hakim biochimica.pdf
-
Upload
federicamanuelacammarata -
Category
Documents
-
view
37 -
download
0
Transcript of hakim biochimica.pdf
1
Le cellule
Caratteristiche degli organismi viventi
• Complessi e organizzati
• Capaci di estrarre/trasformare energia
• Capaci di rispondere a cambiamenti
ambientali
• Capaci di autoreplicarsi
• Sono compartimentati
• Seguono le leggi della Fisica e della
Chimica!
2
Sistemi biologici e biomolecole• Pochi elementi naturali, leggeri (fondamentalmente,
C, N, O, H)
• Sistemi lontani dall’equilibrio, spesso allo stato stazionario
• Reazioni chimiche catalizzate
• Macromolecole costituite di unità semplici (struttura gerarchica)
– Proteine
– Acidi nucleici
– Polisaccaridi
• Importanza delle strutture tridimensionali
• Chimica “acquosa”
Elementi nel corpo umano
3
PRINCIPALI CLASSI DI
BIOMOLECOLE
Termodinamica e funzioni di stato
• Funzioni di stato: dipendono solo dagli stati iniziale e finale del sistema
• Entalpia: quantità di energia che un sistema può scambiare con l’ambiente
∆∆∆∆H = ∆∆∆∆ U + P ∆∆∆∆ V
Nei sistemi biologici,
∆∆∆∆H ≅≅≅≅ q (calore a pressione costante)
4
Energia libera (di Gibbs)
• Funzione di stato che consente di valutare
se un processo è spontaneo
G = H – TS
Dove:
H = entalpia
S = entropia
La variazione in energia liberadetermina la direzione di un
processo
∆∆∆∆G = Gprodotti - Greagenti
∆∆∆∆G = ∆∆∆∆ H - T ∆∆∆∆ S
∆G < 0 reazione esoergonica, spontanea
∆G > 0 reazione endoergonica; richiede energia dall’esterno
∆G = 0 reazione all’equilibrio
5
Entropia∆G = ∆H - T ∆∆∆∆ S
• L’entropia è una misura del grado di disordine di un sistema
• L’entropia aumenta quando il sistema diventa piùdisordinato e diminuisce quando il sistema è piùstrutturato
• Molte reazioni biologiche tendono ad aumentare l’ordine e a diminuire in entropia (∆∆∆∆S < 0)
• Reazioni esotermiche (∆∆∆∆H < 0) che aumentano in entropia (∆∆∆∆S > 0) avvengono spontaneamente (∆∆∆∆G< 0)
• Reazioni endotermiche (∆∆∆∆H > 0) possono avvenire spontaneamente se T ∆S > ∆H
Esempi di differenze di entropia
• BASSA ENTROPIA
• Acqua - ghiaccio
• Poesia
• Scrivania di un bancario
• ALTA ENTROPIA
• Acqua - vapore
• Serie casuale di lettere
• Scrivania di uno
scienziato
6
Da: Lehninger
Un processo esoergonico: la diffusione attraverso una
membrana
membrana
tempo
7
Effetto idrofobico
Molecole d’acqua ordinate
∆G e costante di equilibrio
La variazione di energia libera di una reazione dipende
dalle concentrazioni di reagenti e prodotti
∆G = ∆G°’ + RT ln [prodotti]/[reagenti]
dove: ∆G°’ = variazione di energia libera standard
All’equilibrio:
0 = ∆G°’ + RT ln [prodotti]/[reagenti]
da cui
∆∆∆∆G°’ = - RT ln K’eq
8
Costanti di equilibrio e variazioni di energia libera standard
K’eq
0,001
0,01
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
∆∆∆∆G°’ (kJ/mole)
17,1
11,4
5,7
0,0
5,7
-11,4
-17,1
Variazioni di energia libera standard ∆∆∆∆G°’
• Pressione atmosferica; t = 25 °C
• Attività chimica (concentrazione) = 1
• In Biochimica, lo stato standard è a pH = 7
• All’acqua è attribuito comunque un valore
pari ad 1
9
I legami fosfoanidridici dell’ATP
Sub-
Trasferimento di
un gruppo fosfato
Trasferimento di un
gruppo adenilico
Sub-
ATP
10
Una reazione energeticamente sfavorita può procedere se accoppiata ad una
favorita• Molte reazioni biochimiche sono energeticamente sfavorite (∆G > 0) e non procedono spontaneamente
• Le cellule possono condurre tali reazioni accoppiandole ad una reazione (processo) con un ∆G maggiormente negativo
• Reazioni energeticamente sfavorite sono spesso accoppiate all’idrolisi dell’ATP che ha un ∆G º′ = -7.3 kcal/mol
• L’energia utilizzabile in una molecola di ATP è“contenuta” nei legami fosfoanidridici
Reazioni accoppiate
11
Importanza di intermedi fosforilati
Composti in genere stabili cineticamente
L’ATP è usato per alimentare numerosi processi
The ATP cycle
Luce (fotosintesi) o composti ad alta energia potenziale (respirazione)
Sintesi di macro-molecole (proteine, DNA…)
Sintesi di altri componenti cellulari)
Movimenti cellulari
Trasporti di molecole/ ioni contro gradiente
Generazione di potenziali elettrici
Calore
1
GLI α-AMMINOACIDI
� Sono caratterizzati da un
gruppo carbossilico e da un
gruppo amminico legato al
carbonio adiacente (α)
� Si differenziano per il
gruppo sostituente -R
Gli amminoacidi costituenti le proteine:
� Sono venti (standard), α-ammino-acidi, apparte-
nenti alla serie L
� Sono anfoteri
� Caratterizzati da un punto isoelettrico (pI) dovuto
ai gruppi ionizzabili
� Esistono numerosi altri amminoacidi con ruoli
diversi
�La sequenza degli amminoacidi (struttura
primaria) determina la struttura spaziale
�La struttura determina la funzione
2
Stereoisomeria degli amminoacidi
Carbonio
asimmetrico
Tutti gli amminoacidi standard, tranne la glicina, possiedono
almeno un carbonio asimmetrico
La convenzione secondo Fischer per la configurazione fa riferimento alla
gliceraldeide:
3
Importanza della stereoisomeria: solamente un enantiomero possiede
attività anti-infiammatoria
Proprietà acido-base
� Gli amminoacidi sono acidi poli-protici deboli
� pH basso: gruppo amminico e carbossilico protonati
� pH neutro: si dissocia il carbossile
� pH alto: si dissocia il gruppo ammonio
� A pH fisiologico (pH ~7.0) è stabile la forma zwitterionica: i gruppi amminici sono protonati, il carbossile è completamente dissociato.
– Gruppo carbossilico : pKa ~ 2
– Gruppo amminico α: pKa ~ 9
4
Proprietà acido-base� Punto isoelettrico (pI): valore di pH al quale
l’amminoacido ha carica netta nulla.
� Nel caso di un amminoacido con catena laterale neutra è
dato da:
)pKpK(2
1pI
)NH(a2COOH)(a1
3+
−−+=
αα
pKa1 pKa2
Amminoacidi con catene
laterali apolari
gruppi R non polari, alifatici
gruppi R aromatici
5
Amminoacidi con catene laterali polari
La prolina è un imminoacido(contiene un gruppo amminico secondario)
6
Amminoacidi carichi
gruppi R carichi positivamente (basici)
gruppi R carichi negativamente (acidi)
Alcune proprietà degli amminoacidi standard
Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
7
La cisteina può formare ponti disolfuro (ossidazione)
Gli spettri UV di amminoacidi aromatici
8
Curva di titolazione della
glicina
)pKpK(2
1pI
)NH(a2COOH)(a1
3+
−−+=
αα
Curva di titolazione del glutammato
9
Curva di titolazione dell’istidina
Alcuni amminoacidi modificati (dopo la traduzione)
10
Importanti molecole derivate da amminoacidi
La selenocisteina (Sec), il ventunesimo amminoacido
� Analogo alla Cys, contiene Selenio al posto di Zolfo
� Deriva da una modificazione della Serina; èinserita come tale nelle proteine. E’ codificata in modo particolare
� Importante in numerosi enzimi ossido-riduttivi
� Negli Archaea esiste un 22° amminoacido, la pirrolisina (Pyl).
11
Il legame peptidico
Il legame peptidico si genera (formalmente) per eliminazione
di una molecola di acqua tra gruppo carbossilico ed amminico
1
Le proteine
� Sono polimeri lineari costituiti di
amminoacidi
� Contengono diversi gruppi funzionali
� Possono formare strutture complesse
� Possono essere rigide (strutturali) o
flessibili
Alcuni ruoli delle proteine� Enzimi (biocatalizzatori)
� Proteine strutturali - collagene
� Proteine regolatrici - ormoni (ad esempio: insulina, glucagone)
� Proteine di trasporto – emoglobina (O2)
� Proteine di trasporto di membrana
� Recettori
� Proteine contrattili - actina, miosina
� Proteine “di difesa” – anticorpi
� Proteine che decodificano l’informazione
2
Le proteine sono polimeri lineari costituiti da amminoacidi
� Le proteine sono polimeri lineari, non ramificati, degli amminoacidi
� Il legame peptidico o carboammidico si genera (formalmente) per eliminazione di una molecola di acqua tra gruppo carbossilico di un amminoacido ed amminico dell’amminoacido adiacente
� L’equilibrio sarebbe spostato verso l’idrolisi
� I legami peptidici sono cineticamente stabili
� Per convenzione il polimero viene “letto” partendo dall’ammino-acido N-terminale
Il legame peptidico� ha un parziale carattere di doppio legame: non ruota
liberamente
� Si trova quasi sempre nella configurazione trans (Cα
da lati opposti) a minore ingombro sterico
3
Il legame peptidico è un sistema planare
Sei atomi giacciono sullo stesso piano
Il legame peptidico
� A causa della distribuzione degli
elettroni il legame peptidico ha
specifiche proprietà elettriche:
– è dipolare.
O
N
H
Cα1
Cα2
+ 0.42
- 0.42
- 0.20
+ 0.20
-
+
4
Il grafico di Ramachandran
αααα elica
Foglietti ββββ
O
N
H
CH3ω
φ
ψ
Cα1
Cα2
La struttura delle proteine può essere suddivisa in quattro livelli
� STRUTTURA PRIMARIA: sequenza degli amminoacidi uniti da legami peptidici. Legami covalenti
� STRUTTURA SECONDARIA: organizzazioni regolari e ricorrenti nello spazio dei residui amminoacidici adiacenti (come, ad es. α-elica e struttura β). Legami a idrogeno
� STRUTTURA TERZIARIA: ripiegamento della catena polipeptidica dovuto ad interazioni deboli. In tale ripiegamento sono presenti diversi tipi di struttura secondaria. Proteine globulari
� STRUTTURA QUATERNARIA: interazioni esistenti fra varie subunità, nel caso in cui le proteine siano costituite da più catene polipeptidiche.
5
Struttura primaria
� Struttura primaria di un peptide o di una proteina:
sequenza degli amminoacidi uniti da legami peptidici
descritta per convenzione a partire dall’AA ammino-
terminale (il primo) all’AA carbossi-terminale (l’ultimo).
