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GUIÓN DE PRÁCTICAS DE

GENÉTICA

3º CC. MAR 2005/06

Área de Genética de la Universidad de Vigo

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LISTADO DE PRÁCTICAS PRÁCTICA 1. Inferencia y verificación de proporciones mendelianas en maíz. PRÁCTICA 2. Manejo de Drosophila en el laboratorio. PRÁCTICA 3. Conceptos de genética mediante simulación por ordenador. PRÁCTICA 4. Seminarios de problemas. AULAS Y LABORATORIOS LABORATORIO 25 DE GENÉTICA. Prácticas 1 y 2 El laboratorio 25 está en el 3º piso, Bloque B, Edificio de Ciencias Experimentais AULAS DE INFORMÁTICA. Práctica 3 Las aulas de informáticas están en el 1º piso, Bloque D, Edificio de Ciencias Experimentais. AULAS DE DOCENCIA. Práctica 4 Las aulas de docencia están en el 1º piso, Bloque C, Edificio de Ciencias Experimentais.

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PRÁCTICA 1: INFERENCIA Y VERIFICACIÓN DE PROPORCIONES MENDELIANAS EN MAÍZ

OBJETIVOS

- Aprendizaje de la inferencia mendeliana - Utilización de la prueba Ji-cuadrado en Genética

CONTENIDOS

- Interés y aplicaciones del organismo de estudio - El ciclo biológico del maíz - El origen del maíz como especie - El maíz en experimentación genética - Métodos de muestreo - Verificación de hipótesis nulas: homogeneidad - Estimación de proporciones fenotípicas en cruzamientos

PLAN DE TRABAJO

I. Métodos de muestreo de la variabilidad fenotípica II. Planteamiento y verificación de hipótesis genéticas: casos simples (mazorcas grupo I) III. Planteamiento y verificación de hipótesis genéticas: casos complejos (mazorcas grupo II)

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Strickberger, Genética (1985) Fincham, Genética (1986) Levine L & Schwartz N., Laboratory exercises in genetics (1973)

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INTRODUCCIÓN El maíz es popularmente conocido por su importancia alimentaria y económica. Ha sido el alimento básico de las culturas precolombinas y un sustento principal de las economías locales durante gran parte del siglo XX. La importancia comercial del maíz se basa en:

Sus propiedades nutritivas Su alta productividad La facilidad de su cultivo y adaptabilidad La posibilidad de conservación y almacenamiento a largo plazo La variabilidad fenotípica de impacto comercial

Además de su importancia comercial, esta especie ha tenido una considerable importancia científica en la genética de plantas vasculares, debido a las ventajas experimentales que permite su biología:

Es fácil de cultivar y de manipular para efectuar cruces dirigidos Presenta variabilidad genética para caracteres fenotípicos Es un sistema genético cómodo con 10 pares cromosómicos visibles

Ciclo de vida y biología El maíz es una planta angiosperma monoica con sexos separados en inflorescencias. Su nombre científico es Zea mays (n=10). Posee un ciclo de vida con alternancia entre una fase gametofítica y una esporofítica, aunque la primera está muy reducida. Como planta representativa del tipo C4 (capaces de fijar directamente el CO2), posee un crecimiento rápido, y no necesita suelos muy fertilizados. La planta crece durante aproximadamente cinco meses hasta que se desarrollan las inflorescencias masculinas y femeninas. Llegado este momento es posible manipular la fecundación, bien protegiendo las inflorescencias femeninas, bien cortando las masculinas antes de que maduren. Las inflorescencias masculinas pueden utilizarse para polinizar hasta 500 inflorescencias femeninas. Tras la fecundación, se desarrolla el fruto en forma de mazorca que agrupa a un conjunto de granos con las semillas. Muchos caracteres genéticos que afectan al fenotipo de los granos pueden analizarse sobre la mazorca, ya que sus granos constituyen una progenie numerosa del cruzamiento parental. En 1977 se conocían ya 350 loci individuales que afectan al fenotipo de la planta o del grano. Origen del maíz comercial Hoy en día se barajan varias hipótesis para explicar el origen del maíz: A partir de un pariente próximo (Zea mexicana), con el que aún hibrida. A partir de una especie extinguida parecida a Zea mexicana A partir de una especie extinguida parecida a Zea mays

La mayoría de investigadores coinciden en que la planta de maíz, tal como se conoce actualmente, se originó por selección artificial desarrollada consciente o inconscientemente durante los últimos 10.000 años. Se sabe por restos arqueológicos que los indios mexicanos cultivaban y seleccionaban sus variedades de maíz desde hace más de 5000 años (se tienen registros similares de manipulaciones para mejorar variedades de palmeras datileras en el Egipto de los faraones). Ello ha llevado a una inmensa diversificación regional de variedades identificables por caracteres fenotípicos de la mazorca, tal como ya hizo constar en su día Charles Darwin. El maíz en la experimentación genética La planta del maíz se ha utilizado en todas las ramas de la genética. Ha sido relevante en el desarrollo de la genética mendeliana clásica, y la citogenética, especialmente a mediados del siglo pasado (experimentos de Chrighton, McClintock, etc.). Además de su uso en investigación genética básica, también ha sido una especie sometida a mejora por métodos de genética cuantitativa:

