Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll ... · Aktives Zentrum des Enzym reagiert...
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HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.
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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007
Claus Opper15. 4. 82
Protokoll zu den Übungen im Experimentalvortrag, LA Chemie
Thema: Enzymatische Reaktionen
Die biochemische Katalyse:Alle Enzyme stellen kompliziert gebaute Eiweißkörper ~ar.
Sie besitzen die Fähigkeit, die Geschwindigkeit chemischerReaktionen tausend- bis millionenfach zu beschleunigen, indemsie die Aktivierungsenergie herabsetzen, also den zum Raaktionsstart notwendigen Energiebetrag so weit verringern, daß dieUmsetzung ablaufen kann, siehe auch Anlage 1.Für den menschlichen Organismus schätzt man die enzymatischkatalysierten Reaktionen auf über 10000. Da die Enzyme Substratspezifisch arbeiten, haben sie auch eine wichtige Steuerungsfunktion im intermediären Stoffwechsel. Diese steuerungsfunktionenwerden noch durch bestimmte He*mreaktionen unterstützt.Versuche zur Demonstration e n z yma t Lsche r- Reaktionen:1. Eiweißverdauung durch Pepsin2. Katalasereaktion in Hefe3. Explosionschemie der Bombardierkäfer, siehe auch Anl. 2.
~.
Der Eiweißcharakter der Enzyme:Er soll beispielhaft mit verschiedenen Nachweisreaktionen demonstriert werden:1. Nachweis der Peptidbindungen mit der Biuret-Probe2. '! der s-haltigen Aminosäuren3. XanthoproteinreaktionSiehe hierzu Anlage 31
Einteilung der Proteine:Systematische Einteilung seit 1964. Nachsilbe ist -ase.Zur Bezeichnung einer bestimmten Enzymgruppe, die z. B.hydrolisierende Eigenschaften besitzen werden als "Hydrolasen"bezeichnet.Hauptklassen sind:Hydrolasen ,z.B. LipaseOxidoreduktasen, z. B. Glucose OxidaseTransferasen, z. B. Glutamat-Oxalacet-TransaminaseLyasen, z. B. AldolaseIsomerasen, z. B. Phospohexose-Isomerase.Ligasen, z! B. Acetyl-CoA-Carboxylase
.Substratspezifität:Demonstration mit ausgesägtem(aus Holz) Schlüssel-Schloß ~lodell.
Aktives Zentrum des Enzym reagiert nur mit spezifischem Substrat •
. Enzymkinitik:Allgemein gilt Kinetik als Lehre der Reaktionsgeschwindigkeit.Enzyme erhöhen die Geschlvindigkeit einer Reaktion. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist das Maß für die Menge und Wirksamkeit einesEnzyms. Die Einheit ist Mikromol Substratumsatz pro Zeit.Erläuterung der Begriffe Substratsättigung, Michaeliskonstanteund aalbmaximale Geschwindigkeit.Versuch: irmittlung der MichaelisKonstanten bei der alkoholischen
Gärung. Eine Hefesuspension wird mit 3 verschiedenenMengen Glucose versetzt. Die entsteherlen CO
2-Gasmengen
werden aufgefangen~und notiert. Ebenso wird die Zeitin der sie entstanden sind notiert.Erläuterung"Lineweaver und Burk Auftragung" der Me s swe r-t ezur Ermittlung der MichaelisKonstanten.
Eine hohe MichaelisKonstante bedeutet eine geringe Affinität des
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Enzymes zum Substrat, denn eine hohe Substratsättigung ist nötig,um die "Halbsättigung"bzw. Halbmaximale Ge e c hw.Lrrdi.gke Lt; zu erhölten.
Volumenaktivität:
• d,
GPTL-A1anin + 2-0xoglutarat~yruvat + L-Glutamat
Enzymaktivitäten werden in internationalen Einheiten(Units)angegeben. Definitionsgemäß setzt 1 Unit (U) in l' ~Iinute 1 ~likro
mol Substrat unter definierten Bedingungen um. Man bezieht imallgemeinen auf das Volumen. Damit erhält man die Volumenaktivität: U/l.
Photometrischer (optischeQ Test:Grundlagen sind das Lambert-Beersche Gesetz: E = c •sowie das Absorptionsverhalten von NAflH
2bzw. NAD.
In vielen enzymatischen Reaktionen wird \vasserstoff übertragen.Wasserstoffakzeptor ist NAß, das dabei zu NAOH
2reduziert wird.
