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REACCCIÓN DE BIURET

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. MÉTODO COLORIMÉTRICO.

 

La presencia de proe!nas en una mezcla se puede determinar mediante

la reacci"n de# Bi$re. El reactivo de Biuret contiene CuSO4  en solución acuosa

alcalina (por la presencia de NaOH o KOH que no participan en la reacción. La

reacción se !asa en la "ormación de un compuesto de color violeta# de!ido a la

"ormación de un comple$o de coordinación entre los iones Cu%& ' los pares de

electrones no compartidos del nitróeno que "orma parte de los enlaces

pept)dicos.

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La reacción de!e su nom!re al Biuret# una mol*cula "ormada a partir de dos

de +rea (H%N,CO,NH,CO,NH%# que es la m-s sencilla ' que da positivo a esta

reacción# com+n a todos los compuestos que tenan dos o m-s enlaces

pept)dicos consecutivos en sus mol*culas.

El Biuret.

El reaci%o de Bi$re es aquel que detecta la presencia de prote)nas '

p*ptidos cortos ' otros compuestos similares con dos o m-s enlaces pept)dicos en

sustancias de composición desconocida.

La reacción requiere de sul"ato c+prico (CuSO4# $unto con tartrato de sodio '

potasio (KNaC4H4O/4H%O en un medio alcalino (NaOH o KOH que no participan

en la reacción. El reactivo# de color azul# cam!ia a violeta en presencia de

prote)nas# ' vira a rosa cuando se com!ina con poli p*ptidos de cadena corta.

El ensa&o de Bi$re es un método colorimétrico que puede complementarse con

una espectroscopia ultravioleta visi!le a una lonitud de onda de 01 nm (para

detectar el ion Cu%&.

http://es.wikipedia.org/wiki/Nan%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Cobrehttp://es.wikipedia.org/wiki/Nan%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Cobre

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BIURET CUANTITATI'O. TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS.

 2 di"erencia de otras prue!as# #a reacci"n de Bi$re es c$ani(ica)#e# es decir# a

*a&or concenraci"n de proe!nas+ *a&or inensidad de co#or %io#ea . Esta

reacciones# en las que el color "ormado es proporcional a la cantidad de sustanciase llaman reacciones co#ori*,ricas.

  Midiendo #a inensidad de co#or  se podr)a conocer #a concenraci"n de

#a s$sancia  que lo produce. 3ara ello se aplican ,cnicas (oo*,ricas#

empleando un aparato llamado co#or!*ero (si mide sólo un determinado color

o especro(o"*ero (si realiza una medida de todo el espectro de colores.

  La luz es parte de la radiación electroman*tica# que se propaa de "orma

ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores se

di"erencian unas de otras por sus lonitudes de onda (distancia entre la cresta de

una onda ' la siuiente# que se mide en nm. La luz visi!le enlo!a las radiaciones

comprendidas entre 51 , 601 nm# que corresponden a los colores del arco,iris# de

tal "orma que cada color corresponde a una radiación con una lonitud de

onda espec)"ica. El espectro"otómetro dispone de una l-mpara que emite luz

monocrom-tica# de una lonitud de onda determinada# que incide ' atraviesa la

muestra coloreada a medir# ' de un detector# que medir- la cantidad de luz que no

es a!sor!ida por la muestra. 3ara cada sustancia determinada# se utilizar- laradiación de lonitud de onda a la que a!sor!a m-s cantidad de luz.

  Su "uncionamiento de !asa en la le' de Beer,Lam!ert7 la "racción de luz

incidente que es a!sor!ida por una solución es proporcional a la concentración de

soluto ' al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz

incidente (81 ' la re"le$ada (8 dar- una idea de la cantidad de radiación que 9a sido

a!sor!ida por la muestra. Es lo que se denomina A)sor)ancia (2!s o Densidad

Ópica (:O.

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La Le' de Beer,Lam!ert se "ormula como7 2!s (:O ; ε  < C < =

 Siendo ε el coe"iciente de e

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ESPECTROFOTOMETRIA.

La espectro"otometr)a es el m*todo de an-lisis óptico m-s usado en lasinvestiaciones !iolóicas. El espectro"otómetro es un instrumento que permitecomparar la radiación a!sor!ida o transmitida por una solución que contiene una

cantidad desconocida de soluto# ' una que contiene una cantidad conocida de lamisma sustancia.

Aodas las sustancias pueden a!sor!er ener)a radiante# aun el vidrio que pareceser completamente transparente a!sor!e lonitud de ondas que pertenecen alespectro visi!le el aua a!sor!e "uertemente en la reión del in"rarro$o.

La a!sorción de las radiaciones ultravioleta# visi!les e in"rarro$as depende de laestructura de las mol*culas# ' es caracter)stica para cada sustancia qu)mica.

Cuando la luz atraviesa una sustancia# parte de la ener)a es a!sor!ida la

ener)a radiante no puede producir nin+n e"ecto sin ser a!sor!ida.El color de las sustancias se de!e a que *stas a!sor!en ciertas lonitudes deonda de la luz !lanca que incide so!re ellas ' solo de$an pasar a nuestros o$osaquellas lonitudes de onda no a!sor!ida.

MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE AN1LISIS

-. NATURALE2A DE LA RADIACIÓN ELECTROMA3NÉTICA

 La radiación electroman*tica es una "orma de ener)a radiante que se propaa

en "orma de ondas. En este "enómeno ondulatorio se de"ine7

a4 Lonitud de onda ( 7  es la distancia entre dos m-

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  Geión 8n"rarro$a7 ; 651 a 1#111 nm

 En la reión visi!le# la luz se descompone en colores. La luz !lanca contiene todoel espectro de lonitudes de onda. Si interacciona con una mol*cula puede ser dispersada o a!sor!ida.

 5. FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LU2 6 MATERIA

 A. FENÓMENO DE ABSORCIÓN

Cuando una part)cula que se encuentra en estado de reposo o estado "undamentalinteracciona con un 9az de luz# a!sor!e E ' se trans"orma en una part)cula enestado e

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Se puede perder intensidad por la interacción con la cu!eta o el solvente. 3araevitar este error se 9ace una primera medida con una solución de re"erencia oBL2NCO# que contiene todos los posi!les compuestos que intervienen en la lecturamenos el que vamos a medir. Aodas las medidas que se 9aan con posterioridadser-n re"eridas a esta medida inicial ' se 9ar-n en la misma cu!eta que se utilizó

en la medida del !lanco.  La Aransmitancia se usa poco# se emplea m-s la 2!sor!ancia (2 porque larelación entre 2 ' la concentración de una solución es directamente proporcional 'la de la A es inversamente proporcional.

La relación entre la a!sor!ancia ' la transmitancia es la siuiente7

, Si el @A ; =11 2 ; %,lo A ; %,lo =11 ; 1, Si el @A ; 1 2 ; %,lo 1 ;

En los aparatos que se usan actualmente se presentan a!sor!ancias# pero elaparato lo que mide realmente es @A que lueo trans"orma a a!sor!ancia.

7.-. LE6 DE BEER

JLa a!sor!ancia de una solución es directamente proporcional ala concentración 'a la lonitud del paso de la luz.

  2 ; . !. c

Siendo7

A8 a!sor!ancia. No tiene unidades.

8 el coe"iciente de e

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=. 3or comparación con una solución conocida7 si tenemos % soluciones# unapro!lema (3 ' una est-ndar (S# podemos esta!lecer la siuiente relaciónmatem-tica entre ellas7

%. 2 trav*s de una curva de cali!ración7 la curva de cali!ración es larepresentación r-"ica en un e$e de coordenadas de la 2!sor!ancia (e$e de

ordenadas "rente a la Concentración (e$e de a!scisas. Se ensa'an variassoluciones de concentración conocida ' se determinan sus 2# constru'*ndosela curva de cali!rado# que es una recta. na vez ensa'adas las solucionespro!lemas# su concentración se averiua por interpolación de las 2 de lassoluciones pro!lema en la curva de cali!ración.

  Ha' que tener en cuenta la linealidad # que es el intervalo de concentraciones delcromóeno entre las cuales e

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5.5. COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO

-. F$ene de #$:7 proporciona ener)a radiante en "orma de luz visi!le o no visi!le.

  Aipos de l-mparas7, L-mparas de "ilamento de tunsteno7 se utilizan para lonitudes de onda delespectro visi!le ' el ultravioleta próercurio7 Emiten un espectro discontinuo oespectro de l)neas que se utilizan para cali!ración de lonitudes de onda# seemplean solo para espectro"otómetros ' cromatora")a H3LC.

  3recauciones7, Las su!idas ' !a$adas !ruscas de tensión producen su"rimiento de la l-mpara '

cam!ios en las lecturas de la 2!sor!ancia., La l-mpara tiene una vitalidad limitada ' se de!e viilar para que "uncione !ien el

aparato.

5. Rendi;a de enrada7 tiene como "unción reducir al m-

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, Gedes de di"racción7 son un ran n+mero de l)neas paralelas situadas adistancias iuales entre s) ' son 9endiduras so!re un vidrio o una super"iciemet-lica. Cada una de estas 9endiduras se comporta como un peque?o prisma.

9. Rendi;a de sa#ida8 tiene como "unción impedir que la luz di"usa atraviese la

cu!eta de la muestra# que provocar)a desviaciones a la Le& de Beer .

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9.5 TIPOS DE APARATOS

  ES3ECAGODOA>EAGO :E H2M S8>3LE7 es iual que la descripcióndada para el espectro"otómetro en eneral. Consta de los mismos elementos(E$. Bilirru!inómetro7 para determinar !ilirru!ina directa en capilar.

  ES3ECAGODOA>EAGO :E :OBLE H2M EN EL ES32C8O7 todos loscomponentes est-n duplicados# menos la l-mpara ' el medidor. :os 9aces deluz pasan al mismo tiempo por los distintos componentes separados en elespacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de luz ' de a!sor!ancia.

  ESPECTROFOTÓMETRO DE ?A2 DOBLE EN EL TIEMPO8 utilizan losmismos componentes que el espectro"otómetro de 9az simple. :os 9aces deluz pasan por los mismos componentes pero no al mismo tiempo. Emplean unJC9opper consistente en un interruptor rotativo del 9az luminoso colocado acontinuación de la rendi$a de salida. n sistema de espe$os dirie la porción deluz re"le$ada por el Jc9opper a trav*s de una cu!eta de re"erencia ' de a9) aldetector com+n. El detector lee alternativamente el 9az procedente de lamuestra ' el de la cu!eta de re"erencia. Esto compensa la variación de ener)aradiante.