QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

QCWS 参考プロトコル

抗 HLA 抗体検査（FlowPRA）

2019 年度版

作成者

日本組織適合性学会 認定制度委員会 ワーキンググループ

抗 HLA抗体 WG

QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

制定・改訂履歴

版

数

制 定 日 制定理由

作成

責任者 施 行 日

初

版

日本組織適合性学会が開催する QCWS での HLA 検

査を実施する際に用いる QCWS 参考プロトコルと

して制定した。

WG

版

数

改 訂 日 改訂理由 改訂内容

改訂

責任者 施 行 日

２ 2019 年 9月１日

表記の統一

記載ミス

「HLA抗体」を「抗 HLA 抗

体」の表記に変更

DTT処理での回転数 WG

QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

目 次

１．FlowPRA製品概要 ............................................................ 1

１．１ FlowPRA の使用目的・原理 .............................................. 1

１．２ FlowPRA の種類 ........................................................ 2

２．検査の準備 .................................................................. 3

２．１ 検査機器の準備・キット内容・検体処理 .................................. 3

２．２ 検体の処理 ............................................................ 5

２．３ 検査の手順 ............................................................ 6

３． FlowPRA Screening Test のフローサイトメーター条件設定 .................... 10

３．１ FSC vs. SSC .......................................................... 10

３．２ FL2 vs. FSC .......................................................... 10

３．３ FL1ヒストグラム ..................................................... 11

3.3.1 NC血清を流す意義 ................................................... 11

3.3.2 PC血清を流す意義 ................................................... 11

3.3.3 コントロールビーズを流す意義 ........................................ 11

３．４ コンペンセーションの調整（蛍光補正） ................................. 12

４． マーカー設定の考え方 ..................................................... 12

５． FlowPRA Screening Test データ例 ......................................... 13

５．１ Class I & II、コントロールビーズと NC血清を反応させた場合のヒストグラム

............................................................................. 13

５．２ Class I ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム .................. 14

５．３ Class II ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム ................. 15

６． 機器設定の重要性 ......................................................... 16

FlowPRA Screening Test ケーススタディー【1】 ................................... 16

FlowPRA Screening Test ケーススタディー【2】 ................................... 17

日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例 .................................... 18

1

QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

１．FlowPRA製品概要

１．１ FlowPRA の使用目的・原理

FlowPRA は、フローサイトメーターを使用して血清中の抗 HLA 抗体を検出する為の研究用試

薬で、精製した HLA 抗原がコーティングされたマイクロビーズである。高感度に抗 HLA抗体

を検出する事ができる。

FlowPRAビーズと血清を反応後、FITC標識抗ヒト IgG 抗体で染色し、フローサイトメーター

により蛍光強度を測定し、抗 HLA抗体を検出する。

※本図における「HLA抗体」とは「抗 HLA 抗体」の事を示す

2

QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

１．２ FlowPRA の種類

FlowPRAは FlowPRA Screening、FlowPRA Specific、FlowPRA Single Antigen の 3種類のキ

ットがある。FlowPRA Screening： 1ビーズに 1パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており、

