GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS LEMESZENSKI - USP · 2013-06-06 · GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Química
GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS LEMESZENSKI
Protoflavonoides e meroterpenos de
espécies de Piper
Versão corrigida da tese defendida conforme resolução CoPGr 5890 O original se encontra disponível na Secretaria de Pós-Graduação do IQ-USP
São Paulo
Data de depósito na SPG
04/06/2013
GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS LEMESZENSKI
Protoflavonoides e meroterpenos de
espécies de Piper
Tese apresentada ao Instituto de Química
da Universidade de São Paulo para obtenção
do Título de Doutor em Química
Orientador: Prof. Dr. Massuo Jorge Kato
São Paulo
2013
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Divisão de Biblioteca e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Lemeszenski , Giovana Cássia de Frei tas
L552p Pro tof lavonoides e mero terpenos de espéc ies de Piper /
Giovana Cáss ia de Fre i tas Lemeszenski . -- São Paulo , 201 3 .
203p.
Tese (doutorado ) – Inst i tuto de Química da Universidade de
São Paulo. Departamento de Química Fundamental .
Orientador: Kato, Massuo Jorge
1 . Produtos naturais 2. Quimiometr ia I . T . I I . Kato, Massuo
Jorge , or ientador .
547.7 CDD
Giovana Cássia de Freitas Lemeszenski
Protoflavonoides e meroterpenos de espécies de Piper
Tese apresentada ao Instituto de Química
da Universidade de São Paulo para obtenção
do Título de Doutor em Química
Aprovado em 05 de abril de 2013.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Massuo Jorge Kato
Instituição: Instituto de Química – USP
Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira
Instituição: Universidade Federal de São Carlos
Prof. Dr. Frederico Guaré Cruz
Instituição: Universidade Federal da Bahia
Prof. Dr. Angelo Cunha Pinto
Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof. Dr. Reinaldo Carmino Bazito
Instituição: Instituto de Química – USP
A Deus.
Aos meus pais Cleide e Luis Carlos.
Aos meus irmãos André e Mônica.
Ao meu esposo Daniel.
Com amor e gratidão por estarem sempre ao meu lado.
AGRADECIMENTOS
À Universidade de São Paulo e ao Instituto de Química pela oportunidade em
realizar este trabalho de pesquisa.
Ao Prof. Dr. Massuo Jorge Kato, pela orientação, compreensão,
ensinamentos e pelos conselhos no decorrer destes seis anos de trabalho.
À FAPESP e ao CNPq pelas bolsas concedidas e pelo apoio financeiro.
Aos funcionários da SPG do IQ-USP pela atenção e apoio.
Ao Gilberto Franchi e à Profa. Maria Claudia Max Young pelos ensaios
realizados.
Ao Dr. João Marcos Batista Junior (Instituto de Química – UNESP) pela
colaboração nos cálculos de DFT.
Ao Prof. Dr. Marcus Tullius Scotti (UFPB) e Msc. Harold Hilarion Fokoue
(LQPN-IQUSP) pela colaboração nos cálculos de quimiometria.
À Profa. Dra. Elsie F. Guimarães (Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do
Rio de Janeiro) pela identificação das espécies vegetais.
Ao Dr. Frederico Drumont Martins, Chefe da Floresta Nacional de Carajás
(ICMBio – MMA) e a Cia Vale pela colaboração nas coletas das plantas.
Aos amigos e colegas do LQPN: Adalberto, Alberto, Aline, Anderson,
Augusto, Camila, Celso, Cristina, Edgard, Erica, Fábio Chaves, Fábio Rodrigues,
Graça, Harold, Homero, Juliana, Joca, Joaquim Matheus, Karina, Lucas, Lydia,
Marcilio, Mariana, Mauro, Nidia, Renata, Vitor Bueno, Vitor Ferraz e Yasmin.
Aos amigos e colegas do IQ: Viviane, Tati, Claudinei, Denise, Georgia, Lya,
Luciana, Emerson e Fernanda, pela amizade.
Aos colegas da Central Analítica, pelas análises realizadas, pelo apoio e
amizade: Alessandra, Alfredo, Cristiane, Denize, Emerson, Fernando, Janaína,
Luzia, Márcio Nardelli, Márcio Santos, Margarida, Michele, Miriam, Nanci e Rebeca.
À minha família, principalmente por compreender minha ausência e me apoiar
no decorrer deste trajeto.
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho.
“Cada planta tem centenas de substâncias
e uma delas pode ser mais importante do que uma galáxia.”
(Otto R. Gottlieb)
RESUMO
Freitas Lemeszenski, G.C. Protoflavonoides e meroterpenos de espécies de Piper. 2013. 203p. Tese. Programa de Pós-Graduação em Química. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
As espécies da família Piperaceae, Piper bowiei, P. caldense, P.
carniconnectivum e P. permucronatum apresentam uma característica morfológica
em comum que são os frutos pendentes e globosos. Seus extratos brutos foram
submetidos às análises de espectrometria de massas e ressonância magnética
nuclear e os espectros obtidos submetidos às análises quimiométricas por PCA
(análise de componentes principais) e HCA (análise por agrupamento hierárquico) a
fim de obter uma diferenciação entre as espécies ou observar suas possíveis
similaridades. Os resultados obtidos em uma análise preliminar estimularam-nos a
realizar o estudo fitoquímico em busca de seus constituintes majoritários. Foram
isoladas e identificadas treze substâncias, sendo quatro meroterpenos e nove
flavonoides, dos quais seis são descritos pela primeira vez. Ensaios de atividade
antifúngica e antitumoral foram realizados levando em consideração relatos da
literatura de substâncias com estruturas similares.
Palavras Chave: Piperaceae, Piper, protoflavonoides, meroterpenos, metabolôma.
ABSTRACT
Freitas Lemeszenski, G.C. Protoflavonoids and meroterpenes from Piper species. 2013 203p. PhD Thesis. Graduate Program in Chemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
The Piperaceae species Piper bowiei, P. caldense, P. carniconnectivum and
P. permucronatum have pendant fruits as a common morphological characteristic.
Thus, their extracts were analyzed by mass spectrometry and nuclear magnetic
resonance and submitted to chemometric analysis by PCA (principal component
analysis) and HCA (hierarchical cluster analysis) in order to get a differentiation
between species and to observe their possible similarities. Based on the results
obtained in a preliminary analysis the phytochemical studies were carried out on their
crude extracts in order to identify their major constituents. The study allowed the
identification of thirteen compounds, being four meroterpenes and nine flavonoids,
six of which were described for the first time. Biological activity assays were
performed taking into account the potential activities reported for similar compounds.
Keywords: Piperaceae, Piper, protoflavonoids, meroterpenes, metabolome.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição geográfica das espécies de Piper (Jaramillo; Manos, 2001). . 22
Figura 2. Estrutura da aristolactama caldensina. ...................................................... 24
Figura 3. Imagens da planta P. caldense. ................................................................ 24
Figura 4. Imagem da planta P. carniconnectivum. .................................................... 26
Figura 5. Metabólitos isolados das raízes de Piper carniconnectivum. .................... 26
Figura 6. Estrutura da protoapigenona (55). ............................................................. 35
Figura 7. Efeito dos substituintes na atividade antitumoral das protoflavonas (Lin; Nakagawa-Goto; et al., 2007). ................................................................................... 35
Figura 8. Processamento da matriz por PCA resultando nos gráficos de scores e loadings. .................................................................................................................... 42
Figura 9. Processamento da matriz por HCA resultando no dendrograma. ............. 43
Figura 10. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. caldense (K842-FA). .............................................................................. 50
Figura 11. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. caldense (K-842 FA, CDCl3, 500 MHz). ......................................................................................... 51
Figura 12. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364FA). .................................................................................. 52
Figura 13. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364 FA, CDCl3, 200 MHz). ................................................................................................ 52
Figura 14. Cromatograma obtido por CLAE de K-1022 FA. ..................................... 54
Figura 15. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1022 FA (500 MHz, CDCl3). ......... 54
Figura 16. Cromatograma CLAE de K-1441 FA. ...................................................... 55
Figura 17. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FA (500 MHz, CDCl3). ..................... 56
Figura 18. Cromatograma CLAE de K-1441 FrA. ..................................................... 57
Figura 19. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FrA (500 MHz, CDCl3). .................... 57
Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE de K-1600 FC. ..................................... 58
Figura 21. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1600 FC (500 MHz, CDCl3) .......... 59
Figura 22. Reação de metilação das substâncias 12 e 13. ...................................... 60
Figura 23. Reação de acetilação da substância 12. ................................................. 61
Figura 24. Reação de hidrogenação catalítica das substâncias 8 e 12. ................... 62
Figura 25. Diagrama ilustrativo da bioautografia dos extratos brutos. ...................... 63
Figura 26. Diagrama ilustrativo da bioautografia das substâncias puras. ................. 64
Figura 27. Gráfico de scores de (PC1 v PC2) com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância). ................................................... 72
Figura 28. Gráfico de loadings com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância). ...................................................................... 73
Figura 29. Estruturas das substâncias 1 e 2............................................................. 77
Figura 30. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 1 e b) 2. ............................ 77
Figura 31. Espectro de RMN de 1H de 1 (200 MHz, CDCl3). .................................... 78
Figura 32. Espectro de RMN de 13C de 1 (50 MHz, CDCl3)...................................... 79
Figura 33. Espectro de RMN de 1H de 2 (500 MHz, Acetona –d6). .......................... 80
Figura 34. Estruturas das substâncias 3, 4 e 5. ........................................................ 82
Figura 35. Estrutura da substância 3. ....................................................................... 82
Figura 36. Espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF) da substância 3. ....... 83
Figura 37. Espectro de RMN de 1H de 3 (Acetona-d6, 500 MHz). ........................... 83
Figura 38. Estrutura da substância 4. ....................................................................... 84
Figura 39. Espectro de massas de alta resolução de 4 (ESI-TOF). ......................... 85
Figura 40. Espectro de RMN de 1H de 4 (500 MHz, CDCl3). .................................... 85
Figura 41. Correlações HMBC selecionadas de 4. ................................................... 86
Figura 42. Estrutura da substância 5. ....................................................................... 87
Figura 43. Espectro de massas de alta resolução da substância 5 (ESI-TOF). ....... 87
Figura 44. Espectro de RMN de 1H de 5 (500 MHz, Acetona-d6). ........................... 88
Figura 45. Estruturas das substâncias 6 e 7............................................................. 90
Figura 46. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 6 e b) 7. ............................ 90
Figura 47. Estrutura da substância 6. ....................................................................... 91
Figura 48. Espectro de RMN de 1H de 6 (CDCl3, 300 MHz). .................................... 92
Figura 49. Estrutura da substância 7. ....................................................................... 93
Figura 50. Espectro de RMN de 1H de 7 (Acetona-d6, 300 MHz). ........................... 93
Figura 51. Estruturas das substâncias 8 e 9............................................................. 95
Figura 52. Estrutura da substância 8. ....................................................................... 95
Figura 53. Espectro de massas de alta resolução (HR-ESI-TOF) da substância 8. . 96
Figura 54. Espectro de absorção na região do infravermelho de 8 (KBr). ................ 96
Figura 55. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3). .................................... 97
Figura 56. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação de 7,2 a 3,5 ppm). ......................................................................................................................... 98
Figura 57. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação 3,17 a 2,60 e de 2,60 a 2,00 ppm). .............................................................................................. 98
Figura 58. Principais correlações HMBC observadas nos anéis B e C de 8. ........... 99
Figura 59. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3).................................. 100
Figura 60. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3) (ampliação de 210 a 120 ppm e de 105 a 30 ppm). ........................................................................................ 100
Figura 61. Correlações NOE (----) e HMBC ( ____) observadas no anel A de 8. ...... 101
Figura 62. Mapa de contorno HMBC de 8 (ampliação nas regiões de 13,5 a 3,0
ppm em F2 e de 80,0 a 220,0 ppm em F1). ......................................................... 101
Figura 63. Mapa de contorno do experimento 2D NOESY de 8 (ampliação na região de 7,5 a 3,5 ppm em F1 e F2). ................................................................................ 102
Figura 64. Estrutura da substância 8. ..................................................................... 102
Figura 65. Estrutura da substância 9. ..................................................................... 103
Figura 66. Espectro de massas de alta resolução de 9 (ESI-TOF). ....................... 104
Figura 67. Espectro de absorção na região do Infravermelhor de 9 (KBr). ............ 104
Figura 68. Espectro de RMN de 1H de 9 (DMSO-d6, 500 MHz). ............................ 105
Figura 69. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 6,5 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz). ................................................................................................................ 106
Figura 70. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 3,2 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz). ................................................................................................................ 106
Figura 71. Espectro de RMN de 13C de 9 (DMSO-d6, 125 MHz)............................ 107
Figura 72. Principais correlações NOE (----) e HMBC (____) observadas para 9. .... 108
Figura 73. Mapa de contorno HSQC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz). .......................... 108
Figura 74. Mapa de contorno HMBC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz) ........................... 109
Figura 75. Mapa de contorno COSY de 9 (DMSO-d6, 500 MHz). .......................... 109
Figura 76. Estrutura da substância 9. ..................................................................... 110
Figura 77. Estrutura da substância 8 com estereoquímica definida. ...................... 111
Figura 78. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S)-8; b) Espectro DC experimental obtido para 8; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R)-8. ....................................... 112
Figura 79. Estrutura da substância 9 com estereoquímica definida. ...................... 113
Figura 80. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S,2’S)-9; b) Espectro DC experimental obtido para 9; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R,2’R)-9. ........... 113
Figura 81. Estrutura da substância 8a. ................................................................... 114
Figura 82. Espectro de massas de alta resolução de 8a (ESI-TOF). ..................... 114
Figura 83. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) da substância 8a. .............. 115
Figura 84. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 8a (500 MHz, CDCl3) na região de 3,1 a 1,7 ppm. .................................................................................................... 116
Figura 85. Espectro de RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) da substância 8a. ............ 116
Figura 86. Estruturas das substâncias 10 e 11. ...................................................... 118
Figura 87. Estrutura da substância 10. ................................................................... 118
Figura 88. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 10. ........... 119
Figura 89. Espectro de RMN de 1H de 10 (CDCl3, 500 MHz). ................................ 120
Figura 90. Espectro de RMN de 13C de 10 (CDCl3, 125 MHz). ............................... 121
Figura 91. Estrutura da substância 11. ................................................................... 121
Figura 92. Espectro de massas de alta resolução de 11 (ESI-TOF). ..................... 122
Figura 93. Espectro de RMN de 1H de 11 (MeOD, 500 MHz). ............................... 123
Figura 94. Espectro de RMN de 13C de 11 (MeOD, 125 MHz) ............................... 123
Figura 95. Estruturas das substâncias 12 e 13. ...................................................... 125
Figura 96. Estrutura da substância 12. ................................................................... 125
Figura 97. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 12. ........... 126
Figura 98. Espectro de absorção na região do infravermelho de 12. ..................... 126
Figura 99. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD). ............................... 128
Figura 100. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD), ampliação de 5,38 a 5,05 ppm e de 1,76 a 1,53 ppm. .............................................................................. 128
Figura 101. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD). ............................ 129
Figura 102. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação de 42 a 15 ppm e de 175 a 113 ppm.................................................................................... 130
Figura 103. Mapa de contorno de HSQC de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação 8,0 a 1,2 ppm em F1 e de 160,0 a 0,0 ppm em F2. ......................................................... 130
Figura 104. Correlações HMBC selecionadas para a substância 12. ..................... 131
Figura 105. Ampliação do mapa de contorno HMBC de 12 (de 4,85 a 7,70 ppm em
F1 e de 10,0 a 190,0 ppm em F2) ........................................................................ 132
Figura 106. Ampliação do mapa de contorno HMBC de 12 (de 3,50 a 1,40 ppm em
F1 e de 10,0 a 180,0 ppm em F2). ....................................................................... 132
Figura 107. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 12 (500 MHz, MeOD). ................. 133
Figura 108. Correlações NOE observadas para 12. ............................................... 134
Figura 109. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 12 (500 MHz, MeOD). .............. 134
Figura 110. Estrutura da substância 13. ................................................................. 135
Figura 111. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 13. ......... 135
Figura 112. Espectro de RMN de 1H de 13 (500 MHz, CDCl3). .............................. 136
Figura 113. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3). ............................. 137
Figura 114. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3) (Ampliação).......... 137
Figura 115. Correlações NOE observadas para 13. ............................................... 138
Figura 116. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 13 (500 MHz, MeOD). .................. 139
Figura 117. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 13 (500 MHz, MeOD). ............... 139
Figura 118. Estruturas das substâncias 12a, 12b, 12c e 13a. ............................... 141
Figura 119. Espectro de massas de alta resolução (ESI+) de a) 12a; b) 12b; c) 12c. ................................................................................................................................ 142
Figura 120. Estrutura do derivado 12a. .................................................................. 142
Figura 121. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3). ............................ 143
Figura 122. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3) ampliação de 4,2 a 1,4 ppm. .................................................................................................................. 143
Figura 123. Espectro de RMN de 13C de 12a (125 MHz, CDCl3) ampliação de 171 a 108 ppm e de 62 a 9 ppm. ...................................................................................... 144
Figura 124. Estrutura do derivado 12b. .................................................................. 146
Figura 125. Espectro de RMN de 1H de 12b (MeOD, 300 MHz). ........................... 146
Figura 126. Espectro de RMN de 13C de 12b (MeOD, 75 MHz). ............................ 147
Figura 127. Estrutura do derivado 12c. .................................................................. 149
Figura 128. Espectro de RMN de 1H de 12c (MeOD, 400 MHz) ............................ 149
Figura 129. Espectro de RMN de 13C de 12c (125 MHz, MeOD). .......................... 150
Figura 130. Espectro de RMN de 13C/DEPT 135º de 12c (125 MHz, MeOD). ....... 151
Figura 131. Estrutura do derivado 13a. .................................................................. 152
Figura 132. Espectro de RMN de 1H de 13a (CDCl3, 500 MHz) ............................. 152
Figura 133. Espectro de RMN de 13C de 13a (CDCl3, 125 MHz) ............................ 153
Figura 134. Placas de CCDA reveladas com UV (=254 nm), esporos de C. cladosporioides e C. sphaerospermum. .................................................................. 157
Figura 135. Estrutura da substância protoapigenona. ............................................ 158
Figura 136. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (5, 6 e 8) e controles positivos (Gleevec e vincristina) .............................................................. 159
Figura 137. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (8, 8a e 9) ................................................................................................................................ 160
Figura 138. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper. .......................... 164
Figura 139. Gráfico de loadings (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper. ............................................ 164
Figura 140. Cromatogramas CLAE-UV de alguns extratos. ................................... 166
Figura 141. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM, dos extratos de espécies de Piper. ................................................... 167
Figura 142. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM dos extratos de espécies de Piper. ................................................................... 168
Figura 143. Gráfico de HCA para análise de CLAE-EM. ........................................ 169
Figura 144. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (66% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper. ................................... 171
Figura 145. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3) dos extratos de espécies de Piper. ....................................................... 171
Figura 146. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper. ................................... 172
Figura 147. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.......................... 173
Figura 148. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase orgânica. ........... 174
Figura 149. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper. ....................................... 175
Figura 150. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper. ............................. 175
Figura 151. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase hidroalcoólica. .. 176
Figura 152. Biossíntese de meroterpenos e flavonóides em espécies de Piper..... 179
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continua). ............ 29
Tabela 2. Protoflavonoides de ocorrência natural (continua). ................................... 36
Tabela 3. Gradiente de eluição realizado na CLAE. ................................................. 47
Tabela 4. Local de coleta das espécies estudadas. .................................................. 49
Tabela 5. Extratos preparados para estudo fitoquímico. ........................................... 50
Tabela 6. Linhagens de células leucêmicas testadas. .............................................. 64
Tabela 7. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM – infusão direta. ..................... 66
Tabela 8. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H. ..................... 67
Tabela 9. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM- Infusão direta. ....................... 71
Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P.