NAD hat bei 3qO nm kein Absorptionsmaximum im ~egensatz zu NADH •Eine Konzentrationsänderung von NADH2 pro ~eiteinheit ist direktproportional der gemessenen Extinktion E. Uber den molarenExtinktionskoeffizienten von NADH2 können also Substratumsetzungen
pro Zeit photomerrisch gemessen werdenVersuch: zur praktischen Demonstration dieser Hesstechnik wurde
am registrierenden Zeissphotemeter die GlutamatPyruvat-Transaminase gemessen.Reaktionsschema
Pyruvat + NADH2LDH--....&>~ L-Lactat + NAD
Mit geeigneten Reagentien wird, an die eigentlicheEnzymreaktion die zweite Reaktion, bei der NADH2 abgebaut wird angeschlossen.Man nennt diese Reakt10ndann Indikatorreaktion, weil sie ja gemessen wird.Aus den stöchiometrischen Verhältnissen ergibt sichjedoch eine direkte Propoertionalität zur GPT-Aktivität.
In der klinischen Diagnostik ist eine Vergleichbarkeit derAnalysenergebnisse wichtig. Aus diesem Grund existieren "OptimierteStandardbedingungen nach dem Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft Cür Klinische Chemie(1972), Z. Klin. ehern. K1in. Biochem.
,--,,' 10,182-192."
Hinweis·: Zur einfacheren Darstellung des Protokolls wurde auf die~--Ableitung der Michaelis-Konstanten verzichtet. Zur Ableitung
si.ehe H. U. Bergmeyer, Me t h o d e n der enzymatischen Analyse t
Band 1', \ve inheim/Bergst r ••
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I JJJ.-tBEHRING INSTITUT
1375 1
Iestemar"-GPT [ALAT] optimiertCombipack 2 X 25 D]
I~I-Bestell-Nr . OSPE 10: Packung für 2 x 20 bzw . 2 x 25 Makro - oder 2 x 100Mikro-Bestimmungen
Handelsformenund Bestellnummern
MethodeOptimierter ' ) UV-Test mit Extinknonsabnahme zur Bestimmung der Glutamat-Pyruval Transaminase (GPT) nac h lo lqende m Reakl lon, sclll "na
Durchführung
Serum '"' 500 ,11 400 !II lGPT-Reagenz '21 ( + 25" Cl 2500 ..) 2000 ,11 IM;"Choo, 1 rn;, b;, 15 rni, be> 900," ' 25 eiern",,;. ,," -- -
Oxoglutarat 13 I 100 ,11 i 100 ,11' )_ _ _ ___-.1............... _
Sofort mischen , Lösung ggl. in Küvette umgießen. Extinktion Igenau ablesen und gleichzeitig Stoppunr U l u C ", C;I ( i. J W '~ 1 1 8I e I
Ablesungen in Abst änd en von gen au 1 min . I
I
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100 1'1500 111
Oxoglutarat ßI
Mischen. 1 min bis 15 min ber genau , 25 C temperieren II - ----------r----------i
20 ,11
Frauen : bis 19 U/I ( +- 25' C)
Männ er : bis 23 Uil ( I 25 C)
Sofort mischen , Lösung ggl. in tem perierte Kuvette umgie ßenNach ca . 1 rnin Extinktion gen au ablese n und ylelchzeitig Stopp uhr dr ücken"). 3 weitere Ablesungen in Abstanden von gen au1 rnin.
Bel d er Messung eine für Halbmikro-Küvetten geeignete Blendeverwende n.
Berechnung
Arbeitsanleitung für manuelle Makro- und Mikro-Best im mungen derGlutamat-Pyruvat-TransaminaseVerfahren mit Startreagenz')
Für die Regi str ierung mit einem Schr eiber sind ebenfalls Umr echnungstabellen von Winkelgrad u. in Enzyrnaktivi tät beigefugt.
Normalbereich im SerumS}
Die drei Extmktronsd ifterenzen aus den autemandertorcenden Meß-punkten bilden . daraus Mittelwert I. \E /mln) berechnen. -
Die Akti vität kann nach den folgend en F-orme ln ber echn et oder den folgen den Umrechnungstabellen entnommen werden (verdünnte Sera x 11):
2. Mikro-Bestimmung
I in eine temp erierte Halbmikro-Küv~te oder In ein geeignetesI Reag enzröhrchen pipettieren :
SerumGPT-Reagenz r2l (+25° C)
Meßbereich rns 1:33 U/I,\ E/mln 0 ,105 (Hg 365 nrn ),\ E/ min ... 0 ,195 (Hg 334 nm , 340 nm )
Bei höheren Aktivitäten 1 Teil Serum 'I HI J 0 T8118n rsoron l<ocrlsa1z -Lösun g(NaCI9 g/I) verdünnen und Test Wiederholen I Ergebnis x 11) ').
r= Wellenl äng e ----,--
LHg 365 nm TI U/I ( " ml.I/ rnl)
Hg 334 nm "\ E/min x 1823
___. ___ 340 nm L\ E/ min x 1003__ _~I._ _L\ E/~ ' ~ x _~~
-B
Makro-Ansatz
A
t -Lactat + NAD
Pyruvat ~ L-Glut amat.ser,~
Je nach vorhandenen Pipetten AnsatzA ode r B wählen . In eine Küvett e oderin ein Reagenzröhrchen pipettieren :
Makro-Bestimmung
L-Alamn I 2-0xoglutarat
Pyruval + NADH,
Küvette : 1 cm Sch ichtdicke
Wellenl änge : Hg 365 (bzw. 366) nm . Hg 334 nm oder 340 nm
Temperatur : + 25 C rTner rnostau
Probe: Serum. Heparin- oder EDT A-Pl asma.
