Herramientas de laboratorio aplicadas al diagnóstico y el

monitoreo del tratamiento de la infección por VIH (Virus

Inmunodeficiencia Humana)Inmunodeficiencia Humana)Fabián Fay

CIBIC.

Rosario.

Argentina

Test de laboratorio para el diagnóstico, pronostico y

seguimiento de la infección por HIV

• Detección de Anticuerpos Anti-HIV EIA

• Detección de Ag P24

• Detección combinada Ag+Ac EIA

• Detección de Ac- anti-HIV (Western Blot)• Detección de Ac- anti-HIV (Western Blot)

• HIV-RNA cuantitativo (Carga Viral)

• Detección de HIV-DNA en CMSP

• Determinación de Resistencia a antiretrovirales

• Determinación de tropismo viral

• Test NAT para bancos de sangre

Historia Natural de la Infección por HIV-1

Respuesta Inmune

Conteo CD4+

ARN HIV-1en Plasma

Meses Años

Síntomas

Nature Medicine (1996) 2:625

log (copias/ml)

Evolución natural de la carga viral en un paciente infectado

Nivel Replicativo de base

8

10

12

Tiempo infección (meses)

Este nivel de replicaciónobtenido condiciona elpronostico de la evoluciónhacia SIDA.

años

0

2

4

6

0 1,5 2 3 6 8 12 20

Diagnóstico de HIV• Test de screening: Anticuerpo Anti-HIV

– 3era generación: Ac. Anti – HIV

– 4ta generación: • Test combinado: Ac. Anti-HIV + AgP24 HIV

HIV RNAAg P24Ag P24Ac- anti-HIV.

ExposiciónP24

0 20 30 40 50 Dias

HIV RNA

Ac-anti HIV

HIV RNA

Ag P24

Anticuer.

HIV

ELISA 3° (+)ELISA 4° (COMBINADO) (+)

Diagnóstico de HIV

Exposición

P24

0 20 30 40 50 Dias

RNA

Ac-anti

HIV

Algoritmo Diagnóstico¿Cómo confirmar un Elisa de HIV (+)?

Carga Viral HIVLímite

detección 20 Decisión de

Elisa HIV (+)

Carga Viral HIV detección 20 UI/ml

Decisión de Tratamiento

Anticuerpos Western Blot

No define nivel de replicación

HIV RNA

Ag P24

Diagnóstico de HIV

Ac- Anti-HIV (+)

3er generación

Western Blot

(+) DIAGNOSTICO CONFIRMADO

IND REPETIR EN 1 MES

(-) FALSO POSITIVO DE ELISA

Ag P24

Anticuer.

Exposición

P24

0 20 30 40 50 Dias

HIV

RNA

Ac-anti

HIV

HIV RNA

Ag P24

Antic.

Diagnóstico de HIV

Ac- Anti-HIV (+)

4ta generación

Western Blot

(+) DIAGNOSTICO CONFIRMADO

INDETERMINADO O NEGATIVO

HACER P24 O CARGA VIRAL

(+) SE CONFIRMA EL DIAGNÓSTICOAntic.

ExposiciónP24

0 20 30 40 50 Dias

HIV

RN

AAc-

anti

HIV

(+) SE CONFIRMA EL DIAGNÓSTICO

(-) RESULTADO DISCORDANTE

RECOMENDACIÓN

REPETIR ELISA Y CARGA VIRAL

AL MES DE LA PRIMERA MUESTRA

Algoritmo Diagnóstico¿Cómo confirmar un Elisa de HIV (+)?

Elisa HIV (+)Carga Viral

HIV

Límite detección 20

UI/ml

Decisión de Tratamiento

Ventajas:Ventajas:

•Sobre la misma muestra del screening se realiza la confirmación de la infección y se estratifica al paciente para definir si se inicia o no el tratamiento.

•Se minimizan los tiempos de resolución del diagnóstico evitando el drop-out de pacientes para ser tratados.

Test de Laboratorio en el seguimiento de pacientes con HIV

Test cuantitativos:

• Parámetros que permiten observar la evolución, definir la decisión terapéutica y evaluar la respuesta a la misma. evaluar la respuesta a la misma.

• Son independientes de las características individuales del Huésped y o de la población del virus de HIV que lo infecta.

• Ejemplos: Carga Viral, Recuento de CD4.

Test de Laboratorio en el seguimiento de pacientes con HIV

Nuevos Tests:

• Permiten definir y caracterizar parámetros específicos del Huésped o de la población de Virus de HIV que lo infecta con el objeto de poder tomar de HIV que lo infecta con el objeto de poder tomar decisiones terapéuticas específicas para cada asociación Huésped-Virus

• Pueden ser utilizados en distintos momentos: previo al inicio de la terapia antiviral o como soporte de las decisiones a tomar una vez instaurada la misma.

