Hemijska analiza isparljivih komponenti biljne vrste

Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Hemijska analiza isparljivih komponenti biljne vrste

Scandix pecten-veneris L.

-Master rad-

Mentor

Prof. dr Goran Petrović

Student

Nikola Vukadinović

Niš, 2015

Прилог 4/1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: Мастер рад Аутор, АУ: Никола Вукадиновић Ментор, МН: др Горан Петровић

Наслов рада, НР: Хемијска анализа испарљивих компоненти биљне врсте Scandix pecten-veneris L.

Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: српски Земља публиковања, ЗП: Србија Уже географско подручје, УГП: Србија Година, ГО: 2015 Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33 Физички опис рада, ФО: 6 поглавља, 31 странa, 4 табеле, 9 графичких приказа Научна област, НО: Хемија Научна дисциплина, НД: Органска хемија и биохемија Предметна одредница/ Кључне речи, ПО:

хемијски састав, испарљиве компоненте, ГЦ/МС, Scandix pecten-veneris L.

УДК Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: Експериментални део рада рађен је у лабораторијама за органску хемију и биохемију ПМФ-а у Нишу у оквиру пројекта ОИ 172047

Извод, ИЗ:

Биљна врста Scandix pecten-veneris L. прикупљена је на локацији Облачина. Из свежих надземних делова изоловано је етарско уље хидродестилацијом по Clevenger-у и хексански екстракт. Хемијски састав уља и екстраката одређен је ГЦ/МС а садржај испарљивих компоненти у нативном узорку headspace ГЦ/МС методом. У етарском уљу идентификовано је 50 компоненти што чини 98,7% уља. Најзаступљенија класа једињења у уљу су алкани са уделом од преко 50%. Најзаступљеније компоненте су тридекан (36,5%), пентадекан (18,2%) и (E)-cariophyllene са (18,1%). Headspace анализом утврђено је присуство 26 компоненти. Главне компоненте су и овде тридекан (51,1%), пентадекан (27,1%) и (E)-cariophyllene са застуљеношћу од (5,7%). Анализом хексанског екстракта идентификовано је 30 компоненти од којих су најзаступљеније: тридекан (46,5%), нонакозан (16,5%) и пентадекан (13,3%).

Датум прихватања теме, ДП: 15.01.2015 Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО:

Председник: др Олга Јовановић Члан: др Иван Палић Члан, ментор: др Горан Петровић

Образац Q4.09.13 – Издање 1

Прилог 4/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monographic Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: Master work Author, AU: Nikola Vukadinović Mentor, MN: dr Goran Petrović Title, TI: Chemical analysis of Scandix pecten-veneris L. volatiles Language of text, LT: serbian Language of abstract, LA: english Country of publication, CP: Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2015 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33 Physical description, PD: 6 chapters, 31 pages, 4 tables, 9 graphic representations Scientific field, SF: Chemistry Scientific discipline, SD: Organic chemistry and biochemistry

Subject/Key words, S/KW: chemical composition, volatiles, GC/MS, Scandix pecten-veneris L.

UC Holding data, HD: library

Note, N:

The experimental part of this master work was conducted in laboratories for organic chemistry and biochemistry of Faculty of Sciences and Mathematics as a part of the grant 172047

Abstract, AB:

Plant species Scandix pecten-veneris L. was collected at the location Oblačina. From the fresh aerial parts hexane extract and essential oil were isolated by Clevenger type hydrodistillation. The chemical composition of the oil and extract was analyzed by GC/MS, and the content of the volatile components in the native sample by headspace GC/MS. In the essential oil 50 components were identified, what makes 98.7% of total. The most dominant class of compounds in oil is alkanes with a share of over 50%. The major components are tridecane (36.5%), pentadecane (18.2%) and (E)-cariophyllene (18.1%). Headspace analysis showed the presence of 26 components. The main components are the same: tridecane (51.1%), pentadecane (27.1%) and (E)-cariophyllene (5.7%). By the analysis of hexane extract 30 components were identified of which the most common are: tridecane (46.5%), nonacosane (16.5%) and pentadecane (13.3%).

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2015 Defended on, DE:

Defended Board, DB:

President: dr Olga Jovanović Member: dr Ivan Palić Member, Mentor: dr Goran Petrović

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Sadržaj

1. UVOD ................................................................................................................................................. 1

2. OPŠTI DEO ......................................................................................................................................... 3

2.1. Etarska ulja ................................................................................................................................... 3

2.2. Sistematika biljaka ....................................................................................................................... 4

2.2.1. Familija Apiceae .................................................................................................................... 6

2.2.2. Podfamilija Apioideae. .......................................................................................................... 6

2.2.3. Rod Scandix L. ...................................................................................................................... 7

2.2.4. Scandix pecten-veneris L. ...................................................................................................... 7

2.3. Dosadašnja ispitivanja hemijskog sastava etarskog ulja Scandix pecten-veneris L. .................... 9

2.4. Gasna hromatografija (GC) ........................................................................................................ 10

2.4.1. Parametri identifikacije ....................................................................................................... 11

2.4.2. Gasnohromatografska analiza ............................................................................................. 12

2.4.3. Headspace GC metoda ........................................................................................................ 12

2.5. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS) ............................................................ 13

2.5.1. Kvantitativna GC/MS analiza .............................................................................................. 14

3. EKSPERIMENTALNI DEO ............................................................................................................. 16

3.1. Biljni material ............................................................................................................................. 16

3.2. Izolovanje etarskog ulja i heksanskog ektrakta .......................................................................... 16

3.3. Analiza etarskog ulja, ekstrakta i headspace-a ........................................................................... 16

3.3.1. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS) i gasna hromatografija (GC) ....... 16

3.3.2. Identifikacija komponenti .................................................................................................... 17

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................................. 18

4.1. Hemijska analiza ispitivanih uzoraka ......................................................................................... 18

4.1.1. Sadržaj i hemijski sastav etarskog ulja ispitivane vrste S. pecten-veneris .......................... 18

4.1.2. Hemijski sastav headspace-a ispitivane vrste S. pecten-veneris .......................................... 23

4.1.3. Hemijski sastav heksanskog ekstrakta S. pecten-veneris .................................................... 26

5. ZAKLJUČAK ................................................................................................................................... 29

6. LITERATURA .................................................................................................................................. 30

Eksperimentalni deo ovog rada je uradjen u laboratorijama za organsku hemiju i biohemiju PMF-a u Nišu u okviru projekta OI 172047.

Veliku i iskrenu zahvalnost, ovom prilikom, upućujem svom mentoru dr Goranu Petroviću, vanrednom profesoru PMF-a u Nišu, na stručnoj pomoći, vremenu posvećenom mom master

radu, ukazanom strpljenju i razumevanju.

Srdačno se zahvaljujem svojim roditeljima, bratu, rođacima i prijateljima na bezgraničnoj ljubavi, podršci, razumevanju i savetima koje su mi pružili tokom studiranja. Bez Vas sigurno

ne bih uspeo u realizaciji svojih snova.

HVALA VAM

Scandix pecten-veneris Master rad

1

1. UVOD

Značaj biljnog sveta za mogućnost života na našoj planeti je ogroman. Biljke su glavni

izvor kiseonika. One tokom procesa fotosinteze oslobađaju znatne količine kiseonika, koji je

neophodan za život ljudi i životinja, kako na kopnu tako i u vodi.

Lekovite biljke se od davnina koriste u narodnoj medicini za lečenje bolesti ili

očuvanje zdravlja. Tokom čitave svoje istorije čovek je sticao veštinu u nalaženju lekovitih

biljaka, u njihovom gajenju i upotrebi pri lečenju. Najstarija pisana svedočenja o lekovitim

biljkama potiču iz vremena od oko 6000 godina p.n.e. [1]. Poslednjih decenija svetske

farmakološke industrije se u proizvodnji lekova ponovo usmeravaju ka sirovinama dobijenim

iz biljnog materijala. Danas je poznato oko 60 000 lekovitih i 18 000 aromatičnih biljaka [2].