+3HN-G-A-S-T-A-A-K-W-K-COO-
+3HN-Gly-Ala-Ser-Thr-Ala-Ala-Lys-Trp-Lys-COO-
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Livelli di organizzazione delle proteine
6
Alcuni tipi di interazioni deboli
Importanza delle forze deboli
Legami covalenti singoli: 300-400 kJ/mol
van der Waals: 0.4 - 4 kJ/mol
legami a idrogeno: 12-30 kJ/mol
legami ionici: 20 kJ/mol
interazioni idrofobiche : < 40 kJ/mol
7
Struttura secondaria� Organizzazione spaziale regolare e ricorrente
“locale” (a breve distanza)
� Caratterizzata da interazioni deboli, soprattutto legami a idrogeno
L’α-elica(L. Pauling, 1951)
Legami a
idrogeno
Premio Nobel per la
Chimica, 1954
8
L’α-elica
� È stabilizzata da legami a idrogeno intra-catena
� L’ossigeno di un C=O lega l’idrogeno di un NH di
un amminoacido 4 residui più avanti
� L’elica è destrogira
� Le catene laterali sporgono verso l’esterno dell’elica
� L’elica è un dipolo
L’α-elica è un dipolo
9
Che cosa destabilizza l’α-elica
� La prolina destabilizza l’elica: è un
anello piuttosto rigido e non può
formare ponti ad idrogeno
� Residui -R ingombranti
� Residui –R prossimi nello spazio e
dotati della stessa carica
Struttura ββββfoglietto pieghettato
Legami a idrogeno
tra catene
Gruppi –R che
sporgono sopra e
sotto il piano
10
Foglietti β paralleli ed anti-paralleli
Ripiegamento (turn) β� Ripiegamento a 180°
� Quattro amminoacidi: legame a idrogeno tra il 1° e il 4° amminoacido
� Spesso Pro, Gly
� Spesso alla superficie della proteina
11
Frequenza relativa di amminoacidi nella struttura secondaria
Quantità di α-elica e β-foglietto in alcune proteine
1738Carbossipeptidasi (307)
4514Chimotripsina (247)
3526Ribonucleasi (124)
1240Lisozima (129)
039Citocromo c (104)
078Mioglobina (153)
ββββ fogliettoαααα elicaProteina (residui)
Residui (%)
12
Proteine fibrose� Gran parte della catena polipeptidica è
organizzata parallelamente ad un singolo asse, con una sola struttura secondaria (nella cheratina, α-elica)
� Nella fibroina della seta la struttura prevalente è il foglietto β; “soffice” perché le interazioni tra foglietti sono deboli
� Le proteine fibrose:
– hanno alta resistenza meccanica e scarsa reattività chimica
– sono insolubili
– hanno un ruolo strutturale
Le α-cheratine dei mammiferi� Presenti in peli, unghie, corna…
� “Avvolgimenti avvolti”
� Ricche in Cys (che possono formare ponti
conferendo rigidità)
� In uccelli e rettili si trovano β-cheratine
18 % Cys
13
Ponte disolfuro
Tratto da: A.L. Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
Ossidazione e riduzione della cisteina
Tratto da: A.L. Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
Due catene avvolte insieme
Proto
fibrille
Struttura delle α-cheratine
14
La Biochimica dal parrucchiere: la “permanente”
αααα - cheratina dei capelli
Il collagene: una tripla elica� Principale componente dei tessuti connettivi (ossa,
tendini, denti, cartilagini)
� Tre catene avvolte tra loro (tropocollagene): elica
più estesa dell’α-elica
� Composizione amminoacidica particolare
– Un residuo ogni tre è Gly (Gly-X-Y)
– Ricco in prolina
– Amminoacidi insoliti (idrossilisina, idrossiprolina:
formano ponti a idrogeno) “post-traduzionali”;
l’idrossilazione dipende dall’acido ascorbico
� Sono presenti anche legami covalenti inter-catena
15
Dr. Jekyll and Mr. Hyde:le malattie prioniche dipendono dalla
strutturaIl prione “buono” (PrPc)…. e quello “cattivo” (PrPsc)
resistente a tutto e “contagioso”
La conversione PrPc →→→→
PrPsc è autocatalitica
S. Prusiner, Premio Nobel per la
Medicina 1997
Esempi di motivi(struttura supersecondaria)
barile ββββmotivo αααα- αααα
Motivi: raggruppamenti di elementi strutturali secondari
16
Struttura terziaria� Ripiegamenti nello spazio dei diversi segmenti
� Eliche e “nastri“ si impaccano assieme
� Le proteine si ripiegano per “cercare” la struttura più stabile
� Nelle proteine globulari sono importanti gli effetti idrofobici
� Strutture in genere flessibili
� Stabilizzate da legami deboli
� Talvolta, ponti disolfuro
17
Struttura di proteine globulari
Alcune proteine sono “modulari”
� A volte un modulo può essere ripetuto nella stessa proteina
� L’uso di moduli ha una base genetica
� Alcune proteine sono composte di due o piùmoduli (o dominii)
� Dominii: unità strutturalmente indipendenti che possiedono caratteristiche di piccole proteine globulari
� Ogni dominio si può ritrovare in altre proteine
18
Esempi di dominii:l’enzima gliceraldeide 3-fosfato
deidrogenasiDominio per il legame con il substrato
Dominio per il legame con il coenzima NAD
Un coenzima che partecipa ad ossidoriduzioni: il NAD
Nicotinammide Adenina Dinucleotide
19
Struttura quaternaria:associazione di più subunità
� Costituite in modo modulare
� Minori informazioni geniche (minori errori)
� Possibilità di più siti
� Possibilità di regolazione (interazione tra siti)
� Proteine diverse possono condividere le stesse subunità
� Perdita di entropia dovuta alla associazione: sfavorevole
� Guadagno di entropia dovuta al “seppellimento” di residui idrofobici: molto favorevole
� Oltre alla struttura quaternaria, esistono complessi multi-enzimatici
La struttura quaternaria della emoglobina
20
Proteine complesse o coniugate
Classe� Lipoproteine
� Glicoproteine
� Emoproteine
� Flavoproteine
� Metalloproteine– Ferro– Calcio– Zinco– Manganese– Rame
Gruppo prostetico - Esempio� Lipidi β1-lipoproteina
� Glucidi Proteine di membrana
� Eme (ferroporfirina) Emoglobina
� FAD succinato deidrogenasi
– Transferrina– Calmodulina– Superossido dismutasi– Catalasi– Ceruloplasmina; emocianina
Il gruppo prostetico può essere legato alla proteina in diversi modi
Denaturazione delle proteine� Perdita della conformazione spaziale nativa
� Le proteine sono”marginalmente” stabili; basta
la rottura di pochi legami deboli per innescare
la denaturazione
� Molte proteine si denaturano a 50-60°C; alcune
sono stabili a temperature più alte
� La denaturazione oltre che dalla temperatura
può essere provocata da agenti chimici
(caotropici)
� In alcuni casi proteine possono “rinaturarsi”
21
Proteine degli “estremofili”
� Negli “estremofili” (Archaea) ci sono proteine
particolarmente stabili
� Tali proteine sono utili in campi applicativi
� Le loro caratteristiche sono legate alla struttura
(ripiegamento)
“Folding” e denaturazione delle proteine: l’esperimento di
Anfinsen(Nobel per la Chimica
1972)
Denaturazione e “refolding”
della RNAasi (124 aa)
22
Ripiegamento delle proteine
� In E. Coli, una proteina attiva di 100 amminoacidi è prodotta in circa 5 secondi a 37 °C
� Un processo casuale per tentativi richiederebbe venti miliardi di anni (paradosso di Levinthal)
� Probabilmente si formano nuclei di strutture secondarie; il ripiegamento avviene in modo gerarchico
� Ci può essere un “collasso idrofobico”
� Alcune proteine si ripiegano spontaneamente
Ripiegamento delle proteine
23
Ripiegamento delle proteine
• Alcune proteine (chaperone) “guidano”l’avvolgimento (ad esempio, heat shock proteins -hsp)
Chaperon: persona di età matura che un tempo accompagnava una
ragazza di buona famiglia per salvaguardarne la rispettabilità
• Le hsp (come hsp70) ostacolano il ripiegamento
“sbagliato” (“misfolding”) o la denaturazione; sono
proteine molto conservate
Il corretto ripiegamento è “aiutato” da specifiche proteine (hsp e chaperonine);
il processo richiede energia
1
Enzimi� Gli enzimi sono catalizzatori di natura proteica (esistono ancora RNA catalitici o ribozimi)
� influenzano la velocità, ma non l’equilibrio� non si consumano: si trovano immutati alla fine della reazione
� consentono alle reazioni di procedere a velocitàcompatibili con la vita, in condizioni blande
� presenti in piccole quantità (importanza della concentrazione)
� formano complessi reversibili con il substrato� sono specifici
Enzimi� Alcuni enzimi richiedono cofattori (coenzimi)� Ogni enzima mostra condizioni ottimali (pH, T..)� In ogni cellula 2000-3000 enzimi diversi� Alcuni enzimi esistono in forme molecolari diverse (isoenzimi)
� Possono essere “ingannati” da inibitori (la inibizione è alla base dell’azione di molti farmaci)
� Spesso sono coinvolti in vie metaboliche a piùpassaggi
� Talvolta soggetti a regolazione
2
Gli enzimi sono catalizzatori di natura proteica: accelerano le reazioni
biologiche di diversi ordini di grandezzaIncrementi di velocità prodotti da enzimi
SpecificitàGli enzimi:1. catalizzano specifiche reazioni2. Possono riconoscere selettivamente i
propri substrati (specificità geometrica)3. Possono riconoscere la stereoisomeria
� La specificità è controllata dalla struttura
3
Classificazione degli enzimi
La classificazione contiene 4 numeri: ad es., la Lattato Deidrogenasi èLattato:NAD ossidoreduttasi EC 1.1.1.27
Il sito attivo� È una entità spaziale costituita da gruppi anche lontani nella sequenza amminoacidica
� Occupa una parte relativamente piccola della molecola enzimatica
� È una cavità o fenditura (spesso inaccessibile all’acqua)
� I substrati si legano di solito con interazioni deboli
� La specificità dipende dagli atomi/gruppi nel sito attivo
4
Cofattori e Coenzimi� “Cofattori” che partecipano a reazioni enzimatiche (ad esempio, nelle ossido-riduzioni)
� Possono essere legati all’enzima o fungere da co-substrati (co-enzimi)
� Alcuni derivano da vitamine idrosolubili
Vitamina PP(pellagra-preventing)
Un coenzima che partecipa ad ossidoriduzioni: il NAD
Nicotinammide Adenina Dinucleotide
5
Le reazioni enzimatiche:
� Sono spesso in cascata (vie metaboliche)
� Possono essere controllate
PUNTO DI
CONTROLLO
Velocità di reazione ed attivitàenzimatica
� Velocità di reazione: quantità di substrato
trasformato nel tempo
v = - d [S] / dT = d [P] / dT
� Attività enzimatica: è espressa in base alla
velocità della reazione promossa dall’enzima:
� katal (SI): quantità di enzima che converte
1 mol substrato in 1 sec
� Unità internaz. (IU) quantità di enzima che
converte 1 µ mol substrato in 1 min
6
Velocità di reazione ed equilibrio
� L’equilibrio della reazione dipende da ∆G
� La velocità di reazione dipende dalla barriera energetica ∆G ≠
� Ci sono reazioni spontanee (∆G < 0) e sfavorite dal punto di vista cinetico
7
Secondo l’equazione di Arrhenius:
k = A e - ∆G*/RT
dove: k = costante di velocità
∆G* = energia di attivazione
T = temperatura assoluta
Il catalizzatore (enzima) abbassa la energia di attivazione
8
Come funzionano gli enzimiIl modello chiave-serratura (Fischer, 1894)
Sitoattivo
Emil Fischer, 1894
9
Il complesso ES non può essere troppo stabile
da: Garrett & Grisham
Il complesso ES non può essere troppo stabile
10
Come funzionano gli enzimiIl modello dell’adattamento indotto
(“induced-fit” – Koshland 1958)
Sitoattivo
Meccanismi della catalisi
� Catalisi acido-base
� Catalisi covalente
� Metalloenzimi
� Prossimità ed orientamento
11
Prossimità e orientamento
substrati
enzima
Stato di transizione
prodotto
Catalisi acido-base
12
Effetto del pH: la papaina
Fosforil-enzima
Acil-enzima
Glucosil-enzima
Catalisi covalente
Un centro nucleofilo sull’enzima attacca un gruppo elettrofilo del substrato
13
Catalisi favorita da ioni metallici� Metalloenzimi (un terzo
degli enzimi):
– contengono metalli come
cofattori
– enzimi attivati da metalli
� I metalli possono:
– legarsi al substrato per
orientarlo
– partecipare a reazioni redox
– stabilizzare cariche negative
– rendere molecole d’acqua
più acide (Zn2+ e anidrasi
carbonica)
anidrasi carbonica
Meccanismi d’azione: le proteasi a serina
� Tra di esse chimotripsina, tripsina, elastasi: sequenza, struttura e dimensioni (PM = 25.000) simili (evolute da un unico progenitore)
� Stessa specificità di reazione, diversa specificità di substrato
� Partecipano diversi residui amminoacidici (la triade catalitica Ser, His, Asp)
� La serina forma intermedi covalenti (acil-enzima)
� L’istidina agisce come catalizzatore acido-base
� L’aspartato stabilizza e orienta l’istidina
� Meccanismo comune ad altri enzimi (acetilcolinesterasi); evoluzione convergente
14
Sito di riconoscimento per il substrato
Lys; Arg
Aa. aromatici
Ala
La triade catalitica triade catalitica Ser, His, Asp
15
Fluorofosfati organici legano una serina molto reattiva
DIFP
L’istidina rende l’ossigeno della serina
più nucleofilo
O
R1
R2NH
O HH
H N O
O O
H
N
N
Asp102
His57
Ser195
Gly193
16
Meccanismi di azione: la prima reazione della chimotripsina
Acil-enzima
Da: Lehninger
triade catalitica
17
complesso
tetraedrico
La scissione del
complesso
tetraedrico
libera il lato
amminico della
proteina da
idrolizzare
Da: Lehninger
Stabilizzazione dello stato di transizione:la cavità ossianionica
Lo stato di transizione tetraedrico è stabilizzato da due legami a idrogeno
18
Da: Lehninger
L’esistenza dell’acil-enzima
fase esplosiva
(“burst”)
1
La cinetica enzimatica:� Studia la velocità delle reazioni enzimatiche
� Può fornire informazioni sul meccanismo di azionedi un enzima
� Fornisce informazioni sul ruolo di un enzima in condizioni cellulari e sulle risposte a variazioni di concentrazioni di metaboliti
� Fornisce informazioni su come un enzima è regolato
E’ utile:
� nella caratterizzazione di enzimi ad impiego industriale
� nel dosaggio di attività enzimatiche quali indici diagnostici
� nel discriminare diverse forme enzimatiche sia fisiologiche (isoenzimi) sia anomale
Velocità di reazione ed attivitàenzimatica
� Velocità di reazione: quantità di substrato
trasformato nel tempo
v = - d [S] / dT = d [P] / dT
� Attività enzimatica: è espressa in base alla
velocità della reazione promossa dall’enzima:
� katal (SI): quantità di enzima che converte
1 mol substrato in 1 sec
� Unità internaz. (IU) quantità di enzima che
converte 1 µ mol substrato in 1 min
2
Velocità iniziale� La velocità dipende dal substrato, ma [S]
cambia nel tempo (si consuma)
� Per semplicità, la cinetica viene studiata in condizioni iniziali (tempo = 0)
� In queste condizioni,
� [S] >> [E]
� [P] ≈ 0 (la reazione inversa da P a S ètrascurabile)
Cinetica enzimatica
E + S ES
L’enzima si combina con S formando il complesso ES in una
tappa veloce e reversibile.
ES E + P
Nella seconda tappa, spesso più lenta, il complesso ES si
decompone per dare il prodotto più l’enzima libero.