抗 HLA抗体の有無及び％PRA*を確認できる。Class I、Class II用キットがあり、各 30種類

のビーズで全 HLA 抗原を網羅している。

1. FlowPRA Specific：1 ビーズに 1 パネルセル由来の HLA 抗原が結合しており、抗 HLA

抗体の有無、％PRA とおよその特異性を確認できる。各 32 種類の抗原ビーズで全 HLA

抗原を 100%網羅している。ClassI、ClassII 用キットがあり、8 色のビーズと 1 つの

コントロールビーズが予め混合しているバイアルが 4本入っている。

2. FlowPRA Single Antigen：1ビーズに対しリコンビナント HLA抗原が 1 種類のみ結合

しており、抗 HLA 抗体の抗原特異性が分かる。

* %PRA（Panel Reactive Antibody）：全パネル細胞の何％が陽性となるかの値。%PRA が高い程、様々な抗原に対

する抗体を保有している指標となる。

3

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２．検査の準備

２．１ 検査機器の準備・キット内容・検体処理

2.1.1 検査器具・資材の準備

機器 名称

フローサイトメーター

器具・資材 1.5 mL マイクロ遠心チューブ

1.5 mL マイクロ遠心チューブ用高速遠心機 （8,000-10,000 g が出せるもの）

ボルテックスミキサー

シェーカー

P-10 マイクロピペット・チップ

P-20 マイクロピペット・チップ

P-200 マイクロピペット・チップ

P-1000 マイクロピペット・チップ

50 mL ファルコンチューブ

プラスチック製ディスポピペット(先端ができるだけ細いもの） ※参考商品 1-4654-05 ピペット E-231（アズワン）

蒸留水（または精製水）

タイマー

アルミホイル

キムタオル

FACS チューブ

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2.1.2 キット内容と保存方法

未開封のキットは、-65℃以下で有効期限まで保存できる。一度解凍したあとの保存方法と

有効期限は下記のとおりである。

商品コー

ド キット内容 保存と有効期限

1検体あたりのビーズ使用

量

FL1-30

FlowPRA Class I ビー

ズ

10×Wash buffer

100×FITC anti-human

IgG

受領後、キットの箱を開封せずに使

用時まで-80℃～-65℃のフリーザー

に保管。製品は、この状態で保存期

間内は安定である（箱に記載された

有効期限を参照）。初回使用後およ

び/または製品の解凍後は、試薬を

2℃～5℃に保管する。一度解凍した

FlowPRA ビ ー ズ ま た は FITC

conjugated F(ab')2 anti-human IgG

は再凍結しない。解凍したビーズは、

3 ヵ月、または有効期限が 3 ヵ月以

内の場合はその有効期限まで 2℃～

5℃に保管する。Wash Buffer または

FITC conjugated F(ab')2 anti-

human IgG は、12ヵ月、または有効

期限が 12 ヵ月以内の場合はその有

効期限まで 2℃～5℃に保管する。

5 µL

FL2-30

FlowPRA Class II ビー

ズ

10×Wash buffer

100×FITC anti-human

IgG

5 µL

FL12-60

FlowPRA Class I ビー

ズ

FlowPRA Class II ビー

ズ

10×Wash buffer

100×FITC anti-human

IgG

5 µL + 5

µL

2.1.3 他に必要な試薬

商品コード 商品名 梱包単位 1検体あたりの血

清使用量

FL1-PC FlowPRAクラス IPC血清 10 tests 20 µL

FL2-PC FlowPRAクラス IIPC 血清 10 tests 20 µL

FL-NC FlowPRA クラス I & クラス IINC血

清

10 tests 20 µL

FLCNTBD FlowPRA コントロールビーズ 10 tests 1 µL

製品コード 品名 容量 1検体の使用量

LS-NC FlowPRA negative control serum 400 uL（20test） 20 uL

LS-AB2 FITC conjugatedgoat anti human

IgG

0.5 mg

（約 1000test）

×100 Stock を

1 uL

― PBS － －

5

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２．２ 検体の処理

2.2.1 検体前処理（必須）

1. 血清は必ず凍結融解する。融解後は、しっかり転倒混和を行ってから遠心を行う。（8,000

～10,000 g、10分間以上）。不純物が多い検体は遠心速度、時間を増やす。バックグラウ

ンドが高くなるため、血漿の使用は推奨しない。

2. 遠心後、上層、下層および壁面に凝固物が存在する可能性があるので、慎重に中間層か

ら検体を回収して使用する。

2.2.2 再検査の為の検体処理（QCWS部会推奨）

1. 非特異シフトが見られる場合：非特異物質の吸着操作

使用する試薬：AdsorbOut（製品コード：ADSORB、One Lambda）

AdsorbOut処理プロトコル（メーカープロトコル）

① （1テストあたり）血清 30 uLに対して Adsorb Out ビーズを 3 uL加え、ボルテックス

する。

② 室温で 30 分間、振とうしながら反応させ、15,000 rpmで 5分間遠心する。

③ 上清を、ビーズを吸わないように慎重に新しい別の 1.5 mLチューブに移す。

④ もし検体に Adsorb Out ビーズが混入した場合には、再度超遠心し、上清を移す。

2. ピークの波形がギザギザで、シフトしていない場合： DTT処理による IgM 抗体の除去

使用する試薬：DTT （dithiothreitol、メーカー不問)