Izuzetno prirodno bogatstvo Srbije se između ostalog ogleda i u oko 876 lekovitih biljnih

vrsta [1]. Zbog velike važnosti biljaka potrebno ih je dobro poznavati i to ne samo njihovu

građu i staništa, već i njihov hemijski sastav.

Aromatično bilje je od davnih vremena privlačilo pažnju čoveka koji ga je

upotrebljavao kao lek, začin, za aromatizaciju raznih napitaka, pripremu kozmetičkih ulja i

smola za ulepšavanje, kao i u druge svrhe. U XIX i XX veku dolazi do ekspanzije korišćenja

etarskih ulja i ona dobijaju sve veći farmakomedicinski i privredni značaj u celom svetu, a

njihova proizvodnja i upotreba ni danas nije ništa manja. Pomoću savremenih tehnika i

metoda otkriveno je da su etarska ulja složene smeše alifatičnih i aromatičnih jedinjenja i da

se sastoje od raznih ugljovodonika, alkohola, aldehida, ketona, estara, fenola, kiselina,

alkaloida i drugih supstanci. Ova jedinjenja predstavljaju sekundarne biljne metabolite koje

ona koristi u odbrambene svrhe ili pri interakciji sa okolinom (sa drugim biljkama,

biljojedima, patogenima i oprašivačima) [3].

Etarska ulja su lokalizovana u različitim delovima biljaka (cvet, list, stablo, koren,

plod, kora) pa u zavisnosti od toga ulja lokalizovana u različitim delovima iste biljke mogu

imati slični hemijski sastav ali se mogu i značajno razlikovati [4].

Ispitivanje hemijskog sastava etarskih ulja omogućuje pronalaženje novih načina

primene u raznim granama industrije. Među njima su od posebnog značaja: hemijska,


2

farmaceutska, parfimerijska, prehrambena, industrija boja i lakova, industrija pesticida i dr.

gde se etarska ulja i drugi ekstrakti koriste kao aditivi za hranu i pića, antiseptici, insekticidi i

za maskiranje mirisa različitih sintetičkih proizvoda [5].

Biljna vrsta Scandix pecten-veneris L. je jedna od najrasprostranjenijih iz roda

Scandix. Pripada grupi jestivih biljaka. Zbog svoje niske kaloričnosti dosta se koristi u

Mediteranskoj kuhinji, posebno u dijetalnoj ishrani. Konzumiranje ove biljne vrste u Grčkoj

je dokumentovano pre više od 2000 godina. Može se naći na teritoriji naše zemlje. Bogata je

mineralima, masnim kiselinama, ω–3 masnim kiselinama, proteinima i vlaknima [6].

U dosadašnjim ispitivanjima biljnih vrsta iz roda Scandix domaćih i stranih autora,

utvrđeno je da su najzastupljenije klase jedinjenja identifikovane u etarskom ulju, alkani kao i

masne kiseline i njihovi derivati.

Imajući u vidu napred iznešene činjenice, odlučili smo da korišćenjem trenutno

najsavremenije metode ispitamo:

Količinu i sastav etarskog ulja kao i sastav headspace uzorka i heksanskog

ekstrakta svežih nadzemnih delova biljke Scandix pecten-veneris L. sa lokacije

Oblačina (Merošina, Nišavski okrug) i da na osnovu dobijenih, kao i

predhodno objavljenih rezultata, uočimo hemotaksonomske karakteristike

biljne vrste.

Navedena istraživanja vršena su primenom sledećih metoda:

Izolovanje etarskog ulja - hidrodestilacija po Clevenger-u;

Priprema heksanskog ekstrakta;

Razdvajanje i analiza etarskog ulja - gasna hromatografija (GC) i kombinacija

metoda gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC/MS);

Analiza lako isparljivih komponenata uzorka - headspace metodom;

Analiza heksanskog ektrakta - gasna hromatografija (GC) i kombinacija

metoda gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC/MS).


3

2. OPŠTI DEO

2.1. Etarska ulja

Norme Francaise T75-006 definišu etarsko ulje kao: ˮProdukte dobijene iz biljne

sirovine procesom destilacije vodenom parom, mehaničkim ceđenjem perikarda agruma ili

jednostavnom destilacijom. Etarsko ulje se naknadno odvaja od vodene faze primenom

različitih fizičkih procesaˮ.

Etarska (eterična, esencijalna) ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte

biljnog tkiva. Na sobnoj temperaturi etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili

polučvrstu konzistenciju. Obično su bezbojna ili slabo obojena. Mogu imati bledo žutu do

bledo zelenu boju a neka ulja mogu biti obojena crveno, ljubičasto, što zavisi od prisustva

azulena koji ulju daju boju. Već na sobnoj temperaturi ulja su isparljiva pa zato u zavisnosti

od hemijskog sastava imaju i specifičan miris. Ona su lipofilna te se stoga dobro rastvaraju u

nepolarnim rastvaračima. Generalno se ne rastvaraju u vodi tj. samo mali broj sastojaka je

rastvorljiv u vodi. Etarska ulja nemaju tačno definisanu tačku ključanja.

Etarska ulja predstavljaju kompleksne liposolubilne smeše isparljivih jedinjenja

sintetisanih od strane biljaka: terpenoida (monoterpeni, nelaktonski seksviterpeni, neki

diterpeni), isparljivih alifatičnih jedinjenja (ugljovodonici, alkoholi i estri kratkog lanca,

karbonilna jedinjenja, masne kiseline i estri), isparljivih aromatičnih jedinjenja (fenilpropeni,

aromatični alkoholi i aldehidi itd.), jedinjenja sumpora (izotiocijanati, sulfidi, merkaptani,

heterociklična jedinjenja) i jedinjenja azota (aromatični amini, heterociklična jedinjenja,

glukozinolati).

Prilikom izolovanja etarskog ulja najvažnije je obezbediti dobar prinos i kvalitet

proizvoda. Najvažnije je napraviti pravilan izbor postupka, odnosno tehnike izdvajanja

etarskog ulja. Koji će se postupak primeniti zavisi od: vrste biljke, sadržaja ulja u biljci, dela

biljke iz koga će se etarsko ulje ekstrahovati (koren, stablo, list, cvet, plod i sl.), prinosa i


4

kvaliteta etarskog ulja koji obezbeđuje primenjeni postupak. Za ispitivanje hemijskog sastava

najviše se koriste hromatografske metode, pre svega gasna hromatografija.

Etarska ulja se najčešće dobijaju destilacijom vodenom parom (hidrodestilacijom) i to

u aparaturi po Clevenger-u, običnom destilacijom, destilacijom pod sniženim pritiskom,

presovanjem, ceđenjem ili ekstrakcijom pomoću različitih organskih rastvarača. Primena

etarskih ulja je raznovrsna. Upotrebljavaju se u medicini, farmaciji, parfimerijskoj i

kozmetičkoj industriji, prehrambenoj industriji i poljoprivredi [7].

2.2. Sistematika biljaka

Sistematika je biološka disciplina koja se bavi proučavanjem, razgraničavanjem,

upoređivanjem, hijerarhijom i filogenijom organskih vrsta. Sistematika je oblast biologije u

kojoj se definišu grupe organizama na osnovu njihovih odlika, da bi se zatim utvrdile veze

između tih grupa i preko tih veza grupe klasifikovale po različitim principima. Osobine po

kojima se vrši grupisanje mogu biti bilo koja svojstva organizma (fiziološke, morfološke,

ekoloske, biohemijske, genetičke, biogeografske i dr).

Različite grupe organizama nazivaju se taksoni. Taksoni koji imaju zajednička

svojstva grupišu se u taksone višeg nivoa. Stavljanje organizama u taksone koji se nalaze u

različitim hijerarhijskim nivoima naziva se klasifikacija, a nivo koji takson ima u klasifikaciji

naziva se sistematska ili taksonomska kategorija [8].