La velocità della reazione dipende dalla concentrazione di ES (I
ordine):
v0 = k3 [ES]
k1
k2
k3
3
Cinetica enzimatica
Michaelis e
Menten
Cinetica enzimatica:assunzione dell’equilibrio
� Il complesso ES è in rapido equilibrio con
l’enzima libero E
se k3 << k2 Ks = k2/ k1
assunzione dello stato stazionario:
� d [ES]/dt = 0
4
Cinetica di Michaelis-Menten
Reazioni catalizzate da enzimi
Un grafico di velocità iniziale contro [S] mostra tre zone:
Km ha le dimensioni di una concentrazione
Parametri cinetici
� Km
� kcat costante catalitica (numero di turn-over)
� Vmax (dipende da [E0])
� kcat/Km (costante di specificità o efficienza
catalitica)
� Inibizione (Ki)
5
Significato della KM� È una costante di dissociazione apparente:
misura il grado in cui l’enzima è legato al substrato
� Dipende dalle costanti cinetiche:
KM = (k2 + k3)/ k1
� Se ha valori bassi, l’enzima si satura con poco
substrato (affinità elevata)
� Corrisponde alla concentrazione di S per la quale:
v0 = VM/2
� È caratteristica di un enzima per un certo substrato
Significato della KM
Spesso la KM ha valori
simili alle concentrazioni
cellulari fisiologiche dei
substrati (in rosa)
6
Numero di turn-over o costante catalitica (kcat)
VM = kcat [E0]
� Massimo numero di molecole di substrato
convertite nella unità di tempo da una
molecola (sito) di enzima
� È correlata alla velocità di decomposizione
del complesso ES
Grafico degli inversi
Consente di linearizzare i dati
7
Significato di kcat/Km (costante di efficienza o di specificità)
� Dà una idea della efficienza relativa con cui
vengono trasformati substrati diversi (specificità)
� Dà una idea dell’efficienza catalitica dell’enzima
� Enzimi “perfettamente” evoluti hanno costanti
cinetiche che si approssimano alla diffusione
4. 1082,5 . 10-21. 107H2O2Catalasi
8,3. 1070,0121. 106CO2Anidrasi carbonica
1,6. 1089. 10-51,4. 104AcetilcolinaAcetilcolin-esterasi
kcat
/Km
(s-1M-1)
Km (M)kcat
(s-1)SubstratoEnzima
1 . 1082. 10-52. 103Benzilpenicil-lina
β-lattamasi
1,6. 1085. 10-6800FumaratoFumarasi
Enzimi per cui kcat
/Km è vicino alla velocità di associazione controllata per diffusione
8
Effetto della temperatura
denaturazione
Tratto da: Champe, Harvey, Ferrier “Le basi della Biochimica”, Zanichelli
Relazione tra temperatura e velocità (Arrhenius)
ln v = cost. - Eatt/RT
9
Inibizione enzimatica
� Reversibile
– competitiva
– non competitiva e mista
– (acompetitiva)
� Irreversibile (inattivazione)
Inibizione competitiva
10
Inibizione competitiva
L’inibitore competitivo riduce la concentrazione di enzima libero disponibile per legare il substrato
Inibizione competitiva
11
Il grado di inibizione dipende da [I] e da KI (affinità dell’inibitore)
E’ possibile ricavare KI
Inibizione non competitiva
(KI = KI’)
12
Inibizione non competitiva
Inibizione non competitiva
13
Inibizione mista
(KI ≠≠≠≠ KI’)
Inibitori irreversibili� Si legano all’enzima con legami stabili (covalenti)
� Non possono essere rimossi con mezzi semplici
� Cinetica analoga all’inibizione non competitiva
� Sono utilizzati
– nello studio dei siti catalitici
– come farmaci (anti-metaboliti)
– come anti-parassitari
14
Un reattivo per le
cisteine
Inibitori a serina (acetilcolinesterasi)
DIFP, esteri fosforici (Parathion), gas nervini
Sarin
15
Inibitori come farmaci: i sulfamidici
Un inibitore competitivo del metabolismo dei folati (diidrofolato reduttasi)
16
La parete batterica e il peptidoglicano
� Vasto polimero di
glucidi e piccoli peptidi
tenuti assieme da
legami crociati
� Struttura rigida
resistente alla lisi
osmotica
Azione della penicillina
Inibisce la formazione di legami crociati nel peptidoglicano della parete batterica
Non esiste analoga reazione nel metabolismo animale
17
Inibitori come farmaci:le “statine”
Abbassano i livelli di
colesterolo inibendo l’HMG-
CoA reduttasi, enzima-
chiave nella sintesi endogena
del colesterolo
Inibitori come farmaci: inibitori delle HIV proteasi
� Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine
� Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro)
� occorrono inibitori ad alta specificità
18
Inibitori come farmaci:gli inibitori suicidi
� Di norma poco reattivi
� vengono riconosciuti dal sito catalitico
� reagiscono covalentemente col sito catalitico,
inattivandolo
� Ottimi candidati come farmaci per i minimi
effetti collaterali
1
Regolazione enzimatica
♦ Quantità di enzima (sintesi /degradazione)
♦ Cofattori
♦ Modificazioni allosteriche
− cooperatività (effetti omotropici)
− effettori (effetti eterotropici)
♦ Modificazioni covalenti
− reversibili: fosforilazione/defosforilazione
− irreversibili: attivazioni proteolitiche
Possono coesistere più meccanismi di regolazione
� ha cinetica sigmoide
� è quasi sempre polimerico
� mostra cooperatività
� Esiste in due forme, T ed R, a diversa affinità
(T a bassa affinità)
� Può essere descritto con gli stessi modelli
usati per l’emoglobina
Un enzima regolato (allosterico):
T ⇔⇔⇔⇔ R
2
Cinetica di un enzima regolato
Un caso di cooperativitàestrema
Concentrazione critica di substrato
3
Effettori allosterici
Effettori allosterici
4
Inibizione retroattiva (a feed-back)
La reazione catalizzata dalla aspartato transcarbamilasi (ATCasi)
una pirimidina
5
L’aspartato carbamiltransferasi
Modificazioni covalenti
CoagulazioneTrombinaBicarbonatoγ-carbossilazione
TrascrizioneRNA
polimerasi
NADADP-
ribosilazione
Impaccamento
DNA
IstoniAcetil CoAAcetilazione
Metabolismo
glucosio;
segnalazione
Glicogeno
fosforilasi
ATPFosforilazione
FunzioneEsempioDonatoreModificazione
6
Regolazione covalente:fosforilazione/defosforilazione
(Ser, Thr; Tyr)
Regolazione covalente:fosforilazione/defosforilazione
� La regolazione per fosforilazione è un processo
comune
� 30-50 % delle proteine negli eucarioti possono
essere fosforilate
� Nell’uomo esistono più di 500 chinasi
� Esistono numerose chinasi che riconoscono
sequenze consenso di amminoacidi
� Possono esserci fosforilazioni multiple
7
Amplificazione in cascata
Quando enzimi attivano altri enzimi, il numero di molecole influenzate in una cascata aumenta geometricamente
Numerose chinasi sono coinvolte nella trasduzione di
segnali
8
Attivazioni proteolitiche:
gli enzimi digestivi
zimogeni
Vengono prodotti anche inibitori delle proteasi
Attivazioni proteolitiche:la cascata della coagulazione
1
Trasporto dell’ossigeno�Bassa solubilità di O2 in soluzioni acquose come il
sangue (1 x 10-4 M)
� In singole cellule o piccoli organismi è sufficiente la diffusione
�Esistono numerose proteine che legano ossigeno
– Emoglobina (ferro)
� vertebrati
– Emocianine (rame)
� molluschi
– Clorocruorine (ferro)
� Anellidi
ββββ 2
Mioglobina ed EmoglobinaProteine globulari complesse (contengono un
gruppo prostetico)
Emoglobina
Mioglobina
αααα 1αααα 2
ββββ 2 ββββ 1
Max Perutz, Premio Nobel per la Chimica 1962
2
Il gruppo prostetico è detto eme� È costituito da ferroprotoporfirina IX e Fe (II)
� Nell’emoglobina funzionale il Ferro rimane Fe2+ e non si ossida
� Esiste una emoglobina non funzionale contenente Fe3+ (metaemoglobina)
gruppi
propionici
pirrolo
globina
Nell’eme il Ferro (II) può avere sei legami di coordinazione:
� Quattro con gli N degli anelli
pirrolici
� Uno con una ISTIDINA
(prossimale) della globina
� Uno disponibile per l’ossigeno
� Il ferro deve essere “protetto”dalla ossidazione
His
sito per l’ossigeno
3
Vista di lato
Residuo di His
prossimale
Piano dell’anello
porfirinico
proteina
Istidina prossimale e distale
4
Ruolo dell’istidina distale
monossido di carbonio
Localizzazione dell’eme
His prossimale
His distale
tasca idrofobica
5
La ferro-protoporfirina è responsabile del colore del sangue
Mioglobina ed Emoglobina
� La struttura delle due proteine è diversa:
– Mioglobina: monomero con un gruppo prostetico (eme) che
complessa uno ione Fe2+.
– Emoglobina: tetramero (nei mammiferi) fatto di subunità (α2β2)
simili alla mioglobina; ognuna contiene un gruppo prostetico (eme)
che complessa uno ione Fe2+.
� Le funzioni biologiche delle due proteine sono diverse:
– Mioglobina: lega con lata affinità l’O2 e lo rende disponibile
SOLO quando la pO2 è molto bassa (muscolo, cetacei in
immersione).
– Emoglobina: lega l’O2 quando la pO2 è alta (polmoni, branchie) e
lo rilascia quando la pO2 è più bassa (tessuti, cellule).
6
La Mioglobina:
� È una proteina monomerica globulare compatta
� Contiene otto segmenti (A, B, C...) ad α-elica
(circa 75%)
� Possiede una cavità idrofobica che contiene
l’eme
� 153 amminoacidi
� PM ≈ 17.000
Il legame con l’ossigeno
� Nella mioglobina:
� Si definisce la saturazione frazionale (ΥO2 ) la
frazione di siti che hanno ossigeno legato:
Mb + O2 MbO2
KD =[Mb] [O2]
[MbO2]
γO2 =[Mb] + [O2]
[MbO2]γO2 =
KD + [O2]
[O2]
7
La MIOGLOBINA mostra una caratteristica
curva di saturazione iperbolica
Y
Y = [O2] /(K D + [O2]) = pO2 /(p50 + pO2)
Ruolo della mioglobina
� Mb ha un’alta affinità per
l’ossigeno: p50 bassa (2.8 Torr)
� Riesce ad “estrarre” l’ossigeno
dai capillari
� Quando le cellule sono
metabolicamente attive, Mb
rilascia l’ossigeno ai muscoli
8
L’emoglobina:� È costituita da 4 subunità (tetramero α2β2)
� è una proteina regolata (allosterica)
� mostra una curva di saturazione sigmoide
(cooperatività positiva)
Confronto tra Mb e Hb
9
L’emoglobina: una proteina regolata
� Effetti omotropici (dovuti al legando):
– cooperatività positiva
� Effetti eterotropici (dovuti ad altre molecole,
che si legano in un sito diverso da quello
attivo)
– allosterismo
Come si spiega la regolazione ?
� L’emoglobina esiste in due conformazioni (Perutz):
- Conformazione T (tesa), a bassa affinità per l’O2 (forma
deossigenata)
- Conformazione R (rilassata), ad elevata affinità per l’O2
T ⇔⇔⇔⇔ R
� Il legame della prima molecola di O2 causa la rottura di
alcune interazioni tra le subunità, rendendo più facile il
legame con le successive molecole di O2: cooperatività
positiva. Il cambiamento di affinità è dovuto ad una
modificazione conformazionale.
� Nella emoglobina, la forma T è stabilizzata da ponti salini
10
Effetto del legame con O2
Cooperatività positiva
STATO T
STATO R
11
Modello concertato (MWC)
� La proteina è un oligomero
� Esiste in due stati conformazionali, T ed R in equilibrio
� La forma non legata è T, a bassa affinità
� Tutti i siti di legame sono equivalenti
Stato T Stato R
L’emoglobina è finemente modulata: effetto del pH e della CO2
� In acqua, la CO2 libera H+ (reazione favorita dalla
anidrasi carbonica)
CO2 + H2O ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ H+ + HCO3-
gli ioni idrogeno stabilizzano la forma deossi:
H+Hb + O2 ⇔⇔⇔⇔ HbO2 + H+
12
L’emoglobina è finemente modulata: effetto del pH (effetto Bohr)
A pH più bassi la
curva di saturazione si
sposta a destra:
minore affinità
L’emoglobina è finemente modulata: effetto della CO2
� La CO2 si lega a gruppi amminici terminali con
formazione di carbammati:
R-NH2 + CO2 ⇔⇔⇔⇔ R-NH-COO- + H+
� Anche questa reazione stabilizza la forma T
(deossi);
� inoltre consente il trasporto della anidride carbonica
(15-20%), che viene rilasciata quando in presenza di
alte concentrazioni di O2 la forma ossi prevale
13
Il sistema tamponante del sangue
� Il principale sistema tampone è il bicarbonato:
� La reazione è catalizzata dall’enzima anidrasi carbonica
CO2 + H2O ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ H+ + HCO3-
da: Berg et al. Biochimica 6E - Zanichelli
L’emoglobina è finemente modulata: ruolo del BPG
14
L’emoglobina è finemente modulata: ruolo del BPG
BPG stabilizza la forma deossi legandosi ad
una cavità con gruppi positivi
Concentrazione alta nel sangue
Ruolo del BPG
15
Emoglobina fetale Hb F
Emoglobina fetale: BPG si lega
debolmente
His 143 assente in HbF
16
Varianti dell’emoglobina
� Ci sono almeno 800 varianti della emoglobina:
circa 95% riguardano un solo amminoacido
� Il 5 % della popolazione mondiale ha una
emoglobina diversa da quella “normale”
(HbA)
� Numerose mutazioni sono “silenti” (non
“patologiche”) - mutazioni conservative
� Consentono di studiare relazioni
struttura/attività
Anemia falciforme ed HbS� In Hb S, una Val sostituisce Glu in una posizione
superficiale;
� Val può dare legami idrofobici con un’altra Hb, particolarmente nella forma deossi;
� Le molecole Hb si aggregano in fasci e possono precipitare (eritrociti falciformi)
� Distribuzione geografica caratteristica
17
In Hb S, una Valina sostituisce un Acido glutammico
Hb S è meno acida di HbA
Distribuzione geografica
da: Berg et al. Biochimica 6E - Zanichelli
Il “tratto” falciforme (eterozigoti) conferisce protezione dalla malaria.