permucronatum e P. carniconnectivum (continua). ................................................... 74
Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C de 1 e RMN de 1H de 2. .............................. 81
Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C de 3, 4 e 5 (500 e 125 MHz). ...................... 89
Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C de 6 e 7 (300 e 75 MHz). ............................ 94
Tabela 14. Dados de RMN de 1H e13C de 8 (500 e 125 MHz, DMSO-d6). ............ 103
Tabela 15. Dados de RMN de 1H e13C de 9 (500 e 125 MHz, DMSO-d6). ............ 110
Tabela 16. Dados de RMN de 1H e 13C de 8a (500 e 125 MHz, CDCl3). ................ 117
Tabela 17. Dados de RMN de 1H e 13C de 10 e 11 (500 e 125 MHz). .................... 124
Tabela 18. Dados de RMN de 1H e 13C de 12 e 13 (500 e 125 MHz). .................... 139
Tabela 19. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a
substância 12a. ....................................................................................................... 145
Tabela 20. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 300 e 75 MHz) obtidos para a
substância 12b. ....................................................................................................... 148
Tabela 21. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 500 e 125 MHz) de 12c. .............. 151
Tabela 22. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a
substância 13a. ....................................................................................................... 154
Tabela 23. Atividade antifúngica contra C. cladosporioides e C. sphaerospermum.
................................................................................................................................ 156
Tabela 24. Citotoxidade de 5, 6 e 8 para as linhagens de células leucêmicas K-562 e
NALM-6. .................................................................................................................. 159
Tabela 25. Citotoxidade de 8, 8a e 9 para as doze linhagens de células leucêmicas
avaliadas. ................................................................................................................ 160
Tabela 26. Espécies de Piper analisadas por PCA. ................................................ 162
Tabela 27. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H. ................. 165
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APCI Ionização química à pressão atmosférica
CC Cromatografia em coluna
CL Cromatografia líquida
CLV Cromatografia líquida à vácuo
CCDA Cromatografia em camada delgada analítica
CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa
CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
COSY Correlation Spectroscopy
DC Dicroismo circular
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
EM Espectrometria de massas
EM-ESI Espectrometria de massas com ionização por electrospray
EM-IE Espectrometria de massas com ionização por elétrons
ESI Ionização por electrospray
FDA Food and Drug Administration
HCA Hierarchical cluster analysis (Análise por agrupamento hierárquico)
IE Ionização por elétrons
TDDFT Time-dependent density functional theory
HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation
HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento
m/z Relação massa carga
NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy
PC Principal component (Componente principal)
PCA Principal components analysis (Análise de componentes principais)
RMN de 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
TOF Time of flight (Tempo de voo)
tR Tempo de retenção
deslocamento químico em ppm
s simpleto
sl simpleto largo
d dupleto
dd duplo dupleto
ddd duplo duplo dupleto
dddd duplo duplo duplo dupleto
dt duplo tripleto
dl dupleto largo
t tripleto
td triplo dupleto
tsep triplo septupleto
m multipleto
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 22
1.1 FAMÍLIA PIPERACEAE ................................................................................................. 22
1.1.1 Piper caldense .................................................................................................. 23
1.1.2 Piper bowiei ...................................................................................................... 25
1.1.3 Piper permucronatum ....................................................................................... 25
1.1.4 Piper carniconnectivum .................................................................................... 25
1.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM PIPER ....................................................................... 27
1.2.1 Meroterpenos ................................................................................................... 27
1.2.2 Protoflavonoides ............................................................................................... 34
1.3 ANÁLISES METABOLÔMICAS DE PLANTAS ..................................................................... 38
1.3.1 Preparo da amostra .......................................................................................... 38
1.3.2 Aquisição de dados .......................................................................................... 39
1.3.3 Quimiometria .................................................................................................... 41
Análise exploratória .................................................................................................. 41
Padrão de reconhecimento não supervisionado ....................................................... 42
2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 44
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 45
3.1 ESPECIFICAÇÕES DE MATERIAIS, INSTRUMENTOS E TÉCNICAS UTILIZADAS ..................... 45
3.1.1 Solventes utilizados em cromatografia ............................................................. 45
3.1.2 Cromatografia líquida ....................................................................................... 45
3.1.3 Cromatografia em camada delgada analítica e preparativa .............................. 46
3.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência ............................................................ 46
3.1.5 Espectrometria de Massas ............................................................................... 47
3.1.6 Ressonância Magnética Nuclear ...................................................................... 47
3.1.7 Espectrofotometria de absorção na região do UV-Vis....................................... 47
3.1.8 Espectroscopia na região do Infravermelho ...................................................... 48
3.1.9 Polarímetro ....................................................................................................... 48
3.1.10 Espectropolarímetro ..................................................................................... 48
3.2 MATERIAL VEGETAL ................................................................................................... 48
3.3 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ....................................... 49
3.3.1 Preparo dos extratos brutos.............................................................................. 49
3.3.2 Metabólitos de Piper caldense .......................................................................... 50
3.3.3 Metabólitos de Piper bowiei .............................................................................. 52
3.3.4 Metabólitos de Piper permucronatum ............................................................... 53
3.3.5 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1441) ................................................... 55
3.3.6 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1600) ................................................... 58
3.4 OBTENÇÃO DE DERIVADOS ......................................................................................... 59
3.4.1 Reação de metilação ........................................................................................ 60
Preparação do diazometano .................................................................................... 60
Metilação .................................................................................................................. 60
3.4.2 Reação de acetilação ....................................................................................... 61
3.4.3 Hidrogenação catalítica .................................................................................... 61
3.5 ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA .............................................................................. 62
3.5.1 Atividade antifúngica ........................................................................................ 62
3.5.2 Atividade antitumoral ........................................................................................ 64
3.6 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA) ........................................................... 65
3.6.1 Preparo dos extratos ........................................................................................ 66
Extratos para injeção direta ...................................................................................... 66
Preparo dos extratos para CLAE-EM e RMN de 1H .................................................. 67
3.6.2 Obtenção de dados .......................................................................................... 68
Análise por ESI-EM (Injeção direta) ......................................................................... 68
Análise por CLAE-EM .............................................................................................. 68
Análise por RMN de 1H ............................................................................................ 69
3.6.3 Processamento dos dados ............................................................................... 70
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 71
4.1 ANÁLISE DOS COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA) DOS EXTRATOS ................................... 71
4.2 SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS ................................................................... 74
4.3 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DO CROMENOS 1 E 2 ....................................................... 77
4.4 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DAS FLAVONAS 3, 4 E 5 ................................................... 82
Substância 3 ............................................................................................................ 82
Substância 4 ............................................................................................................ 84
Substância 5 ............................................................................................................ 86
4.5 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DAS FLAVANONAS 6 E 7 ................................................... 90
Substância 6 ............................................................................................................ 91
Substância 7 ............................................................................................................ 92
4.6 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS 8, 9 E 8A ............................................ 95
Substância 8 ............................................................................................................ 95
Substância 9 .......................................................................................................... 103
Configuração absoluta de 8 e 9 .............................................................................. 111
Substância 8a ........................................................................................................ 114
4.7 IDENTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS 10 E 11 ................................................................ 118
Substância 10 ........................................................................................................ 118
Substância 11 ........................................................................................................ 121
4.8 IDENTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS 12, 13 E DERIVADOS ............................................. 125
Substância 12 ........................................................................................................ 125
Substância 13 ........................................................................................................ 135
Substâncias 12a, 12b e 12c e 13a ......................................................................... 141
4.9 ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA ............................................................................ 155
4.9.1 Avaliação da atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum. ............................................................................... 155
4.9.2 Atividade antitumoral ...................................................................................... 158
4.10 ANÁLISES QUIMIOMÉTRICAS .................................................................................. 162
4.10.1 Espectrometria de massas com injeção direta ............................................ 163
4.10.2 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas 165
4.10.3 Ressonância magnética nuclear da fase orgânica ...................................... 169
4.10.4 Ressonância magnética nuclear da fase hidroalcoólica .............................. 174
4.11 VIAS BIOSSINTÉTICAS ENVOLVIDAS NA FORMAÇÃO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
IDENTIFICADOS ................................................................................................................ 178
5. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 180
6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 182
APÊNDICE A –ESPECTROS DE MASSAS POR INJEÇÃO DIRETA DOS EXTRATOS ANALISADOS POR PCA .................................................................................................. 189
APÊNDICE B - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS EXTRATOS ANALISADOS POR PCA (FASE ORGÂNICA) .......................................................................................................... 191
APÊNDICE C - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS EXTRATOS ANALISADOS POR PCA (FASE HIDRO ALCOÓLICA) ............................................................................................ 192
SUMULA CURRICULAR ................................................................................................... 193
ANEXO A - CÁLCULOS DE DFT DAS SUBSTÂNCIAS 8 E 9 .......................................... 197
Introdução 22
1. INTRODUÇÃO
1.1 Família Piperaceae
A família Piperaceae, uma das mais primitivas famílias entre as
Angiospermas, pertence à ordem Piperales e é constituída por cinco gêneros, sendo
os mais representativos Piper e Peperomia com cerca de 2000 e 1700 espécies,
respectivamente (Jaramillo; Manos, 2001). As espécies de Peperomia são em sua
maioria de pequeno porte, suculentas e muitas vezes epífitas, enquanto que
espécies de Piper são geralmente arbustos ou pequenas árvores. A maior
diversidade de espécies de Piper encontra-se na região neotropical, com cerca de
dois terços das espécies descritas (Figura 1) (Dyer; Dodson; Richards, 2004;
Jaramillo; Manos, 2001; Quijano-Abril; Callejas-Posada; Miranda-Esquivel, 2006).
Figura 1. Distribuição geográfica das espécies de Piper (Jaramillo; Manos, 2001).
Essa é uma família bastante comum nas formações florestais brasileiras,
particularmente na Mata Atlântica, onde espécies do gênero Piper são pequenos
arbustos ou árvores sub-lenhosas, comuns no sub-bosque, sendo facilmente
reconhecidos mesmo em estado vegetativo pela presença de caules articulados com
nós foliares geniculados e folhas simples e alternadas. As inflorescências são
Introdução 23
particularmente distintas contendo de dezenas a milhares de minúsculas flores em
frutos verticais ou pendentes (Dyer; Dodson; Richards, 2004; Souza, 2005).
Poucas espécies possuem importância econômica, com exceção de Piper
nigrum, que é a fonte da pimenta do reino, uma das pimentas mais utilizadas no
mundo e das raízes de P. methysticum, fonte de Kava ou chá de cava-cava, que são
utilizadas como ansiolítico (Dyer; Dodson; Richards, 2004).
Estudos fitoquímicos de espécies do gênero Piper, realizados com cerca de
15 % das espécies, levaram à descoberta de muitos metabólitos secundários,
principalmente alcalóides, amidas, lignanas, neolignanas, terpenos, derivados de
ácidos benzoicos e flavonóides, com um alto potencial de bioatividade (Dyer;
Dodson; Richards, 2004; Parmar et al., 1997; Scott et al., 2008; Sengupta; Ray,
1987).
Espécies de Piper presentes nas regiões tropicais e subtropicais têm sido
amplamente investigadas devido às inúmeras substâncias biologicamente ativas
nelas presentes, o que justifica seu amplo uso na medicina popular como remédios
para dores no estômago, agentes anti-inflamatórios, antipiréticos, contra asma, e até
como repelentes de insetos (Leite et al., 2012; Parmar et al., 1997).
1.1.1 Piper caldense
A espécie Piper caldense C.DC. (Figura 3) conhecida como “pimenta d’agua”
é utilizada na Paraíba como sedativo, antídoto para picadas de cobras e para
tratamento de dores de dente (Cardozo-Junior; Chaves, 2003). Esta é uma espécie
endêmica do Brasil, com ocorrência no nordeste, centro-oeste, sudeste e região sul,
sendo encontrada principalmente na Mata Atlântica (Guimarães et al., 2012).
Introdução 24
Estudos realizados com as raízes de Piper caldense levaram ao isolamento da
aristolactama caldensina (Figura 2) (Cardozo-Junior; Chaves, 2003).
Figura 2. Estrutura da aristolactama caldensina.
Figura 3. Imagens da planta P. caldense.
N
O
H3CO
H3CO
Introdução 25
1.1.2 Piper bowiei
Piper bowiei Yunck., uma espécie endêmica do Brasil é encontrada na Mata
Atlântica nas regiões de São Paulo, Rio de Janeiro e Espirito Santo (Guimarães et
al., 2012). Não há relatos na literatura sobre o estudo químico desta planta.
1.1.3 Piper permucronatum
Piper permucronatum Yunck. é encontrada predominantemente nos estados
de São Paulo e Rio de Janeiro (Guimarães et al., 2012). Não há relatos de estudos
fitoquímicos na literatura, sendo somente relatado o estudo da composição de seu
óleo essencial, que é constituído predominantemente pelos arilpropanoides
miristicina (25,6%), dilapiol (54,7%), asaricina (8,6%) e elemicina (9,9%) (De Morais
et al., 2007).
1.1.4 Piper carniconnectivum
Piper carniconnectivum C. DC. (Figura 4) é uma espécie encontrada na região
norte do Brasil, principalmente na região Amazônica (Guimarães et al., 2012).
Estudos realizados com as raízes desta planta levaram ao isolamento e identificação
de quatro flavonoides C-metilados (1-4), uma cumarina (5) e três derivados
ciclopentenodiônicos (6-7) (Figura 5) (Facundo; Braz, 2004; Facundo et al., 2004).
Introdução 26
Figura 4. Imagem da planta P. carniconnectivum.
O
R2
MeO
R1
OH O
OMeMeO
OH O
(1) R1= Me; R
2= H
(2) R1= H; R
2= Me
(3) R1= R
2= Me
(4)
O
R1
R2
O
O
OH O
OR2
R1
OO O
(6) R1= Me; R
2= H
(7) R1= H; R
2= Me
(8) R1= Me; R
2= H
(8a) R1= H; R
2= Me
(5)
Figura 5. Metabólitos isolados das raízes de Piper carniconnectivum.
Introdução 27
1.2 Metabólitos secundários em Piper
As espécies de Piper são conhecidas por apresentarem uma grande
variedade de metabólitos secundários bioativos, como alcaloides, amidas,
flavonoides, lignanas, neolignanas, terpenos e meroterpenos, como cromenos e
derivados de ácidos benzoicos prenilados, os quais têm apresentado diversas
atividades biológicas como antifúngica, antioxidante, bactericida, tripanossomicida,
inseticida e citotóxica (Batista et al., 2008; Flores et al., 2008; Flores et al., 2009;
Kato; Furlan, 2007; Parmar et al., 1997; Yamaguchi et al., 2006).
Dentre as substâncias bioativas obtidas a partir de espécies de Piper, é
possível destacar a grandisina, uma lignana tetraidrofurânica de P. solmsianum, que
apresentou atividade tripanossomicida in vitro contra T. cruzi (Martins et al., 2003) e
atividade larvicida contra Aedes aegypti (Cabral et al., 2009), e as amidas de P.
tuberculatum que apresentaram atividade inseticida contra lagarta da soja e contra a
broca da cana-de-açúcar (Navickiene et al., 2007) e mais recentemente, atividade
moluscicida (Rapado et al., 2011) e schistossomicida (Moraes et al., 2011).