U sistematizaciji biljaka upotrebljavaju se taksonomske kategorije, odnosno jedinice

ili ˮtaksaˮ. Taksonomske kategorije predstavljaju novoe hijerarhije u biloškim

klasifikacijama, odnosno u taksonomiji. Ovim apstraktnim pojmovima dodeljuju se konkretna

značenja u vidu imena neke grupe organizama, čime je omogućeno određivanje hijerarhijske

pozicije tog taksona među svim živim bićima. Osnovna taksonomska kategorija je vrsta, a

postoje hijerahijski i niže (infraspecijske) i više (subspecijske) kategorije. Vrsta predstavlja

skup svih biljaka, odnosno jedinki, koje se slažu u najvećem broju, naročito biljnih

karakteristika, koje zauzimaju određen prostor ili areal i koje mogu imati potomstvo. Vrste se

međusobno razlikuju po konstantnim naslednim karakteristikama [9].


5

Kod varijabilnih vrsta razlikujemo sledeće infraspecijske jedinice: podvrste, varijetete

i forme. Podvrsta (subspecias) obuhvata biljne odlike u okviru vrsta koje nisu oštro

međusobno razgraničene, pri čemu se često radi o geografskim ili ekološkim populacijama.

Varijetet (varijetas) je još niža jedinica. Čije se jedinke međusobno razlikuju od drugih. Kod

kultivisanih biljaka, varijetetu odgovarajuća jedinica je sorta (cultivar), koja se odlikuje

specifičnim morfološkim, biološkim i proizvodnim osobinama.

U supraspecijske jedinice spadaju: rod (genus), familija (familia), red (ordo), klasa

(classis), odeljak (phylum) i carstvo (regnum).

Idući od roda ka carstvu sve je manji broj zajedničkih osobina koje karakterišu

određene taksonomske jedinice. Taksonomske jedinice se označavaju latinskim nazivom, pri

čemu se koriste ustaljeni nastavci pri imenovanju.

Filogenetsko stablo roda Scandix L. dato je u Tabeli 1.

Tabela 1. Filogenetsko stablo roda Scandix L.

Taksonomske kategorije Taksoni

Carstvo (regnum) Plantae

Podcarstvo (subregnum) Viridaeplantae

Odeljak (phylum) Tracheophyta

Pododeljak (subphylum) Euphyllophytina

Infraodeljak (infraphylum) Angiospermae

Klasa (classis) Magnoliopsida

Podklasa (subclassis) Asteridae

Red (ordo) Apiales

Familija (familia) Umbelliferae (Apiaceae)

Podfamilija (subfamilia) Apioideae

Pleme (tribus) Scandiceae

Rod (genus) Scandix

Epitet pecten-veneris L.

Botaničko ime Scandix pecten-veneris L.

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=Spermatophyta

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=Magnoliophyta

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=Magnoliopsida

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=Asteridae

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=Asterales


6

Pored toga što se sistematske jedinice označavaju latinskim imenima, za označavanje

imena vrste koristi se dvojna ili binarna nomenklatura, koju je predložio Linne – na primer:

Scandix pecten-veneris. Prvo ime (Scandix) je ime roda i piše se velikim početnim slovom,

dok je drugo ime (pecten-veneris) ime vrste i piše se, po pravilu malim početnim slovom. Ime

vrste ukazuje na neku njenu osobinu.

2.2.1. Familija Apiceae

Familija Apiaceae (Umbelliferae) obuhvata između 3000 i 3700 vrsta podeljenih u

300-450 rodova (tačan broj je predmet diskusije, pošto još uvek ne postoji definitivno

prihvaćena klasifikacija ove familije) rasprostranjenih po čitavoj planeti [10]. I pored gotovo

kosmopolitskog rasprostranjenja familije, većina rodova raste u severnoj umerenoj zoni, sa

posebno razvijenim centrom diverziteta u Mediteranskom i Irano-Turskom regionu. Biljke

ove familije, kako samonikle tako i kultivisane, od davnina imaju svoje mesto u čovekovoj

ishrani i tradicionalnoj medicini. U Srbiji fаmilijа Apiaceae je zаstupljenа sа 53 rodа i 138

vrsta [11].

2.2.2. Podfamilija Apioideae.

Podfamilija Apioideae je daleko najveća podfamilija sa oko 404 roda i preko 3000

vrsta. Biljke iz ove porodice su uglavnom zeljaste sa šupljim stabljikama i raznolikim, često i

višestruko perasto deljenim listovima [12]. Mnogi članovi ove podfamilije se razlikuju od

drugih podfamilija zbog posedovanja složene cvati. Dok je grupa bez sumnje monofiletska,

mnoga plemena i subplemena tradicionalno prepoznata u okviru ove podfamilije nisu.

Poznati predstavnici su:

- šargarepa (Daucus carota L.)

- celer (Apium graveolens L.)

- peršun (Petroselinum crispum)

- paštrnak (Pastinaca sativa L.)

- mirođija (Anethum graveolens L.)

- morač (Foeniculum vulgare Mill.)


7

- češljika (Scandix pecten-veneris L.)

- anis (Pimpinella anisum L.)

- kim (Carum carvi L.)

- korijander (Coriandrum sativum L.)

- kumin ili indijski kim (Cuminum cyminum L.)

- baštenska krasuljica (Anthriscus cerefolium L.)

- anđelika (Angelica spp.)

2.2.3. Rod Scandix L.

Rodu Scandix pripadaju jednogodišnje niske biljke, uglavnom sa tankim, vretenastim

korenom. Stabljika je jednostavna ili već od osnove razgranata, uspravna ili se izdiže,

prugasta, pri osnovi lisnih drški dlakava ili gola. Listovi su na lisnim drškama, 2–4 puta

perasto deljeni, sa dlakavim i po obodu opnastim rukavcem, goli ili proređeno dlakavi. Štitovi

su uglavnom sa malim brojem zrakova, a vršni štitovi mogu imati 1–3 gola zraka.

Involukruma najčešće nema, a listići involuceluma su eliptični ili lancetasti, često dvozubi ili

perasto deljeni. Cvetovi su hermafroditni i muški, sa belim kruničnim listićima, koji po obodu

nekada mogu biti i veći. Plod je uglavnom linerano izdužen, sa dugačkim kljunom, a

merikarpijumi su sa 5 zatupastih, jednakih rebara. Brazde sa dorzalne strane su sa 1–3 kanala

sa etarskim uljem, a sa ventralne strane locirana su još dva žlezdana kanala. Stubići su dužine

stilopodijuma ili mnogo duži.

Rod obuhvata oko 15 vrsta rasprostranjenih većinom u oblasti Sredozemlja, a na

teritoriji Srbije raste samo jedna vrsta – S. pecten-veneris L. Literaturni podaci ukazuju na

postojanje još i podvrste S. australis L. subsp. balcanica, međutim, novija istraživanja ne

ukazuju na prisustvo ovog taksona u flori Srbije.

2.2.4. Scandix pecten-veneris L.

Scandix pecten-veneris (češljika, venerina češljika, zmijin češalj, eng. shepherd’s

needle, venus-comb) je jednogodišnja biljka visine 15–20 cm, ali može narasti i do 50 cm.

Raste u Evropi po poljima, neobrađenim površinama i pored puteva [13].


8

Koren je tanak, vretenast (Slika 1.). Stabljika je jednostavna ili razgranata od osnove,

prugasta, kod lisnih drški gola ili maljava. Listovi su na drškama, goli ili dlakavi, 3–4 puta

perasto deljeni, sa lancetastim ili končastim režnjevima poslednjeg reda. Štitovi sa 1–3

najčešče gola zraka, bez involukruma, involucelum od većeg broja listića, oko 10

hermafroditnih i muških cvetova, beli krunični listići. Plod je dužine 2–8 cm, sa 3–4 puta

dužim kljunom.

Slika 1. Scandix pecten-veneris L.