Nella talassemia sono coinvolte intere catene.
1
Lipidi� Composti eterogenei, idrofobici (poco solubili
in acqua, solubili in solventi apolari)
� Funzioni principali:
– riserve energetiche (grassi e olii)
– costituenti delle membrane
– in alcuni casi, “messaggeri” (ad esempio, ormoni)
– agenti emulsionanti
Acidi grassi
� Acidi carbossilici a lunga catena, spesso a numero pari di carbonii (i più comuni hanno 12-24 carbonii)
� Possono essere saturi o insaturi:– gli insaturi sono di solito cis
– le insaturazioni spesso cominciano dal C-9 (∆9)
– le insaturazioni sono ogni tre carbonii (non sono coniugate)
� I punti di fusione:– aumentano con la lunghezza
– diminuiscono con il grado di insaturazione
� La “fluidità” aumenta con il grado di insaturazione
2
Alcuni acidi grassi naturali
Acidi grassi saturi e insaturi
Acido stearico 18:0 Acido oleico 18:1 (∆9)
cis
3
“Impaccamento” degli acidi grassi
Triacilgliceroli (trigliceridi)� Esteri del glicerolo con acidi grassi� Riserva energetica depositata in forma anidra� Possono produrre acqua metabolica� Sono isolanti termici
glicerolo
4
Cere
� Esteri di acidi grassi a lunga catena con
alcoli a lunga catena
� Funzioni energetiche e protettive
� Di largo impiego nell’industria farmaceutica
e cosmetica
Classi principali di lipidi
Lipidi di deposito (neutri)
Lipidi di membrana (polari)
Triacilgliceroli
fosfolipidi glicolipidi
glicerofosfolipidi sfingolipidi sfingolipidi
5
Glicerofosfolipidi� Lipidi polari (anfipatici)
� Il glicerolo è esterificato:
– con due acidi grassi (code non polari)
– con un gruppo fosfato (testa polare)
� Il gruppo fosfato a sua volta può essere
esterificato con un altro alcool
Glicerofosfolipidi
6
Glicerofosfolipidi e fosfolipasi� I fosfolipidi possono essere “tagliati”
da fosfolipasi specifiche
� La fosfolipasi C libera diacilglicerolo,
una molecola segnale
SfingolipidiDerivano dalla sfingosina, un amminoalcool insaturo a 18 carbonii: i
C-1, 2, 3 “somigliano” al glicerolo
Un esempio: la sfingomielina:
Ossidrile in posizione 1
esterificato con fosforilcolina
Legame ammidico con un
acido grasso (cerammidi)
7
Sfingolipidi� Cerammide: unità comune
– Sfingomieline (testa polare di fosfocolina o
fosfoetanolammina)
– Glicosfingolipidi
� Cerebrosidi: singola unità saccaridica
� Gangliosidi: teste polari con oligosaccaridi complessi
(abbondanti sulla superficie esterna delle cellule)
Gli zuccheri di glicosfingolipidi sono i determinanti dei
gruppi sanguigni umani
Sfingolipidi
Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
8
� Quattro anelli condensati (ciclopentano-peridrofenantrene); nucleo planare e rigido
� Precursore di ormoni steroidi, sali biliari, vitamina D…
Steroidi e colesterolo
Testa polare
I sali biliari emulsionano i lipidi
9
Fosfolipidi in acqua
Ad esempio,
acidi grassi
lisofosfolipidi
Tratto da: A.L. Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
Membrane� Strutture laminari che delimitano diversi compar-
timenti cellulari
� Costituite da lipidi anfipatici e proteine (conten-gono anche carboidrati)
� Proteine specifiche svolgono ruoli funzionali
� Semi-permeabili
� Asimmetriche
� Fluide
� Resistenti e flessibili: si auto-assemblano e si sigillano
10
Schema di una membrana: il “mosaico fluido”
esterno
interno
proteina periferica
Mobilità dei lipidi e fluidità
� Movimento delle catene acilichee diffusione laterale
� La fluidità dipende dalla temperatura
� La fluidità dipende dalla composizione (presenza di insaturi, lunghezza delle catene)
� Il colesterolo modula la fluidità
� Il movimento trasversale (“flip-flop”) è lento; richiede enzimi (flippasi e floppasi) e spesso ATP
11
Temperatura di transizione
(stato paracristallino ⇒ fluido)
Composizione in acidi grassi di cellule di E. coli coltivate a temperature diverse
Percentuale rispetto agli acidi
grassi totali
10 °C 20 °C 30 °C 40 °C
Acido miristico (14:0) 4 4 4 8
Acido palmitico (16:0) 18 25 29 48
Acido palmitoleico (16:1) 26 24 23 9
Acido oleico (18:1) 38 34 30 12
Rapporto insaturi/saturi 2.9 2.0 1.6 0.38
12
Movimento “flip-flop”
� Le flippasi possono
richiedere energia
� In genere, determinano asimmetria nella membrana
Composizione e asimmetria
13
FRAP: una misura della mobilità
Proteine di membrana� Proteine integrali
– strettamente legate alla membrana con interazioni
idrofobiche
– si possono rimuovere solo disgregando la
membrana (con detergenti)
– Possono contenere più segmenti transmembrana
� Proteine periferiche o estrinseche
– legate blandamente ad una faccia della membrana
– una volta rimosse sono solubili
� Proteine ancorate covalentemente a lipidi (ad
esempio, GPI – glicosil-fosfatidilinositolo)
14
Un esempio di proteina integrale, la
batteriorodopsina (7-S)
1: porzione non raft della membrana2: lipid raft (ricco di colesterolo e sfingolipidi)3: proteina transmembrana associata a lipid raft 4: proteina nella porzione non raft della membrana5: proteina glicosilata6: proteina ancorata al GPI (glicosil-fosfatidilinositolo)7: colesterolo8: glicolipidi
spazio intracellulare
spazio extracellulare
Zattere o “lipid rafts”
Raft
15
Lipidi biologicamente attivi
� Ormoni steroidei
� Fosfatidilinositolo e suoi derivati fosforilati:
– segnalazione
� Cerammide e suoi derivati
– Segnalazione
� Eicosanoidi (derivati dell’acido arachidonico)
– Prostaglandine
– Trombossani
– Leucotrieni
Eicosanoidi
FANS
Tratto da: A.L. Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
Derivano principalmente dall’acido arachidonico
16
EicosanoidiEsplicano il loro ruolo a livello locale: vita breve
� Prostaglandine
– Numerosi tipi
– Stimolano la contrazione uterina, regolano il flusso sanguigno, sono legate all’infiammazione
� Trombossani
– Prodotti nelle piastrine, coinvolti nella coagulazione
� Leucotrieni
– segnali biologici: ad esempio, inducono la contrazione della muscolatura liscia nei polmoni
La cicloossigenasi (COX) che partecipa alla sintesi di prostaglandine e trombossani è inibita da FANS
1
Sistemi di trasporto di membrana
� Diffusione semplice (processo spontaneo non mediato)
� Trasportatori
– Diffusione facilitata o trasporto passivo
– Trasporto attivo
� primario
� secondario
�Canali e pori
Diffusione semplice
Processo spontaneo non
mediato.
La velocità dipende dal
gradiente ∆[C], dalla
superficie di contatto e
da un coefficiente di
diffusione (legge di Fick)
2
Il flusso segue il gradiente di concentrazione…
… oppure un gradiente elettrico (o entrambi)
3
Diffusione semplice
� Non sono richieste proteine particolari
� Le specie si muovono seguendo il gradiente di
concentrazione; da [C] più alta a [C] minore
� Spesso, bassi coefficienti di permeabilità: velocità
bassa
� Poche specie diffondono efficacemente per questa via
(gas come l’ossigeno, molecole non polari come gli
steroidi...)
Trasportatori di membrana
Soggetti a modificazioni
conformazionali
I trasportatori (come gli
enzimi) diminuiscono
l’energia di attivazione
del processo di trasporto
4
Trasporto passivo (diffusione facilitata)
� Come per le reazioni che richiedono enzimi, la diffusione può essere possibile dal punto di vista termodinamico, poco probabile dal punto di vista cinetico.
� I soluti si muovono secondo gradiente (direzione favorita termodinamicamente)
� Proteine aumentano la velocità di trasporto(confronta con gli enzimi)
� Il trasporto mostra cinetiche di saturazione
Trasporti mediati e non mediati:differenze
� Velocità
� Specificità
� Saturazione
� Competizione
� Inibizione/inatti-
vazione
5
Il trasporto passivo del glucosio (Glut1; glucosio permeasi)
� Dodici eliche trans-membrana
� Due siti di legame (interno ed esterno)
� Cambiamento conformazio-nale in seguito al legame con il glucosio
� Glucosio nel plasma: ~ 5 mM
� Famiglia di trasportatori Glut: Glut4 è sotto il controllo dell’insulina
Ad es., Glut
pompa del
sodio
6
Trasporto attivo� I soluti si muovono contro gradiente (chimico,
elettrico o entrambi)
� Il processo sarebbe sfavorito termodinamicamente
– Trasporti attivi primari: l’energia deriva direttamente
da ATP
– Trasporti attivi secondari: l’energia deriva da un altro
processo accoppiato e favorevole (ad esempio,
gradienti ionici)
Un trasportatore attivo primario:la Na+-K+ ATPasi
� Escono 3 Na+
� Entrano 2 K+
� contro gradiente
chimico ed elettrico
7
Un trasportatore attivo primario:la Na+-K+ ATPasi
Dapprima ATP fosforila il
trasportatore e ne cambia la
specificità
Il cambiamento conforma-
zionale è dovuto alla
fosforilazione di un Asp
(ATPasi di tipo P)
La proteina fosforilata lega K+
Il fosfato si libera e K+ viene
rilasciato
La pompa del sodio è inibita dalla ouabaina e da glicosidi
cardioattivi come la digitossina
8
La concentrazione di calcio intracellulare è controllata
� [Ca2+] in è circa 0.1 µM, circa 4 ordini di grandezza più bassa che all’esterno
� Esistono almeno due Ca-ATPasi di tipo P, una di membrana citoplasmatica che espelle il calcio e una del reticolo endoplasmico/sarcoplasmico(SERCA) che lo sequestra
� Nella contrazione muscolare, il calcio èrilasciato dal reticolo
� Esiste anche uno scambiatore Na+/Ca2+
Un trasportatore attivo secondario:il trasportatore intestinale di glucosio
� Il trasportatore porta all’interno (sinporto)
– il glucosio contro gradiente (∆G positivo)
– il sodio secondo gradiente (∆G negativo)
� L’energia (sotto forma di ATP) è consumata
per espellere di nuovo il sodio (pompa del
sodio)
9
Trasportatori attivi primari e secondari
La resistenza ai farmaci anti-tumorali (MDR)
Dipende da una
pompa proteica che
espelle sostanze
estranee (in genere
idrofobiche) come
alcuni farmaci
Glicoproteina P
10
Sistemi di trasporto in cellule di mammifero
� Glucosio
� Amminoacidi
� H+ (ATPasi di tipo F)
� Na+, K+
� Ca++ (SR)
� Ca++, Na+
� Lattosio, H+ (E. coli)
� Passivo
� Co-trasporto attivo con Na+
� Co-trasporto attivo con Na+
� Attivo (mitocondri)
� Attivo primario (antiporto)
� Attivo primario
� Scambio attivo (secondario)
� Attivo secondario (sinporto)
Canali
� “Buco acquoso” nella membrana
� Velocità molto elevate (anche 1000 volte superiori ai trasportatori
� “Gating” (possono essere aperti o chiusi)
� Non saturabili
� Seguono il gradiente
11
La famiglia delle acquaporine� Nei mammiferi esistono almeno 11 proteine-
canale integrali per l’acqua
� Diversa localizzazione e ruolo
� Flusso molto veloce
� Peter Agre, Premio Nobel per la Chimica, 2003
Il canale per il sodio dipendente dal voltaggio è
bloccato dalla tetrodotossina
12
Il recettore dell’acetilcolina
Il canale del recettore dell’acetilcolina
Residui idrofobici ingombranti Leu tengono chiuso il canale
Il legame di due acetilcoline provoca una rotazione
Con i recettori occupati, le eliche espongono residui polari verso il canale
13
Ionofori mobili e che formano canali� Molecole organiche (spesso di origine
batterica) che aumentano la permeabilità di
membrana
– formanti canali
– trasportatori mobili
Valinomicina
Ionoforo specifico per K+
Struttura ciclica; contiene D- ed L-amminoacidi
Affinità per il potassio 1000 volte superiore rispetto al sodio
14
Gramicidina
1
Il metabolismo;sistemi enzimatici coordinati per:
�ottenere energia dall’ambiente (luce solare o sostanze
nutrienti)
�convertire molecole nutrienti nelle molecole caratteristiche
della cellula
�polimerizzare precursori (per produrre proteine,
polisaccaridi, acidi nucleici…)
�sintetizzare/degradare molecole specializzate
In E. coli, più di 1000 reazioni chimiche
Alto livello di coordinazione
Relazioni metaboliche
Da: Lehninger
OSSIDAZIONI
RIDUZIONI
2
Le vie metaboliche� Sono spesso “irreversibili” (∆G << 0)
� Molte tappe sono prossime all’equilibrio (∆G°’ ≅ 0) e dipendono dalle concentrazioni di reagenti
� Una (o più di una) tappa iniziale è di controllo(irreversibile); qui spesso il reagente si accumula (“diga”)
� Vie cataboliche e anaboliche sono spesso diverse
� Le vie cataboliche sono convergenti; quelle anabolichedivergenti
� Negli eucarioti esiste compartimentazione: questo consente di separare alcune vie e di mantenere concentrazioni diverse di metaboliti ed enzimi
I flussi sono controllati dalle reazioni “irreversibili”
Reazione limitata
dall’enzima (lontano
dall’equilibrio)
Reazioni limitate
dal substrato
(prossime
all’equilibrio)
3
Controllo del metabolismo
• Attività enzimatica (regolazione allosterica e covalente)
• Quantità di enzimi (induzione e repressione)
• Disponibilità di substrati
• Stato energetico
AMPADPATP
ADPATP
++
+ 2/1Carica energetica =
Le vie cataboliche sono convergenti
Da: Champe
4
Esempi di reazioni biochimiche
• Trasferimenti di gruppo (sostituzione nucleofila)
• Ossido-riduzioni
• Eliminazioni, isomerizzazioni, riarrangiamenti
• Reazioni che formano/rompono legami C-C
Composti “ad alta energia”• La completa ossidazione di “combustibili”
libererebbe notevoli quantità di energia:
– Glucosio: 2850 kJ/mole
– Palmitato 9780 kJ/mole
• Il metabolismo procede a tappe: l’energia è
immagazzinata a “pacchetti” in intermedi
“ad alta energia”
5
ATP, un composto con elevata energia di idrolisi
Adenina
ATP, un composto con elevata energia di idrolisi
6
Sub-
Trasferimento di
un gruppo fosfato
Trasferimento di un
gruppo adenilico
Sub-
ATP
Importanza di intermedi fosforilati
Composti in genere stabili cineticamente
7
L’ATP è usato per alimentare numerosi processi
The ATP cycle
Luce (fotosintesi) o composti ad alta energia potenziale (respirazione)
Sintesi di macro-molecole (proteine, DNA…)
Sintesi di altri componenti cellulari
Movimenti cellulari e lavoro meccanico
Trasporti di molecole/ ioni contro gradiente
Generazione di potenziali elettrici
Calore
Nell’uomo ci sono circa 100 g di ATP: a riposo si “consumano”
circa 40 kg ATP/giorno
Reazioni accoppiate
8
Coenzimi ossido-riduttivi
NAD+ e FAD
• Piridinici (NAD e NADP)
– Derivano dalla niacina (Vitamina PP o B3)
– Cosubstrati di più di 200 enzimi
– Ruoli metabolici specializzati
– Accettano due elettroni (ione idruro H:-)
– NADPH è coinvolto nelle biosintesi riduttive
• Flavinici (FMN e FAD)
– Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)
– Possono trasferire un elettrone alla volta
– In genere, legati saldamente agli enzimi (flavoproteine)
Coenzimi ossido-riduttivi
9
Un coenzima che partecipa ad ossidoriduzioni: il NAD(P)
Nicotinammide Adenina Dinucleotide
Ossidoriduzioni ed energia
• L’ossidazione di coenzimi ridotti è un processo
esoergonico
• L’energia liberata può essere utilizzata per la
sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa)
• ATP può essere generato anche dall’accoppia-
mento con processi più esoergonici
(fosforilazione a livello del substrato)
10
- CH2- CH2- - CH ==== CH -
FAD FADH2
Il substrato si è ossidato (ha perso elettroni), il FAD si è ridotto a FADH2 (ha acquistato elettroni)
- CH - CH2-
OH
- C - CH2-
ONAD+ NADH
Il substrato si è ossidato (ha perso elettroni), il NAD+
si è ridotto a NADH (ha acquistato elettroni)
I coenzimi flavinici e piridinici sono accettori di elettroni che provengono dalle
ossidazioni
Gli elettroni possono trasferirsi da prodotti ridotti a reagenti
ossidati di una reazione sovrastante
OSSIDANTI
RIDUCENTI
Da: Lehninger
1
Il glucosio svolge un ruolo centrale
Glicogeno, amido,
saccarosio...