1.2.1 Meroterpenos
Produtos naturais provenientes de via biossintética mista e que são
parcialmente derivados da via dos terpenoides são denominados meroterpenos.
Uma grande quantidade de meroterpenos é descrita na literatura, como
fenilpropanoides, alcaloides e flavonoides contendo cadeia lateral isoprênica (Geris
e Simpson, 2009).
Diversos meroterpenos tem sido identificados nas plantas da família
Piperaceae, principalmente os derivados de ácido benzoico, os quais têm
Introdução 28
apresentado inúmeras atividades biológicas demonstrando o potencial desta classe
de substâncias. Dentre estes compostos destacam-se os antifúngicos (1, 3, 5, 6, 11-
16, 19, 25 e 31) (Lago et al., 2004), antioxidantes (29-31) (Yamaguchi et al., 2006),
bactericidas (1, 27, 36, 44-47, 50, 53 e 54) (Rüegg et al., 2006), leishmanicidas (1-4,
17, 25, 26, 38-44, 46, 48 e 50) (Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2009) e os
tripanossomicidas (2, 4 e 31) (Flores et al., 2008) (Tabela 1).
Introdução 29
Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continua).
Substância Planta Atividade Referência
(1) P. aduncum; P. hostmannianum; P.
glabratum
Antifúngica; Bactericida;
Leishmanicida
(Lago et al., 2009; Lago et al., 2004; Orjala, J. et al.,
1993)
(2) P. glabratum; Leishmanicida; tripanossomici-
da; (Flores et al., 2008)
(3) P. aduncum; P. dilatatum; P.
hostmannianum; P. glabratum;
Antifúngica; Leishmanicida;
(Diaz; Arias; Joseph-Nathan,
1987; Lago et al., 2009; Orjala,
Jimmy et al., 1993; Terreaux;
Hostettmann; Kurt, 1998) (Flores et al., 2008; Lago et al.,
2004)
(4) P. glabratum; Leishmanicida; tripanossomici-
da; (Flores et al., 2008)
(5) P. aduncum; Antifúngica; (Lago et al., 2009)
(6) P. gaudichaudianum; Antifúngica; (Lago et al., 2004)
(7) P. dilatatum;
(Terreaux; Hostettmann; Kurt,
1998)
(8) P. taboganum; P.
dilatatum;
(Roussis; Ampofo; Wiemer, 1990;
Terreaux; Hostettmann; Kurt,
1998)
(9) P. lanceaefolium; (Lopez; Ming; Towers, 2002)
(10) P. lanceaefolium; (Lopez; Ming; Towers, 2002)
COOCH3
OH
R1
1 R1=H
2 R1=OH
COOCH3
OH
R1
R2
3 R1=H R2=OH
4 R1=R2=OH
5 R1=H R2=OOH
OH
COOCH3
O
COOR1
OH
R2
O
7 R1=R2=H
8 R1=CH3 R2=H
9 R1=H R2=OH
10 R1=CH3 R2=OH
Introdução 30
Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continuação).
(11) P. aduncum; Antifúngica; (Lago et al., 2004)
(12) P. hostmannianum; Antifúngica; (Lago et al., 2004)
(13) P. hostmannianum; Antifúngica; (Lago et al., 2009)
(14) P. aduncum; Antifúngica;
(Baldoqui et al., 1999; Lago et al.,
2004)
(15) P. taboganum; P. aduncum; P.
hostmannianum; P. dilatatum;
Antifúngica;
(Baldoqui et al., 1999; Diaz; Arias; Joseph-Nathan,
1987; Lago et al., 2004; Orjala,
Jimmy et al., 1993; Roussis; Ampofo;
Wiemer, 1990; Terreaux;
Hostettmann; Kurt, 1998)
(16) P. aduncum; Antifúngica;
(Baldoqui et al., 1999; Lago et al.,
2004; Orjala, Jimmy et al., 1993)
(17) P. aduncum; P. dennisii;
Leishmanicida;
(Cabanillas et al., 2012; Orjala,
Jimmy et al., 1993)
(18) P. aduncum; (Baldoqui et al.,
1999)
(19) P. gaudichaudianum;
Antifúngica; (Lago et al., 2004)
(20) P. hostmannianum;
(Diaz; Arias; Joseph-Nathan,
1987)
(21) P. dilatatum;
(Terreaux; Hostettmann; Kurt,
1998)
O
COOCH3
H3CO
COOR1
OHOH
OH
12 R1=H
13 R1=CH3
O
O
R1O
R2
14 R1=R2=H
15 R1=CH3 R2=H
16 R1=CH3 R2=OH
O
O
R1O
17 R1=H
18 R1=CH3
O
O
OH
O
O
H3COR
1 20 R1=H
21 R1=OH
Introdução 31
Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continuação).
(22) P. lanceaefolium; (Lopez; Ming; Towers, 2002)
(23) P. taboganum; P. gaudichaudianum; P.
dilatatum;
(Lago et al., 2004; Roussis; Ampofo;
Wiemer, 1990; Terreaux;
Hostettmann; Kurt, 1998)
(24) P. lanceaefolium; (Lopez; Ming; Towers, 2002)
(25) P. aduncum; P. gaudichaudianum;
Leishmanicida; Antifúngica;
(Flores et al., 2009) (Flores et al., 2008; Lago et al., 2004)
(26) P. aduncum; P.
dennisii; Leishmanicida;
(Baldoqui et al., 1999; Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2009) (Lago et
al., 2004)
(27) P. aduncum; Bactericida; (Orjala, J. et al.,
1993)
(28) P. aduncum; (Orjala, Jimmy et
al., 1993)
(29) P. crassinervium; Antioxidante; (Yamaguchi et al.,
2006)
(30) P. crassinervium; Antioxidante; antifúngica;
(Lago et al., 2004; Lopes et al., 2008; Yamaguchi et al.,
2006)
(31) P. crassinervium;
Antioxidante; antifúngica;
tripanossomici-da;
(Lago et al., 2004; Lopes et al., 2008; Yamaguchi et al.,
2006)
O
O
R1O
R2
O
22 R1=H R2=OH
23 R1=CH3
R2=H
24 R1=CH3 R2=OH
COOR1
OR2
25 R1=R2=H
26 R1=H R2=CH
3
27 R1=R2=CH3
OCH3
COOCH3
OH
OH O
COOH
OH O
COOH
OH O
COOH
OH
Introdução 32
Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continuação).
(32-35) P. marginatum; (Maxwell;
Rampersad, 1988)
(36) P. multiplinervium; Bactericida; (Rüegg et al.,
2006)
(37) P. arieianum; (Green; Treadwell;
Wiemer, 1999)
(38) P. heterophyllum; P. arieianum;
Leishmanicida; (Flores et al., 2009)
(39) P. heterophyllum; Leishmanicida; (Flores et al., 2009)
(40) P. arieianum;
P. heterophyllum; Leishmanicida;
(Flores et al., 2009; Green; Treadwell;
Wiemer, 1999)
(41) P. heterophyllum; Leishmanicida; (Flores et al., 2009)
(42) P. heterophyllum; Leishmanicida; (Flores et al., 2009)
(43) P. heterophyllum; Leishmanicida; (Flores et al., 2009)
OR2
COOR1
32 R1=R2=H
33 R1= H R2=CH3
34 R1=CH3 R2=H
35 R1=R2=CH3
OH
HOOC
COOH
OH
OH
COOH
OH
R1
38 R1=H
39 R1=OH
COOH
OH
OHCHO
COOH
OH
OHCOOH
R1
41 R1=H
42 R1=OH
COOH
OH
OHCOOH
OH
Introdução 33
Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (conclusão).
(44) P. aduncum; P. acutifolium; P. dennisii;
Bactericida;
Leishmanicida;
(Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2008; Orjala, J. et
al., 1993)
(45) P. aduncum; P. acutifolium;
Bactericida;
(Flores et al., 2008; Orjala, J. et al.,
1993)
(46) P. aduncum; P. dennisii;
Bactericida;
Leishmanicida;
(Cabanillas et al., 2012; Orjala, J. et
al., 1993)
(47) P. aduncum; Bactericida; (Orjala, J. et al.,
1993)
(48) P. acutifolium; Leishmanicida; (Flores et al., 2008)
(49) P. acutifolium; (Flores et al., 2008)
(50) P. aduncum; P. dennisii;
Leishmanicida; bactericida;
(Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2009; Orjala, J. et
al., 1993)
(51) P. acutifolium; (Flores et al., 2008)
(52) P. acutifolium; (Flores et al., 2008)
(53-54) P. aduncum; Bactericida; (Orjala, J. et al.,
1993)
COOR1
OR2
44 R1=R2=H
45 R1= H R2=CH3
46 R1=CH3 R2=H
47 R1=R2=CH3
COOH
OR1
OH
48 R1=H
49 R1= CH3
COOH
OH O
COOH
OCH3 OH
COOH
OH OHOH
OR1
O O
53 R1=H
54 R1= CH3
Introdução 34
1.2.2 Protoflavonoides
Flavonoides contendo anel B não aromático são também denominados de
protoflavonoides e representam uma sub-classe de produtos naturais das mais
raras. Os principais relatos de ocorrência desta classe de flavonoides são em
espécies de samambaias das famílias Thelypeteridaceae, Equisetaceae e
Dryopteridaceae (Noro et al., 1969; Wada, Hiroshi et al., 1987; Wei et al., 2011)
pertencentes à divisão das Pteridófitas, com vinte substâncias relatadas,
relacionando a principal ocorrência deste esqueleto em plantas primitivas. Em
Angiospermas, há apenas um relato da ocorrência de quatro substâncias na espécie
Ongokea gore (Olacaceae) (Jerz; Waibel; Achenbach, 2005) (Tabela 2).
Estudos de atividade biológica realizados com protoflavonoides têm relatado
que esta classe de substâncias apresenta um grande potencial citotóxico,
apresentando resultados promissores contra inúmeras linhagens de células
tumorais. Apesar de sua atividade não ser tão potente (~1uM) em comparação aos
fármacos cisplatina, vicristina e taxol (~2 nM), por exemplo, estudos realizados com
a combinação dessas substâncias com as drogas atualmente utilizadas no
tratamento do câncer têm apresentado um aumento no potencial citotóxico (Lin, A.-
S. et al., 2005; Liu et al., 2011; Wei et al., 2011).
Entre os protoflavonoides identificados, a protoapigenona (Figura 6) tem sido
bastante investigada e apresentou inibição do crescimento de células tumorais de
câncer de ovário in vitro e in vivo (MDAH-2774 e SKOV3) sem grandes efeitos
colaterais. Sua administração combinada com o fármaco cisplatina no tratamento de
células MDAH-2774 aumentou significantemente a inibição em relação à
demonstrada por cada uma das substâncias isoladamente (Chang; Su; et al., 2008).
Introdução 35
Figura 6. Estrutura da protoapigenona (55).
A potencial atividade citotóxica demonstrada pela protoapigenona motivou
também a realização de sua síntese total e a avaliação da atividade de seus
análogos, bem como o estudo de sua relação estrutura atividade. Isso permitiu
demonstrar que a presença de duplas ligações simétricas no anel B faz a
protoflavona exibir uma atividade citotóxica maior quando comparada com a
presença de apenas uma dupla ligação. A presença de alguns substituintes, como o
grupo metoxílico na posição C-7 do anel B, demonstrou aumentar a seletividade e
potencializar sua atividade contra diferentes tipos de linhagens de células tumorais
(Figura 7) (Lin; Nakagawa-Goto; et al., 2007).
Figura 7. Efeito dos substituintes na atividade antitumoral das protoflavonas (Lin; Nakagawa-Goto; et al., 2007).
O
O
OH
OOH
OH
O
O
OH
OR1
R2
OCH3>H>OH
anel aromático conjugado
OCH3 ou OH são permitidos
OH>OCH3
CO>OH
duplas simétricas
Introdução 36
Tabela 2. Protoflavonoides de ocorrência natural (continua).
Protoflavonoide Nome Planta Atividade Referência
(55) Protoapigenona
Thelypteris torresiana (Thelypteridaceae);
Phegopteris decursive-pinnata (Thelypteridaceae) Macrothelypteris viridifrons
(Thelypteridaceae);
Antitumoral
(Chang; Su; et al., 2008;
Chang; Wu; et al., 2008; Lin, A. S. et al., 2005; Pouny et al.,
2011; Wei et al., 2011)
(56) Protogenkwanona
Pseudophegopteris hirtirachis
(Thelypteridaceae);
Phegopteris decursive-pinnata (Thelypteridaceae)
(Pouny et al.,
2011; Wada, H. et al., 1987)
(57) Protoapigenina
Thelypteris torresiana (Thelypteridaceae);
Macrothelypteris viridifrons
(Thelypteridaceae);
Antitumoral
(Lin, A. S. et al., 2005; Wei et al.,
2012)
(58)
Thelypteris torresiana (Thelypteridaceae);
Macrothelypteris viridifrons (Thelypteridaceae);
Equisetum arvense (Equisetaceae);
(Hauteville et al., 1981; Lin, A. S. et al., 2005; Wei
et al., 2012)
(59) Protogenkwanina
Pseudophegopteris hirtirachis
(Thelypteridaceae); Equisetum arvense
(Equisetaceae);
(Hauteville et al., 1981; Wada, H.
et al., 1987)
(60-62) Pseudophegopteris
hirtirachis (Thelypteridaceae);
(Wada, H. et al.,
1987)
(63) Protofarrerol Leptorumohra miqueliana
(Dryopteridaceae);
(Akahori et al., 1970;
Fukushima et al., 1969;
Murakami et al., 1987; Noro et
al., 1969)
(64) 2’,3’-di-hidroproto-
genkwanona
Phegopteris connectilis (Thelypteridaceae);
Phegopteris decursive-pinnata
(Thelypteridaceae);
Antitumoral (Adam, 1999; Pouny et al.,
2011)
(65) Macrothelypteris viridifrons
(Thelypteridaceae);
(Wei et al.,
2011)
(66) 2’,3’-di-hidro-2’-hidroxiprotoapi-
genina
Macrothelypteris viridifrons (Thelypteridaceae);
Phegopteris decursive-pinnata (Thelypteridaceae)
Antitumoral (Pouny et al.,
2011; Wei et al., 2011)
(67) 5’,6-di-hidro-6’-metoxiprotoapi-
genina
Thelypteris torresiana (Thelypteridaceae);
Macrothelypteris viridifrons (Thelypteridaceae);
Antitumoral
(Lin, A. S. et al., 2005; Wei et al.,
2012)
O
OOH
OH
R1O
O
55 R1= H
56 R1= Me
O
OOH
OH
R1O
OR2
57 R1=H, R2=H
58 R1=H, R2=Glu
59 R1=Me, R2=H
O
OOH
OH
MeO
H
O
O
OHOH
OR2
OR1
60 R1=Ac, R2=H
61 R1=H, R2=Ac
62 R1=H, R2=H
O
OOH
OH
OH
O
H
O
OOH
OH
R1O
OR2
64 R1=H, R2=H
65 R1=H, R2=OH
66 R1=Me, R2=OH
67 R1=H, R2=OMe
Introdução 37
Tabela 2. Protoflavonoides de ocorrência natural (conclusão).
(68) Di-
hidroprotofarrerol
Leptorumohra miqueliana (Dryopteridaceae);
(Fukushima et
al., 1969)
(69) (2S)-ongokein-4’-ona
Ongokea gore (Olacaceae);
(Jerz; Waibel; Achenbach,
2005)
(70) Tetra-hidro-protogenkwanona
Pseudophegopteris hirtirachis
(Thelypteridaceae);
(Wada, H. et al., 1987)
(71) Macrothelypteris viridifrons
(Thelypteridaceae);
(Wei et al.,
2012)
(72) Tetra-hidro-protogenkwanina
Pseudophegopteris hirtirachis
(Thelypteridaceae);
(Wada, H. et al., 1987)
(73) Macrothelypteris viridifrons
(Thelypteridaceae);
(Wei et al., 2012)
(74) Flavotorresina Thelyptheris torresiana
(Thelypteridaceae);
(Lin; Chang; et al., 2007)
(75) Macrothelypteris
torresiana (Thelypteridaceae);
(Tang et al.,
2010)
(76)(2S)-cis-4’-hidroxi-ongokeina (77) (2S)-trans-4’-hidroxi-ongokeina
Ongokea gore (Olacaceae);
(Jerz; Waibel; Achenbach,
2005)
(78) (2S)-4’-4’-dimetoxi-
ongokeina
Ongokea gore (Olacaceae);
(Jerz; Waibel; Achenbach,
2005)
O
OOH
OH
OH
O
H
O
OOH
OH
MeO
O
H
O
OOH
OH
MeO
O
O
OOH
OH
R1O
OR2
71 R1= H, R2=H
72 R1= Me, R2=H
73 R1=H, R2=Glu
O
OOH
OH
OH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
OHMeO
OMe
O
OOH
OH
MeOH
OH
O
OOH
OH
MeOH
OMe
OMe
Introdução 38
1.3 Análises metabolômicas de plantas
O termo metabolôma compreende o conjunto de todos os metabólitos
primários e secundários presentes em um determinado organismo. A análise
metabolômica de plantas é a chave para a compreensão da complexidade de seu
metabolismo e da ligação entre genótipos e fenótipos (Villas-Bôas et al., 2005).
A obtenção do metabolôma constitui-se num grande desafio, visto que a
quantidade de metabólitos presente em uma única planta pode chegar a 30.000.
Além da grande quantidade de metabólitos, outra limitação está relacionada com a
presença de substâncias com uma grande variedade estrutural, com diferentes
tamanhos, polaridades, estabilidade e reatividade, o que dificulta a realização da
análise de todo o metaboloma utilizando uma única técnica analítica (Verpoorte;
Choi; Kim, 2010).