DTT処理プロトコル（第 4回 アメリカ組織適合性学会 ASHI推奨プロトコル）

① DTT溶液（0.05 M) 10 uLに対して血清を 90 uL加える。（DTTの終濃度は 0.005 M）

② よく混ぜた後、37℃で 30-45分間反応させる。8,000-10,000 gで 10 分間遠心し上清を

使用する。

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２．３ 検査の手順

2.3.1 操作の流れ

•血清を凍結融解、転倒混和（血漿は不可）

•8,000～10,000gで10分間、遠心前処理

•NC血清、PC血清、サンプル血清とビーズを混合

•遮光、室温（20-25℃）、振とうで30分間反応反応

•洗浄バッファー1mL、遠心（9,000xg、2分間）

•上清除去、ドライボルテックス洗浄（3回）

•100倍希釈した二次抗体を100 uLずつ添加

•遮光、室温（20-25℃）、振とうで30分間反応FITC標識

•洗浄バッファー1 mL、遠心（9,000xg、2分間）

•上清除去、ドライボルテックス洗浄（2回）

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2.3.2 標準プロトコル

注意

FlowPRA Screening Test で Class I と Class II を同時にスクリーニングする場合は、1

検体あたり Class I、Class II ビーズを各 5 µL、コントロールビーズ 1 µL をあらかじ

め必要検体数分混合しておき、混合したビーズを 1 テストあたり 11 µL 使用する。

操作

1. FlowPRAビーズを使用前によくボルテックスする。各 1.5 mL チューブに NC 血清、PC 血

清（Class I & II）、サンプル血清 20 µL を分注する。

2. 下記の量のビーズを入れてピペッティングで混合する。ビーズをチューブから取る際、

不均一になるのを防ぐために、ピペッティングしながら一定の動作で取る。検体の入っ

たチューブに血清を加える際にもピペッティングし混合する。

Class I ビーズ量 Class II ビーズ

量

コントロールビー

ズ量

Class Iのみ 5 µL － 1 µL

Class IIのみ － 5 µL 1 µL

Class I + Class

II

5 µL 5 µL 1 µL

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3. シェーカーでゆっくりシェイクしながら暗所 20 - 25℃で 30 分間反応する。シェーカー

がない場合は、反応の間に数回軽くボルテックスする。

4. 10x Wash buffer を蒸留水（または精製水）で希釈し、1× Wash buffer を調製する。

5. 各チューブに 1x Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 gで 2分間遠

心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。 ビーズを吸わないように注意する。

≪洗浄 1 回目≫

6. 上清を除いたペレットをほぐすために、2 秒～5 秒程度ボルテックスする。（ドライボル

テックスは、長くかけすぎ無い様に注意する。以下同様。）各チューブに 1x Wash buffer

を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠心後、先の細いピペットで上清

をしっかり除去する。 ≪洗浄 2回目≫

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7. 上清を除いたペレットをほぐすために、ドライボルテックスする。

8. 各チューブに 1x Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠

心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。 ビーズを吸わないように注意する。

≪洗浄 3 回目≫

9. 上清を除いたペレットをほぐすために、ボルテックスする。（ドライボルテックス）

10. 洗浄 3回目の遠心時に、1テストあたり 100x FITC anti-human IgG 1 µL を Wash buffer

99 µL で希釈し、1×FITC anti-human IgG を調製する。

11. 1x FITC anti-human IgG 100 µL をビーズに加えてボルテックスし、シェーカーでゆっ

くりシェイクしながら暗所、20-25℃で 30 分間反応する。シェーカーがない場合はイン

キュベーションの間に 1 回軽くボルテックスする。

12. 各チューブに 1x Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠

心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。 ビーズを吸わないように注意する。

≪洗浄 1 回目≫

13. 上清を除いたペレットをほぐすために、ボルテックスする。（ドライボルテックス）

14. 各チューブに 1×Wash buffer を 1,000 µL 加えてボルテックスし、9,000 g で 2分間遠

心後、先の細いピペットで上清をしっかり除去する。ビーズを吸わないように注意する。

≪洗浄 2 回目≫

15. 上清を除いたペレットをほぐすために、ボルテックスする。（ドライボルテックス）

16. 1×Wash buffer 500 µL をチューブに加え、スポイトでフローサイトメーター用のチュ

ーブに移す。

17. すぐに測定する。あるいは遮光して 2-5℃で 24 時間までは保存可能。

初期設定時などゆっくり長く流したい時は、この最終液量は 500 µL 程度まではフレキシブ

ルに変更可能（また、機種によっても最低液量が異なることがあるので注意）。

翌日読む場合は Fixing solution: PBS with 0.5% formaldehyde (add 1.35 mL 37%

formaldehyde to 100 mL PBS)を使用すると良い。

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３． FlowPRA Screening Test のフローサイトメーター条件設定