deposito
glicolisi (10 reazioni)
Acidi grassi
2
Alcuni aspetti della glicolisi• Via “antica” e conservata
• Formazione di ATP nella glicolisi
• Destino del piruvato
• Energia rimasta nel piruvato
• Ruolo degli intermedi fosforilati
• Altri zuccheri come fruttosio e galattosio sono trasformati in intermedi della glicolisi
• Il NAD+ come reattivo limitante
• Fermentazioni: reazioni anaerobiche che rigenerano NAD+
Glicolisi: fase preparatoria
Fosforilazione del glucosio e
formazione della
gliceraldeide-3-P
3
Glicolisi: fase di recupero
conversione della gliceraldeide-3-P
Formazione di ATP
Glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi→ 2 piruvato + 2 NADH +
2 ATP + 2 H2O + 4 H+
Il glucosio è
trasportato
all’interno
della cellula
4
1. Attivazione del glucosio:
la prima tappa è “irreversibile” e regolata
∆G = - 33.9 kJ/mol
Reazioni accoppiate
5
Isoenzimi della esochinasi:ruolo metabolico
Vmax/2
epatica (non è inibita da G-6-P)
inibita da G-6-P
Il glucosio è trattenuto nella cellula dalla fosforilazione a G6P
La fosforilazione
sposta l’equilibrio a
destra
6
2. Isomerizzazione a fruttosio
È più facile fosforilare un -OH primario
3. La seconda fosforilazione è catalizzata dalla fosfofruttochinasi (PFK-1)
7
La fosfofruttochinasi è un enzima regolato
4. L’aldolasi catalizza una condensazione aldolica
∆∆∆∆G = - 0.23 kJ/mol
8
5. I prodotti dell’aldolasi possono
interconvertire per isomerizzazione
La glicolisi prosegue dalla GA3P
TPI è un enzima “perfetto”
6. L’ossidazione dell’aldeide “guida” la
formazione dell’acilfosfato, composto
ad alta energia
9
Meccanismo d’azione della
gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi
tioemiacetale tioestere
7. La fosfoglicerato chinasi forma ATP
(fosforilazione a livello del substrato)
Le reazioni 6) e 7) sono energeticamente accoppiate:
∆∆∆∆G°’ = 6.3 – 18.5 = - 12.2 kJ/mol
10
Importanza di intermedi fosforilati
6, 7 - riassumendo:
• Un’aldeide (gliceraldeide-3-P) è ossidata a
1,3 bis-fosfoglicerato (che poi si trasforma
in 3-P-glicerato)
• Il NAD+ si riduce a NADH
• Si forma ATP, a spese dell’energia di
ossidazione del carbonio
• La reazione 7) “spinge” in avanti la
reazione 6) con cui è accoppiata
11
Una deviazione nella glicolisi
• Nei globuli rossi, da 1,3 BPG per azione di
una mutasi si forma 2,3 BPG, effettore
negativo dell’emoglobina
8. La fosfoglicerato mutasi riposiziona il
fosfato per la reazione successiva
12
9. La deidratazione catalizzata da enolasi
forma un composto ad alta energia
10. L’energia del PEP è usata per formare un
secondo ATP (piruvato chinasi)
Reazione fortemente esoergonica
13
Bilancio energetico
della glicolisi
Le reazioni della
glicolisi sono
utilizzate in parte
nella via sintetica
(gluconeogenesi)
14
Destino del piruvato e del NADH
• In condizione aerobiche,
– il piruvato è ossidato completamente a CO2 e
acqua (ciclo dell’acido citrico)
– Il NADH partecipa al trasferimento di elettroni
fino all’accettore finale ossigeno: in questo
processo si rigenera NAD+
• In condizioni anaerobiche,
– Il piruvato è trasformato per rigenerare NAD+
(fermentazioni)
Fermentazione lattica• Serve per rigenerare NAD +
• Il lattato è trasportato dal
sangue al fegato dove si può
riformare glucosio (ciclo di
Cori)
15
Fermentazione alcolica (lieviti)
È necessario un cofattore, la
tiamina pirofosfato
La tiamina pirofosfato
• Deriva dalla tiamina, vitamina B1, anti beri-beri
• Partecipa a reazioni di decarbossilazione,
trasportando un’”aldeide attiva”
• Forma un carbanione sull’anello tiazolico (che
contiene un H acido)
16
Vitamina B1
Si forma un carbanioneH acido
Meccanismo
d’azione della
TPP
Da: Lehninger
1
La gluconeogenesi• Alcuni tessuti (globuli rossi, cervello..)
dipendono dal glucosio
• Sintesi di glucosio da precursori non glucidici:
– Lattato, piruvato, ossalacetato, glicerolo…
– Amminoacidi (scheletro carbonioso)
• Usa le reazioni glicolitiche in direzione inversa tranne quelle esoergoniche:
– piruvato chinasi
– fosfofruttochinasi
– esochinasi
• Principalmente nel fegato
• Glicolisi e gluconeogenesi strettamente coordinate
La piruvato carbossilasi produce ossalacetato
• La reazione richiede ATP, HCO3- e biotina (un coenzima
che trasporta CO2 )
• La biotina è legata covalentemente a una lisina dell’enzima
• Regolazione: quando ATP o acetil-CoA sono alti, il
piruvato entra nella gluconeogenesi
• Esiste un "problema di conversione " nei mitocondri
(passaggio di metaboliti tra citosol e mitocondri)
2
La biotina
• Vitamina (H) sintetizzata da batteri intestinali
• Trasporta CO2
• Legata covalentemente a enzimi (braccio mobile)
• La carbossilazione richiede ATP
Biotina Carbossi-biotinil-
enzima
*
L’ossalacetato è
un intermedio del
ciclo di Krebs
(mitocondri)
3
La piruvato carbossilasi
è attivata da acetil-CoA
Acidi grassi
Prima
deviazionepiruvato
chinasi
4
Il trasporto del malato produce NADH citosolici
PEPCK
citosolica
MDH
citosolica
La piruvato carbossilasi è nel mitocondrio
5
Meccanismo di azione della piruvato carbossilasi
La fosfoenolpiruvato
carbossichinasi
• L’ossalacetato è un
piruvato “attivato”
• Occorre molta energia
proveniente:
– dalla decarbossilazione
– dal GTP
6
Le altre due deviazioni
Seconda
deviazione
Terza
deviazione
Nella sintesi di un glucosio si
“consumano” 6 ATP
Dato che nella glicolisi si
formano 2 ATP, un ciclo
futile “costerebbe” 4 ATP
Glicolisi e gluconeogenesi� La glicolisi e la gluconeogenesi sono vie metaboliche
spontanee (esoergoniche)
� Se fossero attive simultaneamente si avrebbe un “ciclo
futile” con consumo di energia: è necessaria una regolazione
reciproca
� Glicolisi: � glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi � 2 piruvato + 2 NADH
+ 2 ATP
� Gluconeogenesi: � 2 piruvato + 2 NADH + 4 ATP + 2 GTP � glucosio + 2 NAD+
+ 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi
� Glicolisi + gluconeogenesi:
� 2 ATP + 2 GTP ���� 2 ADP + 2 GDP + 4 Pi
7
Il fruttosio 2,6-bisfosfato è un potente
modulatore
La glicolisi è attivata La gluconeogenesi è rallentata
Enzima tandem
• Il fruttosio 2,6-bisfosfato è sintetizzato e scisso
da due attività sullo stesso enzima (PFK-2 e
Fruttosio BisFosfatasi -2, (FBP-2))
• L’enzima è sotto controllo allosterico, covalente,
ormonale
8
Ruolo del fruttosio 2,6-bisfosfato
PFK-2
Via del pentosio fosfato
(“shunt” dell’esosio monofosfato)
� Alternativa ossidativa alla glicolisi
�Tessuto adiposo
�fegato (30% del glucosio ossidato)
� Ha origine dal glucosio 6-fosfato
�Esochinasi, Glicogeno
� Serve a produrre (fase ossidativa)
�Pentosio fosfato (ribosio)
�NADPH
9
NADPH
• NADPH: “potere riducente” per
le biosintesi (come quella degli
acidi grassi)
– Distinto da NADH
– [NAD+]/[NADH] ≅ 1000
– [NADP+]/[NADPH] ≅ 0.01
1. Glucosio 6-fosfato deidrogenasi
Si forma un δ-lattone (estere
ciclico intramolecolare)
2. La lattonasi (esterasi)
accelera l’apertura dell’anello
10
3. Fosfogluconato deidrogenasi
• La fosfogluconato deidrogenasi catalizza la de-
carbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato:
il NADP+ serve da ossidante
Un chetosio:
ribulosio-5-P
4. Formazione del ribosio 5-fosfato
� Si forma il chetone ribulosio-5-
fosfato che una isomerasi
converte in ribosio-5-fosfato
� Nella fase ossidativa si formano
un Ribosio-1-P e due NADPH
� NADPH serve per le vie
sintetiche e previene danni
ossidativi
11
Isomerizzazione del ribulosio 5-P
5
6
Via del pentosio fosfato:fase non ossidativa
• Ricicla pentosi in composti a diverso numero di
carbonii
• Da tre pentosi (C5) si può arrivare a due molecole di
fruttosio-6-P (C6) e una gliceraldeide-3-P (C3)
• Può essere percorsa in entrambe le direzioni
(reazioni facilmente reversibili)
• Consente di arrivare a pentosi senza la fase
ossidativa
• Transchetolasi: trasferisce un frammento a due C da
un chetosio donatore a un aldosio accettore
• Transaldolasi: trasferisce un frammento a tre C
12
La fase non ossidativa ricicla i pentosi a glucosio-6-fosfato
Da: Voet et al. Fondamenti di Biochimica - Zanichelli
FASE
OSSIDATIVA
FASE NON
OSSIDATIVA
C5
C5
C7C3
C4
C6
13
Reazioni
reversibili:
la fase non
ossidativa
può essere
percorsa al
contrario
Versatilità della via dei pentosi
1. Richiesta di “potere riducente” e ribosio
(ad esempio, duplicazione cellulare)
– Fase ossidativa
2. Elevata richiesta di NADPH
– La via prosegue con le reazioni transchetolasiche
e transaldolasiche
3. Bassa richiesta di NADPH
– La fase non ossidativa è percorsa a ritroso
partendo da fruttosio-6-fosfato
14
Carenza di G6PDH e favismo
� NADPH contribuisce a mantenere l’ambiente
riducente nei globuli rossi
� La carenza dell’enzima porta a crisi emolitiche
� Numerosi farmaci e sostanze ossidanti possono
scatenare crisi emolitiche
� Distribuzione geografica simile a quella della
malaria
1
Glicogeno• Il glicogeno (come l’amido) è un polimero del D-glucosio
• I monomeri sono legati con legami glicosidici αααα 1→→→→4
nelle catene principali e αααα 1 →→→→ 6 nelle ramificazioni.
