09.12.2009

Anhang

x

Elbe 1

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Elbe 2

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Elbe 3

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Elbe 4

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

AW

CD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Abbildung A 4: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010

Anhang

xi

ORI 2Fa

rben

twick

lung

(OD

kor 5

95) d

er e

inze

lnen

Sub

tratk

lasse

n

0,00,20,40,60,81,01,21,4

VOR 2

0,00,20,40,60,81,01,21,4

KON 2

0,00,20,40,60,81,01,21,4

FIL 2

AWCD (ODkor 595)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0,00,20,40,60,81,01,21,4


Abbildung A 5: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10

Anhang

xii

ORI 3Fa

rben

twick

lung

(OD

kor 5

95) d

er e

inze

lnen

Sub

tratk

lasse

n

0,00,20,40,60,81,01,21,4

VOR 3

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

KON 3

0,00,20,40,60,81,01,21,4

FIL 3

Mittelwert der Farbentwicklung (ODkor 595)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0,00,20,40,60,81,01,21,4


Abbildung A 6: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10

Anhang

xiii

ß-methyl-D-Glucosid

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Galacton Säure γ-Lacton

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Arginin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Methylpyruvat

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Xylose

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Galakturonsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Asparagin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tween 40

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

ORI 1VOR 1KON 1FIL 1

Abbildung A 7: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10

Anhang

xiv

i-Erythritol

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2-Hydroxy-Benzoat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Phenylalanin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tween 80

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Mannitol

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

4-Hydroxy-Benzoat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Serin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-Cyclodextrin

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xv

N-acetyl-D-Glukosamin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

γ-Hydroxy-Buttersäure

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Threonin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Glycogen

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D- Glukosaminsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Itaconsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Cellobiose

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xvi

Glucose-1-Phosphat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-keto-Glutarsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Phenyl-Ethylamin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-D-Lactose

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D,L- α-Glycerolphosphat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Apfelsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Putrescin

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xvii


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Arginin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Methylpyruvat

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Xylose

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Galakturonsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Asparagin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tween 40

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xviii

i-Erythritol

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2-Hydroxy-Benzoat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Phenylalanin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tween 80

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Mannitol

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

4-Hydroxy-Benzoat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Serin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-Cyclodextrin

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xix


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Threonin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Glycogen

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D- Glukosaminsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Itaconsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Cellobiose

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xx

Glucose-1-Phosphat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Phenyl-Ethylamin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-D-Lactose

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Apfelsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Putrescin

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xxi


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Arginin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Methylpyruvat

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Xylose

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Galakturonsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Asparagin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tween 40

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xxii

i-Erythritol

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2-Hydroxy-Benzoat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Phenylalanin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tween 80

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Mannitol

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

4-Hydroxy-Benzoat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Serin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-Cyclodextrin

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xxiii


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

L-Threonin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Glycogen

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D- Glukosaminsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Itaconsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Cellobiose

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



Anhang

xxiv

Glucose-1-Phosphat

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Phenyl-Ethylamin

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

α-D-Lactose

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0


0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

D-Apfelsäure

0 20 40 60 80 100

OD

kor

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Putrescin

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100O

D k

or

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0



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