HICE Carga Viral y genotipificación del VIH-1

7/23/2019 HICE Carga Viral y genotipificacin del VIH-1

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Carga Viral ygenotipificacin del VIH-1

Karen Belloso

EPS- Qumica BiolgicaUCREVE/VIH


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Es el nmero de copias de ARN (materialgentico) del VIH, circulantes en cada mL deplasma.

Dos copias por cada virin (partcula viral).

Se expresa en copias ARN/mL.

La semivida de una partcula viral en plasma

es aproximadamente de 6 hrs, el de unaclula infectada es de 1 da un ciclo de

Qu es la Carga viral deVIH?


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La determinacin de carga viral se realiza para elmonitoreo de pacientes infectados con VIH.

Evala la eficacia del tratamiento antirretroviral.

Se correlaciona directamente con: pronstico clnico

riesgo de transmisin

recuento de CD4+.

Es un marcador predictivo del tiempo de progresina la fase SIDA en conjunto con el conteo de CD4+.

Una carga viral indetectable no significa que el virus

Por qu se realiza?


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Progreso de la infeccin delVIH


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La carga viral de VIH se realiza en lossiguientes casos:

Luego de ser diagnosticado VIH positivo,

antes del inicio de la terapiaantirretroviral.

Para medir la eficacia o respuesta al Tx.

Cuando se cambia el esquema de Tx.

Cada 3 4 meses en Tx de largaduracin.

En Guatemala se realiza cada 6 meses paracontrolar a los pacientes.

Cundo debe realizarse?


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Se realiza por medio de tcnicas debiologa molecular.

Existen diversos mtodos disponiblescomercialmente para ladeterminacin de carga viral.

RT- PCR Tiempo Real (Retrotranscripcin-Reaccin en Cadena de la Polimerasa)

ADN ramificado

NASBA (replicacin secuencial de cidos

nucleicos).

Cmo se realiza?


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Comparacin de mtodoscomerciales disponibles


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Es una tcnica de amplificacin de cidosnucleicos utilizada para la cuantificacin delVIH-1 (grupos M y O).

Se basa en 3 procesos principales:

1. preparacin de la muestra paraextraer el ARN viral.

2. Transcripcin inversa el ARN paragenerar ADNc.

3. Amplificacin mediante PCR del

ADNc y deteccin simultanea.

PCR Reaccin en Cadena dela Polimerasa


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Preparacin automatizada de lamuestra en el equipo COBASAmpliprep

1. Preparacin de lamuestra

Captura genrica basada en Slice

1000 uL de plasma con EDTA.

Lisis de partculas vricas VIH-1.

Se unen a micropartculasmagnticas.

Unido el ARN de VIH-1 y QSa las partculas magnticas, se

les agrega la mezcla deamplificacin (master mix).


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2. Transcripcin reversa yPCR

ReverseTranscripti

on

andPCR

Amplicon

marcado

Mg

2+Mn2+

Taq DNAPolymerase

rTth Z05 DNAPolymerase

AmpErase

Primermarcado

TargetRNA

dCTP

dNTP

s

dGTP

dU

TPdATP

Des: 95CHib: 37-65CAmp: 72C


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COBAS TaqMan 48 Amplifica y simultneamente cuantifica de

forma absoluta el producto de la amplificacin.

Se emplean sondas doblemente marcadas (FAN)con dos tipos de fluorocromos, un donador y unaceptor, en los cules hay una trasnferencia deenerga fluorescente mediante resonancia.

3. Amplificacin ydeteccin


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Es un proceso automatizado, lo cual evita lacontaminacin y errores en el procedimiento.

Utiliza un control de calidad interno (QS) paragarantizar la amplificacin en la muestra.

Utiliza Amplilink, un software para reportar muyprctico y fcil de utilizar.

Permite procesar 48 muestras en 4hrs aprox. Un amplio rango de deteccin

Desde 20 copias/mL

Hasta 10,000,000 copias/mL

Cuantifica adecuadamente el VIH-1 del grupo O yM.

Caractersticas del mtodo


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Este es un mtodo muy costoso puesnecesita de equipo especial para llevara cabo la prueba.

Actualmente un kit de CV para 42muestras cuesta aproximadamenteQ.12,000

Desventaja


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Se realiza la determinacin de Carga viral apacientes de varias regiones del pas.

Las muestras son referidas desde las Clnicas deAtencin Integral.

Los lugares que envan muestras son:

Trabajo realizado en el rea

-Hospital Nacional Juan JosOrtega de Coatepeque.

-Hospital Dr. Rodolfo Robles,Quetzaltenango.

-Hospital Regional de Zacapa.

-Hospital Nacional Regional deEscuintla.

-Hospital de la Amistad Japn-Guatemala, Izabal.

-Hospital Dr. Jorge VidesMolina Huehuetenango.

-Hospital Infantil ElisaMartnez Izabal.

-Hospital Pedro deBethancourt, AntiguaGuatemala.


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Ingreso de muestras

durante 2011

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Porcentaj

es%


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Genotipificacin Viraldel VIH


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Es el anlisis de secuenciasespecficas del genoma del VIH en unpaciente, con el fin de comprobar si

existen mutaciones asociadas a laresistencia especfica a ciertosantirretrovirales.

Qu es la Genotipificacin?


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Codn (posicin)

M184V

Aminocidotipo

silvestreMetionina

AminocidomutadoValina

Cada regin de la secuencia del virus codifica a unaminocido y dependiendo de las mutaciones existentescambia el aminocido que codifican. Esto confiereresistencia a los antirretrovirales.

Ejemplo:


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Cuando se sospecha de resistencia

Cuando los pacientes no handemostrado progreso de la infeccincon la terapia antirretroviral que se leadministra.

Mantienen valores de carga viralelevados mientras estn adheridos a laterapia.

Se les ha cambiado de esquema varias

veces.

Cundo se realiza?


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Por medio de la secuenciacin del genomaviral.

Secuencias de ADN de la regin delgenoma amplificada previamente por PCR

Secuencia de aminocidos, la cual secompara con la de una cepa de referencia

o silvestre del VIH. El ltimo paso es la interpretacin de

resultados detectando variaciones en lasecuencia de genes que se asocian aresistencia a los antirretrovirales.

Cmo se realiza?


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Equipo

necesarioViroSeq HIV-1 Genotyping


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Preparacin de la Muestra y

RT-PCR


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Secuenciacin


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Electroforesis, anlisis de datos yreporte


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Resumen


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Reporte


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Ventajas:

Ms barato y ms rpido que otros mtodosbasados en replicacin (fenotpicos).

Desventajas

Es una medida indirecta de la susceptibilidad.

Requiere interpretacin clnica por expertos.

Patrones de resistencia no estn claramentedefinidos.

Ventajas y desventajas


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Preguntas?


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Muchas Gracias!

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