• È un sistema di accumulo del glucosio sotto forma di
granuli (soprattutto nel fegato): struttura molto ramificata
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
OOH
O
CH2OH
OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
OH
n
n
4
6
1α
1α
1mm
Demolizione del glicogeno (glicogenolisi)
• Alimenta il glucosio del sangue (~ 5mM) dal
fegato e la glicolisi nel muscolo
• Riserva di breve durata
• Richiede tre enzimi
2
La glicogeno fosforilasi• Stacca un glucosio -1-fosfato (G1P) da una estremità
non riducente (C-4 libero) (reazione di fosforolisi)
Glicogeno• La struttura dei granuli di glicogeno permette una
rapida mobilizzazione (scissione) del glucosio 1-P
poiché vi sono molte estremità diverse attaccabili
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
OOH
O
CH2OH
OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
O
O
CH2OH
OH
OH
OH
n
n
4
6
1α
1α
3
2, 3 Glicogenolisi
• Date le dimensioni del sito, la fosforilasi riesce a tagliare il legame α 1→ 4 fino a quattro residui dalla ramificazione
• 2. Un enzima deramificante“sposta” tre unità di glucosio (transferasi) e “taglia” l’ultimo glucosio (attività glucosidasi) formando glucosio libero
• 3. La fosfoglucomutasi (una isomerasi) converte G1P in G6P
• Nel fegato, il G6P produce glucosio (G6P fosfatasi)
Nel fegato è
presente la G6P
fosfatasi
4
La glicogeno fosforilasi è un enzima
polimerico controllato
• Regolazione covalente: esiste una forma fosfo-
rilata in Serina (fosforilasi a) più attiva e una
defosforilata (fosforilasi b) meno attiva
• Regolazione allosterica: conformazione attiva R
e meno attiva T. Un effettore positivo come
AMP sposta l’equilibrio verso R.
Sintesi del glicogeno
• Sintesi e demolizione devono seguire vie diverse
• Occorrono tre enzimi
• La sintesi è coordinata con la demolizione
• La sintesi ha inizio con una reazione esoergonica
(di attivazione)
• Si utilizza UTP come trasportatore di glucidi
5
1. La UDP-glucosio pirofosforilasi
• G1P è trasferito su UTP
• L’idrolisi del pirofosfato PPi
rende la reazione esoergonica
(strategia comune)
2. La glicogeno sintasi
• Il glucosio è trasferito dall’UDPG sul C-4 di un
estremità non riducente di glicogeno (αααα 1→→→→4 )
6
La glicogeno sintasi è un enzima
controllato
• La glicogeno sintasi è un tetramero in cui la forma
fosforilata (su Ser) è meno attiva (al contrario della
fosforilasi)
• La forma fosforilata è regolata allostericamente
• Il controllo glicogeno fosforilasi/sintasi è ormonale
3. L’enzima ramificante
• La sintasi allunga catene con legami αααα 1→→→→ 4 (come
nell’amilosio)
• Le ramificazioni sono dovute ad un enzima che
trasferisce segmenti di residui di glucosio su di un C6
• Dato che la sintasi può solo allungare segmenti pre-
esistenti, la sintesi comincia da una proteina
glicogenina su cui si forma un “innesco” (su di un
residuo di Tyr)
1
Fasi della demolizione aerobica del glucosio
� Produzione di acetil-CoA (complesso della
piruvato deidrogenasi)
� Ossidazione dell’acetil-CoA (ciclo di Krebs)
� Trasferimento di elettroni e fosforilazione
ossidativa
Gli acetil-CoA possono provenire anche dalla
demolizione (ossidazione) degli acidi grassi
Il Ciclo dell’acido citrico (di Krebs; 1937)
“cristae”
(acetilCoA)
2
Il Ciclo dell’acido citrico: una panoramica
� Via circolare (ciclo) con otto reazioni
� Le reazioni avvengono nella matrice
mitocondriale (un enzima è nella membrana
mitocondriale interna)
� Nei mitocondri vi sono anche gli enzimi per
l’ossidazione degli acidi grassi e la fosforilazione
ossidativa
Il Ciclo dell’acido citrico: una panoramica
� Reazione netta totale:
� Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi →
CoA + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2 CO2
� L’energia di ossidazione è conservata nei
coenzimi ridotti e nel GTP
� Il ciclo agisce come un catalizzatore che ossida
gruppi acetilici
� Gli intermedi della via possono essere precursori
di altri composti (funzione anfibolica)
3
Una tappa di collegamento:la piruvato deidrogenasi
� Trasforma il piruvato in acetil-CoA
� È un complesso (in E. coli, 60 subunità!) formato da tre enzimi:– piruvato deidrogenasi
– diidrolipoiltransacetilasi
– diidrolipoildeidrogenasi
� Utilizza cinque coenzimi:– CoA-SH
– tiamina pirofosfato (TPP)
– Lipoato
– NAD+
– FAD
Il complesso piruvato deidrogenasi
consente l’ingresso del piruvato nel
ciclo di Krebs
4
Il coenzima A (CoA-SH)
ββββ-mercaptoetilammina Acido pantotenico
I tioesteri sono composti “ad alta energia”
L’acido pantotenico è una vitamina del
gruppo B
La tiamina pirofosfato
(TPP)
La Tiamina è una vitamina (B1) – anti beri-beri
5
Coenzimi ossido-riduttivi
NAD+
FAD
FMN
Il lipoato (fattore vitaminico)
è un braccio mobile legato
covalentemente all’enzima E2
Catena polipeptidica di E2
(diidrolipoiltransacetilasi)
6
Decarbossilazione
ossidativa del
piruvato
�Piridinici (NAD e NADP)
– Derivano dalla niacina (Vitamina PP o B3)
– Cosubstrati di più di 200 enzimi
– Ruoli metabolici specializzati
– Accettano due elettroni (ione idruro H:-)
– NADPH è coinvolto nelle biosintesi riduttive
�Flavinici (FMN e FAD)
– Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)
– Possono trasferire un elettrone alla volta
– In genere, legati saldamente agli enzimi (flavoproteine)
Coenzimi ossido-riduttivi
7
Controllo della piruvato deidrogenasi� Inibizione retroattiva da prodotto
– NADH
– Acetil CoA
� Regolazione covalente
– la fosforilazione tramite una chinasi rende il
complesso meno attivo
– L’insulina attiva la piruvato deidrogenasi tramite una
fosfatasi
� Regolazione allosterica
– ATP inibisce
– AMP attiva
1. La citrato sintasi: l’acetil-CoA condensa con l’ossalacetato
legame tioestere
8
2. L’aconitasi: il citrato isomerizza
La reazione sarebbe spostata a sx, ma si consuma isocitrato
L’isocitrato si ossida più facilmente
3. Prima decarbossilazione ossidativa: l’isocitrato deidrogenasi
Si forma il primo NADH
9
4. Seconda decarbossilazione ossidativa:
l’α-chetoglutarato deidrogenasi
Il meccanismo è analogo alla piruvato deidrogenasi:
il prodotto è un tioestere ad alta energia
5. Parte dell’energia è recuperata in
una fosforilazione a livello del substrato
10
6. Ossidazione del succinato
SDH: nella membrana interna
7. Idratazione del fumarato
11
8. L’ossalacetato viene recuperato: la malato deidrogenasi
La reazione sarebbe endoergonica, ma la
citrato sintasi rimuove l’ossalacetato
I prodotti del ciclo di Krebs
12
Bilancio del ciclo� Nella glicolisi dal glucosio si formano 2 ATP e due
NADH
� Nel ciclo di Krebs da due molecole di piruvato si ottengono:
– 8 NADH (di cui due 2 dalla piruvato deidrogenasi)
– 2 FADH2
– 2 GTP
� Dalla ossidazione dei coenzimi nella fosforilazione ossidativa si ottengono:
– Dal NADH: 2.5 - 3 ATP
– Dal FADH2: 1.5 - 2 ATP
� Dalla ossidazione completa del glucosio si ottengono 32-38 ATP, con una resa attorno al 65%
Controllo del ciclo di Krebs
� Tre fattori:
– Disponibilità di substato
– Inibizione da prodotto
– Inibizione allosterica retroattiva
(da ATP)
� Il ciclo è regolato a livello
delle tre tappe esoergoniche:
– Citrato sintasi
– Isocitrato deidrogenasi
– α-chetoglutarato deidrogenasi
Acidi grassi
13
Reazioni cataplerotiche/anaplerotiche
� Ossalacetato per la gluconeogenesi
� Acetil-CoA per la sintesi degli acidi grassi (via citrato)
� Ossalacetato/chetoglutarato verso il metabolismo degli amminoacidi
� Ossalacetato dalla piruvato carbossilasi (gluconeogenesi); un aumento di acetil-CoA attiva l’enzima
� Ossalacetato/ chetoglutarato dal metabolismo degli amminoacidi
1
Trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa
• Le ossidazioni di nutrienti producono coenzimi ridotti
(NADH, FADH2)
• Nel processo di riossidazione dei coenzimi ridotti è
coinvolto un flusso di elettroni attraverso intermedi redox
• L’energia resa disponibile dal flusso esoergonico di
elettroni è accoppiata al trasporto endoergonico di protoni
attraverso la membrana mitocondriale
• il flusso di protoni in senso inverso (gradiente protonico)
fornisce l’energia libera per la sintesi di ATP
Trasporto di elettroni e
fosforilazione ossidativa: schema
2
Creste
Membrana interna
Membrana esterna
Spazio intermembrana
Matrice
STRUTTURA DEL MITOCONDRIO
Probabilmente “antichi” batteri aerobici; possiedono un loro DNA
Sistemi navetta: i coenzimi ridotti devono
essere trasportati nei mitocondri
La navetta
malato-aspartato
Da: J. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer “Biochimica”, Zanichelli
3
La navetta del
glicerofosfato
I valori positivi indicano una maggiore tendenza ad acquistare elettroni
(ridursi).
Il flusso di elettroni va da specie con potenziale più negativo a specie con
potenziale più positivo
Potenziali redox nella catena respiratoria
4
I potenziali redox consentono di valutare la variazione di energia libera
E = E°’ +RT/nℑ . ln [accettore e-]/ [donatore di e-]
∆E = Eaccettore - E donatore
∆G°’ = - nℑ ∆E°’
Ad esempio,
NAD+ + H+ + 2e- ⇔ NADH E°’ = - 0.315 V
1/2 O2 + 2H+ + 2e- ⇔ H2O E°’ = 0.815 V
L’ossigeno ha maggior tendenza a ridursi:
1/2 O2 + NADH + H+ ⇔ H2O + NAD+
∆E°’ = 1.130 V ∆G°’ = - 218 kJ/mole
Alla catena respiratoria partecipano:
• Coenzimi (NADH, FADH2, FMN)
• Proteine integrali di membrana come
– citocromi (contenenti gruppi eme)
– proteine ferro-zolfo
• Ubichinone o Coenzima Q, molecola idrofobica
diffusibile nel doppio strato
• Citocromo c, una piccola proteina periferica
(solubile )
5
Schema del trasferimento elettronico
matrice
Spazio intermembrana
Complesso INADH DEIDROGENASI trasferisce elettroni dal NADH al Q
Complesso IISUCCINATO DEIDROGENASI trasferisce elettroni dal FADH2 al Q
Complesso IIIUBICHINONE-CITOCROMO C REDUTTASI trasferisce elettroni dal Q al citocromo c
Complesso IVCITOCROMO OSSIDASI trasferisce elettroni dal citocromo c all’O2
All’interno di ogni complesso, gli elettroni passano sequenzialmente
attraverso una serie di trasportatori di elettroni.