A análise metabolômica consiste em três partes experimentais distintas:
preparo da amostra, aquisição de dados e tratamento de dados, e os principais
desafios são a padronização e a reprodutibilidade de todas as etapas (Schripsema,
2010).
1.3.1 Preparo da amostra
Inúmeras metodologias referentes ao preparo de amostra para as análises
metabolômicas estão descritas na literatura, no entanto, o ponto mais importante
nesta etapa é obter um método eficaz (Verpoorte; Choi; Kim, 2010).
Após a coleta do material é necessário realizar uma etapa de quenching, que
consiste em realizar mudanças bruscas de temperatura através do congelamento
Introdução 39
em nitrogênio líquido, por exemplo, reduzindo assim o aparecimento de artefatos
resultantes da atividade enzimática.
Para a determinação do método de extração dos metabólitos deve-se
considerar a técnica analítica a ser utilizada na etapa seguinte. Assim, a seleção da
polaridade das substâncias deverá envolver o tipo de solvente extrator, podendo ser
utilizadas misturas de solventes com polaridades distintas. A qualidade do material e
solventes utilizados também é importante para evitar a presença de contaminantes e
inserção de artefatos, além disso, o material a ser extraído pode ser fresco,
liofilizado ou seco. Um aspecto de grande importância é a realização de amostragem
adequada para se obter um suporte estatístico para a análise em questão.
1.3.2 Aquisição de dados
Atualmente nenhum método analítico simples ou combinado é suficiente para
detectar todos os metabólitos em um organismo. Diversas técnicas analíticas vêm
sendo utilizadas nas análises metabolômicas, principalmente cromatografia gasosa
ou líquida acoplada à espectrometria de massas (CG-EM e CLAE-EM), injeção
direta no espectrômetro de massas e ressonância magnética nuclear (RMN)
(Allwood; Goodacre, 2010).
A escolha da melhor técnica deve levar em consideração quais são os
metabólitos de interesse, além das vantagens e desvantagens de cada técnica. A
técnica de CG-EM é aplicada na separação, identificação e quantificação de
diferentes classes de metabólitos, principalmente os voláteis, de baixa polaridade e
termoestáveis. A presença de uma biblioteca para comparação torna possível a
identificação de grande parte dos metabólitos. Para os metabólitos de média
Introdução 40
polaridade muitas vezes é necessário acrescentar uma etapa de derivatização, o
que dificulta a identificação de metabólitos desconhecidos (Villas-Bôas et al., 2005).
Na análise de CLAE-EM podem ser analisados os metabólitos de média e alta
polaridade presentes em matrizes complexas com alta sensibilidade na detecção. O
acoplamento da cromatografia líquida com espectrometria de massas permite a
análise de metabólitos termicamente instáveis e não voláteis. No entanto há
limitações quanto ao uso das fases móveis utilizadas na separação cromatográfica,
fazendo-se necessário o uso de fases móveis e tampões voláteis, quando
necessário. As principais fontes de ionização empregadas são electrospray (ESI) e
ionização química sob pressão atmosférica (APCI). O ESI é utilizado principalmente
para a ionização de compostos polares e o APCI para os de menor polaridade
(Allwood; Goodacre, 2010; Villas-Bôas et al., 2005).
A injeção direta no espectrômetro de massas também pode ser utilizada para
uma identificação rápida dos metabólitos presentes, sendo frequentemente
necessária a realização de fragmentação para a identificação e caracterização
destes. Neste tipo de análise há uma grande interferência da matriz da amostra, pois
não há uma etapa prévia de separação cromatográfica (Villas-Bôas et al., 2005).
O emprego de RMN permite analisar diferentes classes de metabólitos
primários e secundários. Os experimentos de RMN 2D são também utilizados para a
elucidação estrutural dos principais constituintes da mistura. De uma forma geral, a
RMN possibilita obtenção de resultados quantitativos, no entanto, a principal
desvantagem é sua baixa sensibilidade, principalmente quando são analisadas
matrizes complexas, sendo necessária uma quantidade muito maior (cerca de 10 a
50 mg) de material em comparação às técnicas de espectrometria de massas
(menos de 1 mg) (Kim; Choi; Verpoorte, 2010, 2011).
Introdução 41
1.3.3 Quimiometria
A quimiometria constitui-se em uma área dentro da química onde os dados
são processados por métodos estatísticos ou matemáticos com a finalidade de
identificar padrões e expressá-los de uma maneira mais simplificada, evidenciando
as similaridades e diferenças existentes entre eles. Existem diversas técnicas
quimiométricas, como a análise de componentes principais (PCA), análise por
agrupamento hierárquico (HCA), entre outros (Brereton, 2003).
As técnicas quimiométricas podem ser de análise exploratória de dados,
reconhecimento de padrão não supervisionado, reconhecimento de padrão
supervisionado, modelos de regressão, entre outros.
Análise exploratória
A análise exploratória de dados consiste principalmente na técnica de análise
de componentes principais (PCA) e é utilizada no processamento de dados
complexos e com muitas variáveis, como os cromatográficos e espectrais. Busca-se
uma simplificação desses dados para um sistema composto por componentes
principais (PCs), que representam o conjunto total das variáveis presentes e que
descrevam a variância dos mesmos. Nesta análise é possível observar as relações
entre os dados, como as diferenças e similaridades, no entanto, algumas vezes as
variáveis não podem ser correlacionadas, impossibilitando a obtenção de um bom
resultado (Manly, 2008).
No PCA, a matriz original, contendo muitas variáveis, é reduzida através de
uma transformação matemática resultando em dois gráficos, os quais podem ser
interpretados mais facilmente. No gráfico de scores, que possui o mesmo número de
Introdução 42
linhas da matriz original, é apresentado o resultado em função da quantidade de
amostras analisadas onde é possível observar as similaridades e diferenças entre
elas. No gráfico de loadings, que possui o mesmo número de colunas da matriz,
original, apresenta o resultado em função das variáveis presentes na matriz (Figura
8). As PCs descrevem a variância dos dados, em porcentagem, a qual está
diretamente relacionada com a quantidade de dados originais utilizados para a
obtenção dos gráficos (Brereton, 2003; Livingstone, 1995; Wold; Esbensen; Geladi,
1987).
Figura 8. Processamento da matriz por PCA resultando nos gráficos de scores e loadings.
Padrão de reconhecimento não supervisionado
O padrão de reconhecimento não supervisionado consiste principalmente na
análise de agrupamentos hierárquicos (HCA) e é utilizado com a finalidade de
evidenciar as similaridades entre padrões de dados.
A base da HCA é a realização dos cálculos das distâncias entre objetos em
um espaço multidimensional. Essas distâncias são usadas para a construção de um
diagrama, conhecido também como dendrograma, o qual permite a identificação de
MATRIZ DE DADOS
SCORES LOADINGS
PCA
11
P(Amostras)
N (Variáveis)
11
P(Amostras)
PC (scores) 11
N(Variáveis)
PC (loadings)
Introdução 43
grupos de similaridades entre as amostras (Figura 9) (Brereton, 2003; Livingstone,
1995).
Figura 9. Processamento da matriz por HCA resultando no dendrograma.
No HCA as distâncias pequenas indicam uma maior similaridade entre as
amostras, e distâncias maiores indicam que estas são distintas entre si. Várias
metodologias podem ser empregadas nos cálculos das distâncias, sendo as
principais: ligação simples (vizinho mais próximo), ligação completa (vizinho mais
distância) e método de Ward (Brereton, 2003).
MATRIZ DE DADOS
HCA
11
P(Amostras)
N (Variáveis)
A B E C D
Objetivos 44
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi utilizar técnicas metabolômicas para a
análise de um conjunto de espécies vegetais com o propósito de realizar um estudo
fitoquímico. Os extratos de Piper bowiei, P. caldense, P. carniconnectivum e P.
permucronatum, espécies com frutos pendentes, foram analisados por técnicas
espectrométricas (ESI), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas de alta resolução e Ressonância Magnética Nuclear, e os
dados obtidos foram submetidos à análise quimiometria (PCA e HCA).
O trabalho também teve como objetivo a caracterização dos agrupamentos
observados no PCA através do isolamento e elucidação estrutural dos principais
constituintes através de técnicas cromatográficas e espectroscópicas. Finalmente,
os produtos naturais isolados foram analisados quanto às atividades biológicas em
função de suas características estruturais para as quais relatos haviam sido
descritos.
Materiais e Métodos 45
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Especificações de materiais, instrumentos e técnicas utilizadas
3.1.1 Solventes utilizados em cromatografia
Os solventes utilizados nos procedimentos de extrações e eluições de
colunas cromatográficas foram devidamente destilados e tratados pela Central de
Solventes do Instituto de Química da USP. Nas análises de CLAE e CG foram
utilizados solventes de grau cromatográfico (Merck, Tedia e J.T. Baker), e água
deionizada (18m, Milli-Q, Millipore), todos filtrados e posteriormente
desgaseificados.
3.1.2 Cromatografia líquida
As separações por cromatografia líquida (CL) foram realizadas utilizando uma
coluna de vidro em diferentes dimensões. As separações por cromatografia líquida a
vácuo (CLV) foram realizadas sob vácuo utilizando-se um funil de placa sinterizada
acoplado a um kitassato.
As fases estacionárias utilizadas foram sílica Gel 60 de 0,070 – 0,200 nm
(sílica comum) e 0,035-0,060 nm (sílica flash) (Acrós Organics ou Merck), C-18
preparativo (125 Å, 22-105 m) (Waters) e Sephadex LH-20 (GE Healthcare).
Materiais e Métodos 46
3.1.3 Cromatografia em camada delgada analítica e preparativa
As cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) foram realizadas em
placas de alumínio revestidas com Sílica gel 60 F254 0,2 mm (Merck).
As cromatografias em camada delgada preparativa (CCDP) foram realizadas
em placas de vidro de 20 x 20 cm revestidas com sílica gel 60 PF254 (Merck) com 1,0
mm de espessura.
Os reveladores utilizados foram lâmpada de ultravioleta em câmara escura
nos comprimentos de onda 254 e 365 nm e aspersão de solução de vanilina
sulfúrica (5,1 g de vanilina, 50 mL de ácido sulfúrico concentrado e 800 mL de
etanol) seguida de aquecimento.
3.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência
As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram
realizadas em um sistema de cromatografia acoplado a um detector na região do
UV-Vis com arranjo de diodos (Sistema CLAE-DAD). Foi utilizado um cromatógrafo
líquido Shimadzu modelo CMB-20A, equipado com um detector UV-DAD modelo
SPD-20A, duas bombas modelo LC-20AD, forno de coluna CTO-20A e um injetor
automático modelo SIL-20AC, controlados pelo software LC solutions (Shimadzu).
Foi utilizada coluna de fase reversa C-18 da marca Phenomenex (Luna C-18
(2) 250 x 4,6 mm – 5) acoplada a uma pré-coluna de material equivalente.
O gradiente de eluição utilizado nas separações por CLAE foi constituído
pelos eluentes A: H2O - 0,1% ácido fórmico e B: ACN - 0,1% ácido fórmico (Tabela
3).
Materiais e Métodos 47
Tabela 3. Gradiente de eluição realizado na CLAE.
Tempo (min) %B
0.01 20
2.00 20
25.00 100
30.00 100
32.00 20
35.00 20
3.1.5 Espectrometria de Massas
As análises por espectrometria de massas (ESI) foram realizadas nos
equipamentos ESQUIRE 3000 plus, MicrOTOF e MicrOTOF-Q (Bruker Daltonics)
para identificação das amostras por injeção direta ou por CLAE acoplada à
espectrometria de massas.
As análises por espectrometria de massas com ionização por impacto de
elétrons foram realizadas cromatógrafo Shimadzu modelo GCMS-QP5050
3.1.6 Ressonância Magnética Nuclear
As análises de RMN foram realizadas nos espectrômetros Bruker DPX 300
(300 MHz), Bruker DRX 500 (500 MHz), Varian Inova 300 (300 MHz) e Varian
Gemini 200 (200 MHz). As amostras foram solubilizadas em solventes deuterados
(CDCl3, CD3OD, Acetona-d6, D2O e DMSO-d6, Aldrich).
3.1.7 Espectrofotometria de absorção na região do UV-Vis
As análises de espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta-
visível foram realizadas em um espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-1650 PC,
utilizando-se cubetas de quartzo com 10 mm de caminho óptico.
Materiais e Métodos 48
3.1.8 Espectroscopia na região do Infravermelho
As análises por espectroscopia na região do infravermelho foram realizadas
no espectrômetro BOMEM-MB100. As amostras sólidas foram analisadas em KBr
(proporção 1 mg amostra: 100 mg KBr) e as líquidas viscosas em filme com cerca de
0,01 mm de espessura.
3.1.9 Polarímetro
O ângulo de desvio de luz plano polarizada []D foi medido em um polarímetro
da marca Perkin-Elmer, modelo 343, equipado com uma lâmpada de sódio e
utilizando uma célula de quartzo de 100 mm de caminho óptico.
3.1.10 Espectropolarímetro
As curvas de dicroísmo circular foram obtidas em um espectropolarímetro
Jasco, modelo J-720 e utilizando uma célula de quartzo de 1 mm de caminho óptico.
3.2 Material Vegetal
As espécies: Piper bowiei, Piper caldense, Piper carniconnectivum e Piper
permucronatum foram selecionadas para estudo considerando o fato terem sido
pouco estudadas e por terem em comum a presença de frutos pêndulos e globosos.
Os espécimes estudados foram coletados com a autorização para atividades com
finalidade científica número 15780-3 (ICMBio e Sisbio) e vêm sendo mantidos na
estufa para plantas do Laboratório de Química de Produtos Naturais no Instituto de
Química da USP. As espécies foram identificadas pela Profa. Dra. Elsie Franklin
Materiais e Métodos 49
Guimarães no Instituto de Pesquisas do Jardim Botânico do Rio de Janeiro (Tabela
4)
Tabela 4. Local de coleta das espécies estudadas.
Espécie Código Local de coleta
P. bowiei K-364 São Paulo – SP
P. caldense K-484 Ubatuba – SP
P. caldense K-842 Ubatuba – SP
P. caldense K-951 Santa Tereza – ES
P. caldense K-1209 Ubatuba – SP
P. permucronatum K-310 São Paulo – SP
P. permucronatum K-1022 Cubatão – SP
P. permucronatum K-1210 Ubatuba - SP
P. permucronatum K-1220 Ubatuba - SP
P. carniconnectivum K-976 Carajás – PA
P. carniconnectivum K-978 Carajás – PA
P. carniconnectivum K-991 Carajás – PA
P. carniconnectivum K-1441 Belterra – PA
P. carniconnectivum K-1600 Manaus – AM
3.3 Extração e purificação dos metabólitos secundários
3.3.1 Preparo dos extratos brutos
Para o estudo fitoquímico foi selecionada uma planta de cada espécie
coletada. Os diversos órgãos de cada planta (folhas, caule, galhos, frutos e raízes)
foram separados e secos em uma estufa a 50 ºC por 48 horas e moídos em um
moinho de facas.
O material foi extraído com AcOEt ou CHCl3/MeOH por 3 dias a temperatura
ambiente. O solvente foi filtrado e concentrado em um evaporador rotativo (Büchi). O
material restante foi extraído novamente com o mesmo solvente e concentrado junto
com o extrato anterior (Tabela 5). Após a filtração do extrato das folhas de P.
Materiais e Métodos 50
carniconnectivum, este foi submetido a uma extração líquido-líquido com adição de
250 mL de H2O, apenas a fase orgânica CHCl3 foi submetida ao fracionamento.
Tabela 5. Extratos preparados para estudo fitoquímico.
Espécie/código
da planta
Parte da planta
Massa de material seco (g)
Solvente de extração
Código Massa extrato
P. caldense (K-842) Folhas 10,5 AcOEt K-842 FA 2,6 g
P. bowiei (K-364) Folhas 11,7 AcOEt K-364 FA 1,7 g
P. permucronatum (K-1210) Folhas 50,0 AcOEt K-1210 FA 7,0 g
P. carniconnectivum (K-1441) Folhas 14,0 AcOEt K-1441 FA 3,5 g
P. carniconnectivum (K-1441) Frutos 5,0 AcOEt K-1441 FrA 1,4 g
P. carniconnectivum. (K-1600) Folhas 15,1 CHCl3/MeOH
(1:1) K-1600 FC 1,6 g
3.3.2 Metabólitos de Piper caldense
Através das análises de CLAE (Figura 10) e RMN de 1H (Figura 11) foi
possível verificar a presença de um composto majoritário (tR=19.5 min) no extrato
bruto das folhas de P. caldense (K- 842 FA).
Figura 10. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. caldense (K842-FA).
12
Materiais e Métodos 51
Figura 11. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. caldense (K-842 FA, CDCl3, 500 MHz).
O extrato K-842 FA foi submetido a um fracionamento por CLV utilizando
como fase estacionária sílica comum (h = 10 cm, ø = 10 cm) e eluição gradiente
com os solventes hexano, AcOEt e MeOH. Neste fracionamento foram obtidas doze
frações que foram analisadas por CCDA e posteriormente por CLAE. A substância
majoritária da fração K-842FA 3 foi purificada por CCDP utilizando-se como eluente
hexano: AcOEt (3:2), que levou ao isolamento da flavona 4.
Através da análise de CLAE foi possível detectar o metabólito majoritário do
extrato, na fração K-842FA 6, que foi fracionada por CC utilizando-se eluição
gradiente com os solventes hexano, acetato de etila e metanol, a fase estacionária
utilizada foi Sílica gel 60 comum. Neste fracionamento foram obtidas dez frações e
na fração K-842FA 6.5 foi identificado o ácido caldensínico (12), composto
majoritário do extrato.
