Guide-it products

다카라코리아바이오메디칼㈜

CRISPR-Cas9 System

Contents

• Genome Editing (Genome Engineering)

• CRISPR/Cas9 System

• Clontech의 CRISPR/Cas9 system: Guide-it

Genome Editing

• 유전자 조작 (Genome Editing or Genome Engineering)

- 세포 내에서 유전정보를 자유롭게 편집, 조작 (editing)하는 기술

[특정유전자(또는 염기서열)의 기능 연구]

- “어떻게 유전형(Genotype)이 표현형(Phenotype)에 영향을 미치는가”의 가정

- 유전자조작이 가장 좋은 방법!

: Gene knockout, Gene modification,

Gene correction, Gene addition….

즉, Genome Editing이란 Target Gene의 기능 등을 확인하기 위해, 유전자를 자르고 붙이는 등의 편집, 조작 기술

Gene repair method

Gene repair = Fix the broken gene

- Double-stranded DNA Break(DSB)는 방사능, 유해 화학물질 등의 환경에서 유발 ⇒ 치명적

- 유전자가위에 의한 유전자 절단 ⇒ Double-stranded DNA Break (DSB) 유발

DSB에 대한 Cell의 저항 Gene repair method

1. Non-homologous end joining (NHEJ) - Rapid, Flexible, but Error prone (에러(Indel) 존재)

2. Homologous Recombination (HR) - Slower, restricted to late S and G2 - Precise (정확한 회복)

이러한 세포 내의 “Gene repair” 특성을 이용하여 Gene editing (Gene engineering)을 진행한다

Gene repair method

Gene repair = Fix the broken gene

대부분의 Genome Editing에 의한 Repair 방법 (Indel 형성)

- Double-stranded DNA Break(DSB)는 방사능, 유해 화학물질 등의 환경에서 유발 ⇒ 치명적

- 유전자가위에 의한 유전자 절단 ⇒ Double-stranded DNA Break (DSB) 유발

Or I could use CRISPR/Cas9

1. Ease of Use

- 하나의 target sequence에 대해 하나의 guide RNA만 제작

- guide RNA의 제작은 ZFNs, TALENs에 비해 쉽다.

- ZFNs, TALENs은 하나의 target에 대해 두개의 nuclease를 제작해야 함.

2. Ease of Customization

- Cas9 system의 경우, 다른 target modification을

위해서는 새로운 guide RNA만 제작하면 된다.

3. Editing efficiency

- Cas9과 TALEN 모두 다양한 Cell, Organism에 대해 gene editing 가능

- Cas9은 여러개의 sgRNA co-delivering을 통한 multiple genomic modification 가능

CRISPR/Cas9 system

3세대 유전자가위: CRISPR/Cas9

Cell 157, June 5, 2014 Elsevier Inc. 1263

CRISPR/Cas9

(Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats)

- Microbial adaptive immune system

: 외부의 유전적 요인 (핵산서열 조각)을

Nuclease로 잘라내는 적응면역 시스템

-세균으로부터 I~III형의 CRISPR 시스템을 발견

- 그 중, Streptococcus pyogenes의 CRISPR II

System이 가장 많이 알려져있음

박테리오파지의 감염으로 인한 외부 DNA 침입

외부 DNA 습득

crRNA 생합성

표적간섭

외부 핵산 제거

CRISPR/Cas9 Type II

CRISPR/Cas9 II (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

- 박테리아에서만 나타나는 CRISPR System

- 그 중, Streptococcus pyogenes의 CRISPR II System이 가장 많이 알려져있음

CRISPR/Cas9 Type II 기본 이론

① sgRNA; single guide RNA crRNA와 tracrRNA로 이루어져있음 crRNA=Target specific DNA 결합부위 tracrRNA=Cas9 complex 조합에 필수부위

② Cas9 Nuclease nuclease guided by small RNA

③ PAM Cas9이 인식하는 부위 5’-NGG-3’

Clontech Guide-it 시리즈

CRISPR/Cas9 Complete Series

Overview of Guide-it

<Guide-it>

- Clontech의 CRISPR/Cas9 Type II System

- Site-specific genomic targeting in virtually any organism

1. sgRNA: Single guide RNA 2. Cas9: 목적유전자를 절단하는 효소 3. PAM: 5’-NGG-3’, Cas9 시스템이 인식하는 부위

CRISPR Overview (클릭)

About Guide-it Kits (클릭)

Clontech Guide-it (CRISPR/Cas9)

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

<Complete System>

sgRNA In vitro Transcrpition Kit (631438)

CRISPR/Cas9 System (Green) (632601) CRISPR/Cas9 System (Red) (632602)

Mutation Detection Kit (631443)

Indel Identification Kit (631444)

Complete sgRNA Screening System (631439)

sgRNA Screening Kit (631440)

Cas9 Polyclonal Antibody (632607)

제품명을 클릭하시면 각 제품의 상세정보를 확인 가능합니다.