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Selección de progenitores y selección masal. Obtención de cepas consanguíneas y de sus variedades híbridas. Hibridación con especies relacionadas para conseguir resistencia a plagas Transgénesis

Plan de trabajo Para esta práctica se utilizan mazorcas comerciales obtenidas de la empresa Carolina Biological Supply (USA). Estas mazorcas surgen de diversos cruzamientos con progenitores que difieren en uno o varios genes que afectan al color o la consistencia del grano. El fin último de la práctica es que los alumnos deduzcan los genes causantes de la segregación en un determinado cruzamiento, a partir del conocimiento del fenotipo de los padres y de los granos en la descendencia, así como de algunas particularidades de la biología de la especie. Los cruzamientos (mazorcas) están clasificados por (presumible) orden de dificultad desde los más fáciles (grupo I) a los más complejos (grupo II). Paralelamente se introducen la aplicación básica de las pruebas de Ji-cuadrado de homogeneidad y contingencia. Durante la práctica, también se plantearán, con ejemplos, algunos de los problemas inherentes al método científico y a las pruebas de hipótesis. Los objetivos concretos de esta práctica de cara al alumno son: El planteamiento de un diseño experimental para resolver un problema biológico La elaboración correcta de la hipótesis nula H0 La aplicación de distintas estrategias de muestreo La estima de proporciones fenotípicas La elaboración de hipótesis bajo inferencia mendeliana La verificación de hipótesis. El análisis de algunos mecanismos epistáticos

Materiales En la tabla se muestran los códigos de las mazorcas de maíz y el fenotipo de los progenitores (P púrpura, R rojo, A amarillo, B blanco). Es importante reflexionar sobre el hecho de que la variabilidad no depende del genotipo de la hembra.

GRUPO I (color o forma) GRUPO II (color)

6500 (P X P) 6690 (R X R)

6520 (R X R) 6700 (A X A)

6502 (P X A) 6680 (A X A)

6522 (R X B) 6670 (P X P)

6660 (P X P)

6662 (P X B)

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DESARROLLO DE LA PRACTICA I. METODOS DE MUESTREO 1) ¿Influyen los métodos de conteo de un mismo fenómeno biológico sobre los resultados?

2) Las muestras obtenidas por distintos investigadores, ¿tienen la propiedad aditiva?

3) ¿Qué es una hipótesis nula?

4) ¿Cuál sería la hipótesis nula para enfocar la resolución de la primera pregunta?

5) ¿Qué metodología seguiremos para probar la hipótesis nula?

6) ¿Con qué herramienta estadística podemos comprobar la hipótesis nula?

Si has contestado adecuadamente a las cuestiones anteriores tienes ya el diseño experimental necesario para comenzar a resolver el problema. Ahora sigue estos pasos:

7) Siguiendo algún método de muestreo individual sobre las mazorcas (por ejemplo, se pueden elegir granos al azar, de filas, de columnas, en diagonal etc.), registra el fenotipo de 30 granos (individuos) y el código de la mazorca a la que corresponden. El conteo sobre cada mazorca se puede hacer por parejas.

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8) Registra los datos en estas tablas:

6500

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Púrpura Amarillo Total 6502 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Púrpura Amarillo Total 9) Aplica a los datos la prueba de verificación de la hipótesis nula

10) ¿Cómo se interpreta la prueba de ji-cuadrado?

11) Si el ji-cuadrado no es significativo, ¿Podemos concluir que H0 es falsa o cierta?

12) Si el ji-cuadrado es significativo, ¿Podemos concluir que Ho es falsa o cierta?

13) ¿Cuál es la interpretación biológica de los resultados de la prueba a la luz de la H0?

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II. PLANTEAMIENTO Y VERIFICACIÓN DE HIPÓTESIS GENÉTICAS: CASOS SIMPLES Objetivo: Inferir las proporciones observadas en cada mazorca y comprobar su ajuste con una ji-cuadrado de bondad de ajuste. Tabla 1. Mazorcas grupo I

Cruce Proporciones Progenitores 6500 3 púrpura: 1 amarillo púrpura × púrpura 6520 3 rojo: 1 blanco rojo × rojo 6502 1 púrpura: 1 amarillo púrpura × amarillo 6522 1 rojo: 1 blanco rojo × blanco

14) ¿Qué son las proporciones fenotípicas y las genotípicas?

15) A la vista de los datos ¿cuál sería la mejor estima de las proporciones fenotípicas?

16) ¿Cómo podemos expresar simplemente las proporciones fenotípicas de un cruzamiento, para

verificar su ajuste a una H0?

17) Diseña una hipótesis genética para verificar la segregación observada en el grupo de

mazorcas muestreado.

18) Aplica a los datos la prueba de verificación de la hipótesis nula

Fenotipo Observados Esperados Purpúra Amarillo

19) ¿Cómo se interpreta la prueba de ji-cuadrado?

20) ¿Cuál es la interpretación biológica de los resultados de la prueba a la luz de la H0?