Complesso I : NADH DEIDROGENASI (NADH-ubichinone ossidoreduttasi)
• Trasferimento di elettroni da NADH al Coenzima Q (CoQ ) NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2
• Quattro H+ transportati fuori per 2 e-
Forma a L
6
Complesso I : NADH DEIDROGENASI (NADH-ubichinone ossidoreduttasi)
• Complesso di grandi dimensioni: più di 40
subunità proteiche tra cui
– Una FMN-flavoproteina
– Almeno sei centri FeS
• L’ubichinolo (Coenzima Q ridotto - QH2)
diffonde nella membrana verso il Complesso III
• Inibito da amital (un barbiturico) e rotenone
Coenzimi ossido-riduttivi
NAD+
FAD
FMN
7
Per il loro “trasporto interno” di elettroni le proteine che
fanno parte del I e II complesso utilizzano:
� molecole di FMN e FAD
� centri Fe-S, nei quali il Fe passa dallo stato di
ossidazione +2 a +3 e viceversa, trasportando elettroni
Tratto da: A.L. Lehninger “Introduzione alla Biochimica”, ed. Zanichelli
COMPLESSI I E II
L’ubichinone o
coenzima Q è
liberamente diffusibile
nella membrana
Ubichinone (Q)
ossidato
Radicale
semichinone (QH ••••)
Ubichinolo (QH2)
ridotto
Benzochinone, con una catena
laterale isoprenoide
(comunemente 10 unità: Q10)
8
Complesso II SUCCINATO DEIDROGENASI
(succinato-CoQ reduttasi)
• E’ lo stesso enzima che partecipa al ciclo di Krebs
• Trasferisce elettronidirettamente al CoQ
• NON trasporta H+ nello spazio intermembrana
• Altri substrati trasferiscono elettroni dal FADH2 direttamente al CoQ
da: Lehninger
Complesso III (complesso bc1)UBICHINONE-CITOCROMO C REDUTTASI
• CoQ passa elettroni al citocromo c (e pompa 4 H+)
• Le principali proteine trans-membrana nel complesso III
sono citocromi b e c1
• I citocromi sono agenti che trasferiscono un elettrone
• UQH2 è un trasportatore di elettroni liposolubile
• Il citocromo c è un trasportatore di elettroni idrosolubile
(è una piccola proteina periferica di membrana)
9
I citocromi contengono gruppi prostetici a Ferro
Per il loro “trasporto interno” di elettroni, i complessi III e IV
utilizzano proteine dette citocromi, contenenti gruppi porfirinici
(eme) a cui è legato il Fe, che può passare dallo stato + 2 a quello + 3
e viceversa
I citocromi hanno spettri UV-vis
caratteristici
10
Complesso IVCITOCROMO OSSIDASI
� Grandi dimensioni: 13 subunità
� Trasferisce elettroni dal citocromo c all’O2; si ha una riduzione a 4 elettroni dell’O2 per produrre 2 H2O
� L’ossigeno è dunque l’accettore terminale di elettroni nella catena di trasporto
� La citocromo c ossidasi utilizza 2 gruppi eme di tipo a e 2 siti a rame
� Il complesso IV trasporta anche 2 H+ nello spazio intermembrana
Potenziali
nel trasporto
di elettroni
11
Fosforilazione ossidativa e teoria chemiosmotica
• La sintesi dell’ATP è catalizzata dalla ATP sintasi
• l’energia liberata dal trasporto di elettroni serve per
pompare H+ nello spazio intermembrana creando un
gradiente elettrochimico (pH e carica) (forza motrice
protonica);
• Il potenziale del gradiente è sfruttato per la sintesi di
ATP, grazie al rientro “guidato” di protoni nella matrice
La sintesi di ATP è “guidata” dal gradiente protonico
12
Il gradiente di H+ contribuisce al trasporto di
ATP e Pi
Inibitori della fosforilazione ossidativa
• Il rotenone inibisce il complesso I
• Il cianuro e CO inibiscono il complesso IV, legandosi al ferro dell’eme
• L’oligomicina inibisce l’ATP sintasi
13
Inibitori selettivi
Da: Garrett & Grisham - Biochemistry
Disaccoppianti• L’accoppiamento dipende dall’integrità della
membrana: composti che dissipano il gradiente
protonico (disaccoppianti) impediscono la sintesi
di ATP (ma non la “respirazione”)
• Il grasso bruno contiene un disaccoppiante
proteico naturale (termogenina o UCP-1):
l’energia del gradiente è dissipata come calore
14
Studi su mitocondri:inibitori e disaccoppianti
da: Lehninger
succinato
ADP + Pi
La struttura dell’ATP sintasi
• Composta da due dominii funzionali: Fo e F1
– Fo: (oligomicina-sensibile) proteina integrale di membrana; crea un canale per gli H+;
– F1 : proteina periferica che protrude nella matrice ed è il sito di sintesi dell’ATP; 9 subunità (α3β 3 γδε)
• Il meccanismo di funzionamento dell’ATP sintasi sfrutta il gradiente protonico per sintetizzare ATP; la catalisi è assicurata a turno dalle subunità β, grazie ad una rotazione accompagnata da modificazioni conformazionali.
• La proteina può funzionare come pompa per gli H+, consumando ATP
15
La struttura dell’ATP sintasi
Fo
F1
Spazio intermembrana
matrice
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS)
• Durante il trasferimento elettronico, si
possono formare radicali liberi molto reattivi:
O2 + e- O2-. ione superossido
ANIONE SUPEROSSIDO
PEROSSIDO DI IDROGENO
RADICALE IDROSSILE
16
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS)
• Vita breve
• Alcune sono radicaliche (elettroni spaiati);
H2O2 è reattiva, ma non è un radicale
• A basse concentrazioni: segnalazione
• A concentrazioni medio-alte: danni
• a proteine, lipidi, acidi nucleici
• L’invecchiamento e numerose patologie
degenerative sono correlati alle ROS
Meccanismi antiossidanti• Composti a basso peso molecolare
– Acido ascorbico (vitamina C), tocoferolo
(vitamina E), glutatione…
• Enzimi
– Superossido dismutasi
– Catalasi, glutatione perossidasi (rimuovono
l’acqua ossigenata)
Stress ossidativo
1
Demolizione dei triacilgliceroli
� Dalla dieta: lipasi digestive (la principale è
pancreatica)
� Dalle riserve: lipasi sotto controllo ormonale
Si formano mono- e diacilgliceroli, acidi grassi e
glicerolo
� I lipidi sono trasportati da lipoproteine (i
trigliceridi principalmente da chilomicroni)
Gli acidi biliari emulsionano i lipidi
2
Mobilizzazione dei lipidi di deposito
� I triacilgliceroli sono idrolizzati
da lipasi sotto controllo
ormonale
� Gli acidi grassi sono trasportati
legati all’albumina
Da: Lehninger - Zanichelli
Lipoproteine plasmatiche: densità e composizione
4629208Fosfolipidi
71172Colesterolo
4050183Esteri col.
6105585Trigliceridi
44809199Lipidi %
1.063-
1.210
1.006-
1.063
0.94-
1.006
< 0.94Densità
(g/ml)
HDLLDLVLDLchilomicroni
3
Catabolismo dei lipidi: utilizzazione
del glicerolo
verso la glicolisi
Attivazione degli acidi grassi
acil CoA
sintetasi
acil CoA
sintetasi
acil CoA
acil-adenilato
legato all’enzima
4
Gli acili sono trasferiti nel mitocondrio dalla carnitina
L’esperimento di Knoop
(1904)
Acidi grassi con numero di
carbonii pari…
e dispari
Dimostra che la degradazione procede
staccando unità bicarboniose
5
La chimica del catabolismo degli acidi grassi
La β-ossidazione degli acidi grassi
� Il legame Cα-C
βsi rompe con difficoltà
� Il carbonio β è ossidato (tre reazioni analoghe a
quelle da succinato ad ossalacetato nel ciclo di
Krebs)
� il β-chetoacil-CoA è scisso da una tiolasi
(reazione inversa rispetto ad una condensazione)
� L’acil-CoA accorciato di due atomi di carbonio
ripete il ciclo
6
Quattro reazioni ripetute
1. Acil CoA deidrogenasi (flavoproteine)
Analogo alla succinato deidrogenasi
7
L’acil CoA deidrogenasi è un enzima
della membrana mitocondriale:
gli elettroni del FADH2 sono trasferiti
all’ubichinone
2. Enoil-CoA idratasi (crotonasi)
� Addiziona acqua al doppio legame: analogo alla fumarasi
� La reazione trasforma il trans enoil- CoA in L-β-idrossiacil-CoA
3. Idrossiacil-CoA deidrogenasi� Ossida il gruppo alcolico secondario in β
� È assolutamente specifico per gli isomeri L
8
4. β-chetotiolasi
Un gruppo Cys-SH
dell’enzima attacca il
ββββ-carbonile
Il gruppo -SH di un nuovo CoA
attacca l’acile accorciato, formando
un nuovo acil-CoA∆∆∆∆G°’ < 0
Il ciclo si ripete
� Per l’acido palmitico (C16),
il ciclo si ripete sette volte,
formando
– 8 acetil-CoA
– 7 NADH e FADH2
9
Destino dei prodotti della β-ossidazione
� Acetil-CoA: ciclo di
Krebs
� Coenzimi ridotti: catena
respiratoria
Acidi grassi dispari
� La β-ossidazione porta a propionil-CoA
� Tre ulteriori reazioni lo convertono in succinil-CoA
� Gli acidi grassi dispari sono precursori per la
gluconeogenesi
Acidi grassi insaturi� Opportuni enzimi (isomerasi) convertono doppi legami da
∆3-cis a ∆2-trans
� Nei poliinsaturi, tali legami vanno “spostati” in modo da
trovarsi in posizione trans ∆2: intervengono una isomerasi
e una reduttasi
10
Demolizione dell’acido oleico (monoinsaturo)
Corpi chetonici� L’acetoacetato si forma per
condensazione di acetil-CoA
� Acetoacetato e idrossibutirrato inter-convertono grazie ad una deidrogenasi
� L’acetone è prodotto per decarbossi-lazione
� I CORPI CHETONICI sono normali composti usati da tessuti extra-epatici
� L’acetoacetato è convertito ad aceto-acetil-CoA grazie al succinil-CoA
� Un eccesso di corpi chetonici (chetosi) si osserva nel digiuno prolungato e nel diabete; può portare ad acidosi
11
Formazione dei corpi chetonici
1
Biosintesi degli acidi grassi• Sintesi e catabolismo usano vie differenti
– la biosintesi avviene nel citosol
– Nella sintesi gli intermedi sono legati a -SH di una
proteina trasportatrice di acili (ACP) invece che a CoA-
SH
– Nella sintesi c’è un solo complesso enzimatico
– La biosintesi utilizza come coenzima NADPH (che
proviene principalmente dalla via dei pentosi)
• L’acetil-CoA è “esportato” dai mitocondri sotto
forma di citrato (sistema citrato-malato-piruvato)
• Oltre a equivalenti riducenti, è richiesto ATP
Le fonti di Acetil-CoA
citosolmatrice mitocondriale
membrana mitocondriale
Acidi
grassi
Acidi
grassi
2
Le fonti di Acetil-CoA
• In condizioni di ATP elevato, il citrato si accumula
ed è trasportato fuori dal mitocondrio
• La reazione catalizzata da citrato liasi è formalmente
l’inverso della sintesi: la formazione dell’intermedio
citril-CoA richiede energia:
• citrato + ATP + CoA ⇔ ossalacetato + acetil-CoA + ADP
+ Pi
• L’ossalacetato si trasforma in malato (MDH)
• Il malato può:
– rientrare nel mitocondrio (grazie ad un trasportatore)
– formare piruvato e NADPH (enzima malico)
Le sorgenti di NADPH:
L’enzima malico
La via del pentosio-fosfato
3
In abbondanza di
ATP, il citrato può
uscire dal
mitocondrio
Ciclo di Krebs
Biosintesi degli acidi grassi
• La sintesi impiega unità bicarboniose: acetil-CoA
• La condensazione di due acetil-CoA sarebbe
endoergonica (la reazione catalizzata dalla tiolasi è
esoergonica)
• Un acetil-CoA viene “allungato” a malonil-CoA
per carbossilazione
4
La proteina
trasportatrice di acili
(ACP)serina
gruppi malonile
sono esterificati
al -SH
L’acetil CoA carbossilasi• La carbossilazione dell’acetil-CoA per formare
malonil-CoA è una tappa irreversibile e regolata
• ACC usa bicarbonato, ATP e biotina
5
NAD e NADP non sono
intercambiabili
NAD+/NADH ≅ 1000
NADP+/NADPH ≅ 0.01
L’acido grasso sintasi• In E. Coli è un complesso multienzimatico
costituito da ACP e sei enzimi
• Negli animali, è costituita da due subunità
ciascuna multifunzione
6
1,2 e 3. I gruppi acetile e malonile,
trasferiti sul complesso, condensano
β-chetoacil-ACP
sintasi (KS)
ACP
Acido grasso
sintasi
condensazione di
Claisen La decarbossilazione
rende il processo
esoergonico
4. Riduzione del β-
carbonile
β-chetoacil-ACP
reduttasi (KR)
si forma un D- β-
idrossiacil-ACP
7
5. Deidratazione
β-idrossiacil-
ACP deidratasi
(HD)
si forma un trans-
∆2-butenoil (enoil)-
ACP
6. Riduzione del doppio legame
enoil-ACP
reduttasi (ER)
si forma il butirril-ACP o un acido
grasso saturo allungato di 2 carbonii
8
Sintesi degli acidi grassi: il seguito• Il butirrile è trasferito sull’-SH del primo enzima
• L’ACP resta libero per “accogliere” un malonile
• Si ha una condensazione e le reazioni su ripetono
allungando di due carbonii l’acido grasso
• Di solito, si arriva al massimo a palmitato C16 ; una
attività idrolitica del complesso lo libera dall’ACP
7 acetil CoA + 7 CO2 + 7 ATP ⇔ 7 malonil-CoA + 7 ADP + 7 Pi
acetil CoA + 7 malonil CoA + 14 NADPH + 14 H+ ⇔ palmitato +
14 NADP + + 8 CoA + 7 CO2 + 6 H2O
8 acetil CoA + 7 ATP + 14 NADPH + 14 H+ ⇔ palmitato + 7 ADP
+ 7 Pi + 14 NADP +
Regolazione della biosintesi degli
acidi grassi
• L’acetil-CoA carbossilasi (ACC) è
– attivata allostericamente dal citrato
– inibita retroattivamente dal palmitato
– inibita covalentemente per fosforilazione
(controllata da glucagone/adrenalina)
• La citrato liasi è sotto il controllo dell’insulina
9
defosfo-ACC attiva
a basso [citrato]
fosfo-ACC attiva solo ad alto [citrato]
Regolazione ormonale
Modificazioni degli acidi grassi
• Allungamento da palmitato (reazioni non
citosoliche: reticolo endoplasmico, mitocondri)
• Introduzione di doppi legami (desaturazione)
• Nei mammiferi alcuni poli-insaturi devono
essere assunti con la dieta (essenziali)
10
Destino degli acidi grassi
• In gran parte sono incorporati
– nei triacilgliceroli (di deposito)
– nei glicerofosfolipidi (delle membrane)
• Intermedio della sintesi è il glicerolo-3-fosfato
Il fosfatidato, un
intermedio comune
Al glicerolo-3-fosfato
si esterificano due acili
11
TRIACIL-
GLICEROLI
FOSFOLIPIDI
1
DEGRADAZIONE DEGLI
AMMINOACIDI� Gli amminoacidi derivano:
– dalla demolizione enzimatica delle proteine della dieta (digestione)
– dal turn-over fisiologico delle proteine cellulari (attraverso sistemi complessi - proteasoma)
– In caso di digiuno, proteine cellulari sono usate come “combustibile”
� non vengono immagazzinati
� nella degradazione:
– lo scheletro carbonioso viene recuperato
– il gruppo amminico
� può essere recuperato per altre sintesi
� viene eliminato
glucosio
proteine intracellulari
proteine della dieta
urea (prodotto di
eliminazione dell’azoto)
2
Destino dell’ammoniaca nei vertebrati
Animali ammoniotelici:
vertebrati acquaticiAnimali ureotelici:
molti vertebrati
terrestri; squali
Animali uricotelici:
rettili, uccelli.