9

2.3. Dosadašnja ispitivanja hemijskog sastava etarskog ulja Scandix pecten-

veneris L.

Jedan od radova u kome je vršena analiza etarskog ulja Scandix pecten-veneris je iz

2014. godine. Ispitivan je sastav etarskog ulja vrste Scandix pecten-veneris L. kao samoniklog

bilja u Srbiji [14].

Po njihovim rezultatima, iz suvih nadzemnih delova S. pecten-veneris sa lokacije Niš i

okolina, dobijeno je 0.08–0.18% etarskog ulja iz 7 uzoraka. Prinos ulja kretao se od 0,08 do

0,12% za nadzemni deo, 0,08 do 0,15% za plodove i 0,16 do 0,18% za koren [14]. Analizom

etarskog ulja pomoću GC/MS identifikovano je ukupno 123 komponenti. Većina

identifikovanih komponenti mogu se svrstati u sledeće grupe: alkani (11,1-78,1%), masne

kiseline i jedinjenja vezana na njih (4,2-30,7%), ugljovodonični monoterpeni (do 0,4%),

oksigenovani monoterpeni (u tragovima), ugljovodonični seskviterpeni (do 25,3%),

oksigenovani seskviterpeni (do 1,3%), ditepreni (do 2,2%), fenilpropanoidi (do 12,4%) i

ostalo (0,5-63%). Glavne komponente u etarskom ulju S. pecten-veneris su alkani i to:

pentadekan (1,3-23,5%) i tridekan (8,5-50,7%). Od terpenskih jedinjenja najzastupljeniji je

(E)-caryophyllene (do18,5%). Strukture najzastupljenijih komponenti date su na Slici 2.

Slika 2. Najzastupljenije komponente u ulju S. pecten-veneris.


10

2.4. Gasna hromatografija (GC)

Većina gasnih hromatografa se sastoji iz sledećih delova: rezervoar sa nosećim gasom,

merač protoka gasa, isparivač, injektor, gasnohromatografska kolona, termostat, detektor i

pisač. Šema jednog standardnog gasnog hromatografa data je na Slici 3.

Slika 3. Šema standardnog gasnog hromatografa

Kao gas nosač mogu da se koriste H2, He i Ar. Noseći gas je neophodno da bude

visoke čistoće i hemijski inertan u odnosu na uzorak i tečnu fazu i od njega veoma zavisi

osetljivost detekcije i u manjoj meri efikasnost GC kolone. Takođe i brzina protoka gasa utiče

na efikasnost GC kolone.

GC kolona je cev u kojoj se nalazi nepokretna faza. Izrađuje se od metala (nerđajući

čelik, bakar ili aluminijum) ili stakla. Uobičajena dužina pakovanih kolona je od 0,5 do 4 m a

unutrašnji prečnici su im od ~1 do 4 mm. Sa dužim kolonama postižu se bolja razdvajanja ali

se produžava i vreme analize. Pored toga, kod dužih kolona, potrebni su i veći pritisci nosećeg

gasa. Takođe sa smanjenjem prečnika kolone povećava se i njena efikasnost. Tradicionalno

kolone u gasno hromatografskoj analizi se dele na dve osnovne vrste: pakovane kolone i

kapilarne kolone. Kapilarne kolone imaju znatno veće dužine (30-150 m) i znatno manje

unutrašnje prečnike (0,25 – 0,75 mm) i efikasnije su.

Kolona se nalazi u posebnom termostatu čija temperatura može precizno da se

reguliše. Temperaturna zavisnost molekularne adsorpcije pojedinih komponenata smeše i

njihovo kretanje kroz kolonu zahteva veoma pažljivu kontrolu temperature, čak do nekoliko


11

desetih delova stepena. Smanjenje temperature dovodi do boljeg razdvajanja komponenti ali

takođe i do dugačkog eluacionog vremena (vremena izlaženja). Zbog ovoga je uveden i

takozvani temperaturni program, gde se temperatura postepeno povećava ili smanjuje u

zavisnosti od potrebe.

Detektor je direkno povezan sa izlazom iz kolone, tako da sve što je sa nje eluirano,

zajedno sa nosećim gasom prolazi kroz njega. U gasnoj hromatografiji se koriste više vrsta

detektora. Najpoznatiji i najkorišćeniji među njima su plameno jonizacioni detektor (FID) i

termo provodljivi detektor (TCD). Oba detektora su dosta univerzalna i mogu detektovati

veliki opseg komponenti sa širokom varijacijom koncentracije. Termalno provodljivi

detektori su za nijansu univerzalniji i mogu detektovati većinu komponenti čija je termalna

provodljivost veća od termalne provodljivosti nosećeg gasa, na zadatoj temperaturi. Plameno

jonizacioni detektori su osetljiviji na ugljovodonična jedinjenja i ne mogu detektovati vodu.

Takođe prednost TCD detektora nad FID detektorom je da ne uništava ispitivane komponente

(plameno jonizacioni ih sagoreva) i mogu se postaviti u seriji prilikom analize što omogućava

dodatna ispitivanja za jednu te istu komponentu.

2.4.1. Parametri identifikacije

Retenciono vreme – dužina boravka nekog jedinjenja u GC koloni najčešće se

izražava pomoću retencionog vremena, koje predstavlja vreme koje protekne od trenutka

injektovanja smeše u kolonu do pojave maksimuma signala.

Retencioni indeksi – da bi se olakšala identifikacija organskih jedinjenja u smislu

uporedivosti rezultata dobijenih na različitim instrumentima i pri različitim uslovima, uveden

je sistem retencionih indeksa (RI). Retencioni inteks nekog jedinjenja je relativna veličina i

predstavlja njegov log tR izražen preko skale izvedene iz vrednosti log tR za referentne n-

alkane. Ako se vrednostima log tR n-alkana pripišu vrednosti n x 100, dobija se skala

retencionih indeksa u kojoj su, bez obzira na uslove hromatografisanja, dva uzastopna n-

alkana razdvojena za 100 jedinica. Ovako izvedena skala može da se primeni samo na

jedinjenja hromatografisana pod potpuno istim uslovima kao i referentni n-alkani [15].


12

2.4.2. Gasnohromatografska analiza

Metode identifikacije jedinjenja pomoću gasne hromatografije mogu se podeliti u dve

grupe:

Gasnohromatografske metode (bez primene drugih metoda),

Gasnohromatografske metode u kombinaciji sa drugim metodama

(instrumentalne ili hemijske).

2.4.3. Headspace GC metoda

Headspace je gas koji se nalazi u prostoru iznad uzorka u gasnohromatografskoj viali.

Zagrevanjem uzorka na nižim temperaturama lakše isparljive komponente difunduju u prazan

prostor iznad uzorka u viali, prelazeći u gasnu fazu i formirajući pritom ˮheadspaceˮ gas, što

je prikazano na Slici 4. Headspace analiza je stoga analiza prisutnih komponenti u tom gasu

[16].

Ova analiza je najpogodnija za analizu vrlo lako isparljivih supstanci u čvrstim ili

tečnim uzorcima koji se mogu lako klasifikovati po obimu lako isparljivih komponenti. Teže

isparljive komponente sa višom tačkom ključanja ili polu-isparljive komponente nisu

detektovane ovom metodom, zbog niskog sadržaja u gasnoj fazi.

Kompleksni uzorci (sa složenim matriksom) koji bi inače bili nepogodni za direknu

analizu ili bi zahtevali dodatne pripreme (izdvajanje uzorka), su idealni za ovu metodu jer se

mogu staviti direkno u vialu i analizirati.

Headspace GC se koristi za analizu isparljivih i polu-isparljivih organskih supstanci u

čvrstim i tečnim uzorcima. Popularnost ove metode je porastao tokom poslednjih godina i

sada je svetski priznata kod ispitivanja alkohola u krvi i zaostalih rastvarača u farmaceutskim

proizvodima. Drugi uobičajeni primeri korišćenja ove metode su: industrijske analize

monomera u polimerima, analiza pića i prehrambenih proizvoda, analiza parfema i

kozmetičkih preparata.