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III. PLANTEAMIENTO Y VERIFICACIÓN DE HIPÓTESIS GENÉTICAS: CASOS COMPLEJOS (mazorcas grupo II) Tabla 2. Mazorcas grupo II

CRUCE PROPORCIONES PADRES 6690 9 rojo: 7 blanco rojo x rojo 6700 13 amarillo: 3 púrpura amarillo x amarillo 6680 9 amarillo: 3 blanco: 4 púrpura amarillo x amarillo 6660 12 púrpura: 3 amarillo: 1 blanco púrpura x púrpura 6662 2 púrpura: 1 amarillo: 1 blanco púrpura x blanco 6670 9 púrpura: 3 rojo: 4 blanco púrpura x púrpura

21) ¿Cuántas clases fenotípicas se pueden observar en estas mazorcas? 22) ¿Se pueden explicar esas segregaciones con el modelo 3:1 o 1:1 anterior? 23) ¿Se te ocurren otros mecanismos alternativos? EXPLICACION DEL MODELO PARA EL COLOR DEL GRANO DEL MAIZ

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NORMAS PARA DEDUCIR EL GENOTIPO PARENTAL: Si las proporciones en la F1 son parecidas podríamos estar ante un cruce de homocigoto por

heterocigoto, si son muy distintas se trataría de un cruce de heterocigotos Si las proporciones se desvían de la típicas cualitativamente, entonces estaríamos en un caso

de interacción y efectos epistáticos. Si las proporciones se desvían cuantitativamente entonces puede haber interacciones o

ligamiento. Cuando se conocen las rutas enzimáticas y las consecuencias de los mutantes específicos, el

fenotipo también nos permite hacer inferencias sobre el genotipo. Caso del maíz (epistático). 24) Vuelve a la Tabla 1 y propón una nueve hipótesis genética que explique los resultados a la

luz de los mecanismos bioquímicos descritos.

Mazorca 6500 – Púrpura × Púrpura = 3 Púrpura + 1 Amarillo Mazorca 6520 – Rojo × Rojo = 3 Rojo + 1 Blanco Mazorca 6502 – Púrpura × Amarillo = 1 Púrpura + 1 Amarillo Mazorca 6522 – Rojo 1: Blanco 1

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25) Ahora vuelve a la Tabla 2 y propón una nueve hipótesis genética que explique los resultados

a la luz de los mecanismos bioquímicos descritos.

Mazorca 6690 – Rojo × Rojo = 9 Rojo : 7 Blanco Mazorca 6700 – Amarillo × Amarillo = 13 Amarillo : 3 Púrpura Mazorca 6660 – Púrpura × Púrpura = 12 Púrpura + 3 Amarillo + 1 Blanco Mazorca 6662 – Púrpura × Blanco = 2 Púrpura + 1 Amarillo + 1 Blanco Mazorca 6670 – Púrpura × Púrpura = 9 Púrpura + 3 Rojo + 4 Blanco 26) ¿Qué nombre recibe el tipo/s de interacción génica propuesto?

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PRÁCTICA 2: MANEJO DE Drosophila EN EL LABORATORIO OBJETIVOS

• Manejo de Drosophila en el laboratorio. • Polimorfismos Mendelianos y cromosómicos en Drosophila.

INTRODUCCIÓN Probablemente Drosophila ("la mosca de la fruta") es el eucarionte mejor estudiado desde el punto de vista genético. Este organismo fue introducido como animal de laboratorio para la investigación genética en 1909 por el Dr. T.H. Morgan. Desde entonces se emplea como modelo biológico en varias disciplinas. En Drosophila coinciden varias ventajas para su utilización en estudios genéticos:

1- Rapidez del ciclo de vida (en D. melanogaster dura 10-12 días a 25º). 2- Pocos cromosomas (en D. melanogaster 2N=8). 3- Existencia de abundantes polimorfismos genéticos. 4- Posee cromosomas gigantes (politénicos) en las glándulas salivares de las larvas. 5- Es una especie cosmopolita (distribuida en todo el mundo). Sin embargo, quizás muchos de vosotros os habréis preguntado qué sentido tiene el utilizar una especie, aún con muchas ventajas desde el punto de vista genético, tan diferente de nosotros mismos o de otros animales más interesantes biológica o comercialmente. A pesar de que la pregunta tiene sentido, la respuesta es clara y contundente. Existen tres buenas razones que justifican la utilización de animales sencillos como modelos biológicos de estudio, para a partir de los descubrimientos realizados en dichos modelos poder extrapolar nuestros resultados a animales más complejos o incluso a nosotros mismos. La primera de estas razones proviene del campo de la evolución. Se ha confirmado que todos los organismos vivos conocidos, poseen una misma estructura a nivel molecular, y un funcionamiento básico muy semejante, como consecuencia de que todos están emparentados y descienden de un mismo antepasado común. La segunda razón es de índole práctica. Numerosas veces se ha comprobado en la práctica que dicha extrapolación es útil y ajustada. Por ejemplo, cuando se descubrieron ARN autoprocesables en protozoos, se predijo con éxito que deberían aparecer también en otros organismos. La tercera y última es de sentido común, muchas veces la alternativa no está a nuestro alcance (podemos simular en laboratorio la evolución de una población de bacteria o de virus durante 20000 generaciones, pero no sería viable diseñar un experimento que hiciese lo mismo con vacas; así mismo, muchos diseños experimentales no podrían desarrollarse en seres humanos por razones puramente éticas). BIOLOGÍA Y ECOLOGÍA DE LAS DROSOPHILAS. La "mosca de la fruta" es un insecto perteneciente al orden Díptera. El género Drosophila está compuesto por mosquitas, de unos pocos milímetros de longitud, especializadas en alimentarse de frutos y vegetales en descomposición o parcialmente fermentados. Uno de los productos típicos de las fermentaciones de estas frutas es el ácido acético, por el que estas moscas se sienten irremediablemente atraídas (de ahí su otro nombre vulgar de "moscas del vinagre"). Es un género muy cosmopolita distribuido en prácticamente cualquier clima, altitud y latitud (en concreto la especie Drosophila melanogaster se encuentra en la mayor parte del planeta). El ciclo de vida, al igual que el de otros dípteros es relativamente complejo, pasando por varias fases o etapas (Ver figura 1): Huevo: Las hembras ponen unos 200 huevos blancos en forma de saco de unos 0.5 mm de longitud. Poseen unas extensiones de la membrana externa en posición anterodorsal, que impiden que el huevo se hunda en la superficie semilíquida de su medio natural (frutas en descomposición).

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Larva: Después de un día de desarrollo (a 20º C) eclosiona una pequeña larva de color blanco. Esta larva posee 12 segmentos no aparentes (1 cabeza, 3 torácicos y 8 abdominales), dos capas epidérmicas (endo y exocutícula) y numerosos órganos internos que pueden visualizarse por transparencia. En todas las larvas existen 2 linajes celulares bien diferenciados: 1- Las células larvarias: muy diferenciadas, que han perdido su capacidad de división

celular y sólo pueden aumentar por lo tanto el tamaño de la larva a costa de incrementar su volumen celular y replicar muchas veces su material hereditario (pero sin división celular posterior). Es decir son habitualmente poliploides.

2- Las células imagales o imaginales: células poco diferenciadas, de pequeño tamaño,

diploides y localizadas en ciertas áreas o regiones denominadas discos imaginales. Retienen la capacidad de dividirse y diferenciarse, dando lugar a las estructuras de la mosca adulta durante la metamorfosis. Ya están parcialmente diferenciadas para dar lugar a ciertas estructuras. Las larvas son muy voraces y se pasan todo el rato comiendo. Después de unos cuatro días aproximadamente de crecimiento (a 20º C) desarrollan el tamaño mínimo para convertirse en pupa.

Pupa: En un momento determinado, la exocutícula de la larva se endurece y se vuelve oscura, se forma la pupa o imago. El proceso lo inicia una hormona llamada ecdisona. Durante el mismo, todos los tejidos larvarios son destruidos y utilizados como fuente energética para, a partir de los discos imaginales, formar una mosca adulta. Este estadio suele durar de 3 a 5 días. Adulto: El imago suele salir rompiendo el extremo anterior del pupario. Al principio la mosca es muy alargada, sin el pigmento característico de la forma adulta y con las alas completamente plegadas. Durante las próximas horas después de emerger, la mosca inyecta linfa a las alas, para que se desplieguen y se puedan secar y madura sexualmente. En unas 8-9 horas ya es un adulto con plena capacidad funcional. Su vida no suele pasar de los 20 días a 20º C. Reproducción: Es una especie dioica (con sexos separados), polígama (los machos y las hembras pueden aparearse múltiples veces) y de fecundación interna. Existe un cortejo bastante sofisticado, previo a la cópula, que puede variar mucho de especie a especie. Las hembras suelen copular unas 3 o cuatro veces a lo largo de su vida, aunque son capaces de guardar el esperma de su primera cópula durante toda la vida. TÉCNICAS DE MANEJO Y MANIPULACIÓN EN LABORATORIO Los procedimientos para capturar estas especies en su medio natural suelen ser indirectos, utilizando recipientes que contengan frutas fermentadas, levadura fresca o cualquier otro medio artificial preparado con los componentes anteriores (o incluso añadiéndole acético). Estos contenedores se dejan un par de días en su hábitat natural, bosques y prados, y posteriormente se va a recoger las moscas (bien tapando el recipiente, bien utilizando una red entomológica). En algunas especies particulares muy especializadas es posible capturar los ejemplares directamente en su medio natural mientras copulan o se alimentan. Cultivo en laboratorio: Las moscas se suelen poner en un medio de cultivo en estado de gel que se añade a un frasco que se tapa con algodón. El medio de cultivo posee tres componentes básicos: 1- Una fuente nutritiva: glúcidos y azucares (harina) y proteínas (levadura). 2- Un aglutinante, con el fin de conseguir un estado de gel, ni líquido ni sólido. Pues un

estado demasiado sólido impediría que las larvas se pudieran alimentar del medio de cultivo, y un estado demasiado líquido podría impedir una correcta oxigenación de las mismas durante la alimentación.

