SRM Shoppers Introduction SRM_SHO_300 SRM Shoppers Introduction.
GPC-光散乱法による 高分子特性解析cama/gakugai/external_MALS/...SRM-706a Rz=27.9nm...
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代表的な高分子の分子量測定法
方法 型 平均分子量 有効な測定分子量範囲
膜浸透圧 絶対法 Mn 104~106
蒸気圧浸透法 絶対法 Mn <105
NMR 絶対法 Mn <105
光散乱 絶対法 Mw 103~5×107
X線小角散乱 絶対法 Mw 102~106
沈降平衡 絶対法 Mw,Mz 102~106
固有粘度 相対法 Mv 102~5×107
GPC 相対法 Mn,Mw,Mz 102~5×106
高分子学会編 新高分子実験学 高分子実験の基礎‐分子特性解析‐(共立出版)より一部抜粋
分子量既知の標準品で較正曲線を作る。 分子量未知の試料を測定する。 作成した較正曲線で 分子量の計算をする。
Elution volume
● ●
● ●
●
●
Elution volume
●
● ●
● ●
●
MW
Elution volume
●
分子量分布測定の手順
GPCに接続可能な光散乱検出器 多角度光散乱検出器(Wyatt Technology社製) 18角度、8角度、3角度検出器がある。オプションで粘度検出器も追加可能
2角度式光散乱検出器(Precision Detectors社製) 90°と15°の2角度検出器
トリプル検出器(Viscotek社製) 90°+15°光散乱検出器、粘度検出器、RI検出器の組み合わせ
低角度光散乱検出器;LALLS(東ソー製他) 低角度1点の検出器、現在は販売されていない。
フロー式動的光散乱測定器(Malvern社製他) 粒子径測定のみで、分子量は測定できない
濃度→0、測定角度→0の外挿点で
散乱強度 ∝(濃度) (分子量) (dn/dc)2
静的光散乱測定(分子量)
重い粒子も軽い粒子も同じ波長で振動する 溶液中では分極率は屈折率増分(dn/dc)の2乗に比例
scattered lightincident beam
静的光散乱測定(分子量)
分子量1万×10個 濃度1mg/mL 散乱強度
分子量2万×5個 濃度1mg/mL 散乱強度
濃度検出器は応答量変わらない
分子量10万×1個 濃度1mg/mL 散乱強度
濃度検出器は応答量変わらない
蛋白質が会合するとした場合のシュミレーション (dn/dcが変化しないと仮定する)
モノマー
ダイマー
会合体
1V
10V
2V
静的光散乱法理論式
( ) ( )cA
MPRcK
221+=
∗
θθ
( ) McA
RcK 120 2 +=∗K :光学定数=4π2(dn/dc)2 n0
2/Naλ04
n0 :溶媒の屈折率、Na:アボガドロ数 λ0:真空中の入射光の波長
R(θ) :過剰還元散乱強度 C :試料濃度 M :重量平均分子量 A2 :第二ビリアル係数 P(θ) :分子内干渉因子 P(θ)-1=1+1/3k2<S2>+O(k4) k=(4π/(λ0/n0))sinθ/2
角度を0°に近似すると・・・ P(0°) → 1
( ) Mr
Mn
RcK
g1
2sin
316 22
20
20
2
+⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛=∗ θ
λπ
θ
濃度を0に近似すると・・・C→0
A2 from initial slope !
rms radius from initial slope!