.
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
-0.0
1-0
.00
0.0
10.8
40.8
40.8
50.8
60.8
70.8
80.8
91.2
3
1.2
51.2
81.2
91.3
11.3
31.5
61.5
71.5
91.6
01.6
2
1.6
61.6
81.7
31.7
41.7
91.9
61.9
82.0
02.0
12.0
22.0
4
2.0
52.0
62.0
82.0
92.1
02.1
42.1
52.2
42.2
62.2
82.2
9
3.3
53.3
74.1
45.0
95.1
15.1
25.3
26.8
47.2
67.4
37.4
6
Materiais e Métodos 52
3.3.3 Metabólitos de Piper bowiei
Através das análises de CLAE (Figura 12) e RMN de 1H (Figura 13), foi
possível verificar a presença de um composto majoritário (tR=23.4 min) no extrato
das folhas de P. bowiei K- 364 FA.
Figura 12. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364FA).
Figura 13. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364 FA, CDCl3, 200 MHz).
ppm (t1)
0.02.55.07.510.0
11.8
8
7.73
7.46
7.45
7.45
7.43
7.42
7.27
6.15
5.68
5.67
5.66
5.63
5.62
5.52
5.50
5.46
5.44
5.35
5.00
4.98
4.85
3.86
3.67
3.51
3.47
3.08
3.02
2.91
2.89
2.34
2.30
2.29
1.80
1.78
1.72
1.48
1.45
1.25
1.21
1.18
0.00
0
1/2
6
Materiais e Métodos 53
O extrato K-364 FA foi submetido a um fracionamento por cromatografia
líquida a vácuo (CLV) utilizando como fase estacionária sílica comum (h = 10 cm, ø
= 10 cm) e eluição gradiente com hexano, AcOEt e MeOH. Neste fracionamento
foram obtidas quatorze frações.
As frações foram analisadas por CCDA e a fração K-364FA 2 foi submetida à
uma CCDP utilizando-se como fase móvel a mistura hexano e AcOEt (9:1), levando
ao isolamento da substância 1, o cromeno 2,2-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de
metila.
A fração K-364FA 5 foi fracionada por CC utilizando-se como fase
estacionária Sephadex LH-20 e eluição isocrática com MeOH. Foram obtidas dez
frações, sendo que na fração K-364FA 5.7 foi identificada a substância 2, cromeno
8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de metila. Na fração K-364FA 5.5 foi
identificada a substância 6, a flavanona di-hidrowogonina, constituinte majoritário do
extrato.
3.3.4 Metabólitos de Piper permucronatum
Através das análises de CLAE (Figura 14) e RMN de 1H (Figura 15) foi
possível verificar a presença de dois compostos (tR=14.5 e 16.5 min) no extrato das
folhas de P. permucronatum K- 1022 FA.
Materiais e Métodos 54
Figura 14. Cromatograma obtido por CLAE de K-1022 FA.
Figura 15. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1022 FA (500 MHz, CDCl3).
O extrato K-1210FA (2,7 g) foi submetido à cromatografia líquida à vácuo
(CLV) utilizando fase estacionária reversa C-18 (h = 5 cm, ø = 10 cm). O extrato foi
solubilizado em 90 mL de MeOH e à solução foram adicionados 10 mL de água, com
a intenção de precipitar ácidos graxos e clorofila. A mistura foi então submetida à
filtração (4 X 100 mL de MeOH:H2O - 9:1). A solução foi concentrada em um
evaporador rotativo e submetida ao fracionamento cromatográfico por CLV
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
0.0
00.8
10.8
4
0.8
50.8
60.8
70.8
70.8
80.8
91.2
51.2
91.3
31.3
71.5
81.5
91.6
8
1.7
91.8
41.9
61.9
71.9
92.0
42.1
02.1
22.3
62.7
72.7
72.8
02.8
13.0
63.0
83.0
93.1
23.8
13.9
03.9
15.0
95.1
15.1
25.3
45.3
45.3
65.3
76.0
46.0
56.0
66.0
76.0
86.8
86.8
97.2
67.3
27.3
412.0
0
12.0
2
3
7
Materiais e Métodos 55
utilizando-se como fase estacionária sílica flash (h = 7 cm, ø = 10 cm) e eluição
gradiente com hexano, AcOEt e MeOH. Neste fracionamento foram obtidas quatorze
frações. Na fração K-1210FA-4 foi identificada a substância 7, a flavanona
sakuranetina, que foi purificada por CC (h = 25 cm, ø = 3,5 cm) utilizando-se como
fase estacionária sílica flash e eluição gradiente com os solventes hexano, AcOEt e
MeOH. Na fração K-1210FA-12 foi identificada a substância 3, que foi purificada por
CL utilizando-se como fase estacionária Sephadex LH-20 (h =45 cm, ø = 2,5 cm) e
eluição isocrática com MeOH. Esta substância foi identificada como a flavanona 7-O-
metil-luteolina
3.3.5 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1441)
Através das análises de CLAE (Figura 16) e RMN de 1H (Figura 17) do extrato
K-1441 FA foi possível verificar a presença de um composto majoritário (tR= 11.0
min) no extrato das folhas de P. carniconnectivum K- 1441 FA.
Figura 16. Cromatograma CLAE de K-1441 FA.
O extrato K-1441 FA (3,5 g) foi submetido ao fracionamento cromatográfico
por CLV utilizando-se como fase estacionária sílica Gel 60 Comum (h = 5 cm, ø = 5
9
8
Materiais e Métodos 56
cm) e eluição gradiente com os solventes hexano, AcOEt e metanol. As quatorze
frações obtidas foram analisadas por CCDA, CLAE e RMN, levando à identificação
de duas novas substâncias. Na fração K-1441FA-9 foi identificada a substância 8,
que foi purificada por CL utilizando-se como fase estacionária Sephadex LH-20 (h =
50 cm, ø = 2,5 cm) e eluição isocrática com MeOH. Na fração K-1441FA-12 foi
identificada a substância 9, através do procedimento de recristalização utilizando
MeOH.
Figura 17. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FA (500 MHz, CDCl3).
No extrato dos frutos de P. carniconnectivum (K-1441 FrA) observou-se a
predominância de uma substância em tR= 25,5 min, através das análise de CLAE
(Figura 18) e RMN de 1H (Figura 19).
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm-0
.01
-0.0
00.0
10.8
50.8
81.2
31.2
51.2
81.6
01.6
82.0
42.0
5
2.0
62.0
72.0
82.0
92.1
02.1
12.1
52.1
62.4
72.4
82.5
1
2.5
22.6
42.6
42.6
72.6
82.7
62.7
72.7
82.7
92.7
9
2.8
03.0
63.0
93.1
03.1
23.8
23.8
33.9
03.9
04.4
24.4
3
4.4
54.4
66.0
86.1
06.1
27.0
97.1
07.1
17.1
27.2
611.7
7
Materiais e Métodos 57
Figura 18. Cromatograma CLAE de K-1441 FrA.
Figura 19. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FrA (500 MHz, CDCl3).
O extrato K-1441 FrA (3,5 g) foi submetido ao fracionamento cromatográfico
por CLV utilizando-se como fase estacionária sílica Gel 60 Comum (h = 10 cm, ø = 5
cm) e eluição gradiente com os solventes hexano, AcOEt e metanol. Foram obtidas
treze frações. As frações obtidas foram analisadas por CCDA, CLAE e RMN,
levando à identificação de duas novas substâncias, na fração K-1441FrA-5 foi
identificada a substância 13, que foi purificada por CL utilizando-se como fase
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
1.2
11.2
51.2
61.2
61.2
8
1.2
91.5
81.5
91.6
71.7
12.0
53.2
53.3
23.8
23.8
93.9
04.1
24.1
34.8
34.9
35.0
35.0
95.1
45.1
65.3
05.6
26.0
9
6.8
66.8
8
7.3
2
7.8
47.9
07.9
2 Current Data ParametersNAME K1441 FrAEXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121229Time 17.12INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 0SWH 7002.801 HzFIDRES 0.106854 HzAQ 4.6793203 secRG 90.5DW 71.400 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.1330032 MHzNUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 W
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1299827 MHzWDW EMSSB 0LB 0.30 HzGB 0PC 1.00
13
Materiais e Métodos 58
estacionária sílica comum (h = 40 cm, ø = 2,5 cm) no modo gradiente com os
solventes hexano, AcOEt e MeOH.
3.3.6 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1600)
Através das análises de CLAE (Figura 20) e RMN de 1H (Figura 21) foi
possível verificar a presença de três compostos majoritários (tR= 9,0, 12,0 e 15,0
min) no extrato das folhas de P. carniconnectivum K-1600 FC. Este extrato
apresentou um perfil cromatográfico diferente do obtido para as folhas de P.
carniconnectivum K-1441-FA.
Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE de K-1600 FC.
11
10
5
Materiais e Métodos 59
Figura 21. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1600 FC (500 MHz, CDCl3)
O extrato K-1600 FC (1,6 g) foi submetido ao fracionamento cromatográfico
por CLV utilizando-se como fase estacionária sílica Gel 60 Comum (h = 7 cm, ø = 5
cm) e eluição gradiente com hexano, AcOEt e MeOH. Foram obtidas dez frações. Os
compostos majoritários 5, 10 e 11 foram identificados nas frações K-1600FC-6, 4 e
9, respectivamente, e foram purificados por CCDP utilizando-se como eluente
hexano:AcOEt (2:3).
3.4 Obtenção de derivados
A obtenção de derivados dos metabólitos secundários isolados foi realizada
para as substâncias 8, 12 e 13, conforme procedimentos descritos a seguir, com a
finalidade de obter substâncias com variedade estrutural para o estudo de atividade
biológica.
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
0.0
0
1.2
5
1.6
8
2.0
4
3.8
83.8
93.9
23.9
23.9
7
5.1
2
6.3
46.4
06.4
26.4
96.6
26.8
96.9
17.2
6
12.3
2
Materiais e Métodos 60
3.4.1 Reação de metilação
Preparação do diazometano
A um balão de destilação de 500 mL, equipado com condensador de tubo reto
(sem juntas esmerilhadas), contendo uma solução de 0,1 mol de N-metil-N-nitroso-
para-tolueno-sulfonamida (Diazald®) em 240 ml de éter etílico foi adicionado uma
solução de KOH (0,1 mol) em 7 ml de água destilada e 25 ml de etanol. A seguir,
esta mistura foi aquecida em torno de 35ºC em um banho de água quente a 45ºC e
a solução destilada de diazometano foi coletada em frasco refrigerado.
Metilação
As substâncias 12 e 13 (80 e 72 mg, respectivamente) foram tratadas com
excesso de solução etérea de diazometano e deixadas em repouso por 12 horas à
temperatura ambiente. A formação dos produtos desejados foi verificada por CCDA.
Os produtos de cada uma das reações foram separados por CCDP utilizando-se
como eluente uma mistura de hexano e AcOEt (7:3). Foram obtidos 70 mg de 12a
(rendimento: 88%) e 55 mg de 13a (rendimento: 76%) (Figura 22).
COOH
OCH3
COOH
COOCH3
OCH3
COOCH3
CH2N2
éter
13 13a
Figura 22. Reação de metilação das substâncias 12 e 13.
COOH
OH
OH
COOH
COOCH3
OCH3
H3CO
COOCH3
CH2N2
éter
12 12a
Materiais e Métodos 61
3.4.2 Reação de acetilação
A substância 12 (140 mg, 0,3 mmol), foi dissolvida em excesso de anidrido
acético (1,0 mmol) a qual foram adicionadas Et3N (1,0 mmol) e DMAP (4-N,N-
dimetil-aminopiridina (0,03 mmol) (Figura 23). A mistura reacional foi mantida sob
agitação por 24 horas à temperatura ambiente (Virsu et al., 2001). O produto 12c (70
mg, rendimento: 50%) foi purificado por CCDP utilizando-se como eluente hexano:
AcOEt (2:3).
Figura 23. Reação de acetilação da substância 12.
3.4.3 Hidrogenação catalítica
As substâncias 8 e 12 (30 mg, 100 mg) foram dissolvidas em 3 mL de
metanol, e foram adicionados 2 mg e 5 mg, respectivamente, de catalisador Pd-C
(10%) (Aldrich) (Figura 24). A mistura foi colocada sob agitação em um reator em
atmosfera de hidrogênio à pressão de 4 atm por 3 horas. Os produtos 12c, 8a foram
purificados por CCDP utilizando-se como eluente uma mistura de diclorometano e
metanol (9,5:0,5) para a substância 12c (80 mg, rendimento: 80%), e para a
substância 8a (22 mg, rendimento: 73%) foi utilizada uma mistura de hexano e
AcOEt (2:3).
COOH
OH
OH
COOH
COOH
O
O
COOH
O
O
O
OO
DMAP
Et3N
12 12c
Materiais e Métodos 62
Figura 24. Reação de hidrogenação catalítica das substâncias 8 e 12.
3.5 Ensaios de atividade biológica
3.5.1 Atividade antifúngica
Os ensaios de atividade antifúngica dos extratos brutos e das substâncias
isoladas foram realizados em colaboração com o Instituto de Botânica de São Paulo,
sob a supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young. As amostras foram ensaiadas
contra os fungos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum.
Ambas as espécies foram selecionadas por produzirem uma grande quantidade de
esporos e apresentarem crescimento uniforme em condições de cultura in vitro.
Uma avaliação qualitativa do potencial fungitóxico foi realizada com os
extratos brutos das espécies em estudo através da metodologia de bioautografia
(Homans; Fuchs, 1970). Este ensaio consiste na observação da ação inibitória de
extratos e substâncias antifúngicas sobre esporos de fungos utilizados para
revelação das placas cromatográficas.
Para a realização dos experimentos com os extratos brutos, as amostras (400
g) foram aplicadas em placas comerciais de sílica PF254 (MERCK) sob suporte de
O
O
OOH
H3CO
H3CO
OHO
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
H2, Pd/C
MeOH4 atm/ 4 h
8 8a
COOH
OH
OH
COOH
H2, Pd/C
MeOHCOOH
OH
OH
COOH12
4 atm/ 4 h
12b
Materiais e Métodos 63
alumínio e eluídas com fase móvel adequada para a separação cromatográfica de
cada extrato. Após a evaporação completa do solvente as placas foram aspergidas
com uma solução contendo glicose, sais e os esporos dos fungos reveladores, e em
seguidas incubadas a 25ºC, em câmara escura por 48 horas. Após o tempo de
incubação pôde-se observar o crescimento do fungo na superfície da placa, sendo
que nas regiões onde são encontradas substâncias com atividade antifúngica não há
crescimento do fungo, sendo observados os halos de inibição (Figura 25).
Figura 25. Diagrama ilustrativo da bioautografia dos extratos brutos.
Após a purificação dos metabólitos secundários dos extratos, foram
realizados ensaios para determinação do limite de detecção da atividade, através da
variação da concentração da amostra aplicada na placa. Os resultados foram
comparados com a atividade de substâncias antifúngicas padrão, como a nistatina.
As substâncias puras foram dissolvidas em 10l de MeOH nas quantidades
100, 50, 25, 10, 5 e 1 g e aplicadas em uma placa cromatográfica de alumínio
A B C
solução de glicose,sais e esporos
48 horas25ºC
Câmara escura
A B C A B C
Eluição
Extratos
Incubação
Materiais e Métodos 64
revestida com sílica PF254 (Merck). As placas foram incubadas nas mesmas
condições realizadas com os extratos brutos (Figura 26).
Figura 26. Diagrama ilustrativo da bioautografia das substâncias puras.
3.5.2 Atividade antitumoral
O ensaio de atividade antitumoral foi realizado pelo CIPOI (Centro Integrado
de Pesquisas Oncohematológicas na Infância – Unicamp) através da colaboração
com o farmacêutico Gilberto Carlos Franchi Junior. As amostras foram testadas
contra doze linhagens de células leucêmicas in vitro (Tabela 6).
Tabela 6. Linhagens de células leucêmicas testadas.
Linhagem de célula
K562, HL60, NB4 Leucemia mielóide
P39 Síndrome mielodisplásica (SMD)
NAMALWA, DAUDI, RAMOS Linfoma de Burkitt
JURKAT, MOUT4 Leucemia linfoblástica aguda T
U937 Linfoma histiocítico
NALM6, B15 Leucemia linfoblástica aguda B
Neste ensaio as células neoplásicas foram distribuídas em uma placa com 96
poços (100 μL células/poço contendo meio RPMI 1640 (Sigma R6504)
suplementando com 10% de soro fetal bovino (Gibco 16000-044), 1% de penicilina
Padrão
Substâncias
100 50 25 10 5 1 g
solução de glicose,sais e esporos
48 horas25ºC
Câmara escura
Incubação
Materiais e Métodos 65
(10,000 IU / ml) e 10mg/ml de estreptomicina (15,070 Gibco). A placa contendo as
células foi mantida em estufa umidificada a 97% com temperatura de 37ºC. Após o
tempo de incubação, as substâncias a serem testadas foram dissolvidas em 0,1 %
de DMSO nas concentrações de 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e 0,00001 g/ml
e adicionadas às placas contendo as células.
Para a contagem das células, todas as etapas do ensaio foram automatizadas
utilizando a estação de manuseamento líquido epMotion® 5070 (Eppendorf,
Vaudaux, Schonenbuch, Switzerland). A placa foi incubada novamente por 48 horas
a 37 oC em estufa umidificada com atmosfera de 5% de CO2.