3- Inhibidores de crecimiento de hongos (competidores de la levadura) y de bacterias.

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Reconocimiento fenotípico del sexo: En Drosophila existe dimorfismo sexual, es decir que los sexos se pueden distinguir morfológicamente. En los adultos, la distinción se puede realizar atendiendo a (Ver figura 2): 1- El tamaño (las hembras son mayores). 2- Diferencias en el abdomen. 3- Existencia de un peine sexual en el segundo segmento de la primera pata de los

machos (cuya finalidad es sujetar a la hembra durante la cópula). Obtención de hembras vírgenes: Ya que las hembras poseen la capacidad de guardar esperma de cópulas anteriores durante toda su vida, si queremos hacer cruces controlados es imprescindible utilizar hembras que sean vírgenes. Para conseguirlas se suelen utilizar tres métodos distintos: 1- Sexado de larvas en el tercer estadío (distinguiendo los ovarios de los testículos con

binocular), y aislamiento de las larvas hembras hasta su maduración. 2- Sexado de pupas (en los machos se puede distinguir el peine sexual) y aislamiento de

las hembras. 3- A partir de adultos, recogiendo todas las hembras recién emergidas hasta 8 horas

después de su nacimiento. Propagación de líneas y nomenclatura: Habitualmente se utilizan 10-15 parejas para fundar un frasco de cultivo típico de laboratorio de unos 250 ml de volumen. Cada 15-20 días las moscas de una determinada línea se cambian a un frasco con medio nuevo para que funden una nueva generación. Así, el mantenimiento de una línea en laboratorio durante todo un año suele implicar unas 24 generaciones. Se recomienda mantener un mínimo de 2 frascos por línea. Cuando se funda una nueva línea se suele escribir la abreviatura de los fenotipos "mutantes" de los padres, así como la fecha en la que se inició el cultivo. Tradicionalmente el fenotipo de la hembra se pone primero. Un ejemplo de etiqueta típica sería: Alternativamente se usa la abreviatura del mutante y como subíndice una letra para el correspondiente alelo, ejemplo: W+ / Ww

Manejo de las moscas en el laboratorio: Para eterizar (dormir) y examinar las moscas adultas el procedimiento es el siguiente: Golpear la base de la botella para que las moscas se vayan al fondo, quitar el tapón e invertir la botella sobre otra limpia, poner a esta nueva botella un tapón de algodón empapado en éter y esperar unos segundos hasta que las moscas se duerman ( si se espera demasiado tiempo las moscas se mueren). Una vez dormidas, depositarlas sobre una placa de cristal y observar a la lupa. IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES DE Drosophila melanogaster: MUTACIÓN CARACTERÍSTICA FENOTÍPICA Salvaje (+) Mosca con las características más frecuentes en la población Curly/Lobe (Cy/L) Alas curvadas y ojos en forma de riñón. Yellow (y) Cuerpo de color amarillo. White (w) Ojos de color blanco. CROMOSOMAS POLITÉNICOS. En 1881 E.G. Balbiani encontró unas estructuras extraordinariamente peculiares en los núcleos de ciertas células secretoras en dípteros. Sin embargo, hicieron falta 50 años para que se demostrara que dichas estructuras eran cromosomas (Painter, Heitz y Bauer, 1933). Los cromosomas politénicos se han encontrado en tejidos secretores como recto, tubos de Malpighi, intestino, glándulas salivares, aunque es en estas últimas donde habitualmente alcanzan su desarrollo máximo. Los cromosomas politénicos son el resultado de múltiples replicaciones del material

W × + (10-10-04)

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nuclear sin ir seguidas de división celular. Como consecuencia se forman células poliploides en los que los diferentes cromosomas homólogos se unen formando un complejo estable capaz de amplificar hasta 1000 veces la estructura del cromosoma (en aquellos casos donde se han producido más de 20 rondas de replicación). Estos cromosomas se visualizan como estructuras alargadas unidas todas en un punto común el cromocentro (lugar donde se unen todos los centrómeros). En Drosophila melanogaster se observan claramente los 2 brazos de los cromosomas 2 y 3 y el brazo largo del X, unidos al cromocentro (con algo de experiencia puede llegar a observarse un rudimento de condensación que representa al cromosoma Y). También se aprecia un patrón de bandeado, formado por regiones de mayor o menor condensación. En estos cromosomas también pueden visualizarse PUFFS (abultamientos que representan zonas de transcripción activa) y anillos de Balbiani (grandes zonas muy distendidas donde el nivel de transcripción es máximo, asociado a la transcripción de ARN ribosómicos). Los cromosomas politénicos, por lo tanto, permiten la localización visual de los genes en los cromosomas, y son pues extremadamente útiles para obtener mapas físicos de distribución de genes en cromosomas. También se han utilizado para estudiar el polimorfismo de bandas en las poblaciones, así como para detectar fenómenos de reordenaciones cromosómicas y/o deleciones o duplicaciones. OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS POLITÉNICOS. Para esta práctica se utilizará D. virilis ya que la larva es de mayor tamaño y su manejo es por tanto más fácil. Se suelen utilizar larvas del tercer estadío (justo antes de convertirse en pupas). Se coloca la larva sobre una superficie plana, y bien en seco, bien en agua destilada, se disecciona separando la cabeza del cuerpo mediante la presión con dos punzones de disección Las dos glándulas salivares están situadas a ambos lados del aparato bucal y son transparentes. Las células, que son de gran tamaño tienen un aspecto granuloso, frecuentemente están asociadas con grasa (ver figura 3). Una vez localizadas, se separan y se colocan en un portaobjetos con unas cuantas gotas de orceina lacto-acética. Se deja que se tiña durante 10-20 minutos, y luego se deposita en cubreobjetos pequeño sobre ella, se tapa con un papel de filtro y se realiza un aplastamiento controlado ejerciendo presión sobre el mismo con el dedo pulgar. Entonces ya está lista para su observación al microscopio a unos 100-400 aumentos (Ver figura 4). Las buenas preparaciones se pueden fijar temporalmente usando laca de uñas para sellar el borde del cubre-objetos. Las preparaciones para conservar se hacen utilizando hielo seco para fijar los cromosomas, deshidratando con alcohol, y posteriormente añadiendo una resina epoxi (bálsamo de Canadá, etc.).

