Grundlagen der Immungenetik - MH-Hannover: Startseite · PCR-SSP (sequence-specific primers)...
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Grundlagen der ImmungenetikGrundlagen der Immungenetik
PD Dr. S. ImmenschuhInstitut für Transfusionsmedizin, MHH
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p21
MHC = Major Histocompatibility Complex• umfasst eine Gruppe von Genen, die Proteine codieren, welche für
- die Immunerkennung,
- die Gewebeverträglichkeit (Histokompatibilität) bei Transplantationen,
- die immunologische Individualität wichtig sind
• bei jeder Species unterschiedlich:
- Mensch: HLA - humanes Leukozytenantigen
- Schwein: SLA - Schweine Leukozytenantigen
- Maus: H2
- Ratte: RT
• beim Menschen sind die HLA Gene auf dem
kurzen Arm von Chromosom 6 (6p21.31)
p21
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• Definition und Genetische Organisation der HLA Gene
• Struktur und Funktion des HLA Komplexes
• Typisierung und Nomenklatur von HLA MolekülenPolymorphismus von HLA Molekülen
• Klinische Bedeutung des HLA SystemsMinor Histokompatibilitätsantigene Histokompatibilität und TransplantationMechanismen der Fremderkennung
Humane Leukozyten Antigene - HLA
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Das HLA System Das HLA System ––
Definition und Genetische OrganisationDefinition und Genetische Organisation
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Die HLA Gene
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Diversität von HLA durch Polygenie und Polymorphismus
Polygenie PolymorphismusBeteiligung mehrerer Gene an Auftreten einer Genvariation (Allel)der Ausbildung eines Phänotyps in einer Population
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Polygenie und Polymorphismus tragen zur Diversität der HLA-Moleküle eines Individuums bei
Polygenie = mehrere GenorteHLA Klasse I: HLA-A, HLA-B, HLA-CHLA-Klasse II: HLA-DRB1, DQB1
Polymorphismus = allelische VielfaltHLA-A 630 Allele 649 Allele 697 AlleleHLA-B 979 Allele 1029 Allele 1109 AlleleHLA-C 338 Allele 350 Allele 381 AlleleHLA-DRB1 633 Allele 640 Allele 690 AlleleHLA-DQB1 90 Allele 91 Allele 95 Allele
2670 Allele 2759 Allele 2972 AlleleStand 01/2008 Stand 04/2008 Stand 10/2008
+ 302 neue Allele
Das HLA System
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Entdeckung neuer HLA Allele seit 1968
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Struktur und Biologische Funktion Struktur und Biologische Funktion
des HLA Systemdes HLA System
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Expression von HLA Antigenen
-+++Thrombozyten
--Erythrozyten-+Nierenzellen-+Leberzellen
-+++Granulozyten++++++Antigenpräsentierende Zellen (APC)
++++++Makrophagen++++++B-Zellen++++T-Zellen
Klasse IIKlasse I
HLA-Klasse I Expression auf nahezu allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten
HLA-Klasse II Expression ausschließlich auf Zellen des Immunsystems
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Struktur von HLA Klasse I und II Molekülen
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Antigenpräsentation über HLA Moleküle
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HLA Klasse I und II Pathways
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Biologische Funktion des HLA-Systems
MHC-RestriktionAntigene werden nicht als frei lösliche Proteine von T Zellen erkannt, sondern nur wenn diese ihnen als Proteinfragmente (= Peptide) durch HLA Moleküle präsentiert werden
• Unterscheidung von „selbst“ und „fremd“
• Schlüssel-Moleküle für die Initiierung der spezifischen (adaptiven) immunologischen Antwort
• Ligand für Natürliche Killerzellen (NK Zellen)
• Reifung der T-Lymphozyten
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Zusammenfassung HLA-Klasse I – Moleküle• Endogene Peptide: Anzeige intrazellulärer Infektion, Initiierung einer