A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de redução de MTT (Sigma
M2128), utilizando um sal de tetrazólio (1-[4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio.
A densidade óptica foi medida por espectrofotometria em 570 nm (Bio-Tek Power
Wave XS). O valor de IC50 foi determinado considerando os 50% da atividade em
relação a células de controle. Neste ensaio foi utilizado como controle positivo o
princípio ativo vincristina (Freshney, 1987).
3.6 Análise de Componentes Principais (PCA)
A PCA foi realizada com os dados obtidos a partir dos extratos das plantas
estudadas utilizando-se duas técnicas de espectrometria de massas, sendo uma por
injeção direta e outra por CLAE-EM ambas com ionização por electrospray. Outra
técnica utilizada na obtenção de dados para a PCA foi RMN de 1H.
Materiais e Métodos 66
3.6.1 Preparo dos extratos
Extratos para injeção direta
Aproximadamente 500 mg de material fresco (Tabela 7) foram congelados em
nitrogênio líquido, triturados e homogeneizados em um almofariz. Cerca de 20 mg
do material triturado foram submetidos à extração utilizando 1 mL de solvente
AcOEt, que em seguida foram agitados em um vortex por 30 s. A solução foi
mantida em agitação em um agitador automático (T = 25º C) por 48 horas seguida
da centrifugação à temperatura ambiente por 10 min em uma rotação de 12000 rpm.
O sobrenadante (200 ul) foi separado e seco. O extrato seco foi acondicionado em
freezer à temperatura de -20º C até o momento das análises.
Tabela 7. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM – infusão direta. Espécie Parte da planta Código Local de coleta
Piper bowiei Folhas K-364 F São Paulo – SP
P. caldense Folhas K-484 F Ubatuba – SP
P. caldense Folhas K-842 F Ubatuba – SP
P. caldense Galhos K-842 G Ubatuba – SP
P.r caldense Frutos K-842 Fr Ubatuba – SP
P. caldense Sementes K-842 S Ubatuba – SP
P. caldense Folhas K-951 F Ubatuba – SP
P. caldense Galhos K-951 G Santa Tereza – ES
P. caldense Frutos K-951 Fr Santa Tereza – ES
P. caldense Sementes K-951 S Santa Tereza – ES
P. caldense Caule K-951C Santa Tereza – ES
P. caldense Raiz K-951 R Santa Tereza – ES
P. permucronatum Folhas K-310 F São Paulo – SP
P. permucronatum Folhas K-1022 F Cubatão – SP
P. permucronatum Galhos K-1022 G Cubatão – SP
P. carniconnectivum Folhas K-963 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-976 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-978 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-991 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-989 F Carajás – PA
Materiais e Métodos 67
Preparo dos extratos para CLAE-EM e RMN de 1H
Os extratos para CLAE-EM (Tabela 8) foram preparados em triplicata
utilizando o mesmo procedimento realizado no preparo para análise por injeção
direta.
Para os extratos de RMN de 1H, aproximadamente 500 mg de material fresco
foram congelados em nitrogênio líquido, triturados e homogeneizados em um
almofariz. Cerca de 50 mg do material triturado foram transferidos para um tubo
eppendorf de 2 mL e submetido à extração utilizando uma mistura de 700 l de
solvente CHCl3, 350 l de CH3OH e 350 l de H2O. A mistura foi agitada em um
vortex por 30 s e mantida em repouso por 20 min à temperatura ambiente, seguida
de nova agitação no vortex por 30 s e centrifugada por 20 min a 12000 rpm.
Foram coletados 400 l da fase hidroalcóolica e 200l da fase CHCl3,
separadamente, e transferidos para um tubo Eppendorf. As soluções foram secas e
acondicionadas à -20ºC até o momento da análise.
Tabela 8. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H. Espécie Código Local coleta
P. caldense K1209A Ubatuba-SP
K1209B Ubatuba-SP
K1209C Ubatuba-SP
K1569A Cunha-AM
K1569B Cunha-AM
K1581A Cunha-AM
P. permucronatum K1210A Ubatuba-SP
K1210B Ubatuba-SP
K1210C Ubatuba-SP
K1220A Ubatuba-SP
K1220B Ubatuba-SP
P. carniconnectivum K1441A Belterra-PA
K1441B Belterra-PA
K1441C Belterra-PA
K1600A Cunha-AM
K1600B Cunha-AM
Materiais e Métodos 68
3.6.2 Obtenção de dados
Análise por ESI-EM (Injeção direta)
As amostras secas foram dissolvidas em 1 mL de MeOH e filtradas com filtros
de 0,45 m. A análise por espectrometria de massas foi realizada em um
equipamento Quattro II triploquadrupolo (Micromass, Manchester, U.K.) com
ionização por electrospray (ESI+) no modo positivo, voltagem do capilar 4,5 kV e do
skimmer 70 V, o fluxo do gás nitrogênio de nebulização e de secagem foi de 250 e
30 L/h. O fluxo da fase móvel foi de 50 L/min. As amostras foram analisadas por
infusão direta e os dados processados pelo programa Masslynx (Micromass) versão
3.2.
Os dados dos espectros de massas foram convertidos ao formato ASCII
através do programa Masslynx (Micromass) e exportados para o programa Excel
(Microsoft) onde foi elaborada a matriz de dados. As variáveis selecionadas na
matriz foram os valores de massas na faixa de m/z 100 a 650 Da obtidos para cada
extrato.
Análise por CLAE-EM
As amostras secas foram dissolvidas em 1 mL de MeOH e filtradas com filtros
de 0,45 m. As análises de CLAE-EM foram realizadas no equipamento MicrOTOF-
Q II (Bruker) acoplado à um cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca
Shimadzu, composto por uma controladora CBM-20A, duas bombas LC-20AD, um
detector UV-Vis (dois canais) SPD-20A, injetor automático SIL-20AC e forno de
coluna CTO-20A. Foi utilizada coluna de fase reversa C-18 da marca Phenomenex
(Luna C-18 150 x 4,6 mm – 5) acoplada a uma pré-coluna de material equivalente.
Materiais e Métodos 69
Os eluentes utilizados foram A: H2O-0.1% ácido fórmico e B: ACN-0,1% ácido
fórmico. O método cromatográfico utilizado nesta análise foi 0.01-1.00 min – 20%B;
1.00-15.00 min – 20 a 100%; 15.00-18.00 min – 100%; 18.00-20.00 min – 100-20%,
fluxo 0,2 mL.min-1.
Os espectros de massas obtidos foram transformados em netCDF e
transportados para uma matriz em duas dimensões através do algoritmo
disponibilizado na aplicação web XCMS Online (Tautenhahn et al., 2012). As
variáveis selecionadas na matriz foram os valores de massas na faixa de m/z 100 a
1000 Da obtidos para cada extrato em função do tempo de retenção e intensidade
dos picos.
Análise por RMN de 1H
Para cada amostra, o extrato seco correspondente a fase hidroalcoólica
(CH3OH+H2O) foi dissolvido em 600 L de D2O e transferido para um tubo de RMN
de 5 mm e o extrato seco correspondente a fase orgânica (CHCl3) foi dissolvido em
600 L de CDCl3 e transferido para um tubo de RMN de 5 mm. Os experimentos de
RMN de 1H foram realizados no equipamento de RMN de 500 MHz, modelo Avance
III da Bruker Biospin (Alemanha).
Os parâmetros de aquisição dos espectros de RMN de 1H foram os seguintes:
sequência de pulso de 90º (zg), TD= 64K, DS= 4, NS= 64, SW= 12,9836 ppm (ou
6493,506 Hz), AQ= 5,046s, FID res= 0,099083Hz, O1= 3125,81 Hz (ou O1P= 6,250
ppm), d1= 2s. O processamento do espectro foi realizado através da transformada
de Fourier utilizando multiplicação exponencial, SI= 64K e lb=0,3 Hz. O espectro
transformado teve sua fase e linha de base ajustadas, e foi referenciado através do
Materiais e Métodos 70
sinal do TMS em 0,00 ppm, para amostra em CDCl3 e através do sinal do TPS em
0,00 ppm, para amostra em D2O.
Por fim, foi realizada a integração do espectro em faixas de 0,02 ppm (10,00
Hz). Os valores dos deslocamentos químicos médios das faixas integradas e suas
integrais foram transferidos para uma matriz elaborada no programa Excel
(Microsoft).
3.6.3 Processamento dos dados
Esta etapa foi realizada em colaboração com o Msc. Harold H. Fokoue
(LPQN-IQUSP). As matrizes de dados obtidas para cada uma das técnicas analíticas
foram submetidas à análise de componentes principais (PCA) utilizando-se o
software The Unscrambler (versão 9.5, CAMO Process AS, Noruega), no qual foi
realizada a normalização pela média. Os dados foram visualizados (gráficos de
scores e loadings) de acordo com as componentes principais mais representativas.
Para análise de agrupamento hierárquico (HCA) foi utilizado o programa
Statistica (versão 11, StatSoft, EUA). Os cálculos foram realizados utilizando
distância Euclidiana e o método de Ward.
Resultados e Discussões 71
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Análise dos componentes principais (PCA) dos extratos
Com a finalidade de obter uma visão geral das similaridades entre as
espécies de Piper estudadas, os extratos foram preparados e analisados por EM. Os
espectros obtidos foram então submetidos ao PCA.
As quatro espécies analisadas, que possuem frutos pendentes e globosos, P.
caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum foram coletadas em
diferentes regiões (Tabela 9).
Tabela 9. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM- Infusão direta. Espécie Parte da planta Código Local de coleta
P. bowiei Folhas K-364 F São Paulo – SP
P. caldense Folhas K-484 F Ubatuba – SP
P. caldense Folhas K-842 F Ubatuba – SP
P. caldense Galhos K-842 G Ubatuba – SP
P. caldense Frutos K-842 Fr Ubatuba – SP
P. caldense Sementes K-842 S Ubatuba – SP
P. caldense Folhas K-951 F Ubatuba – SP
P. caldense Galhos K-951 G Santa Tereza – ES
P. caldense Frutos K-951 Fr Santa Tereza – ES
P. caldense Sementes K-951 S Santa Tereza – ES
P. caldense Caule K-951C Santa Tereza – ES
P. caldense Raiz K-951 R Santa Tereza – ES
P. permucronatum Folhas K-310 F São Paulo – SP
P. permucronatum Folhas K-1022 F Cubatão – SP
P. permucronatum Galhos K-1022 G Cubatão – SP
P. carniconnectivum Folhas K-963 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-976 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-978 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-991 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-989 F Carajás – PA
Na análise das amostras por PCA (Figura 27) os componentes principais
(PC1 e PC2) representam aproximadamente 61% dos dados. No gráfico scores foi
possível observar a formação de três agrupamentos distintos, de acordo com a
Resultados e Discussões 72
espécie, sendo o grupo principal (I) constituído majoritariamente pelos extratos de P.
caldense, além dos galhos de P. permucronatum (K1022G). No grupo II observou-se
a presença dos extratos de P. carniconnectivum, e no grupo III as amostras de P.
bowiei e P. permucronatum foram agrupadas, mas não foram diferenciadas entre sí.
Figura 27. Gráfico de scores de (PC1 v PC2) com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância).
No gráfico de loadings (Figura 28) foi possível observar os valores das
variáveis que tiveram uma maior contribuição para a discriminação observada no
gráfico de scores, nesta análise os valores das variáveis são os valores de m/z
obtidos na análise de EM-ESI. Nas amostras de P. carniconnectivum a variável de
m/z 335 Da foi a que apresentou maior influência no agrupamento das amostras
desta espécie, enquanto para P. bowiei e P. permucronatum a maior contribuição foi
da variável m/z 287 Da. No grupo principal, constituído pelas amostras de P.
caldense, observou-se a presença de inúmeras variáveis na faixa de m/z 450 Da.
Resultados e Discussões 73
Figura 28. Gráfico de loadings com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância).
Com os resultados observados, nesta análise preliminar, iniciou-se o estudo
fitoquímico das espécies de Piper com a finalidade de caracterizar os valores
observados no gráfico de loadings através do isolamento e determinação estrutural
dos principais constituintes químicos.
Resultados e Discussões 74
4.2 Substâncias isoladas e identificadas
O estudo fitoquímico realizado com as espécies Piper caldense, P. bowiei, P.
permucronatum, P. carniconnectivum levou ao isolamento e identificação de 13
substâncias (Tabela 10).
Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum (continua).
Cromenos
P. bowiei (K-364 Folhas)
(1) 2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-carboxilato de metila
P. bowiei (K-364 Folhas)
(2) 8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-carboxilato de metila
Flavonas
P. permucronatum (K-1210 Folhas)
(3) 7-O-metil-luteolina
2-(3’,4’-di-hidroxifenil)-5-hidroxi-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
P. caldense (K-951 Folhas)
(4) velutina
5-hidroxi-2-(4’-hidroxi-3’-metoxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
P. carniconnectivum (K-1600 Folhas)
(5) Scrofuleina
5-hidroxi-2-(4’-hidroxifenil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
O
O
O
R
(1) R= H
(2) R= OH
O
O
R4
R3
OH
R1
R2
R1 R2
R3 R4
(3) H OCH3 OH OH
(4) H OCH3 OCH
3 OH
(5) OCH3 OCH
3 H OH
Resultados e Discussões 75
Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum (continuação).
Flavanonas
P. bowiei (K-364 Folhas)
(6) di-hidrowogonina
(2S)-2,3-di-hidro-5,7-di-hidroxi-2-fenil-8-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
P. permucronatum (K-1210 Folhas)
(7) sakuranetina
(2S)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(4’-hidroxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
Protoflavonoides
P. carniconnectivum (K-1441- Folhas)
(8) (2S,1’R)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’-cicloexen-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
Obtido através da hidrogenação de 8
(8a) (2S)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
P. carniconnectivum (K-1441- Folhas)
(9) (2S,1’R)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’,2’-dihidroxi-4’-oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
P. carniconnectivum (K-1600- Folhas)
(10) 5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
P. carniconnectivum (K-1600- Folhas)
(11) 5-hidroxi-2-(1’,4’-di-hidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona
O
O
R3
OH
R1
R2
R1 R2 R3
(6) OH OCH3 H
(7) OCH3 H
OH
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
OH
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
Resultados e Discussões 76
Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum (conclusão).
Derivados de ácidos benzoicos prenilados
P. caldense (K-951 Folhas)
(12) ácido-3-[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-il]-4,5-di-hidroxibenzoico,
ácido caldensínico
Obtido através da reação de metilação de 12.
(12a) 3,4-dimetoxi-5-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca-2’E, 6’E, 10’E,14’-tetraen-1’-il]-benzoato
de metila
Obtido através da reação de acetilação de 12.
(12b) ácido-3,4-bis-(acetiloxi)-5-[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1-il]
benzoico
Obtido através da reação de hidrogenação de 12.
(12c) Ácido benzenododecanoico-5-carboxi-2,3-di-hidroxi-ε,ι-dimetil-α-(4-metilpentila)
P. carniconnectivum (K-1441 Folhas)
(13) ácido-3-[(2’E,6’E,10’Z)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-il]-4-metoxibenzoico
Obtido através da reação de metilação de 13.
(13a) 4-metoxi-3-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca-2’E, 6’E, 10’Z,14’-tetraen-1’-il]-benzoato
de metila
COOR1
OR2
OR2
COOR1
(12) R1=R2= H
(12a) R1=R2 = CH3
(12b) R1= H R2= COCH3
COOH
OH
OH
COOH
R
(13) H
(13a) CH3
COOROCH3
COOR
Resultados e Discussões 77
4.3 Identificação estrutural do cromenos 1 e 2
As substâncias 1 e 2 (Figura 29) foram identificadas em pequena quantidade
como um óleo a partir do extrato das folhas de P. bowiei (K-364 FA), suas estruturas
foram determinadas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C e por EM-IE.
Figura 29. Estruturas das substâncias 1 e 2.
No espectro de massas de 1 obtido por EM-IE (Figura 30) observou-se um
pico em m/z 218 Da correspondente a [M]+•, compatível com a fórmula molecular
proposta C13H14O3. O íon fragmentário com m/z 203 Da (pico base) indicou a perda
de um grupo metílico. Para a substância 2 observou-se um pico em m/z 234 Da,
correspondente a [M]+•, sendo que a diferença de 16 Da observada, corresponde à
presença de um grupo hidroxila na posição 8, sendo proposta a fórmula molecular
C13H14O4.
Figura 30. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 1 e b) 2.
O
O
O
R
(1) R= H
(2) R= OH
50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
100
7258
86115
144
187
203
Inte
nsid
ade r
ela
tiva (
%)
m/z
218
50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
100
3951
7794
115
129 160174
203
234
Inte
nsid
ade R
ela
tiva
m/z
219a) b)
[M] +•
[M] +•
Resultados e Discussões 78
GFREITAS.007
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5Chemical Shift (ppm)
5.5
55.6
0
6.2
56.3
0
6.6
86.7
3
7.1
9
7.6
1
7.7
17.7
5
No espectro de RMN de 1H de 1 (200 MHz, CDCl3) (Figura 31) observou-se a
presença de um duplo dupleto em 7,75 (J 2,2 e 8,4 Hz, 1H, H-7) e dois dubletos
em 7,61 (2,2 Hz, 1H, H-5) e 6.70 (8,4 Hz, 1H, H-8) indicativos de um sistema
aromático 1,2,4-trissubstituído. Observou-se também dois dupletos em 6,27 (9,9
Hz, 1H, H-4) e 5,58 (9,9 Hz, 1H, H-3) referentes aos hidrogênios da dupla ligação
nas posições 3 e 4. O espectro apresentou ainda um simpleto em 3,80 (3H, H-12)
correspondente aos hidrogênios da metoxila do grupo metílico e um simpleto em
1,38 (6H, H-9 e H-10) referente às metilas C-10 e C-11.