Figura 1: Ciclo de vida y dimorfismo sexual en Drosophila melanogaster. (1) macho (2)hembra (3) huevo (4,5,6) estadios de larva (7) paso de pupa a adulto.

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Figura 2: Vista ventral del abdomen de un macho y una hembra de Drosophila melanogaster.

Figura 3: Disección de la parte anterior de una larva de Drosophila en la que se muestran las dos glándulas salivares.

Figura 4: Cromosomas politénicos de Drosophila.

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PRÁCTICA 3: CONCEPTOS BÁSICOS EN GENÉTICA MEDIANTE ANIMACIÓN POR ORDENADOR

OBJETIVOS

• Repasar los conceptos más importantes y/o complejos en Genética. PROGRAMA VISUAL GENETIC PLUS. Este programa de prácticas virtuales esta desarrollado en un entorno Windows y posee varias prácticas interactivas de laboratorio. El programa está en inglés. Las prácticas están ordenadas por áreas temáticas, cubriendo la mayor parte de los métodos explicados en la asignatura. Las prácticas virtuales en este programa suelen llevar asociadas simulaciones explicativas en donde se condensan los principios teóricos necesarios para resolver los distintos problemas. Las prácticas virtuales de laboratorio que veremos serán: 1. Cruces Mendelianos 2. Análisis de ligamiento 3. Ligamiento al sexo en Drosophila 4. Efectos del género en cruzamientos prueba en Drosophila Inicio del programa Visual Genetics Plus

1) Para iniciar el programa pulsa sobre el icono “openvg.exe” o sobre el acceso indirecto en la carpeta “Ciencias” en el escritorio. Verás una pantalla como la siguiente:

2) Ahora pulsa sobre el botón “Classical Mendelian Genetics/Linkage” y te aparecerá la siguiente pantalla:

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3) Pulsa en el botón “Select Individual modules” y verás la siguiente pantalla con los módulos individuales:

4) Vamos a trabajar con los módulos 1, 3, 4 y 5.

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Modúlo 1. Cruces monohíbridos, dihíbridos y trihíbridos 1) Empecemos con el primero pulsando en el botón “1. Monohybrid, Dihybrid and Trihybrid

Mendelian Ratios”. Aquí se te explica en que consiste la práctica. Léelo con calma:

2) Una vez que lo has leído pulsa el botón “Continue”. Aparecerá la siguiente pantalla:

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3) Lee las instrucciones. La idea es hacer cruces para intentar averiguar el tipo de herencia de los genes responsables de estos caracteres: color de la flor (blanco, púrpura), borde de la hoja (aserrado, liso), y pilosidad del tallo (piloso, liso). Selecciona el cruce que quieres hacer y pulsa el botón “Do Cross”. Aparecerá la siguiente pantalla:

4) Examina la F1 resultante. ¿Cuáles son los caracteres dominantes? Selecciona la opción

apropiada para cada una de los tres fenotipos en el recuadro “INTERPRETING THE F1”. Ahora, fijándose en los genotipos de los parentales, deduce el fenotipo de la F1, indícalo en el recuadro y pulsa “Check answer” para comprobar tu respuesta. Si has acertado verás algo así:

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5) Ahora vamos a cruzar la F1 consigo misma. Pulsa el botón “Do F1 × F1 cross” y verás la siguiente pantalla:

6) Predice la progenie que debería de producirse en la F2. Marca los fenotipos/genotipos que piensas que van a aparecer. Indica la proporción esperada de cada uno de ellos. Ahora pulsa el botón “Check progeny” para comprobar tu respuesta. Si aciertas aparecerá la siguiente pantalla.