Zimm plot: ( )kc
RcK
+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
∗
2sin vs.Plot 2 θ
θ
Zero angle: Zero concentration:
( ) McA
RcK 120 2 +=∗
( ) Mr
Mn
RcK
g1
2sin
316 22
20
20
2
+⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛=∗ θ
λπ
θ
GPC-MALS測定では、 光散乱測定時には非常に希薄濃度状態を検出している。
散乱強度の測定角度変化∝分子サイズ (RMS半径=慣性回転半径=Rg)
ポリスチレンMw=8,000,000g/mol 15角度測定例
青点=散乱強度の逆数
初期勾配∝Rg
Y軸切片=1/Mw
MALS測定実測例
MALSのデータ取り込み
・ 全検出器同時に1~8 ポイント / secで取り込み ・ 各スライス毎、分子量(Mw)RMS半径(Rg)測定
3D Plot - stdpst7s
17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3
スライスデータ
溶出容量 測定角度
高角度
低角度
散乱強度
・スライスデータ例 Ve:12.342(mL) Mw:7.3E+6 (g/mol) Rg:165.5 (nm)
・ MALS 3Dプロット 736スライス 測定角度 23°~ 147° 全15角度
SEC-MALS
dn/dcとは…
① 溶媒
② 試料
③ 温度
④ 波長
C=2 C=1 C=0
試料濃度による屈折率の増分
一定の条件下では変化しない物理量
Mw>2000では分子量にほとんど依存しない
空気
溶媒
光
入射光の角度が濃度に比例する
屈折率増分(dn/dc)
dn/dc値の測定方法
専用の示差屈折率計を使用する。 (最適な測定法)
GPCカラムからのサンプル回収率を100%と仮定し、dn/dc既知の物質を用いて校正したRI検出器より得られたピーク面積値とサンプル注入量からdn/dc値を見積もる。 (簡易的に求める方法ではあるが、様々な問題点あり)
示差屈折率検出器 Optilab rEX
機能 dn/dc測定が可能 絶対屈折率測定が可能 HPLC用RI検出器として使用可能
特長 光源波長の選択が可能(LED交換) (633、658、690nm etc.) 温調範囲;4~50℃ ワイドダイナミックレンジ
第 5 回 M A L S 研 究 会 談 話 会
0 5 10 15 20-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Time (minutes)
Adj
uste
d O
utpu
t (vo
lts)
Set Concentrations
C=0.05%
C=0.10% C=0.15%
C=0.20% C=0.25%
測定時間
OPT
ILA
B 信号強度
dn/dc測定 実際例 Pullulan48K in 50mM NaNO3
dn/dc測定 実際例 Pullulan48K in 50mM NaNO3
0.00
-41.00x10
-42.00x10
-43.00x10
-44.00x10
dn
dn/dc Curve
0.0 5.0x10-4 1.0x10-3 1.5x10-3 2.0x10-3 2.5x10-3
Concentration (g/mL)
-11.30x10
-11.35x10
-11.40x10
-11.45x10
-11.50x10
-11.55x10
dn/c
(mL/
g)
Known Calibration constant (1/volts): 1.1888e-03dn/dc (mL/g) : 0.1425 ± 0.0002
試料濃度 (g/mL)
dn/
dc (m
L/g
) n
各種ポリスチレンの測定 サンプル
1.National Institute of Standards and Technology;NIST(米国)多分散ポリスチレン標準 SRM-706a Mw=285,000(保証値)
2. Polymer Standard Service社(ドイツ) ポリスチレン標準 8-star, Mn=45,500 one arm
GPC-MALS測定条件 カラム :Shodex GPC KF-806L(昭和電工製) 溶離液 :トルエン
流速 :1.0mL/min 光散乱 :DAWN HELEOS(Wyatt Technology社製) RI検出器 :Optilab rEX(Wyatt Technology社製)
分子量vs.溶出時間
測定値 SRM706a Mw=2.896×105
8-Star Mw=3.854×105
SRM706a 8-Star
参考値 SRM706a Mw=2.85×105
8-Star* Mw=3.64×105
8-StarのMw値は、Mn=45,500(one arm)×8 とした計算値
SRM706a GPC測定
mV
Log M
minutes6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
0.0
0.5
1.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
1
測定結果 Mn=103,015 Mw=292,369
較正曲線作成に使用したPS標準(8点) Mw= 3,053,000
956,000 483,000 189,300
60,450 30,300 10,050
3,790
保証値 Mw=285,000
8-StarポリスチレンのGPC測定
mV
Log M
minutes6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
1
測定値 Mn=187,511 Mw=254,115
較正曲線作成に使用したPS標準(8点) Mw= 3,053,000
956,000 483,000 189,300
60,450 30,300 10,050
3,790
参考値 M=364,000
( )4 / 2sp P IP Pη = Δ − Δ
粘度検出器測定原理
• 4 Capillary Bridge
0/ 1spη η η= −
0[ ] lim /spc
cη η→
= 固有粘度[η]
比粘度ηsp
·Rod-like polymer → > 1.0
·Random coil polymer → 0.5 – 0.7
[η] = KM α
log [η] = logK + α log M
·Spherical molecule → < 0.5
Mark-Houwink-Sakurada equation
北海道大学 工学研究科 生物機能高分子専攻 佐藤敏文准教授よりご提供
Figure. Mark-Houwink plots in DMF at 25 oC of �����poly-1 (hyperbranched) and poly-3(linear).
Satoh, T. Kakuchi, T. et al�Macromolecules, 40(26), 9313-9321(2007)
Z�
Mark-Houwink-Sakurada plots
北海道大学 工学研究科 生物機能高分子専攻 佐藤敏文准教授よりご提供