FlowPRA の測定では正しいデータをとるために、最初にフローサイトメーターの条件設定を

正しく行うことが非常に重要。この設定を保存し、以降呼び出して使用すれば、基本的には

微調整のみで測定できる。

FlowPRA Screening Test を読み取るためには、陰性コントロール血清、Class I 陽性コント

ロール血清、Class II 陽性コントロール血清、コントロールビーズを検体血清と同時に流す

必要がある。

３．１ FSC vs. SSC

３．２ FL2 vs. FSC

Class II ビーズ

Class I ビーズ

コントロールビーズ

Class I ビーズ

Class II ビーズ

コントロールビーズ

FlowPRA Screening Test Class

I、Class II、コントロールビーズ

の FSC vs. SSC ドットプロット

ビーズの半径は約 2 ～4 µm のた

め、「リンパ球向けのモード」で解

析している場合は感度を上げる。

FlowPRA Screening Test Class

I、Class II、コントロールビーズ

の FL2 vs. FSC ドットプロット

Class II ビーズおよびコントロ

ールビーズにはビーズに色素が

含まれているため、PEの蛍光強度

により領域を分けることができ

る。

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３．３ FL1ヒストグラム

3.3.1 NC血清を流す意義 NC 血清を検体と同時に流す目的は、陰性血清を基準に陽性領域と陰性領域を決めるため。

Class I Class II

3.3.2 PC血清を流す意義

PC 血清を検体と同時に流す目的は、二次抗体が働いているかを確認するため。

Class I Class II

3.3.3 コントロールビーズを流す意義

コントロール

ビーズ

Class II ビーズ

Class I ビーズ

陰性コントロール血清に

Class I 、Class II とコン

トロールビーズを反応させ

た際の FL1 ヒストグラム

コントロールビーズを他の

ビーズと混合して流す目的

は、血清中の非特異反応の有

無を確認するため。抗 HLA抗

体陰性の検体にも関わらず

非特異反応によりヒストグ

ラムが右側にシフトする場

合があり、コントロールビー

ズのヒストグラムを基に非

特異か陽性反応かを判断す

る。

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３．４ コンペンセーションの調整（蛍光補正）

コンペンセーションとは、2 種類以上の蛍光の測定において、それぞれの蛍光の波長が重な

り合う場合（例：FITC と PE）、互いの検出器にいわゆる「光漏れ」が起きるため、電気的に

補正するもの｡

1：Class I ビーズ + NC 血清（FL-NC）、2：Class I ビーズ + Class I PC 血清（FL1-PC）、

3：Class IIビーズ + PBS を混合したビーズをフローサイトメーターに流し、集団の位置を

調整する。

集団 2 は上にずれる傾向なので、下に寄せて集団 1 と 2 が X 軸と並行な位置に来る

ように調整（FL2-%FL1 の値を上げる）

集団 3 は右にずれる傾向なので、左に寄せて集団 1 と 3 が Y 軸と並行な位置に来る

ように調整（FL1-%FL2 の値を上げる）

４． マーカー設定の考え方

Class I ビーズ・ Class II ビーズ・コントロールビーズと血清を反応させた場合の

Class I ヒストグラム

検体血清が図のようにネガティブピークがはっきり分かる形状の場合、NC 血清で設定し

た M1 をそのまま用いるのではなく、ネガティブピークのすぐ横のピーク谷間に合わせ

て M2 を再設定して%PRA を求める。

凡例

集団 1： Class I ビーズ ＋ FL-NC （1）

集団 2： Class I ビーズ ＋ FL1-PC （2）

集団 3： Class II ビーズ ＋ PBS （3）

ネガティブ

コントロール血清

被検血清

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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

５． FlowPRA Screening Test データ例

５．１ Class I & II、コントロールビーズと NC 血清を反応させた場合のヒストグラム

NC Class I

NC Class II

Cont.