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7) Compara tu respuesta con el gráfico que aparece en el recuadro “BRANCHING DIAGRAM”, que explica la segregación de los alelos en este cruce. Si quiere ver los parentales originales pulsa el botón “Show parents”. Cuando hayas entendido este resultado, pulsa el botón “Do Cross” para crear una nueva F1 o pulsa el botón “Go to Part 2” para explorar cruces atípicos:

8) Repite estos experimentos con cruces monohíbridos para los diferentes caracteres. Experimenta con cruces dihíbridos y trihíbridos. Explora además cruces atípicos y escribe todas tus conclusiones sobre la herencia de estos caracteres.

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Modúlo 2. Análisis de ligamiento 1) Ahora pasemos al segundo módulo que vamos a explorar pulsando en el botón “3.

Mapping genes by 3-point testcrosses”. Verás una pantalla en la que se te explica en que consiste la práctica. Léelo con calma:

2)

3) Vamos a empezar desde cero con un nuevo mapa. Selecciona la opción “Begin with new Map data” y pulsa el botón “Continue”. Se abrirá la siguiente pantalla:

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4) En las instrucciones se te indica que dispones de una serie de variedades puras homocigotas para todos los alelos. Cada una de las variedades que se indican es homocigota recesiva para los caracteres indicados (1 ó 2) y homocigota dominante para los otros caracteres. Hay seis genes en total y queremos construir su mapa genético. Diseña un cruce y pulsa el botón “Continue”. Si tu cruce es informativo, verás el botón “Do cross”. Púlsalo y aparecerá una pantalla como ésta:

5) En la pantalla superior se te muestra la F1 resultante del cruce que has seleccionado. Intenta predecir el genotipo y fenotipo de la variedad con la que la vas a cruzar en el cruzamiento prueba Pulsa el botón “Continue” para verla:

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6) Ahora realiza el cruce pulsando el botón “Do Testcross” y verás la siguiente pantalla:

7) Examina los resultados obtenidos. Verás que se te indica la fase gamético de los individuos que acabas de cruzar. Pulsa el botón “Continue” y aparecerá la siguiente pantalla:

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8) Trata de identificar los tipos parentales y los tipos recombinantes entre la progenie el par

de genes activo (en este caso N&H). Pulsa en los recuadro blancos de la derecha de la tabla para que aparezca una ‘R’ que identifique los tipos recombinantes (pulsando otra vez sobre el recuadro la ‘R’ desaparece). Cuando hayas marcado los recombinantes, pulsa en el botón “Total # Rec.” para calcular el número de recombinantes:

9) Ahora pulsa el botón “Get % Rec.” para calcular la frecuencia de recombinación:

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10) Pulsa el botón “Next Gene Pair” y repite el proceso hasta obtener la frecuencia de recombinación de los tres pares. Cuando tengas las tres guarda los resultados pulsando el botón “Save % Rec”:

11) Guarda los resultados por ahora pulsando el botón “SAVE MAPPING DATA” (sólo para diskettes) y pulsa el botón “Do New Cross” para analizar otro cruce.

12) Diseña y realiza los cruces necesarios para resolver el mapa. Si aparece disponible el

botón “Advanced Analysis” y sigue las instrucciones.

13) Dibuja el mapa genético para estos genes:

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Módulo 4. Ligamiento al sexo

1) Elige el módulo 4 (ligamiento al sexo).

2) Lee detalladamente la explicación de este nuevo ejercicio. El objetivo es analizar la

segregación de dos mutaciones recesivas ligadas al cromosoma X: white (w) y miniaure (m), que producen los fenotipos mutantes ojos blancos y alas cortas. Se trata de verificar si se cumplen dos de las propiedades que permiten determinar si un carácter está o no ligado al sexo: 1) Diferencias en la incidencia del carácter entre sexos y 2) Diferencias en los resultados obtenidos en cruces recíprocos. Además, podremos determinar si existe o no ligamiento entre los dos genes. Pulsa continuar.

3) Esta práctica reproduce paso por paso todo lo que es necesario realizar cuando se hace

un cruzamiento real de Drosophilas en el laboratorio. Cada uno de los frascos de cultivo

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contiene una línea pura de Drosophila. Tendrás que seguir las indicaciones que de forma secuencial aparecen en la pantalla.

CRUZAMIENTO 1: hembra fenotipo salvaje x macho white miniature. Pulsa el botón anesthesize para dormir las moscas

4) Arrastra con el ratón las moscas dormidas del frasco izquierdo al disco de observación izquierdo. Arrastra las moscas dormidas del frasco derecho al disco de observación derecho. Haz doble clic en la moscas para visualizar su fenotipo y sexo. Recuerda que los machos se distinguen por la presencia de peines sexuales en las dos patas delanteras y la coloración oscura de la parte posterior del abdomen.

5) Obtención F1: Elige una hembra de fenotipo salvaje y un macho doble mutante white miniature. Para ello, arrastra el macho y la hembra al frasco P1xP2 en la ventana inferior. Una vez que los padres se han cruzado, tendrás que retirarlos para que no se confundan con la descendencia. Para ello, pulsa el botón anesthesize para dormir las moscas y

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retirar los padres al disco de observación (arrastrándolos con el ratón). Presiona view F1 para obtener la descendencia del cruzamiento F1.