13

Slika 4. Prikaz nastajanja “headspace“ gasa

2.5. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS)

Kombinacija gasne hromatografije sa masenom spektrometrijom jedna je od

najmoćnijih metoda za identifikaciju organskih jedinjenja složenih smeša. Velika osetljivost

masenog spektrometra (potrebna količina uzorka je reda ~10-10 g), kao i mogućnost brzog

snimanja masenog spektra (manje od 1 s) omogućavaju direkno povezivanje GC kolone sa

masenim spektrometrom i direkno snimanje masenih spektara svih eluiranih jedinjenja.

Analizom ovih spektara dolazi se do struktura jedinjenja sastojaka ispitivane smeše. Prema

tome kod ove kombinacije, uloga gasne hromatografije se svodi na razdvajanje a uloga

spektrometrije na identifikaciju komponenti.

Veliki problem kod povezivanja ova dva instrumenta je taj sto oni rade na različitim

pritiscima. Dok je u masenom spektrometru visoki vakuum na izlazu iz GC kolone pritisak je

nešto iznad atmosferskog, da bi se ova razlika kompenzovala a istovremeno povećala

koncentracija jedinjenja koja dospevaju u jonski izvor masenog spektrometra, GC kolone se

povezuju sa jonskim izvorom preko separatora. Zadatak separatora je selektivno uklanjanje

malih molekula nosećeg gasa iz eluata i propuštanje znatno većih organskih molekula u jonski

izvor [15].

U sistemu GC/MS pored snimanja masenih spektara, maseni spektrometar ima ulogu

gasnohromatografskog detektora. Neprekidnim merenjem ukupne jonske struje (TIC) tj. sume

struja svih jona koji postoje u jonskom izvoru za vreme hromatografisanja dobija se gasni


14

hromatogram. Maseni spektar se dobija merenjem struja koje potiču od jona razdvojenih

prema m/z vrednostima. Maseni spektar se predstavlja kao zavisnost jonske struje od m/z

vrednosti. Uobičajeno je da se intenzitet jonske struje u masenom spektru izražavaju (u %) u

odnosu na intenzitet najobilnijeg jona – osnovnog jona koji iznosi 100%.

Savremeni GC/MS uređaji su povezani sa računarom, što veoma proširuje mogućnosti

metode. Kompjuterom se mogu obavljati niz operacija, od kojih su najvažnije:

- Neprekidna kontrola rada celog uređaja;

- Neprekidno automatsko snimanje masenih spektara za vreme hromatografisanja;

- Prikupljanje, obrada i skladištenje svih GC/MS podataka;

- Naknadna popravka gasnih hromatograma i masenih spektara;

- Određivanje bruto formula jona na osnovu precizno izmerenih masa;

- Identifikacija jedinjenja poređenjem njihovih masenih spektara sa spektrima poznatih

jedinjenja iz baza.

Veliki značaj povezivanja GC/MS sistema sa računarom se ogleda u tome što se

snimljeni spektri mogu odmah upoređivati sa spektrima poznatih jedinjeja iz baza računara.

Ako se radi o jedinjenju čiji spektar ne postoji u bazi, onda je često moguće, na osnovu

sličnosti sa spektrom nekog poznatog jedinjenja predpostaviti kom strukturnom tipu ono

pripada.

Primena računara omogućuje uklanjanje jednog od čestih problema kod GC/MS

analize a to je eluiranje tečne faze sa kolone i to posebno na višim temperaturama. Zbog toga

se u masenim spektrima hromatografisanih jedinjenja često javljaju maksimumi koji potiču od

tečne faze. Korišćenjem softvera moguće je naknadno uklanjanje maksimuma koji potiču od

tečne faze.

2.5.1. Kvantitativna GC/MS analiza

Kod kvantitativne GC/MS analize maseni spektrometar se koristi isključivo kao GC

detektor. Njegove prednosti su u većoj univerzalnosti, kao i mogućnosti selektivne detekcije


15

pojedinih jedinjenja ili klasa. Zbog toga se ova metoda koristi za određivanje mikrokoličina

organskih jedinjenja u složenim smešama. Mnogobrojni su primeri primene ove metode za

kvantitativna određivanja biološki aktivnih jedinjenja kao što su: steroidi, alkaloidi, ostaci

pesticida i mnoga druga.

Da bi se postigla selektivna detekcija pojedinih jedinjenja, što je od posebnog interesa

kod kvantitativnog određivanja, neophodno je merenje promene jonske struje koja potiče

samo od jednog jona, karakterističnog za jedinjenja koje se određuje. Postoje tri načina

merenja intenziteta izabranih jonskih struja. To su:

1. Masena hromatografija;

2. Detekcija jednog jona;

3. Masena fragmentografija ili detekcija više jona.

Kod masene hromatografije (1) tokom hromatografisanja automatski se unose u

memoriju računara kompletni maseni spektri svega što je eluirano sa kolone. Po završenom

hromatografisanju dobija se na jednostavan način, uz pomoć računara, promena struje, tj.

maseni hromatogram.

Metoda detekcije jednog jona (2) sastoji se u neprekidnom merenju intenziteta jonske

struje na samo jednoj m/z vrednosti. Jonska struja na odabranoj m/z vrednosti se meri sve

vreme, dok se jedinjenje iz kog taj jon potiče nalazi u jonskom izvoru masenog spektrometra.

Vreme boravka nekog jedinjenja u jonskom izvoru zavisi od brzine eluiranja. Zbog toga se na

ovaj način postiže znatno veća osetljivost nego kod masene hromatografije kod koje se

snimaju kompletni maseni spektri.

Masena fragmentografija (3) koja je po osetljivosti između prve dve, sastoji se u

merenju promene intenziteta više jonskih struja koje potiču od jona različite m/z vrednosti. To

se kod aparata sa magnetnim analizatorom postiže cikličnom promenom napona i njegovim

zadržavanjem na odabranim m/z vrednostima. Na ovaj način se postiže istovremena detekcija

više jedinjenja i to sa većom osetljivošću nego kod masene hromatografije. Osetljivost se

smanjuje sa povećanjem broja odabranih jona [15].


16

3. EKSPERIMENTALNI DEO

3.1. Biljni material

Biljni materijal vrste Scandic pecten-veneris L. sakupljen je u fazi delimičnog cvetanja

(nadzemni deo biljke). Biljni material je identifikovao Bojan Zlatković i vaučer primerak je

deponovan u herbarijumu Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, Departmana za biologiju i

ekologiju, pod rednim brojem 10871 (Oblačina, ruderalna staništa, 2015).

3.2. Izolovanje etarskog ulja i heksanskog ektrakta

Etarsko ulje dobijeno je postupkom hidrodestilacije svežih usitnjenih nadzemnih

delova biljke (faza delimičnog cveta) u aparaturi po Clevenger-u u trajanju od 2 sata. Ulje je

zatim ekstrahovano od vodene faze dietil-etrom, a dietil-etarski ekstrakt ulja sušen je

anhidrovanim Na2SO4. Posle odvajanja sušila ceđenjem, dietil-etar je uklonjen destilacijom na

rotacionom vakuum uparivaču na sobnoj temperaturi, a etarsko ulje je preneto u vialu i

čuvano na hladnom i tamnom mestu do analize.

Sveži i usitnjeni nadzemni delovi (2 g) ispitivane vrste stavljeni su u erlenmajer i

potopljeni sa 10 ml heksana (HPLC čistoće). Nakon nekoliko dana ekstrakt je ceđen kroz

mikrofilter i prenet u vialu, koja je čuvana na hladnom do analize.

Za headspace metodu uzeto je 0,5 g svežih usitnjenih nadzemnih delova ispitivane

vrste.