adaptiven Immunantwort
• Expression auf fast allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten (nicht auf Erythrozyten)
• Präsentation der Peptide an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T Zellen) - zytotoxische Zellen geben Proteine (Perforine, Granzyme) ab- Membran der Zielzelle wird durchlässig = Tod der infizierten Zelle
HLA-Klasse II – Moleküle • Exogene Peptide: Aufnahme von Antigenen zur Initiierung einer
adaptiven Immunantwort
• Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen (z.B. DCs, B-Zellen)
• Präsentation der Peptide an CD4+ T-Zellen (T Helfer Zellen)- Zytokine, Chemokine werden ausgeschüttet- Immunreaktionen anderer Zellen (B Zellen, T Zellen) wird verstärkt
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Polymorphe Regionen
- Die Positionen der allelischen Vielfalt liegen in den Antigen-bindenden Regionen der HLA-Moleküle
- Sie beeinflussen damit direkt deren Bindungsaffinität und indirekt die Antigenerkennung durch T-Lymphozyten
α1- und α2-Domäne β1-Domäne
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Interaktion zwischen HLA Molekül und Peptid
J. Klein et al. N Engl J Med 2000; 343: 702-709
Peptide binden über Ankeraminosäuren
an HLA Moleküle (z.B. P2 und P9)
HLA Klasse I
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HLA TypisierungsmethodenHLA Typisierungsmethoden
Nachweis von HLA Antigenen und HLA AntikörpernNachweis von HLA Antigenen und HLA Antikörpern
HLA Nomenklatur
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Indikationen zur Typisierung von HLA Antigenen und Antikörpern
• TransplantationNieren- und Stammzelltransplantation
• TransfusionNachweis von Antikörpern gegen fremde HLA-Antigene bei polytransfundierten Patienten
• Krankheitsassoziation Morbus Bechterew assoziiert mit HLA-B27
• Forensik
• Abstammungsbegutachtung/Vaterschaftsgutachten
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Enstehung von HLA Antikörpern
• Transplantationen
• Transfusionen
• Schwangerschaft
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HLA Typisierungsmethoden
• nach dem Verfahren- serologisch
komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest(Mikro-Lymphozytotoxizität nach Terasaki)
- molekularbiologischPCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides) PCR-PCR-SSP (sequence-specific primers) basierendSequenzierung (sequencing-based typing, SBT)
• nach Auflösungsgrad - niedrige Auflösung (low resolution) – serologisch, molekularbiologisch
= 2 stellig: HLA-A24
- hoche Auflösung (high resolution) – molekularbiologisch= 4 stellig: HLA-A*2402
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Prinzip der Benennung von HLA Allelen
Serologie
Molekularbiologie
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R. Waßmuth. Einführung in dasHLA System, 1995
Serologische HLA-Typisierung –Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest
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Serologische HLA-Typisierung –Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest
positives Testergebnislysierte Zellen
positives Testergebnislysierte Zellen
negatives Testergebnisintakte Zellen
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Nachteile der serologischen Typisierung
Niedrigauflösend (low resolution)
= 2 stellig: HLA-B24
Hohe Fehlerrate (insbesondere HLA-DR > 30%)
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HLA Typisierungsmethoden
Molekularbiologische Verfahren
PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides)
PCR-SSP (sequence-specific primers)
Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT)
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Molekularbiologische HLA TypisierungPCR-SSP (sequence-specific primers)
EXON GTT
EXON ATT
5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’
167 bp