6) Duerme las moscas de la F1 y visualiza su fenotipo en el disco de observación tal y como has hecho anteriormente.

- Determina las proporciones fenotípicas de la descendencia contabilizando toda la progenie.

- ¿Cómo explicas los resultados?

7) Presiona view table para conocer qué proporciones obtendrías en un experimento en el que hubieses contabilizado muchos más individuos. Para continuar, presiona return to experiment.

8) Obtención F2: Obtén la F2 cruzando un macho y una hembra de la F1. Para ello, arrastra

al frasco F1xF1 un macho y una hembra del disco de observación donde has contabilizado la F1.

9) Retira nuevamente los adultos para que no se confundan con la progenie F2 (anestésialos

y arrástralos al disco de observación). Presiona view F2 para obtener la descendencia.

10) Anestesia la F2 y contabiliza las proporciones fenotípicas en el disco de observación. Explica los resultados.

11) Presiona view table para conocer qué proporciones obtendrías en un experimento en el

que hubieses contabilizado muchos más individuos.

12) Observa las proporciones de la F2. ¿Existe alguna evidencia de ligamiento entre white y minute?

13) Para continuar, presiona return to experiment.

14) Presiona Start new cross.

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15) CRUZAMIENTO 2: hembra salvaje x macho doble mutante para Bar y miniatura. Repite todo el proceso hasta la F2 partiendo de este cruce recíproco.

16) Una vez hayas finalizado el cruzamiento 2, explica la discrepancia o similitud de los

resultados con los obtenidos en el cruzamiento 1.

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Módulo 5. Efectos del género en cruzamientos prueba en Drosophila

1) Elige el módulo 5.

2) Lee detenidamente el planteamiento de esta práctica. El objetivo es determinar cual es la causa de las diferencias de segregación que se observan en ciertos cruces recíprocos. Verás que no sólo la herencia ligada al sexo puede producir tales diferencias, y deducirás cual es la explicación de tus resultados. Para ello, analizarás la herencia de dos mutaciones recesivas de Drosophila: ojos púrpura (p), y coloración negra del cuerpo (b).

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3) En los frascos de la izquierda y derecha hay líneas puras de Drosophila cuyo genotipo se indica en la pantalla. Procede a hacer un cruzamiento de un individuo púrpura con otro de cuerpo negro, tal y como ya has hecho anteriormente:

a. Duerme las moscas b. Visualiza su fenotipo sobre los discos de observación c. Elige el macho y la hembra que vas a cruzar, y arrástralos al frasco P1xP2 para

obtener la F1 d. Retira los padres al disco de observación e. Presiona view F1 para visualizar la descendencia f. Duerme los individuos F1 y arrástralos al disco de observación para visualizar sus

fenotipos. ¿Cual es el genotipo de machos y hembras? ¿El resultado habría sido distinto si hubieses realizado el cruzamiento recíproco?

4) A continuación, vas a hacer un cruzamiento prueba con los individuos de la F1. Para elegir los individuos homocigotos recesivos de este cruzamiento, presiona show test cross parents.

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5) Duerme a los individuos homocigotos recesivos y deposítalos en el disco de observación. Ahora dispones en la pantalla de todo lo que necesitas para realizar el cruzamiento prueba: los individuos F1 (ventana inferior) y los homocigotos recesivos (ventana superior). El frasco donde harás el cruzamiento prueba es F1-TC, en la ventana inferior.

6) Haz el siguiente cruzamiento prueba: hembra F1 x macho homocigoto doble recesivo (pb/pb). Para ello:

a. Arrastra los individuos al frasco F1-TC b. Retira a los padres c. Presiona view TC progeny para obtener la descendencia d. Anestesia la progenie y visualízala en el disco de observación ¿Son los machos

iguales? ¿Son las hembras iguales? ¿Hay diferencias entre machos y hembras?

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7) Presiona view testcross data para obtener una relación detallada de tus resultados. ¿Hay evidencia de ligamiento ente las mutaciones p y b?.

8) Presiona return to experiment. 9) Presiona Start new cross 10) Repite todo el proceso desde el principio. PERO HAZ EL CRUZAMIENTO PRUEBA

RECIPROCO: macho F1 x hembra doble homocigota recesiva.

11) Cuando hayas llegado al final del proceso, presiona view test cross data 12) En estos momentos dispones en tu pantalla de los datos de los tipos de cruzamiento que

has realizado. A continuación vas a analizar estos datos presionado start análisis. 13) Observa las diferencias de los resultados obtenidos en los dos tipos de cruzamientos

¿Cuál es la explicación? 14) Calcula la frecuencia de recombinación ente p y b. Para ello, haz una vez clic con el

ratón (en la fila all progeny) sobre cada una de las casillas que contiene cada fenotipo recombinantes. El número total de recombinantes se va sumando automáticamente a medida que los seleccionas.

15) Presiona show % recombinación para calcular la distancia entre loci. Verifica tu análisis presionando check answer

16) Finalmente presiona show summary, y comprueba si la explicación que allí se da coincide con la que tú has propuesto