Test que aportan datos individuales de la relación Huésped - Virus

• Test que detectan características de la población de Virus infectante:

– Test de Resistencia (Geno / Fenotipo)

– Test de Tropismo – TrofileTM / Genotropismo

• Test que definen características específicas del • Test que definen características específicas del Huésped:

– HLA B*5107

– TDM para drogas utilizadas en el tratamiento

Uso de la carga viral

Pronóstico –

Decisión terapéuticaEvaluación de la falla terapeúticaDesarrollo de resistencia

Eficacia

terapéutica

Monitoreo respuesta

Cuando realizar una Indicación de testeo de Carga Viral de HIV-1

• En el momento del diagnóstico y cada 4 meses en los pacientes no tratados

• Inmediatamente antes de iniciar una terapia antiretroviral.

• A las 4 semanas de iniciada la terapia para verificar su eficacia.eficacia.

• Una vez obtenida una carga viral indetectable, cada 3 -4 meses para el seguimiento de la misma.

• Ante la aparición de eventos clínicos de importancia o disminución marcada de los CD4+.

• Para confirmar falla terapéutica luego de obtener valores detectables en pacientes que habían logrado bajar sus niveles de viremia por debajo de 50 copias/ml

Métodos Comerciales disponibles

• RealTimeTM HIV-1 m2000rt (Abbott, North Chicago, IL, USA)

• NucliSENS EasyQ® HIV-1 v2.0 (bioMerieux; Boxtel, Netherlands)(bioMerieux; Boxtel, Netherlands)

• Cobas® Taqman® (Roche; Pleasanton, CA, USA) CAP/CTM v.2.0

• VERSANT® HIV-1 RNA 1.0 kinetic PCR (kPCR) / VERSANT® bDNA (Siemmens, Berkeley California)

Límites de detección –Rango activo del ensayo

25 cps/ml (~ 14.4 IU/ml) NucliSENS EasyQ HIV-1 v 2.0 10,000,000 cps/ml

~ 5,700,000 IU/ml

48 cps/ml (~ 27.3 IU/ml) CAP/CTQ HIV-1 Roche10,000,000 cps/ml

Límite de detección cuantitativa (Hit rate 95%)Detectable pero no cuantificable (Hit rate 50%)Rango activo de medición

Carga viral

10,000,000 cps/ml

~ 5,700,000 IU/ml

40 cps/ml (~ 22.8 IU/ml) m2000 real time Abbott 10,000,000 cps/ml

~ 5,700,000 IU/ml

35 cps/ml (~ 21.1 IU/ml) k PCR Versant 11,000,000 cps/ml

~ 6,200,000 IU/ml

10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000

Correlación entre métodos

R2:0.9685. En 91% de las muestras las diferencias fueron < 0,5logTaylor et al, Antiviral therapy 2009. 14: 1189-1193.

Impacto de los subtipos sobre la carga viral

HIV-1 Extraordinaria

Grupo M (Major)

9 Subtipos ( A, B, C, D, F ,G, H, J y K)

43 Formas recombinantes Circulantes CRFs (*1)

Extraordinaria variabilidad genética.

+ del 90% de las infecciones a HIV-1 en el mundo son asociadas a formas no-B (*1, 2)Subtipos circulantes en Argentina: B, F, B/F, C y A

Grupo O (outlier)

Variantes N(new), P

* 1 Taylor B, Sobieszczyk M, McCutchan F, Hammer S: The challenge of HIV-1 subtype diversity. N. Engl. J. Med.358,1590-1602 (2008).* 2 Perrin L, Kaiser L, Yerly S: Travel and the spread of HIV-1 genetic variants. Lancet Infect. Dis.3,22-27 (2003).

Impacto de los subtipos sobre la carga viral

Comparison of the RealTime HIV-1, COBAS TaqMan 48 v1.0, Easy Q v1.2, and Versant v3.0 assays for Determination of HIV-1 Viral Loads in a Cohort of Canadian Patients with Diverse HIV Subtype Infections. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 2011, p. 118–124

Deirdre Church,1,3,4* Daniel Gregson,1,3,4 Tracie Lloyd,1 Marina Klein,5 Brenda Beckthold,2 Kevin Laupland,1,4 and M. John Gill2,3,4 Calgary

Laboratory Services1 and Southern Alberta HIV Clinic,2 Alberta Health Services, and the Departments of

Pathology and Laboratory Medicine3 and Medicine,4 University of Calgary, Calgary, Alberta, and the McGill HIV Clinic, McGill University, Montreal,

Quebec,5 Canada

Impacto de los subtipos sobre la carga viral

Estas razones indican la gran importancia en la elección del método a utilizar de acuerdo a los subtipos y formas recombinantes en la región tanto en pacientes naive como tratados.