3.3. Analiza etarskog ulja, ekstrakta i headspace-a

3.3.1. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS) i gasna hromatografija

(GC)

Hemijski sastav ulja je analiziran pomoću GC i GC/MS. GC/MS analiza je izvedena

korišćenjem Agilent 7890 gasnog hromatografa kuplovanog sa 7000B GC/MS/MS triple

quadrupole masenim spektrometrom u MS1 scan modu. Gasni hromatograf je opremljen


17

kapilarnom kolonom HP-5MS (5% fenilmetilsiloksana, 30 m * 0,25 mm, debljina filma 0,25

μm, Agilent Technologies, USA), i opremljen je Combi PAL semplerom i Headspace

G6501B/G6509B. Kao noseći gas korišćen je helijum, pri konstantnom protoku od 1 ml/min

tokom celog vremena analize. Pulsno je injektirana zapremina od 1,0 μl rastvora etarskog ulja

u dietil-etru (razblaženje je 1/100) splitovana u odnosu 40:1. Temperaturni uslovi: radna

temperatura injektora i detektora 250oC, odnosno 300oC. Kolona je linearno programirana u

opsegu 50oC – 290oC sa temperaturnim gradijentom od 4oC/min. Jonizacija je vršena

elektronima energije 70 eV, sa detekcijom u m/z opsegu 40 – 460 (brzina skeniranje je bila 5

skenova u sekundi) a vreme skeniranja 0,32 sekunde.

Hemijski sastav headspace uzoraka je analiziran na istom aparatu pod sledećim

uslovima: oko 500 mg svežeg biljnog materijala (nadzemni delovi), stavljeno je u 20 ml HS

vialu. Uzorak je zagrevan na 80oC tokom 20 min uz mešanje (program meša 5 sekundi uz

pauzu od 2 sekunde). 500 μl isparenja izdvojenih iz nadzemnih delova je izvučeno iz bočice

pomoću gasnog šprica (90oC) i ubrizgano direktno u hromatografsku kolonu preko transfer

linije (75oC).

GC (FID) analiza je rađena pod istim eksperimentalnim uslovima. Procentualni sastav

pojedinih komponenata određen je na osnovu površina pikova, bez korišćenja korekcionih

faktora.

3.3.2. Identifikacija komponenti

Podaci su obrađeni AMDIS (ver. 2,7) i NIST MS Search programskim paketima (ver.

2.0d, Nacionalni institut za standarde i tehnologiju (NIST), SAD). AMDIS je korišćen za

dekonvoluciju masenog skena, tj. ekstrakciju masenih spektara iz skenova preklopljenih

pikova, dok je NIST MS Search obezbedio algoritam za pretragu biblioteka masenih spektara.

Hemijski sastav ispitivanih uzoraka određen je upoređivanjem linearnih retencionih indeksa

pojedinih sastojaka (Adams, 2007) [17], izračunatih u odnosu na retenciona vremena C7 -

C32 n-alkana (Van den Dool et al, 1963), sa literaturnim vrednostima, poređenjem masenih

spektara sa spektrima jedinjenja iz biblioteka Wiley Registry of Mass Spectral Data 6th

Edition, NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 05, Mass Finder 2.3, Adams (Adams, 2007)

kao i koinjektiranjem standardnih supstanci (alkani, nekoliko terpenoida, steroida i

aromatičnih jedinjenja, sintetisana jedinjenja).


18

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Hemijska analiza ispitivanih uzoraka

4.1.1. Sadržaj i hemijski sastav etarskog ulja ispitivane vrste S. pecten-veneris

Količina etarskog ulja svežih nadzemnih delova ispitivane vrste S. pecten-veneris u

fazi delimičnog cvetanja iznosi 0,022%.

Hemijski sastav ulja svežih nadzemnih delova S. pecten-veneris dat je u Tabeli 2. a

hromatogram je prikazan na Slici 5.

Slika 5. Hromatogram etarskog ulja biljne vrste S. pecten-veneris

U etarskom ulju ispitivane vrste identifikovano je 50 jedinjenja, što čini 98,7%

celokupnog etarskog ulja.

Najzastupljenija klasa jedinjenja su alkani koji čine 59,1%. Seskviterpeni su

zastupljeni sa udelom od 27,1% sa udelom ugljovodoničnih seskviterpena od 26,7% prema

0,4% oksigenovanih seskviterpena. Monotepeni su zastupljeni sa svega 0,3%.


19

Fenilpropanoida ima 4,8%. Green leaf jedinjenja ima 0,5%. Masnih kiselina i njihovih

derivata ima 5,5%. Diterpena ima vrlo malo, svega 0,5%. Neterpenoidna jedinjenja čine 0,9%

etarskog ulja.

Najzastupljenija komponenta etarskog ulja (nadzemnih delova) ispitivane vrste je

tridekan sa udelom od 36,5%, što čini više od 1/3 ukupne mase ulja. Ostale najzastupljenije

komponente etarskog ulja su: pentadekan sa udelom od 18,2% i (E)-cariophyllene sa udelom

od 18,1%. Kvantitativno značajne komponente ulja, čiji udeo prelazi 3%, su i: germacren B

(3,9%), (E)-pseudoisoeugenyl isobutyrate (3,9%), tetradecanal (3,2%) i heptadekan (3,1%).

Strukture ovih komponenti date su na Slici 6.

Na osnovu naših rezultata i do sada publikovanih rezultata ispitivanja hemijskog

sastava etarskog ulja Scandix pecten-veneris, može se uočiti da postoje delimične razlike u

pogledu, ne samo broja identifikovanih komponenti, već i zastupljenosti najvažnijih, kao i u

količini dobijenog ulja. Moguće je da se neslaganje rezultata javlja usled različitih

karakteristika lokaliteta sa kojih je prikupljen materijal. Takođe, kvantitativne razlike mogu

poticati i od načina pripreme biljnog materijala obzirom da je prethodno istraživanje rađeno

na suvoj biljci dok se naša analiza odnosi na svež nadzemni deo. Naši rezultati sugerišu da S.

pecten-veneris u okviru roda Scandix treba svrstati u grupu vrsta koje sadrže velike količine

alkana i da ova biljna vrsta pripada uljem siromašnim vrstama.


20

Slika 6. Strukture najzastupljenijih komponenti u etarskom ulju Scandix pecten-veneris L


21

Tabela 2. Sastav (%) etarskog ulja svežih nadzemnih delova S. pecten-veneris

RI Name Klasa Udeo % 1 853 (Z)-3-Hexen-1-ol G 0.3 2 867 1-Hexanol G tr 3 978 β-Pinene MT tr 4 1031 β-Phellandrene MT 0.1 5 1034 1,8-Cineole MT tr 6 1039 (Z)-β-Ocimene MT tr 7 1046 Benzeneacetaldehyde O tr 8 1049 (E)-β-Ocimene MT tr 9 1100 Undecane A 0.5 10 1105 Nonanal G tr 11 1145 (Z)-3-Hexenyl isobutanoate G 0.1 12 1200 Dodecane A 0.2 13 1224 β-Cyclocitral MT tr 14 1265 cis-Chrysanthenyl acetate MT* 0.2 15 1293 1-Tridecene FA 0.1 16 1301 Tridecane A 36.5 17 1306 (E)-2-Tridecene FA 0.2 18 1316 (Z)-2-Tridecene FA tr 19 1382 α-Copaene ST tr 20 1393 1-Tetradecene FA tr 21 1397 β-Elemene ST 0.1 22 1400 Tetradecane A 0.5 23 1407 Methyl eugenol PP tr 24 1410 Dodecanal G 0.1 25 1427 (E)-Caryophyllene ST 18.1 26 1439 γ-Elemene ST 0.1 27 1461 α-Humulene ST 1.0 28 1488 Germacrene D ST 0.3 29 1494 1-Pentadecene FA 0.6 30 1501 Pentadecane A 18.2 31 1504 Bicyclogermacrene ST 2.8 32 1512 Tridecanal FA 0.2 33 1513 Premnaspirodiene ST tr 34 1517 BHT** O 0.9 35 1530 δ-Cadinene ST 0.2 36 1566 Germacrene B ST 3.9 37 1592 Caryophyllene oxide ST* 0.3 38 1601 Hexadecane A 0.1