5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’
Valin (V, GTT)
Isoleucin (I, ATT)
167 bp
5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC G 3’ Extension
5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC A 3’ Extension’
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Molekularbiologische HLA TypisierungPCR-SSP (sequence-specific primers)
EXON GTT
EXON ATT
5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’
167 bp
5’ GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3’
Valin (V, GTT)
Isoleucin (I, ATT)
167 bp
5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC A 3’ STOPP
5’ CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC G 3’ STOPP
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1 2 3 4 5 6 7 8
Kontrollbande (hGH)
spezifisches AmplifikatValin (V, GTT)
spezifisches AmplifikatIsoleucin (I, ATT)
Kontrollbande (hGH)
Proben
V/V V/V V/V V/I V/I V/V V/V V/V
Molekularbiologische HLA TypisierungPCR-SSP (sequence-specific primers)
Ergebnis:
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Heterozygot A/G
Molekularbiologische HLA Typisierung
A G A C C C A G C G G C TG
A G A C C C A G C G G C T
SBT (sequencing-based typing)
Homozygot G
Homozygot A
A G A C C C G G C G G C T
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Molekularbiologische HLA TypisierungSBT (sequencing-based typing)
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Klinische Bedeutung des HLA SystemKlinische Bedeutung des HLA System
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Klinische Bedeutung des HLA-Systems
• Transplantationsmedizin- Knochenmark- und Stammzelltransplantation- Nierentransplantation
• Assoziation zwischen HLA-Antigenen und diversen Erkrankungen
• Abstammungsbegutachtung
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Mechanismen derFremderkennung
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HLAMolekül
T-Zelle
zerstört
Virus-infizierte
Zelle
HLA-vermittelte Interaktion zwischenzytotoxischer T-Zelle und Zielzelle
fremdes HLAMolekül
T-Zelle
zerstört
fremde Zelle
Transplantation
TransplantationssituationKlinische Manifestation: Spender-gegen-Patienten Reaktion
Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD)
Patient
Spender
Die Aktivität der zytotoxischen T-Zellen endet für die betroffene Zelleimmer tödlich!
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A)Direkte Erkennung von allogenen HLA-Molekülen
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Direkte Erkennung von allogenen HLA-Molekülen
Direkte Fremderkennung von HLA Klasse I: Allo-HLA Klasse I Molekülwird durch zytotoxische T-Lymphozyten des Empfängers erkannt.
A.
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B)Indirekte Erkennung von allogenen HLA-Molekülen
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Indirekte Erkennung von Alloantigenen
B.
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C)Erkennung von allogenen Peptiden
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Peptidantigene werden durch HLA Moleküle präsentiert und vom T Zell-Rezeptor erkannt
C.
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Akute Abstoßungsreaktionen kommen sowohl bei MHC-differenter als auch -identischer Transplantation vor.
Akute Abstoßung: MHC und Peptide
MHCa MHCa MHCa
MHCa MHCaMHCb
IsotransplantatAllogene MHC-differenteTransplantation
Allogene MHC-identischeTransplantation
Toleranz schnelle Abstossung langsame Abstossung
0 60 120 0 60 120 0 60 120
Transplantatüberlebensdauer ->
0%
50%
100%
Anz
ahlv
itale
rTr
ansp
lant
ate
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Minor HistokompatibilitätsantigeneMinor Histokompatibilitätsantigene
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Erkennung von allogenen Peptiden
Minor Histokompatibilitätsantigene sind Peptide, die von polymorphen zellulären Proteinen abstammen.
