HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN PHƯƠNG PHÁP...

8/13/2019 HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

http://slidepdf.com/reader/full/ham-luong-thuoc-khang-sinh-nhom-tetracyclin-trong-san-pham-thuy 1/41

www.facebook.com/daykem.quynhon -

www.daykemquynhon.ucoz.com

HÀM LƯỢ NG THUỐC KHÁNG SINHNHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN

PHẨM THUỶ SẢN

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢ NG BẰ NG SẮC KÝ LỎ NGHIỆU NĂNG CAO

GVHD: PH ÙNG VÕ CẨM HỒ NG

SINH VIÊN: TR Ầ N QUANG TUẤ N MSSV:08139324





Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinhchính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin(gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC).

Tetracycline

I.Mức độ độc hại của tetracycline





Oxytetracyclin





Tác dụng độc hại của tetracyclin:

Phản ứng với đườ ng tiêu hóa:+ Thườ ng gặp như ăn mất ngon, buồn nôn, nôn,

đi lỏng, chứng nóng rát dạ dày.

+ Bội nhiễm nấm Candida albicans phải chữa tr ịvớ i nystatin.

+ Viêm ruột do staphylocoque: thườ ng nặng ở ngườ i già và tr ẻ em.





Tai biến nhiễm độc gan:

+ Hiếm gặp nhưng rất nặng là thoái hóa mỡ gando dùng liều cao và theo đườ ng t ĩ nh mạch.

+ Ở bệnh nhân có thai 3 tháng cuối hoặc sau khisinh con.

+ Ở ngườ i suy thận.





DANH MỤC CÁC HOÁ CHẤT, KHÁNG SINH HẠ NCHẾ SỬ DỤ NG TRONG SẢ N XUẤT KINHDOANH THUỶ SẢ N Ban hành kèm theo Quyết địnhsố 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 củaBộ trưở ng Bộ Thuỷ sản) TT Tên hoá chất, khángsinh Dư lượng đối đa (MRL) (ppb)

27 Spectinomycin 300

28 Chlortetracycline 100

29 Oxytetracycline 100

30 Tetracycline 100

31 Sulfonamide (các loại) 100

32 Trimethoprim 50

33 Ormetoprim 50

34 Tricaine methanesulfonate 15-330





II.Phương pháp phân tích

1.Phạm vi áp dụng:Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xácđịnh hàm lượ ng kháng sinh nhóm tetracyclintrong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắcký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt làHPLC).





2.Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này đượ c xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin,Oxytetracycline, and Tetracycline trong phầnăn đượ c của động vật, quyển I, chương 23,

trang 19 - 23 (23.1.17), phương pháp chuẩncủa Hiệ p hội các nhà hoá học phân tích(AOAC) ban hành năm 1997.





3.Nguyên tắc





Dd đệm

Ph(4)

SP

E

Cột tách chiết

pha đảo Sep -Pak Cartrige

C18.

Đầu dò

UV tại

bước

sóng 350

nm theo

phươngpháp

ngoạichuẩn.





-Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (sử dụng ống lytâm dung tích 50 ml).

-pH k ế.-Ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml.-Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml và 1000ml.

-Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml.-Phễu Buch-ner đườ ng kính 5,5 cm.-Pipet tự động điều chỉnh đượ c từ 2 đến10 ml.-Bể siêu âm.





4.2 Hoá chất:-Ðinatri photphat khan (Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng

cho phân tích.- Nướ c cất loại dùng cho HPLC.-Axit xitric ngậm 1 phân tử nướ c, tinh khiết, loại dùng

cho phân tích.-Ethylen đinitrilo tetra axêtat đinatri (sau đây viết tắt là

EDTA) ngậm 2 phân tử nướ c tinh khiết, loại dùngcho phân tích.

-Axít oxalic ngậm 2 phân tử nướ c, tinh khiết, loại dùng

cho phân tích.-Metanol loại dùng cho HPLC.-Axetonitril loại dùng cho HPLC.





4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử:

-Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0 +/-0,05) gồm:

28,4 gNa2HPO4 +

H2O -> định

mức 1000ml

A

21,0 g Axítxitric + H2O

-> Định mức1000ml

B





625ml A + 1000ml B McIlvainePh 4

dung dịch HCl nồng độ 0,1M

dung dịch NaOH nồng độ 0,1M

Dung dịch đệmMcIlvaine - EDTA

6 0, 5 g

E D T

A + 1 6

2 5 m l M

c I l v a i n e





1,26 g axít oxalic + metanol Định mức

1000ml

Dung dịch axitoxalic-metanol

1,26 g axít oxalíc + H2O Định mức

1000ml

Dung dịchPha độngchoHPLC

500 mlaxetonitril

166 ml metanolLọc và đuổi khí





Cân 108 mg mỗi

loại kháng sinhchuẩn (TC, OTCvà CTC)

3 bình địnhmức 100 ml

Đ ị n h m ứ c

1 0 0 m

l m

e t h a n o

l

methano

Dung dịchchuẩn gốc1 000 µg/ml

10 ml

định mức100 ml

Dung dịchchuẩn hỗnhợ p 100 µg/ml

2,5 ml Dung

dịch

chuẩn

hỗn hợp

25 µg/ml

định mức

10 ml.

metanol





Dung

dịch

chuẩnhỗn hợp

25 µg/ml

20 ml

40 ml

100

ml

200

ml

400ml

định mức 10 ml

6 ml

ddaxít

oxalic-metanol

Dung dịch chuẩn hỗn hợp

0.05µg/ml

0.10

0.25

0.50

1.00





5.Phương pháp tiến hành:

5.1 Chuẩn bị mẫu thử -Cân 5,00 g (+/- 0,05) mẫu (m) đã được bămnhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh thứ 1.