Se deberían realizar estudios comparativos que muestren la Se deberían realizar estudios comparativos que muestren la correcta cuantificación de dichos métodos para dichas variantes.

Todas estas observaciones fortalecen también el hecho de mantener el mismo método para el seguimiento de pacientes tratados, especialmente en el contexto de infecciones por subtipos no-B por las diferencias existentes en estos con los diferentes ensayos.

Nuevos métodos de carga viral de

HIV

PROS• Mejora en la sensibilidad y

reproducibilidad

• Menor tiempo de ensayo

• Disminución de los riesgos de contaminación (extracción

CONTRAS• Costo (el costo de los

tratamientos ha bajado, el de la carga viral ha subido)

• Aspectos técnicos y logísticos para su implementacióncontaminación (extracción

cerrada, amplificación-detección en tiempo real en tubo cerrado)

• Menor volumen de muestra

• Mayor versatilidad en los flujos de trabajo (8 – 96 muestras)

• Otros materiales sobre los que trabajar (DBS, tejidos, fluidos)

para su implementación

• Provisión de reactivos en tiempo y forma

• Condiciones correctas para su implementación tecnológica

• Subcuantificación de subtipos y CRF

• Variabilidad entre distintos ensayos

¿Que hacer cuando aparece un blip?

BLIP(50 – 200 copias/ml)

EVALUAR FALLA TRATAMIENTO

Carga Viral

• Repetir la carga viral dentro del mes.• Descartar fallas de adherencia o procesos que puedan aumentar

temporalmente la viremia,• En general un blip se resuelve en un nuevo valor no detectable o en

un valor mayor.• En este último caso, evaluar falla de tratamiento y posible resistencia

(50 – 200 copias/ml)

Limite de detección – 50 copias/ml

Seguir frecuencia de seguimiento normal

Nuevos (viejos) objetivos en los test de Carga Viral

• Significado clínico de valores entre el límite de detección y el límite de cuantificación

• Capacidad para detectar y cuantificar eficientemente todos los subtipos y formas recombinantes circulantes existentes para evitar subestimaciones y falsos negativos.negativos.

• Seguir mejorando la estandarización respecto de las unidades de referencia para disminuir el impacto del cambio de metodología para un paciente.

• Medición de CV en otros materiales en forma estandarizada

• Medición cuantitativa de HIV-DNA proviral

Ciclo replicativo del HIVSitios de acción de los antivirales.

Objetivos de la Terapia antiretroviral

Suprimir la replicación viral:

– Disminuir la CV lo máximo posible.

– En lo posible a niveles indetectables.

– Mantenerlo así el mayor tiempo posible.– Mantenerlo así el mayor tiempo posible.

– Se evitará así la generación de nuevas mutantes, o la propagación de cepas resistentes preexistentes.

Presión dela Droga

Carga viral Virus Salvaje (WT) susceptible a la droga

Efecto de la terapia antiviral

Tiempo

Virus mutanteResistente a la droga

Evolución actual con HAART

CD4/mm3Carga viral Inicio

Terapia

tiempo

Nivel de detección

Desarrollo de ResistenciaCapacidad del virus de cambiar hacia una forma poblacional que mejora o

incrementa su capacidad para replicarse en presencia de inhibidores de dicha replicación.

Inicio de Tratamiento

Selección de quasiespecies

Quasiespecies susceptibles a la DrogaQuasispecies resistentes a la Droga

Carga Viral

Tiempo

Selección de quasiespeciesresistentes

Supresión Incompleta� Potencia Inadecuada� Niveles de droga inadecuados� Falta de adherencia� Resistencia Pre-existentes

DesafíosDesafíos de la Resistencia a de la Resistencia a drogasdrogas en el HIVen el HIV

• HIV se puede volver resistente a todas las drogas disponibles.

• La replicación de variantes resistentes a drogas lleva al paciente a la

falla de tratamiento.

• Durante la falla de tratamiento, el HIV desarrolla patrones de

mutación complejos que causa en muchos casos resistencias

cruzadas e imposibilita el uso de otras drogas.cruzadas e imposibilita el uso de otras drogas.

• Los virus resistentes a drogas pueden ser transmitidos a otros

pacientes complicando su tratamiento inicial, dispersando las

variantes resistentes en la población (aumento de la resistencia

poblacional primaria)

• Si bien tratamientos de rescate pueden volver a suprimir la

replicación viral, las variantes resistentes persisten en reservorios

virales (santuarios) y pueden re-emerger en condiciones favorables

para su replicación.