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HLA mismatches versus graft survival
Days after Transplant0 20 40 60 80 100
Prob
abili
ty1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
HLA Mismatch: 3 Loci
HLA Genotypic Match
2 Loci
0 Locus
1 Locus
? HLAeffect
non HLAeffect
HLAeffect
Stammzelltransplantation
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Funktionelle Kriterien für mHags
• Peptide aus polymorphen Regionen endogener Proteine
• werden durch alloreaktive T Zellen erkannt
• verursachen GvH-and GvL-Reaktionen
Strukturelle Kriterien für mHags
• relevante Phänotyp-Frequenzen mit niedrigem Polymorphismus(meist 2 Allele)
• Segregation unabhängig von HLA
• definiertes Expressions-Profil- Zellen von Haut, Leber und/oder Darm GvHD- hämatopoetischen Zellen und/oder Stammzellen GvL Reaktion
Minor Histokompatibilitätsantigene (mHags)
PEPTIDE
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Graft-versus-Leukemia oder Graft-versus-Host Reaktion
GvLGvHD
NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 4 | MAY 2004 | 373
T-cellT-cell
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Allogene Inkompatibilitäten
Minor HistokompatibilitätsAntigene
HLA Klasse IMolekül
Intrazelluläres polymorphes Protein
MHC non-MHC D/R relation Clinical situation Incompatibility
identical identical syngen Identical Twins none
identical different allogen RD, URD minor
different different allogen RD, URD major + minor
D/R relation Donor/Recipient relationRD Related DonorURD Unrelated Donor
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Minor Antigen HLA Restriktion Gen Expression
A1/HY HLA-A1 DFFRY (USP9Y) broadA2/HY HLA-A2 SMCY broadA33/HY HLA-A33 TMSB4Y broadB52/HY HLA-B52 RPS4Y1 restrictedB60/HY HLA-B60 UTY broadB7/HY HLA-B7 SMCY broadB8/HY HLA-B8 UTY restrictedDQ5/HY HLA-DRB1*05 D0X3Y (DBY) broadDRB1*1501/HY HLA-DRB1*1501 D0X3Y (DBY) broadDRB1*0301/HY HLA-DRB1*0301 RPS4Y1 broad
Y-chromosomal kodierte mHags
Minor Histokompatibilitätsantigene
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Autosomal-kodierte Minor Histokompatibilitätsantigene
Minor Antigen HLA Restriktion Gen Expression
HA-1 HLA-A2/B60 HA-1/KIAA*0223 restrictedHA-2 HLA-A2 Myosin 1G restrictedHA-3 HLA-A1 LBC Oncogene broadHA-8 HLA-A2 KIAA0020 broadHB-1 HLA-B44 unknown restrictedACC-1 HLA-A24 BCL2A1 restrictedACC-2 HLA-B44 BCL2A1 restrictedUGT2B17 HLA-A29 UGT2B17 restrictedLRH-1 HLA-B7 P2X5 restricted
Minor Histokompatibilitätsantigene
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Expression in hämatopoetischen Zellen
zwei allelische Varianten des Peptides
HA-1H V-L-H-D-D-L-L-E-A
HA-1R V-L-R-D-D-L-L-E-A Null-Allel
Präsentation durch HLA-A*0201 Moleküle
Erkennung durch alloreaktive CD8+ zytotoxische T Zellen
Mismatching für HA-1H ist assoziert mit dem Auftreten der GvL-Reaktion
Minor Histokompatibilitätsantigen HA-1
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Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitätenin HLA-identischenSpender/Empfängerpaaren
http://www.lumc.nl/5033/dbminor/
Vorhersage von Inkompatibilitäten für Minor Histokompatibilitätsantigene
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http://www.lumc.nl/5033/dbminor/
Spender EmpfängerHA-1H/H = HA-1H/R
keine Reaktion
Spender EmpfängerHA-1H/H HA-1R/R
Host-versus-Graft Reaktion(Transplantatabstoßung)
Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischenSpender/Empfängerpaaren
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Spender Empfänger
HA-1R/R HA-1H/H
Graft-versus-Leukämie Reaktion
http://www.lumc.nl/5033/dbminor/
Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischenSpender/Empfängerpaaren
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Abstoßung Immuntherapie
Balance zwischen GvHD und GvLReaktion
GvLT Zellen gegen
GvL-assozierte mHags
GvHDT Zellen gegen
GvHD-assozierte mHags
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HA-1 and HA-2 specific CTLs are able to induce complete remission in case of relapse
Marijt et al., 2003
■ CD8+/HA-2-specific T cells
♦ CD8+/HA-1-specific T cells
white blood cell count