Stabilit ät der GPT Im Serum ) .In der Literatur finden sich unterschied liche Angaben: gefunden wurden z. B. nac h einer Woche Aktivitätsve rluste von5% be ii 4 bis +6 C und 15% bet +20 brs -t-25 C.
H ämolyse täuscht erhöhte Werte vor, da die GPT-Konzentration in Erythroz yten etwa ?fach höh er Ist als im Plasma").
ReagenzienJ) ,Puffer/Substrat
l.1JLösung in Flasche [~ unverdünnt verwenden. Haltbarkeit nach OHnender Flasche bei + 4 bis +- 6' C bis zum Verfalld atum der Packung .
GPT-Reagenz
12JInhalt einer Flasche l2i mit 50 ml Puffer/ Substrat aus Flasch e Wlösen .'- Lösung vor Gebrauch auf +25 C temp erieren . Haltb arkeit nach Auf
löse n: 1 Tag bei + 15 bis + 25' C, 4 Tage bei + 4 bis +6' C.
Fr Oxoglutarat
[3 Inhalt in Flasche :31unverdünnt verwenden. Haltb arkeit nach Ottnen. ,der Flasche: 1 Woche bei + 15 bis +25° C, 6 Wochen bei +4 bis t- 6" C_
•••••••
Anmerkungen und Literatur
1 Eine Arberlsvorschnft fur vorge mrschles Reagenz (Serurnstartl enthalt das Ringbuch..Klinische Cherrue-Arbeitsanleitunqen" der Behringwerke AG.
2. Optimierte Testkonzentrationen nach den Empf ehlungen der Deutschen GesellschaftIur Klinische Chem ie (1972 ). Z. Khn Chem. Klm Bioehern 10. 182 - 192
Phosphat-Puffer. pH 7.4 80 mm oL·1L-Alanrn 800 rnmol/l2-0 xog lutaral 18 mrnol/ lNADH, 0.18 mmol. lLactat-Dehydrogenase (LOH) '" t .2 U/ml
3 MOSLEY . J . M. & GOODWIN. R F.11965). Amer J CI,n. Pathol. 44. 591
4 THOMAS. L 11978\. Labor und Diagnose. 1 Aufl. , S. 109. Die Medizirusche Verlaqsgesellschafl Marburg.
S. Das tneoretrsche Prpeurervou.mer. ut.:lragt 0.08 rru. Der Ume rsclueu ":l . 0. ' 11: :.:..: \fE;:f
nachlassiebar (Abweichung rrn ErgebniSun ter 1% ).
6. Bel Analoqph olo metern Extmktion aul etwa O .~, e.nstetlen, bel DrgltalpllOlomelern >lcqt "-'Was ser oder Lull (E Ormessen
Be l hochaktiven Se ra Kann euren vo rzeitrqen NAOH -V.~ r !J r il u (. r r ",!i(' :-jen! 'l '-" ;r~: : " (1~ lt.:;
keine Aktivuai vo rqetauscht woruon VVenn das emqese tzre Serum I1 lc hH ln l:l ~ l q.:l l :.' [zeigen derarnqe Testansatze eitle qennue Ausqanpsexunknon Zur Kun l l () ~ : (': ~O ll !i"' d l( 'Analyse enen taus rnu verdunmem S 8JUI ~ 1 ' 'I.'\ .'l :. 'rl lol t wpr ,'~ ( ' "
8 NormalbereichSCHLEBUSCH. H et al. (1974I. tnscn. mu d. Wsch l 99, 7h5 - 756THEFELD . W. el al. ( 1974). lblo 99. :J"3 351
9. Richl igkeitskontrolle: Kontrollo u-:: l ,.'''' I F'Präzisionskontrolle: K. o ll t ro ll o~ I C fl -; Li l dlL! Se ruq uönl AU
Vor Kindern sichern ! ~3 t: r ,fIl HJ'''~ l';'" k(' AC "jj ;n :,ll! q V'i ( 'l ~ ( ' '<.: i " .
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®Testomar ·GPT [ALAT]Combipack
Verfahren mit Startreagenz
Instructions with Starting Reagent
Mode operatolre avec reactlt declenchant
Istruzioni con starter
-I --. -----T--- .-.- ------- . -- -0;;--- ----- ---Ii J E A - I Hg 365 nm Hg 33-1 nm 340 nm I
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11 B EHR IN G I N STITU T
-!ijeh~
Hg 365 nm
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Hg 334 nm
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340 nm
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0.05052545658
0.06064687276
0 .08084889296
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0 .120124128132136
0.140144148152156
0.160164168172176
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10130 10531 I 11032 11433 11834 I' 12335 12836 13237 13738 11 14239 14840 153
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