L’acido urico è il
catabolita delle purineNegli animali terrestri, forma non tossica e che
limiti il dispendio di acqua
proteine della dieta
3
Reazioni di transaminazione
Il gruppo amminico viene trasferito da un amminoacido ad un chetoacido (di solito l’α-chetoglutarato)
Ad esempio,
chetoglutarato + alanina ⇔ glutammato + piruvato
Il meccanismo di reazione a ping-pong coinvolge come coenzima il piridossal-fosfato
Vitamina B6 (piridossina) e
piridossal-fosfato (aldeide)
� Partecipa a numerosi tipi di reazioni
� Di solito, legato covalentemente a un gruppo ε-NH2 di una lisina dell’enzima tramite una base di Schiff
� Va incontro a trasformazioni reversibili
L’anello del PLP, una
“trappola per elettroni”
4
PLP è normalmente
legato all’enzima
tramite ε-NH2 di una
lisina
Il meccanismo della transamminazione
5
La glutammato deidrogenasirilascia ammoniaca nel fegato
Enzima mitocondriale
Basso livello energetico (ADP): vengono
demoliti amminoacidi
L’ammoniaca è trasportata nel sangue come glutammina...
glutammato + NH3 + ATP glutammina + ADP + Pi
La reazione è catalizzata da una glutammina sintetasi
(richiede ATP) mentre la reazione inversa, che “restituisce”
la ammoniaca, è catalizzata dalla glutamminasi
La glutammina è utilizzata per la sintesi di composti azotati
quali i nucleotidi purinici
La glutammina è presente nel sangue a concentrazioni elevate
(rispetto ad altri amminoacidi)
6
Ciclo dell’alanina
� Nel muscolo, gruppi amminici sono trasferiti
prima al glutammato e poi per
transamminazione al piruvato (dalla glicolisi)
che si trasforma in alanina
� l’alanina è trasportata al fegato
� per transamminazione si riforma piruvato
(che nella gluconeogenesi ritorna a glucosio)
e glutammato
Il destino dell’ammoniaca
7
Il ciclo dell’urea� Avviene nel fegato
� Cinque reazione enzimatiche (1 + 4 nel ciclo)– le prime due nei mitocondri, le altre nel citosol
� Si “consuma” ATP
� Un gruppo amminico deriva dal glutammato
mediante GDH
� Il secondo gruppo amminico deriva da un aspartato
� Stretto collegamento tra i cicli dell’urea e di Krebs
� Il ciclo è regolato
0. “Attivazione”dell’ammoniaca
(reazione preliminare)
carbamil-fosfato
sintetasi I
Esiste una carbamil-fosfato
sintetasi II citosolica coinvolta
nella sintesi dei nucleotidi
pirimidinici
carbossi-fosfato
8
Il ciclo dell’urea (Krebs, 1932)
1. Ornitina transcarbamilasi(mitocondriale)
L’ornitina funge da accettore di un gruppo carbammilico
La citrullina formata nei mitocondri passa nel citosol
9
2. Argininosuccinato sintetasiIl secondo gruppo amminico è portato dall’aspartato, il cui
gruppo amminico condensa con il carbonile della citrullina
citrullil-AMP
3. Argininasuccinato liasi
La via può essere utilizzata per la sintesi di arginina
10
4. Arginasi
L’ultima reazione rigenera l’ornitina.
L’arginina tramite la NO sintasi è il precursore dell’ossido nitrico
NO, un importante mediatore che agisce sul messaggero GMP ciclico
Collegamenti tra ciclo dell’urea e ciclo di
Krebs
11
La sintesi dell’urea è
regolata dall’ N-
acetil-glutammato
A lungo termine, viene
regolata anche la sintesi
degli enzimi coinvolti
La sintesi dell’urea
aumenta in caso di dieta
iper-proteica o di
digiuno prolungato
Gli amminoacidi sono
degradati, attraverso reazioni
“dedicate”, a intermedi meta-
bolici comuni
1
Biosegnalazione• Nei sistemi multicellulari, segnali chimici inducono/
coordinano risposte fisiologiche interagendo con
recettori
– Specificità: complementarietà tra segnale e recettore
– Affinità
– Sensibilità
– Integrazione: più segnali coordinati
– Amplificazione in cascataSEGNALE
Segnalazione e recettori di membrana
• Rilascio del segnale (primo messaggero: ad
esempio, un ormone)
• Interazione con il recettore specifico
• Trasferimento del messaggio (trasduzione)
tramite secondo messaggero
• Attivazione di effettori come risposta (spesso
enzimi intracellulari)
• Spegnimento/desensibilizzazione
2
Desensibilizzazione
L’attivazione del recettore può
scatenare un meccanismo
retroattivo che “spegne” il
recettore o lo rimuove dalla
superficie cellulare
SEGNALE
RISPOSTA
L’adrenalina (epinefrina)
Deriva dalla tirosina
Sintetizzata nelle ghiandole surrenali
3
Recettori a proteina G e Adrenalina
Da: Stryer
Recettori a proteina G (GPCR)
� Recettore con 7 eliche trans-membrana
� L’interazione recettore attivato-proteina G (trimero
αβγ) provoca il legame del GTP
� La subunità α si stacca da βγ e stimola la
produzione di AMP 3’-5’ciclico da parte della
adenilato ciclasi rivolta verso l’interno;
� Lo stimolo è limitato nel tempo: GSαidrolizza GTP
(attività GTPasica) e si riassocia con βγ
� AMPc ha vita breve (è idrolizzato da fosfodiesterasi
dei nucleotidi ciclici)
4
Adrenalina e recettori a proteina G1. Adrenalina si
lega al suo
recettore
2. Il recettore occupato
provoca lo scambio tra
GTP e GDP, attivando Gs
3. Gs αααα si sposta verso
l’adenilato ciclasi
attivandola
4. Adenilato ciclasi
catalizza la formazione di
AMPc
5. PKA è
attivata da
AMPc
6. La fosforilazione
di proteine cellulari
da parte di PKA
causa la risposta
7. AMPc è degradato,
invertendo l’attivazione
di PKA
L’adenilato ciclasi
5
AMP ciclico attiva la proteina chinasi A (PKA)
• PKA regola numerosi enzimi a valle
(sequenze consenso)
• I numerosi passaggi amplificano il
segnale
• L’effetto è contrastato da fosfoproteine
fosfatasi
• Molte molecole regolatrici variano i
livelli di AMPc
• In alcuni casi l’azione di PKA arriva al
nucleo (effetti sulla trascrizione)
PKA inattiva:
Le subunitàregolatrici hanno i siti per AMPc vuoti
Le subunità catalitichehanno i siti di legame bloccati dalle subunitàregolatrici
Le subunitàregolatricilegano AMPc
PKA attiva:
Le subunitàcatalitiche hanno i siti di legame liberi
La via del fosfatidilinositolo
6
Recettori accoppiati alla fosfolipasi C:
la via del fosfatidilinositolo
La via del fosfatidilinositolo
• La fosfolipasi C è attivata dal complesso ormone-recettore tramite una proteina G;
• Agisce sul fosfatidilinositolo 4,5 bis-fosfato (PIP2) liberando due secondi messaggeri:
– diacilglicerolo (DAG) (in membrana)
– Inositolo 1,4,5 trisfosfato (IP3) (nel citosol)
• IP3 favorisce il rilascio di calcio da depositi intra-cellulari
• Il diacilglicerolo attiva proteine chinasi (PKC)
• Anche il calcio funziona da secondo messaggero
7
Recettori con attività tirosina chinasica
(RTK): il recettore dell’insulina
• Recettore (INS-R)
– Due subunità α recettoriali,
verso l’esterno
– Due subunità β transmembrana
con attività Tyr proteina
chinasica
• In seguito al segnale le
subunità β si autofosforilano e
si attivano, fosforilando altre
proteine bersaglio e attivando
una cascata.
Ormoni e regolazione metabolica
• Derivati da un amminoacido
• Peptidici
• Steroidi (recettori nucleari)
8
Regolazione ormonale del
metabolismo energetico
• Controllo della glicemia: azione coordinata di
insulina, glucagone, adrenalina…
– Adrenalina: derivata da un amminoacido
– Glucagone: piccolo peptide
– Insulina: piccolo peptide
• Controllo della lipolisi
“Fight or run”
Glicogenolisi: cascata di segnali
forma “a” attiva
ed indipendente da
effettori allosterici
forma “b” meno
attiva e dipendente
da fattori allosterici
9
Insulina
• Ormone peptidico (PM = 5800 Da, due catene) rilasciato
dal pancreas
• Aumenta la velocità di trasporto del glucosio
• Abbassa [AMPc]
• Attiva fosfoproteina fosfatasi-1 (defosforilazioni)
– si attiva la glicogeno sintasi
– si inattiva la glicogeno fosforilasi
• Attiva la fosfofruttochinasi-1 (PFK-1) (glicolisi)
• Attiva la sintesi di acidi grassi (favorisce la
defosforilazione di ACC)
• Favorisce la sintesi dei triacilgliceroli
Iperglicemia: secrezione di insulinaIngresso di glucosio nelle cellule per
aumentato numero di trasportatori sulla membrana
Attivazione della GLICOGENO SINTASI
DIMINUZIONE DELLA GLICEMIA
Aumento della sintesi degli acidi grassi e dei trigliceridi
10
Bassa [glucosio] nel sangue
Glucagone
[AMPc]
Proteina chinasi A, fosforilazioni di enzimi
Attivazione di FBPasi-2, disattivazione di PFK-2
[F2,6P]
Attivazione di FBPasi, disattivazione di PFK-1
Aumento della gluconeogenesi
Regolazione della
glicemia: glucagone
Aumento glicogenolisi
Il fruttosio 2,6-bisfosfato è un potente
modulatore
La glicolisi è attivata La gluconeogenesi è rallentata
11
Ruolo del fruttosio 2,6-bisfosfato
PFK-2
Enzima tandem e regolazione
• Il fruttosio 2,6-bisfosfato è sintetizzato e scisso da
due attività sullo stesso enzima: PFK-2 e Fruttosio
BisFosfatasi-2, (FBP-2)
• L’enzima è sotto controllo covalente e ormonale:
la fosforilazione PKA-dipendente inattiva PFK-2 e
attiva la fosfatasi FBPasi-2
12
Regolazione
ormonale della
lipolisi
adrenalina
Glucagone/adrenalina
stimolano la lipolisi
attraverso la
fosforilazione AMPc-
dipendente della lipasi.
L’insulina si oppone
alla attività
dell’adrenalina,
inattivando la lipasi.
defosfo-ACC attiva
a basso [citrato]
fosfo-ACC inattiva (attiva solo ad alto [citrato])
Regolazione
ormonale
della sintesi di
acidi grassi
Come si ricava l’equazione di Michaelis-Menten
E + S ↔ ES → E + P
Essendo in condizioni di v0 , la reazione inversa da P verso ES si può trascurare.
Lo stadio lento è la dissociazione del complesso (reazione di I ordine):
V0 = k3 [ES]
Assunzione dello stato stazionario:
d [ES]/dt = 0
In questo caso, le velocità di formazione e dissociazione del complesso sono uguali:
k1 [E][S] = (k2 + k3) [ES]
Esprimiamo [E] (enzima libero) rispetto all’enzima totale [Et] (libero e complessato):
[E] = [Et] - [ES]
Sostituendo:
k1 {[Et] – [ES] }[S] = (k2 +k3) [ES]
Sviluppando:
[Et] [S] – [ES] [S] = (k2 + k3) [ES]
k1
Definiamo:
Km = (k2 + k3)
k1
[Et] [S] – [ES] [S] = Km [ES]
Raccogliamo e ricaviamo [ES]:
[ES] {Km + [S] } = [Et] [S]
[ES] = [Et] [S]
Km + [S]
k1
k2
k3
Dato che abbiamo definito la velocità iniziale:
V0 = k3 [ES]
Sostituendo il valore ricavato per [ES]:
V0 = k3 [Et] [S]
Km + [S]
Dal grafico si osserva che la velocità massima si ottiene quando l’enzima è saturo,
cioè tutto in forma di complesso: [ES] = [Et]:
per [S] grande,
VM = k3 [Et]
Da cui, sostituendo:
V0 = VM [S]
Km + [S]
Si può definire Km come la [S] alla quale la velocità è pari a metà di quella massima:
V0 = VM/2 (confronta con la p50 per la mioglobina)