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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

５．２ Class I ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム

Class I抗体 陽性検体のヒストグラム例

②

①、②、③は波形が右側にシフトしており、明らかに多峰性を示している。

②は一番左側のピークの横に新たなライン（―線）を引き直し、%PRA を変更する。

④は小さい山が右側にシフトしており、弱陽性の抗 HLA 抗体があると思われる。

98.4％

0.9％

陰性検体

陽性検体

Class I の NC 血清（P14）のヒ

ストグラムと比較して、波形が

ほぼ同一の位置にあり、形状も

同一。

Class I の NC 血清（P14）のヒ

ストグラムと比較して、波形が

右側へシフトしており、多峰性

を示している。

① ②

③ ④

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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

５．３ Class II ビーズに対する陰性 / 陽性検体のヒストグラム

Class II 抗体 陽性検体のヒストグラム例

①は波形が右側にシフトしており、明らかに多峰性を示している。

②は小さい山が右側に見える。また、ピークの右側の部分が少し膨らんでいる。

99.8％

0.3％

陰性検体

陽性検体

Class II の NC 血清（P14）の

ヒストグラムと比較して、波形

がほぼ同一の位置にあり、形状

も同一。

Class II の NC 血清（P14）の

ヒストグラムと比較して、波形

が右側へシフトしており、多峰

性を示している。

① ②

16

QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

６． 機器設定の重要性

添付文書と同じプロットが描けているか、確認する。

添付文書より

FSC vs. SSC FSC vs. FL-2

機器の設定が出来ていない例

FSC vs. SSC FSC vs. FL2

（日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用）

Class I

Class II

Control

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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

FlowPRA Screening Test ケーススタディー【1】

同一検体（HLA Class I 抗体陰性の検体）を、FlowPRA Screening Test Class I で測定した

もの。異なる施設およびフローサイトメーターで測定した例を下図に示す。

説明：

ヒストグラムのパターンが大きく 2パターンに分かれた。すなわち、ネガティブコントロー

ルと同じ位置に検体血清のピークが出た施設、ネガティブコントロールよりも右側にシフト

した施設があった。さらに検体血清が右側にシフトした場合、陰性と判定した施設や陽性と

判定した施設があった。検体血清のヒストグラムは右側にシフトしているが、波形がシン

グルピークで、かつ NC 血清とほぼ同形のため陰性と判断する。検体血清が右側にシフトし

た原因として、①コンペンセーション調整が合っていない、②洗浄が悪い、③機器の差な

どが考えられる。

（日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用）

陰性と判定した施設 陽性と判定した施設 ヒストグラムは 右側へシフトしているが 陰性と判定した施設

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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査

FlowPRA Screening Test ケーススタディー【2】

同一検体（HLA Class II 抗体弱陽性の検体）を、FlowPRA Screening Test Class II で測定

したもの。

異なる施設およびフローサイトメーターで測定した例を下図に示す。

説明：

陰性と判定とした 2施設について、「施設 I」は機器の適切なコンペンセーション調整が出

来ていない。「施設 II」はシングルピークのため陰性と判断している。「施設 II」はサンプ

ル調製の手技に問題があると考えられる。使用する血清をよく遠心し、ビーズと血清との反

応を行った後、洗浄や二次抗体のラベリングを正確に行うことをおすすめする。

保留と判定した「施設 III」、「施設 IV」、「施設 VI」は、右側に見られる小さなピークを陽

性と判断して構わない。

「施設 V」は多施設と比べてほとんど右側のピークがほぼ見えず、二次抗体のラベリングが

出来ていない可能性がある。洗浄時（特に二次抗体の添加前）は、上清をしっかり除去す

る。再度検査することをおすすめする。

（日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用）

陰性と判定した施設 (2 施設) 正しいヒストグラム

陽性と判定した施設 (5 施

設)

保留と判定した施設 (4 施設)

施設 II 施設 I

施設 III 施設 IV 施設 V 施設 VI

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日本組織適合性学会 QCWS 参加施設のデータ例

同一検体を用いて FlowPRA Screening Test Class I を行った際の、QCWS 参加施設のヒスト

グラム（raw data）。同一の血清を用いたにもかかわらず、様々なヒストグラムが得られ

る。

各施設の機器においてピークの出方や波形の傾向を把握することによって、弱陽性の抗 HLA

抗体反応や非特異反応を見つけることができ、検査の精度を上げることができる。

（日本組織適合性学会 HP 第 12 回 QCWS 報告書データ 引用）