22

39 1614 Tetradecanal FA 3.2 40 1650 α-Muurolol ST* 0.1 41 1663 Valerianol ST 0.2 42 1680 8-Heptadecene* FA 1.1 43 1701 Heptadecane A 3.1 44 1749 (E)-Pseudoisoeugenyl isobutyrate PP 3.9 45 1801 Epoxy-pseudoisoeugenyl isobutyrate PP 0.4 46 1818 Hexadecanal FA 0.1 47 1847 (E)-Pseudoisoeugenyl 2-methylbutyrate PP 0.5 48 2115 Phytol DT 0.5 49 2700 Heptacosane A tr 50 2900 Nonacosane A tr ukupno: 98,7 %

Alkani – A 59,1%

Seskviterpeni 27,1% ugljovoonični – ST 26,7% oksigenovani – ST* 0,4%

Monotpeni 0,3% ugljovodonični – MT 0,1% oksigenovani – MT* 0,2%

Diterpeni 0,5% ugljovodonični – DT 0,5%

Neterpeni 11,7%

Fenilpropanoidi – PP 4,8% Masne kiseline i njihovi derivati – FA 5,5% ˮGrean leafˮ jedinjenja – G 0,5% ostalo – O 0,9% * stereohemija nije određena (cis- ili trans-)

** potiče od etra

Jedinjenja su prikazana po redosledu eluiranja na HP-5 MS koloni.

RI – eksperimentalno određeni indeksi na pomenutoj koloni metodom koinjektiranja

homologe serije n-alkana C8-C32; tr – tragovi (<0,1%); osenčana su polja koja se odnose na

najzastupljenije komponente (>3%).


23

4.1.2. Hemijski sastav headspace-a ispitivane vrste S. pecten-veneris

Uporedo sa analizom etarskog ulja vršena je i headspace analiza tj. analiza lako

isparljivih komponenti iz nadzemnih delova biljne vrste S. pecten-veneris. Izgled

hromatograma dat je na Slici 7. a hemijski sastav headspace-a je prikazan u Tabeli 3.

Slika 7. Izgled headspace hromatograma biljne vrste S. pecten-veneris

Analizom headspace-a identifikovano je 26 komponenti što čini ukupno 99%.

Najzastupljenija klasa jedinjenja su alkani koji čine 80,4%. Seskviterpena ima 11,7% od toga

ugljovodonični čine 11,2% a oksigenovani svega 0,5%. Monoterpena ima 4,1% i to isključivo

ugljovodoničnih monoterpena. Masnih kiselina i njihovih derivata ima 1,2%. Diterpeni nisu

identifikovani. Neterpenoidna jedinjenja čine 1,6%.

Utvrđeno je da su od svih lako isparljivih komponenti najzastupljenije sledeće:

tridekan (51,1%), pentadekan (27,1%) i (E)-caryophyllene (5,7%). Ove tri komponente čine

više od 4/5 prisutnih komponenti. Strukture najzastupljenijih komponenti prikazane su na

Slici 8.


24

Slika 8. Strukture najzastupljenijih komponenti headspace analize S. pecten-veneris

Na osnovu dobijenih rezultata analize headspace-a možemo zaključiti da se hemijski

sastav lakše isparljivih komponenti ne razlikuje od sastava etarskog ulja ispitivane vrste S.

pecten-veneris. Razlike koje možemo uočiti u odnosu na etarsko ulje su te da je u headspace-u

prisutno manje komponenata i da su neke komponente zastupljene sa mnogo većim udelom

nego li što je to bio slučaj kod ulja. Uzrok prisustva ovakve razlike je taj što su kod headspace

analize u uzorku prisutne samo one komponente sa nižim tačkama ključanja, dok u sastav ulja

ulaze i komponente sa mnogo većim tačkama ključanja, koje se kod headspace analize, pri

datim temperaturnim uslovima nisu mogle izdvojiti iz uzorka biljnog materijala.

Tabela 3. Sastav (%) headspace-a svežih nadzemnih delova S. pecten-veneris

RI Name Klasa Udeo % 1 803 Hexanal G 0.5 2 855 (Z)-3-Hexen-1-ol G 0.7 3 867 1-Hexanol G 0.4 4 893 Styrene MT 2.7 5 936 α-Pinene MT 0.5 6 980 β-Pinene MT tr


25

7 1027 o-Cymene MT tr 8 1032 β-Phellandrene MT 0.5 9 1035 1,8-Cineole MT 0.4 10 1062 γ-Terpinene MT tr 11 1101 Undecane A 1.1 12 1301 Tridecane A 51.1 13 1306 (E)-2-Tridecene FA 0.4 14 1381 α-Copaene ST 1.3 15 1401 Tetradecane A 0.6 16 1428 (E)-Caryophyllene ST 5.7 17 1462 α-Humulene ST 0.5 18 1489 Germacrene D ST 1.4 19 1495 1-Pentadecene FA 0.8 20 1501 Pentadecane A 27.1 21 1504 Bicyclogermacrene ST 0.9 22 1531 δ-Cadinene ST 0.5 23 1567 Germacrene B ST tr 24 1650 α-Muurolol ST* 0.5 25 1664 Valerianol ST 0.9 26 1702 Heptadecane A 0.5

ukupno: 99,0% Alkani – A 80,4% Seskviterpeni 11,7% ugljovodonični – ST 11,2% oksigenovani – ST* 0,5% Monoterpeni 4,1% ugljovoonični – MT 4,1% Diterpeni - ugljovodonični – DT - Neterpeni 2,8% ˮGrean leafˮ jedinjenja – G 1,6% masne kiseline i njihovi derivati – FA 1,2%






26

4.1.3. Hemijski sastav heksanskog ekstrakta S. pecten-veneris

Za analizu isparljivih komponenti biljne vrste S. pecten-veneris vršeno je i ispitivanje

hemijskog sastava heksanskog ekstrakta. Analizom je utvrđeno prisustvo 30 komponenti što

čini 100,0%.

Prikaz hromatograma dat je na Slici 9. a hemijski sastav ekstrakta (u %) je prikazan u

Tabeli 4.

Slika 9. Hromatogram heksanskog ekstrakta biljne vrste S. pecten-veneris

Najzastupljeniji su: tridekan (46,5%), nonakozan (16,5%), pentadekan (13,3%) i

heptakozan (3,1%). Alkani su najzastupljeniji sa udelom od čak 90,9%. Masne kiseline i

njihovi derivati čine 5,6%. Seskviterpeni čine 2,4%, od toga oksigenovani 0,2% a

ugljovodonični 2,2%.. Diterpeni i to ugljovodonični su prisutni sa udelom od 0,8%.

Monoterpena nema. Ostala jedinjenja čine 0,4%.

Na osnovu naših i rezultata drugih autora možemo zaključiti da u sastavu ekstrakta

ispitivane vrste S. pecten-veneriss najzastupljeniju klasu jedinjenja čine alkani. Među

najzastupljenijim komponentama nalaze se one koje dominiraju u ulju. Bitna razlika je ta što

je broj komponenti značajno manji u odnosu na onaj iz ulja i što se kod ekstrakta javlja veći

procenat neterpenskih komponenti najviše alkana. Razlog ovakve razlike u hemijskom i


27

procentualnom sastavu je taj što je za ekstrakt korišćen heksan tj. rastvarač niske polarnosti,

kojim su uspešno estrahovane komponente manje polarnosti i većih molekulskih masa a koje

nisu ili su u manjoj meri izolovane hidrodestilacijom u ulju.