1. Target Site & sgRNA 디자인

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

연구자가 Cas9으로 절단하고 싶은 유전자를 선정

- 타겟 유전자의 Knock-Out, 변이 유전자 복구 등의 목적

Step 1. 유전자서열 중에서 PAM 서열을 고른다 1) PAM; Proto-spacer adjacent motifs 2) CRISPR/Cas9 시스템이 인식하는 부위이므로 꼭 포함 3) PAM 서열 5’-NGG-3’ 예를 들어, AGG, TGG, CGG, GGG

Step 2. 원하는 유전자 서열과 가장 가까운 PAM을 고른다

Step 3. PAM유전자로부터 거꾸로 20bp를 선정하여 sgRNA 제작

Target sequence 선정 방법

http://crispr.mit.edu https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/

1. Target Site & sgRNA 디자인

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

연구자의 Target site 서열을 포함하는 single guide RNA 디자인 (sgRNA)

- sgRNA 제작은? PCR로 제작합니다. (In vitro transcription)

- 그러기 위해서는? PCR primer가 필요

sgRNA PCR primer 제작방법 (Forward primer만)

- T7 Promoter (28nt) - In vitro transcription에 필요

- Target site 서열 (20nt) - 고객이 원하는 서열 삽입 (앞 슬라이드에서 보신 내용)

- Scaffold Template-specific sequence (21nt) - Cas9과 복합체를 이루는 자리

Reverse primer는? Guide-it sgRNA In vitro Transcription Kit (631438)에 포함.

2. sgRNA 디자인 및 제작

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

(631438) (631440)

Guide-it Complete sgRNA Screening System (631439)

In vitro Transcription Kit (code 631438)과 sgRNA Screening Kit (631440)의 패키지 제품입니다.

2. sgRNA 디자인 및 제작

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

sgRNA를 디자인하고 제작 - 하나의 유전자당 최소 2개 이상

제작한 sgRNA의 효율 테스트 - Cas9 시스템에 적합성 테스트

3. sgRNA, Cas9 delivery

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

Mammalian Gene editing(CRISPR/Cas9)을 위하여~

- Plasmid에 sgRNA를 Cloning하고 Cell에서 발현

형광단백질 리포터

Cas9 발현 유전자

Target gene Oligonucleotide : PAM 서열로부터 20bp

Code 제품명

632601 Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green)

632602 Guide-it CRISPR/Cas9 System (Red)

632607 Guide-it Cas9 Polyclonal Antibody

3. sgRNA, Cas9 delivery

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

Mammalian Gene editing(CRISPR/Cas9)을 위하여~

- Plasmid에 sgRNA를 Cloning하고 Cell에서 발현

4. Mutation detection

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

CRISPR/Cas9 작용 후, 정말로 mutation(Indel)이 생성되었는지?

- Sequencing 하기 이전에 간편하게 전기영동으로 확인

Code 제품명 용량

631443 Guide-it Mutation Detection Kit 100 rxns

ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 모두 적용 가능

5. Indel identification

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

어떠한 mutation(Indel)이 생성되었는지 규명

- Indel을 시퀀싱해서 어떤 돌연변이가 발생했나 확인 Code 제품명 용량

631444 Guide-it Indel Identification Kit 10 rxns

ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 모두 적용 가능

5. Indel identification

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

어떠한 mutation(Indel)이 생성되었는지 규명

- Indel을 시퀀싱해서 어떤 돌연변이가 발생했나 확인

Indel 시퀀싱 결과

Clontech Guide-it (CRISPR/Cas9)

Target site

선정

sgRNA

디자인

sgRNA 제작

및 효율 검증

sgRNA, Cas9

세포 내 도입

Mutation

확인

Indel

Identification

<Complete System>

sgRNA In vitro Transcrpition Kit (631438)

CRISPR/Cas9 System (Green) (632601) CRISPR/Cas9 System (Red) (632602)

Mutation Detection Kit (631443)

Indel Identification Kit (631444)

Complete sgRNA Screening System (631439)

sgRNA Screening Kit (631440)

Cas9 Polyclonal Antibody (632607)

제품명을 클릭하시면 각 제품의 상세정보를 확인 가능합니다.