Figura 31. Espectro de RMN de 1H de 1 (200 MHz, CDCl3).
No espectro de RMN de 13C de 1 (Figura 32) observou-se sinais
correspondentes a 12 átomos de carbono, sendo um correspondente a carbonila do
grupo éster em 166,9 (C-9), um carbono metoxílico em 51,8, seis carbonos
referentes ao anel aromático em 120,6 (C-4a), 131,1 (C-5), 122,5 (C-6), 131,0 (C-
GFREITAS.007
8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)
6.523.351.000.970.970.931.07
0.0
0
1.3
8
3.8
0
5.5
55.6
0
6.2
56.3
06.6
86.7
3
7.1
9
7.6
17.7
17.7
5
H-7 dd, 2.2
e 8.4 Hz
H-5 d, 2.2 Hz
H-8 d, 8.4 Hz
H-4 d, 9.9 Hz
H-3 d, 9.9 Hz
OCH3
H-10 e H-11
O
O
O2
45
7
9
12
811
Resultados e Discussões 79
7), 116,1 (C-8) e 157,1 (C-8a). Observou-se também dois carbonos olefínicos em
121,7 (C-3) e 128,1 (C-4), um carbono carbinólico em 77,4 (C-2) e dois carbonos
referentes às metilas em 28,3 (C-10 e C-11).
Os dados de RMN e EM foram comparados com a literatura possibilitando a
identificação da substância 1 como sendo o cromeno 2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-
carboxilato de metila (Diaz; Arias; Joseph-Nathan, 1987) (Tabela 11).
A ocorrência deste cromeno foi também relatada nas espécies Piper aduncum
(Orjala, Jimmy et al., 1993), P. dilatatum (Terreaux; Hostettmann; Kurt, 1998), P.
hostmannianum (Diaz; Arias; Joseph-Nathan, 1987), P. mollicomum (Lago et al.,
2007) e P. taboganum (Roussis; Ampofo; Wiemer, 1990).
Figura 32. Espectro de RMN de 13C de 1 (50 MHz, CDCl3).
No espectro de RMN de 1H da substância 2 (Acetona-d6, 500 MHz) (Figura
33) foram observados dois dupletos em 7,35 (1H, J 2,0) e 7,27 (1H, J 2,0)
GFREITAS.008
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0Chemical Shift (ppm)
28.3
0
51.8
3
76.3
777.0
077.3
777.6
4
116.1
3120.6
3121.6
8122.4
8128.0
6131.0
1131.0
6
157.1
4
166.8
5
C-2
C-6
C-4 C-7/C-5
OCH3
C-10/C-11
C-9 C-8a C-4a
C-3
C-8
Resultados e Discussões 80
indicativos de um sistema aromático 1,3,4,5-tetrassubstituído com a presença de um
grupo hidroxílico no carbono 8, diferenciando de 1 pela hidroxilação observada em
C-8.
Os dados de RMN e EM de 2 foram comparados com a literatura levando à
sua identificação como sendo o cromeno 8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-
carboxilato de metila (Orjala, Jimmy et al., 1993) (Tabela 11).
A ocorrência deste cromeno foi também relatada nas espécies Piper aduncum
(Orjala, Jimmy et al., 1993), P. hostmannianum (Lago et al., 2009) e P. mollicomum
(Lago et al., 2007).
Figura 33. Espectro de RMN de 1H de 2 (500 MHz, Acetona –d6).
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm
0.0
00
1.4
45
2.0
45
2.0
50
2.0
54
2.0
58
2.0
63
3.8
17
5.8
02
5.8
22
6.4
55
6.4
75
7.2
70
7.2
74
7.3
57
7.3
61
6.0
6
2.9
0
0.9
7
1.0
0
0.8
10.8
7
5.86.06.26.46.66.87.07.2 ppm
O
O
O
OH
2
45
7
9
12
811
10
H-4 d, 10,0 Hz
H-3 d, 10,0 Hz
H-5 d, 2.0 Hz
H-7 d, 2.0 Hz
OCH3
Resultados e Discussões 81
Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C de 1 e RMN de 1H de 2.
Posição
1 2
1H
a
13C
a
1H lit
b
13C lit
b
1H
c
1H lit
d
2 - 77,4 - 77,2 - -
3 5,58 (1H, d, 9,9) 121,7 5,66 (1H, d, 9,0) 121,5 5,81 (1H, d, 10) 5,66 (1H, d, 9,9)
4 6,27 (1H, d, 9,9) 128,1 6,40 (1H, d, 9,0) 127,9 6,46 (1H, d, 10) 6,35 (1H, d, 9,9)
4a - 120,6 - 120,5 - -
5 7,61 (1H, d, 2,2) 131,1 7,70 (1H, d, 2,0) 130,9 7,27 (1H, d, 2,0) 7,33 (1H, d, 1,8)
6 - 122,5 - 122,4 - -
7 7,75 (1H, dd, 2,2 e 8,4)
131,0 7,85 (1H, dd, 2,0
e 7,5) 130,8 7,35 (1H, d, 2,0) 7,48 (1H, d, 1,8)
8 6,70 (1H, d, 8,4) 116,1 6,82 (1H, d, 7,5) 115,9 - -
8a - 157,1 - 156,9 - -
9 - 166,9 - 166,6 - -
10 1,38 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 1,49 (6H, s)
11 1,38 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 1,49 (6H, s)
OCH3 3,80 (3H, s) 51,8 3,87 (3H, s) 51,7 3,82 (3H, s) 3,88 (3H, s)
a CDCl3, 200 e 50 MHz;
b CDCl3,
90 e 25,2 MHz (Diaz et al., 1987);
c Acetona-d6, 500 MHz;
d CDCl3,
300 MHz (Orjala, Jimmy et al., 1993), em ppm; J em Hz.
O
O
O
OH
2
45
7
9
12
811
10O
O
O2
45
7
9
12
811
Resultados e Discussões 82
4.4 Identificação estrutural das flavonas 3, 4 e 5
As flavonas 3, 4 e 5 (Figura 34) isoladas de P. permucronatum, P. caldense e
P. carniconnectivum, respectivamente, foram identificadas através dos espectros de
RMN de 1H e 13C e EM.
Figura 34. Estruturas das substâncias 3, 4 e 5.
As fórmulas moleculares de 3, 4 e 5 foram estabelecidas de acordo com os
espectros de massas de alta resolução obtidos por EM-ESI.
Substância 3
Para a substância 3 (Figura 35), isolada de P. permucronatum, observou-se
um pico em m/z 301,0723 Da no espectro de massas de alta resolução (Figura 36),
compatível com a fórmula molecular proposta C16H12O6 (valor calculado para [M +
H]+: 301,0712 Da).
Figura 35. Estrutura da substância 3.
O
O
R4
R3
OH
R1
R2
A
B
C
R1 R2
R3 R4
(3) H OCH3 OH OH
(4) H OCH3 OCH3 OH
(5) OCH3 OCH3 H OH
O
O
OH
OH
H3CO
OH
2
45
71'
4'
3'
Resultados e Discussões 83
Figura 36. Espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF) da substância 3.
Na análise do espectro de RMN de 1H de 3 observou-se sinais
correspondentes a dez hidrogênios. O simpleto em 12,98 (1H, OH-5) foi atribuído à
um hidrogênio de hidroxila quelatada. Observou-se um simpleto em 3,93 (3H)
correspondente a um grupo metoxilíco ligado ao carbono C-7 do anel aromático
(Figura 37).
Figura 37. Espectro de RMN de 1H de 3 (Acetona-d6, 500 MHz).
301.0723
+MS, 12.8min #762
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
5x10
Intens.
270 280 290 300 310 320 330 m/z
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
2.0
42
.05
2.0
52
.05
2.0
62
.84
3.9
3
6.3
26
.33
6.6
16
.67
6.6
87
.00
7.0
27
.48
7.4
97
.51
7.5
27
.53
12
.98
3.0
7
0.9
20
.98
0.9
41
.00
1.0
00
.95
0.8
1
Current Data ParametersNAME Sub 07EXPNO 12PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20101130Time 18.59INSTRUM spectPROBHD 5 mm Dual 13C/PULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 64DS 4SWH 8064.516 HzFIDRES 0.123055 HzAQ 4.0632820 secRG 4DW 62.000 usecDE 10.00 usecTE 300.0 KD1 3.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 10.90 usecPL1 -5.00 dBSFO1 500.1334952 MHz
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1300098 MHzWDW EMSSB 0LB 0.30 HzGB 0PC 1.00
7.50 ppm 7.0 ppm 6.65 ppm 6.35 ppm
OH-5
[M+H]+
H-2’ d, 2,2 Hz
H-6’ dd, 2,2 e 8,5Hz
H-5’ d, 8,5 Hz
H-8 d, 2,3 Hz
H-3 s
H-6 d, 2,3 Hz
OCH3-7
Resultados e Discussões 84
Foram observados também um duplo dupleto em 7,50 (2,2 e 8,5 Hz, 1H,
H-6’) e dois dupletos em 7,52 (2,2 Hz, 1H, H-2’) e 7,01 (8,5 Hz, 1H, H-5’)
indicativos de um sistema aromático 1,3,4-trissubstituído, atribuídos aos hidrogênios
do anel B da flavona. Os dupletos observados em 6,68 (2,3 Hz, 1H, H-8) e 6,32
(2,3 Hz, 1H, H-6) são indicativos de um sistema aromático 1,2,3,5-tetrassubstituido,
e caracterizam o anel A da flavona. O simpleto observado em 6,61 (1H)
corresponde ao hidrogênio olefínico H-3 do anel C.
Os dados de 3 de RMN de 1H e 13C (Tabela 12) foram comparados aos da
literatura levando à sua identificação como sendo a flavona 2-(3’,4’-di-hidroxifenil)-5-
hidroxi-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também conhecida como 7-O-metil-
luteolina (Ahmad et al., 2000). Este é o primeiro relato desta flavona em uma
espécie de Piper.
Substância 4
Para a substância 4 (Figura 38), isolada de P. caldense, observou-se um
pico em m/z 315,0863 Da, no espectro de massas de alta resolução (Figura 39),
compatível com a fórmula molecular proposta C17H14O6 (valor calculado para [M +
H]+: 315,0869 Da).
Figura 38. Estrutura da substância 4.
O
O
OH
OH
H3CO
OCH3
2
45
71'
4'
3'
Resultados e Discussões 85
Figura 39. Espectro de massas de alta resolução de 4 (ESI-TOF).
A flavona 4 apresentou a mesma substituição observada no anel A de 3, um
sistema aromático 1,2,3,5-tetrassubstituído com dois dupletos referentes aos
hidrogênios meta em 6,49 (2,3 Hz, 1H, H-8) e 6,37 (2,3 Hz, 1H, H-6) (Figura 40).
O anel B apresentou sinais indicativos de um sistema aromático 1,3,4-
trissubstituído assim como observado em 3, no entanto, com uma metoxila em C-3’.
Foram observados um duplo dupleto em 7,48 (2,1 e 8,4 Hz, 1H, H-6’) e dois
dupletos em 7,33 (2,1 Hz, 1H, H-2’) e 7,04 (8,4 Hz, 1H, H-5’). O simpleto
observado em 6,57 (1H) corresponde ao hidrogênio da olefínico H-3.
Figura 40. Espectro de RMN de 1H de 4 (500 MHz, CDCl3).
284.3315
315.0863
337.0692
+MS, 11.5-11.9min #(689-710)
0
1
2
3
4
5
4x10
Intens.
280 290 300 310 320 330 340 350 m/z
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
0.0
10
.07
1.2
41
.25
1.2
61
.27
1.6
12
.04
2.1
73
.49
3.8
93
.89
3.9
83
.99
3.9
94
.01
4.0
14
.12
4.1
36
.04
6.3
76
.38
6.4
96
.49
6.5
77
.03
7.0
57
.26
7.3
37
.33
7.4
87
.48
7.4
97
.50
12
.79
2.9
53
.16
0.9
11
.01
1.0
11
.04
1.0
01
.02
0.9
4
Current Data ParametersNAME Sub 01EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080117Time 15.09INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 64DS 0SWH 8169.935 HzFIDRES 0.124663 HzAQ 4.0108533 secRG 203.2DW 61.200 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KD1 5.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecPL1 0 dBSFO1 500.1335431 MHz
F2 - Processing parametersSI 65536SF 500.1300118 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
7.407.457.50 ppm 7.05 ppm 6.406.456.506.55 ppm
[M+H]+
[M+Na]+
H-6’ dd, 2,2 e 8,5 Hz
H-2’ d, 2,1 Hz
H-5’ d, 8,5 Hz
H-6 d, 2,3 Hz
H-8 d, 2,3 Hz
H-3 s
OH-5
OCH3-7 OCH3-3’
Resultados e Discussões 86
As posições das metoxilas foram determinadas através do espectro de
HMBC, no qual foi possível observar as correlações dos hidrogênios em 3,89 com
C-7, assim como os hidrogênios H-6 e H-8. Os hidrogênios da segunda metoxila em
4,01 se correlacionam com C-3’ assim como H-5’ e H-2’ (Figura 41).
Figura 41. Correlações HMBC selecionadas de 4.
Os dados de RMN de 1H e 13C de 4 (Tabela 11). foram comparados aos da
literatura levando à sua identificação como sendo a flavona hidroxi-2-(4’-hidroxi-3’-
metoxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também conhecida como velutina
(Jensen et al., 1994). A ocorrência desta flavona em Piper foi relatada em P. clarkii
(Jensen et al., 1994), P. porphyrophyllum (Rajudin et al., 2010) e P. umbellata
(Baldoqui et al., 2009).
Substância 5
Para a substância 5 (Figura 42), isolada de P. carniconnectivum, observou-
se um pico em m/z 315,0869 Da, no espectro de massas de alta resolução (Figura
43), compatível com a fórmula molecular proposta C17H14O6 (valor calculado para [M
+ H]+: 315,0869 Da).
Resultados e Discussões 87
Figura 42. Estrutura da substância 5.
Figura 43. Espectro de massas de alta resolução da substância 5 (ESI-TOF).
A substância 5 apresentou uma substituição diferente de 3 e 4 no anel A,
sendo um sistema aromático pentassubstituído com o simpleto em 6,86 referente a
H-8. No anel B observou-se a presença de apenas um substituinte, uma hidroxila na
posição C-4’. Os sinais dos hidrogênios simétricos do anel B foram observados em
7,03 (d, 9,0 Hz, 2H, H-3’ e H-5’) e 7,97 (d, 9,0 Hz, 2H, H-2’ e H-6’) (Figura 44).
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO2
45
71'
4'
300.0632 305.1560
315.0869
337.0692
+MS, 12.7min #761
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
290 300 310 320 330 m/z
[M+H]+
[M+Na]+
Resultados e Discussões 88
Figura 44. Espectro de RMN de 1H de 5 (500 MHz, Acetona-d6).
Os dados de RMN de 1H e 13C de 5 (Tabela 12) foram comparados aos da
literatura levando à sua identificação como sendo a flavona 5-hidroxi-2-(4’-
hidroxifenil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, conhecida também como
scrofuleina (Rao; Kingston; Spittler, 1970). Este é o primeiro relato da ocorrência
desta flavona em Piper.
As atribuições dos deslocamentos químicos das flavonas 3, 4 e 5 foram
realizadas de acordo com os espectros de RMN de 1H, 13C, HSQC e HMBC (Tabela
12).
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
-0.0
0
2.0
52
.06
2.0
6
2.8
9
3.8
03
.99
6.6
96
.86
7.0
37
.03
7.0
47
.05
7.9
67
.97
7.9
87
.98
12
.96
2.9
73
.20
1.0
21
.00
2.0
8
2.0
5
0.8
6
Current Data ParametersNAME K1600 P3_2EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121216Time 13.23INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zg30TD 65536SOLVENT AcetoneNS 16DS 0SWH 7507.507 HzFIDRES 0.114555 HzAQ 4.3647475 secRG 203DW 66.600 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.1332608 MHzNUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 W
F2 - Processing parametersSI 65536SF 500.1300071 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
6.86.97.0 ppmppm
H-2’ e H-6’
d, 9,0 Hz
H-8 s
H-3 s
OH-5
OCH3-6 OCH3-7
H-3’ e H-5’ d, 9,0 Hz
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 89
Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C de 3, 4 e 5 (500 e 125 MHz).