Tabela 4. Hemijski sastav heksanskog ekstrakta nadzemnih delova S. pecten-veneris

RI Name Klasa Udeo % 1. 800 Octane A 0.2 2. 900 Nonane A 0.3 3. 925 Methyl hexanoate FA 0.4 4. 1100 Undecane A 1.2 5. 1117 Methyl 4-octenoate FA 0.6 6. 1200 Dodecane A 0.3 7. 1301 Tridecane A 46.5 8. 1400 Tetradecane A 0.5 9. 1427 (E)-Caryophyllene ST 2.0 10. 1482 6-Pentadecene* FA 0.2 11. 1493 1-Pentadecene FA 0.3 12. 1497 2-Tridecanone O 0.4 13. 1501 Pentadecane A 13.3 14. 1503 Bicyclogermacrene ST tr 15. 1566 Germacrene B ST 0.2 16. 1600 Hexadecane A tr 17. 1614 Tetradecanal FA 0.4 18. 1655 α-Muurolol ST* 0.2 19. 1680 8-Heptadecene* FA 2.4 20. 1700 Heptadecane A 2.4 21. 1928 Methyl hexadecanoate FA 0.8 22. 2102 Methyl linoleate FA 0.4 23. 2114 Phytol DT 0.8 24. 2400 Tetracosane A 0.4 25. 2500 Pentacosane A 1.2 26. 2600 Hexacosane A 1.8 27. 2700 Heptacosane A 3.1 28. 2800 Octacosane A 2.0 29. 2901 Nonacosane A 16.5 30. 3000 Triacontane A 1.2

ukupno: 100,0% Alkani – A 90,9% Seskviterpeni 2,4% ugljovodonični – ST 2,2% oksigenovani – ST* 0,2%


28

Diterpeni 0,8% ugljovodonični - DT 0,8% Neterpeni 6% masne kiseline i njihovi derivati – FA 5,6% ostalo – O 0,4% * stereohemija nije određena (cis- ili trans-)






29

5. ZAKLJUČAK

U ovom radu ispitivan je hemijski sastav etarskog ulja, headspace isparljivih

komponenti i heksanskog ekstrakta svežih nadzemnih delova vrste Scandix pecten-veneris L.

sa lokacije Oblačina (ruderalna staništa).

Dobijeni su sledeći rezultati:

- Prinos etarskog ulja svežih nadzemnih delova ispitivane vrste S. pecten-veneris u fazi

punog cvetanja od 0,022% svrstava ovu biljnu vrstu u uljima siromašne vrste.

- U etarskom ulju svežih nadzemnih delova ispitivane biljne vrste identifikovano je 50

komponenti, što čini 98.7% ulja. Najzastupljenija klasa jedinjenja u ulju su alkani

(više od 1/2). Seskviterpeni čine više od 1/4 ukupno identifikovanih komponenti, sa

većom zastupljenošću ugljovodonočnih u odnosu na oksigenovane. Najzastupljenije

komponente u etarskom ulju su: tridekan (36,5%), pentadekan (18,2%) i (E)-

cariophyllene (18,1%). Headspace analizom potvrđeno je prisustvo lako isparljivih

komponenti iz ulja. Utvrđeno je prisustvo 26 komponenti prisutnih i u etarskom ulju,

sa udelom pojedinih komponenti u mnogo većem procentu. Alkani su dominantna

klasa jedinjenja sa 80,4% dok su seskviterpeni prisutni sa 11,7%. Glavne komponente

su: tridekan (51,1%), pentadekan (27,1%) i (E)-caryophyllene (5,7%). Razlike u

prisustvu komponenti i njihovom procentnom sastavu u odnosu na etarsko ulje

posledica su različitih tački ključanja ovih komponenti.

- Analizom heksanskog ekstrakta identifikovano je 30 komponenti od kojih su

najzastupljenije: tridekan (46,5%), nonakozan (16,5%) i pentadekan (13,3%). Alkani

su najzastupljeniji sa udelom od čak 90,9%. Masne kiseline i njihovi derivati čine

5,6%. Seskviterpeni čine 2,4%. Diterpeni su prisutni sa udelom od 0,8%.

- Utvrđene su značajne razlike u hemijskom sastavu u odnosu na etarsko ulje. Prisutan

je mnogo manji broj komponenti, od kojih su neke sa većim procentom a takođe

javljaju se i nove u značajnim procentima. Posledica ovakve razlike je korišćenje

heksana, kao rastvarača niske polarnosti za pripremu ekstrakta.


30

6. LITERATURA

[1] M. Matović, Lekovita moć bilja Editprint, Beograd (2000)Nikolić V. Fam. Apiaceae. In: Josifivić M. (Ed.), Flora SR Srbije 5. Beograd, Srbija, SANU (1973), 183-348

[2] D. Kitić, Etarska ulja , Studentski Medicinski Glasnik (2010), 149-156

[3] Nevenka D. Cakić, Alkanoidi, fenilpropanoidi, steroidi i terpenoidi iz odabranih biljnih vrsta familije Apiaceae, Doktorska disertacija (2012), 13-56

[4] K. H. Kubeczka, Chemical investigation of essential oils of umbeiifers, WORLD CROPS PROD. UTIL. DESCR. 7 (1982), 165-173.

[5] Epameinondas Evergetis, Sofia D. Koulocheri, Serkos A. Haroutounian, Exploitation of Apiaceae Family plants as valuable renewable source of essential oils containing crops for the production of fine chemicals:Part II, Industrial Crops and Products, 64 (2015), 59–67

[6] Aglaia Liopa-Tsakalidi, Scandix pecten-veneris L.: A wild green leafy vegetable AUSTRALIAN JOURNAL OF CROP SCIENCE, 8 (2014), 103-114

[7] Jelena S. Matejić, Biološka aktivnost etarskih ulja i ekstrakata odabranih vrsta iz familije Apiaceae, Doktorska disertacija (2013), 1-87

[8] http://sr.wikipedia.org/sr/Систематика

[9] M. Kojić, Botanika, Naučna knjiga, Beograd (1984)

[10] N. S. Radulovic, M. Z. Mladenovic, and P. D. Blagojevic A 'Low-Level' Chemotaxonomic Analysis of the Plant Family Apiaceae: The Case of Scandix balansae REUT. ex BOISS. (Tribe Scandiceae, CHEMISTRY & BIODIVERSITY, 10 (2013), 1202-1219

[11] Dejan Orčić, Vrste Tribusa Scandiceae (Apiaceae Lindley 1836, subfam. Apioideae) Potencijalni izvor biološki i farmakološki aktivnih sekundarnih molekula, Doktorska disertacija (2010), 11-141

[12] Bnar Kh. Bakr and Jawhar F. Saeed, A Chemo Taxonomical Study of Two Genera Scandix L. and Smyrnium L. of (Apiaceae) in Kurdistan Region of Iraq, ZANCO JOURNAL OF PURE AND APPLIED SCIENCES, 26 (2014), 11-20

http://sr.wikipedia.org/sr/Систематика


31

[13] Nikolić V. Fam. Apiaceae. In: Josifivić M. (Ed.), Flora SR Srbije 5. Beograd, Srbija, SANU (1973), 183-348

[14] N. S. Radulović, M. Z. Mladenović and Z. Z. Stojanović-Radić, Synthesis of small libraries of natural products: New esters of long-chain alcohols from the essential oil of Scandix pecten-veneris L. (Apiaceae), FLAVOUR AND FRAGRANCE JOURNAL (2014)

[15] S. Miliosavljević, Strukturne instrumentalne metode, Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu, (1997)

[16] http://www.perkinelmer.com/PDFs/downloads/GDE_Intro_to_Headspace.pdf

[17] R.P. Adams, Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectrometry 2007 (Allured Publishing Corporation, Carol Stream, Illinois, USA).

http://www.perkinelmer.com/PDFs/downloads/GDE_Intro_to_Headspace.pdf

Hemijska analiza isparljivih komponenti biljne vrste

Documents

Transcript of Hemijska analiza isparljivih komponenti biljne vrste