-Thêm 20 ml dung dịch đệm vào ống r ồinghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng

thể. Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâmtrong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Gạndịch trong của ống thứ 1 vào ống ly tâm thủytinh thứ 2.

-Cho thêm 20 ml dung dịch đệm vào ống lytâm thuỷ tinh thứ 1. Tr ộn đều, ly tâm ốngtrong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút r ồi lạigạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ2.





5.2 Chuẩn bị mẫu tr ắng:

-Mẫu tr ắng được định ngh ĩ a là mẫu thủy sản đã đượ cxác định không có các kháng sinh thuộc nhóm TC.Tiến hành chuẩn bị mẫu tr ắng giống như chuẩn bị vớ imẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.





5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi:-Thêm 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợ p 25 µg/ml

(4.3.7) vào 5,00 g mẫu tr ắng. Ðồng nhất mẫu bằngmáy nghiền đồng thể (4.1.3). Tiến hành chuẩn bị mẫu

giống như chuẩn bị vớ i mẫu thử theo qui định tạiÐiều 5.1.





5 g mẫu tr ắng

mẫu để xác định độ thu hồi

100 µl dd chuẩn hh 25 µg/ml

Ð ồ n

g n h ấ t b

ằ n g m á y

n g h i ề n

đ ồ n

g t h ể

mẫu tr ắng





5.4 Làm sạch dịch chiết:

5.4.1 Chuẩn bị cột Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu ra của mộtxi lanh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêmlần lượ t 20 ml metanol , 20 ml nướ c cất

vào xi lanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịchchảy qua cột.





5.4.2 Làm sạch dịch chiết:

5.4.2.1 Cho lần lượ t các dịch chiết trong ống lytâm thu đượ c vào các cột Sep - Pak đã đượ cchuẩn bị. Tráng r ửa bình chứa bằng 2,0 mldung dịch đệm. Trong giai đoạn này, các

kháng sinh nhóm tetracyclin sẽ đượ c hấ p phụlên bề mặt các hạt r ắn chứa trong cột.Chú thích: K hông được để cho cột Sep - Pakkhô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm

sạch dịch chiết. Ðiều chỉnh cho dịch chảy rakhỏi cột từng giọt.





5.4.2.2 Cho 20 ml nướ c cất vào xi lanh thủy tinh và

cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 phút.

5.4.2.3 Giải hấ p các kháng sinh nhóm tetracyclin bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalic-metanol chảy qua cột vớ i tốc độ 1,5 ml/phút. Thudịch ra khỏi cột vào bình định mức 10 ml. Ðịnhmức tớ i vạch (thể tích V) bằng nướ c cất . Tiếnhành phân tích dịch thu đượ c trên HPLC theo qui

định tại Ðiều 5.5.





5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.5.1 Ðiều kiện phân tícha. Cột sắc ký : Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6mm, kích thướ c hạt 5 µm.

b. Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phòng.

c. Pha động: Hỗn hợ p dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile.

d. Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.

đ. Bướ c sóng cài đặt cho đầu dò UV là 350 nm.

e. Thể tích tiêm: 60 µl.

5.5.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động.





5.5.3 Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLCtheo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung

dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình.Dựng đườ ng chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa cácchiều cao pic thu đượ c và nồng độ (µg/ml) từngloại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc 1(phương tr ình y = ax + b).

5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫutr ắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui địnhtại vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm2 lần. Tính giá tr ị trung bình.

Chú thích: Sau khi phân tích xong, làm sạch hệthống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗnhợ p: nướ c cất- metanol - axetonitrile theo tỷ lệ vềthể tích là 7-1-2 trong 30 phút.





III. Đánh giá kết quả

5.6.1 Ðộ lặ p lại của 2 lần tiêmÐộ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắcký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phảinhỏ hơn 0,5 %.

5.6.2 Ðộ thu hồi (R)Ðộ thu hồi đượ c xác định cho mỗi lần chạy mẫu

phải lớn hơn 80 %.

5.6.3 Giớ i hạn phát hiện:Tín hiệu thu đượ c từ mẫu tr ắng là BTín hiệu thu đượ c từ mẫu thử là S

S

B





5.6.3 Ðườ ng chuẩn đối vớ i mỗi kháng sinh phải

có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồituyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.5.6.4 Ðối vớ i các mẫu chứa ít hơn 0,5 µg/g

kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận

k ết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu vàdung dịch chuẩn trên cột C18 chạy cùng chế độ như cột C8 và so sánh thời gian lưu của pícmẫu và píc chuẩn.





IV.Tài liệu tham khảo

• Quyết định 10/2002/QĐ-BTS về tiêu chuẩn cấ pngành do Bộ trưở ng Bộ Thủy sản ban hành

• Căn cứ Nghị định số 50/CP ngày 21 tháng 6 năm1994 của Chính phủ về nhiệm vụ quyề n hạn và t ổ chứ c bộ máy của Bộ Thu ỷ sản.

• TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀSINH HỌC Ứ NG DỤ NG BỘ MÔN CHĂN NUÔI- THÚ Y,

Chuyên đề dượ c lý thú y THUỐC KHÁNG SINH NHÓMPHENICOLS THUỐC KHÁNG SINH NHÓM CYCLINES

HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN PHƯƠNG PHÁP...

Documents

Transcript of HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN PHƯƠNG PHÁP...