3 4 5
Posição 1H * 13C * 1H ** 13C ** 1H * 13C *
2 - 165,5 - 164,1 - 165,9
3 6,61 (s, 1H) 104,5 6,57 (s, 1H) 104,5 6,69 (s, 1H) 103,6
4 - 183,3 - 182,4 - 184,0
4 a - 106,1 - 105,5 - 106,9
5 - 163,2 - 162,2 - 154,5
6 6,32 (d, 2,3, 1H) 98,8 6,37 (d, 2,3, 1H) 98,1 - 134,0
7 - 166,7 - 165,5 - 160,6
8 6,68 (d, 2,3, 1H) 93,9 6,49 (d, 2,3, 1H) 92,7 6,86 (s, 1H) 91,7
8 a - 158,8 - 157,7 - 154,5
1' - 123,8 - 123,4 - 123,7
2' 7,52 (d, 2,2, 1H) 114,3 7,33 (d, 2,1, 1H) 108,3 7,97 (d, 9,0, 1H) 129,0
3' - 146,6 - 146,9 7,03 (d, 9,0, 1H) 116,6
4' - 150,3 - 149,3 - 162,5
5' 7,01 (d, 8,5, 1H) 116,8 7,04 (d, 8,4, 1H) 115,0 7,03 (d, 9,0, 1H) 116,5
6' 7,50 (dd, 2,2 e 8,5, 1H) 120,3 7,48 (dd, 2,1 e 8,4, 1H) 120,8 7,97 (d, 9,0, 1H) 129,0
-OCH3-6 - - - - 3,80 (s, 3H) 60,4
-OCH3-7 3,93 (s, 3H) 56,5 3,89 (s, 3H) 55,8 3,99 (s, 3H) 56,7
-OCH3-3’ - - 4,01 (s, 3H) 56,2 - -
-OH - 5 12,98 (s, 1H) - 12,79 (s, 1H) - 12,96 (s, 1H) -
-OH – 4’ *** - 6,04 (s, 1H) - *** -
*- Acetona-d6; **-CDCl3; *** - não observado; J em Hertz; em ppm;
O
O
OH
OH
H3CO
OH
2
45
71'
4'
3'
O
O
OH
OH
H3CO
OCH3
2
45
71'
4'
3'
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 90
4.5 Identificação estrutural das flavanonas 6 e 7
As flavanonas 6 e 7 (Figura 45) isoladas de P. bowiei e P. permucronatum,
respectivamente, foram identificadas através dos espectros de RMN de 1H e 13C e
EM.
Figura 45. Estruturas das substâncias 6 e 7.
No espectro de massas de ambas as flavanonas 6 e 7 (IE) (Figura 46)
observou-se um pico em m/z 286 Da correspondente ao pico do íon molecular [M]+•,
este pico associado aos dados de RMN de 13C levou à fórmula molecular C16H14O5.
Figura 46. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 6 e b) 7.
O
O
R3
OH
R1
R2
A
B
C
R1 R2 R3
(6) OH OCH3 H
(7) OCH3 H
OH
50 100 150 200 250 300
0
20
40
60
80
100
271
93
39
51
69
77 104
110
139
153
182
167
209
Inte
nsid
ade
re
lativa
m/z
286
50 100 150 200 250 300
0
20
40
60
80
100
41
55
147
110
91
69
95
120
138193
180
167
Inte
nsid
ade
re
lativa
m/z
286
a) b)
Resultados e Discussões 91
Apesar de ambas as substâncias apresentarem a mesma fórmula molecular,
pôde-se observar as diferenças estruturais através dos espectros de RMN de 1H.
Substância 6
Para a substância 6 (Figura 47), isolada de P. bowiei, no espectro de RMN
de 1H (CDCl3, 300 MHz) (Figura 48), observou-se três duplos dupletos em 5,48
(3,0 e 12,9 Hz, 1H, H-2), 3,08 (12,9 e 17,2 Hz, 1H, H-3) e 2,86 (3,0 e 17,3Hz, 1H, H-
3) correspondente ao sistema ABX do anel C de flavanonas.
O
OOH
OH
OCH3
2
45
71'
3'
Figura 47. Estrutura da substância 6.
Observou-se um simpleto em 11,88 (OH-5) referente ao hidrogênio de
hidroxila quelada, um simpleto em 3,88 (3H, OCH3-8) referente a uma metoxila no
anel A. A presença de simpleto em 6,15 (1H, H-6) é indicativa de um sistema
aromático pentassubstituído, e a presença de um multipleto na região de 7,39-7,49
(5H) sugere a presença de um anel B monossubstituído.
Resultados e Discussões 92
Figura 48. Espectro de RMN de 1H de 6 (CDCl3, 300 MHz).
Os dados de RMN de 1H e 13C de 6 (Tabela 13). foram comparados aos da
literatura sendo identificada como a flavanona (2S)-2,3-di-hidro-5,7-di-hidroxi-2-fenil-
8-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também conhecida como di-hidrowogonina
(Vinciguerra et al., 2003). Este é o primeiro relato da ocorrência desta flavanona em
Piper.
Substância 7
Para a substância 7 (Figura 49), isolada de P. permucronatum, o espectro de
RMN de 1H (Acetona-d6, 300 MHz) (Figura 50) apresentou dois simpletos em
12,15 (1H) e 8,57 (1H) referentes às hidroxilas em C-5 e C-4’, respectivamente.
Observou-se um simpleto em 3,85 (3H) correspondente a uma metoxila e três
duplos dupletos em 5,49 (3,1 e 12,9 Hz, 1H, H-2), 3,22 (12,9 e 17,2 Hz, 1H, H-3b)
e 2,76 (3,1 e 17,2 Hz, 1H, H-3a) correspondentes ao sistema ABX do anel C.
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
-0.0
0
2.8
52.8
52.8
82.8
93.0
63.0
83.0
93.1
23.8
85.4
75.4
75.4
95.5
06.1
56.5
37.2
67.3
97.4
07.4
17.4
17.4
17.4
27.4
27.4
37.4
37.4
47.4
47.4
57.4
57.4
67.4
67.4
67.4
67.4
77.4
77.4
87.4
87.4
87.4
97.4
9
11.8
8
1.0
21.0
3
3.0
2
1.0
0
0.9
6
0.9
4
5.1
0
0.9
9
Current Data ParametersNAME Sub 05 (6)EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120607Time 14.50INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 8SWH 7500.000 HzFIDRES 0.114441 HzAQ 4.3691168 secRG 203DW 66.667 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 WSFO1 500.1332522 MHz
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1300126 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
7.457.50 ppm 5.50 ppm 2.93.03.1 ppm
OH-5
H-2 dd, 3,0 e 12,9 Hz
Anel-B
OCH3-8
H-3a dd, 12,9 e 17,2 Hz H-3b
dd, 3,0 e 17,2 Hz
H-6
Resultados e Discussões 93
Figura 49. Estrutura da substância 7.
A presença de dois dupletos em 6,04 (2,2 Hz, 1H, H-6) e 6,06 (2,2 Hz, 1H,
H-8), indicou a presença de um anel A 1,2,3,5-tetrassubstituído. Os dois dupletos em
6,91 (8,8 Hz, 2H, H-3’ e H-5’) e 7,40 (8,8 Hz, 2H, H-2’ e H-6’) são indicativos de um
sistema aromático 1,4-dissubstituído do anel B da flavanona.
Figura 50. Espectro de RMN de 1H de 7 (Acetona-d6, 300 MHz).
Os valores de RMN de 1H e 13C da substância 7 (Tabela 13) foram
comparados com dados da literatura levando à sua identificação como sendo 2,3-di-
hidro-5-hidroxi-2-(4’-hidroxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também
denominada sakuranetina (Vasconcelos; Silva; Cavaleiro, 1998).
O
O
OH
OH
H3CO
2
45
71'
4'
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
-0.0
1-0
.00
2.0
42
.05
2.0
52
.06
2.0
72
.08
2.0
92
.09
2.7
32
.74
2.7
92
.80
2.8
32
.86
3.1
73
.21
3.2
33
.27
3.8
5
5.4
65
.47
5.5
05
.51
6.0
36
.04
6.0
56
.06
6.8
86
.89
6.9
06
.91
6.9
26
.93
7.3
87
.38
7.3
97
.39
7.4
07
.40
7.4
17
.41
7.4
27
.42
8.5
7
12
.15
1.1
95
.05
1.1
4
0.9
9
1.7
0
1.9
8
2.0
1
0.8
0
0.7
7
Current Data ParametersNAME Sub 06EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120607Time 7.55INSTRUM spectPROBHD 5 mm BBO BB-1HPULPROG zgTD 65536SOLVENT AcetoneNS 16DS 4SWH 4504.504 HzFIDRES 0.068733 HzAQ 7.2745461 secRG 161DW 111.000 usecDE 6.50 usecTE 297.1 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.75 usecPLW1 16.50000000 WSFO1 300.1319530 MHz
F2 - Processing parametersSI 131072SF 300.1300029 MHzWDW EMSSB 0LB 0.30 HzGB 0PC 1.00
6.06.57.0 ppm 3.3 ppm2.8 ppm
H-6’ H-2’
OCH3-7
H-5’ H-3’
H-6 H-8
H-2
H-3a H-3b
OH-5
OH-4’
Resultados e Discussões 94
A ocorrência desta flavanona em Piper foi relatada em P. crassinervium
(Lopes et al., 2008), P. hostmannianum (Portet et al., 2008), P. lhotzkyanum (Lago et
al., 2007) e P. marginatum (Reigada et al., 2007).
As atribuições dos deslocamentos químicos das flavanonas 6 e 7 foram
realizadas de acordo com os espectros de RMN de 13C, HSQC e HMBC (Tabela 13).
Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C de 6 e 7 (300 e 75 MHz).
6
7
Posição 1H * 13C * 1H ** 13C **
2 5,48 (dd, 3,0 e 12,9, 1H) 79,6 5,49 (dd, 3,1 e 12,9, 1H) 80,1
3 3,08 (dd, 12,9 e 17,2, 1H)
2,86 (dd, 3,0 e 17,2, 1H) 43,5
2,76 (dd, 3,1 e 17,2, 1H)
3,22 (dd, 12,9 e 17,2, 1H) 43,5
4 - 195,6 - 197,7
4 a - 103,0 - 103,7
5 - 159,6 - 165,0
6 6,15 (s, 1H) 96,0 6,04 (d, 2,2, 1H) 95,5
7 - 157,9 - 168,9
8 - 127,6 6,06 (d, 2,2, 1H) 94,6
8 a - 152,8 - 164,2
1' - 138,3 - 130,7
2' 7,39-7,49 (m, 5H) 126,0 7,40 (d, 8,8, 1H) 129,6
3' 7,39-7,49 (m, 5H) 128,9 6,91 (d, 8,8, 1H) 116,2
4' 7,39-7,49 (m, 5H) 128,9 - 158,7
5' 7,39-7,49 (m, 5H) 128,9 6,91 (d, 8,8, 1H) 116,2
6' 7,39-7,49 (m, 5H) 126,0 7,40 (d, 8,8, 1H) 129,6
-OCH3-8 3,88 (s, 3H) 61,6 - -
-OH-5 11,88 (s, 1H) - 12,15 (s, 1H) -
-OH-7 6,53 (s, 1H) - - -
-OCH3-7 - - 3,85 (s, 3H) 56,3
-OH - 4’ - - 8,57(1H, s) -
*-CDCl3;**- Acetona-d6; J em Hertz; em ppm;
O
OOH
OH
OCH3
2
45
71'
3'
O
O
OH
OH
H3CO
2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 95
4.6 Identificação estrutural das substâncias 8, 9 e 8a
As substâncias 8 e 9 (Figura 51) foram isoladas a partir do extrato em AcOEt
das folhas de Piper carniconnectivum (código: K-1441 FA) e tiveram suas estruturas
determinadas a partir dos espectros de RMN de 1H, 13C, HSQC, HMBC, COSY e
EM.
Figura 51. Estruturas das substâncias 8 e 9.
Substância 8
A fórmula molecular de 8 (Figura 52), isolada de P. carniconnectivum, foi
estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução, no qual se
observou um pico em m/z 335,1121 Da, correspondente ao íon quasimolecular [M +
H]+, levando à fórmula molecular C17H18O7 (valor calculado para [M + H]+: 335,1131
Da). Foi observado também um íon correspondente ao aduto de sódio em m/z
357,0925 Da [M+Na]+ (Figura 53). A principal fragmentação observada foi referente à
perda do anel B, levando ao íon fragmentário m/z 223,0596 Da.
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
2
45
71'
4'
2'
Figura 52. Estrutura da substância 8.
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
8
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
OH
9
Resultados e Discussões 96
Figura 53. Espectro de massas de alta resolução (HR-ESI-TOF) da substância 8.
O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 54) indicou a
presença de grupos hidroxílicos devido à presença das bandas em 3389 e 3302 cm-1
provenientes da deformação axial de O-H e com a banda em 1310 cm-1 proveniente
da deformação axial da ligação C-O de grupo fenol. Foram observadas também
duas bandas de absorção em 1674 e 1637 cm-1 referentes à deformação axial de
C=O das carbonilas. As bandas referentes às deformações axiais simétricas e
assimétricas da ligação C-H dos grupos metilícos e metilênicos foram observadas na
região de 2950 cm-1.
Figura 54. Espectro de absorção na região do infravermelho de 8 (KBr).
207.0636
223.0596
247.0937
275.0900
289.1066
317.1009
335.1121
357.0925
+MS, 10.4min #623
0
2
4
6
4x10
Intens.
150 200 250 300 350 m/z
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
50
60
70
80
90
100
833
1674
2950
3302
3389
1118
1452
1211
1310
Wavenumber (cm-1)
Ab
so
rba
nce
(%
)
1637
1674
[M+H]+
[M+Na]+
[M+H-Anel B]+
Resultados e Discussões 97
No espectro de RMN de 1H de 8 (Figura 55, Figura 56 e Figura 57) observou-
se sinais típicos de substância da classe das flavanonas, com um simpleto
correspondente a um hidrogênio de um sistema aromático penta-substituído em
6,09 (1H, H-8), dois simpletos correspondente a grupos metoxilícos em 3,83 (3H,
OCH3-7) e 3,89 (3H, OCH3-6) e um simpleto correspondente ao próton da hidroxila
(OH-5) quelatado com a carbonila (C-4) em 11,76, com este conjunto de sinais foi
possível determinar o anel A da flavanona.
Figura 55. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3).
Os sinais correspondentes ao anel C da flavanona foram caracterizados por
três duplos dupletos com padrão de acoplamento ABX em 4,44 (2,8 e 13,8 Hz, 1H,
H-2), 3,09 (13,8 e 17,2 Hz, 1H, H-3) e 2,68 (2,8 e 17,2, 1H, H-3). No entanto, os
sinais de hidrogênios aromáticos esperados para o anel B não foram observados,
estes foram substituídos por sinais correspondentes a quatro hidrogênios alifáticos
em 2,08 (ddd, 4,8, 10,2 e 13,5 Hz, H-6’b), 2,16 (dddd, 1,4, 5,3, 6,3 e 13,5 Hz, H-
6’a), 2,50 (dddd, 0,5, 4,8, 6,3 e 17,3 Hz , H-5’b) e 2,79 (ddd, 5,3, 10,2 e 17,3 Hz, H-
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
0.0
00
1.5
63
2.0
85
2.1
05
2.1
50
2.1
52
2.1
54
2.1
65
2.4
50
2.5
19
2.5
20
2.6
40
2.6
45
2.6
74
2.6
80
2.7
55
2.7
65
2.7
75
2.7
86
2.7
89
2.8
00
2.8
09
3.0
58
3.0
86
3.0
92
3.1
20
3.3
59
3.8
27
3.8
91
3.9
03
4.4
26
4.4
31
4.4
53
4.4
59
6.0
81
6.1
01
6.1
02
6.1
22
6.1
23
7.0
86
7.0
88
7.1
06
7.1
08
7.2
61
11.7
58
1.0
71.1
31.1
31.0
7
1.1
61.0
5
2.9
82.9
9
1.0
0
0.9
30.9
7
1.0
0
0.7
5
Current Data Parameters
NAME Sub 08
EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20110405Time 17.03
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm Dual 13C/
PULPROG zg
TD 65536
SOLVENT CDCl3
NS 128DS 4
SWH 7485.030 Hz
FIDRES 0.114212 Hz
AQ 4.3778548 secRG 362
DW 66.800 usec
DE 6.00 usec
TE 303.7 KD1 3.00000000 sec
TD0 1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 10.90 usec
PL1 -5.00 dBSFO1 500.1332511 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536SF 500.1300124 MHz
WDW EM
SSB 0LB 0.10 Hz
GB 0
PC 1.00
OH-5
Resultados e Discussões 98
5’a) e dois prótons olefínicos típicos de uma cicloexenona em 6,11 (dd, 0,5 e 10,3
Hz, H-3’) e 7,10 (dd, 1,4 e 10,3 Hz, H-2’).
Figura 56. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação de 7,2 a 3,5 ppm).
Figura 57. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação 3,17 a 2,60 e de 2,60 a 2,00 ppm).
4.04.55.05.56.06.57.0 ppm
3.8
27
3.8
91
3.9
03
4.4
26
4.4
31
4.4
53
4.4
59
6.0
81
6.1
01
6.1
02
6.1
22
6.1
23
7.0
86
7.0
88
7.1
06
2.9
8
2.9
9
1.0
0
0.9
30.9
7
1.0
0
7.10 ppm 6.10 ppm 4.45 ppm
2.652.702.752.802.852.902.953.003.053.103.15 ppm
2.6
40
2.6
45
2.6
74
2.6
80
2.7
55
2.7
65
2.7
75
2.7
86
2.7
89
2.8
00
2.8
09
3.0
58
3.0
86
3.0
92
3.1
20
2.052.102.152.202.252.302.352.402.452.502.55 ppm
2.0
85
2.0
95
2.1
05
2.1
15
2.1
50
2.1
52
2.1
54
2.1
62
2.1
65
2.1
66
2.4
50
2.4
84
2.4
86
2.5
09
2.5
19
2.5
20
H-2’ dd, 1,4 e 10,3 Hz H-3’
dd, 0,5 e 10,3 Hz
H-2 dd, 2,8 e 13,8 Hz
H-8
H-5’b dddd, 0,5, 4,8, 6,3 e 17,3 Hz
H-6’a
dddd, 1,4, 5,3, 6,3 e 13,5 Hz
H-6’b
ddd, 4,8, 10,2 e 13,5 Hz
H-5’a ddd, 5,3, 10,2 e
17,3 Hz
H-3b dd, 2,8 e 17,2 Hz
H-3a dd, 13,8 e 17,2 Hz
OCH3-6 OCH3-7
Resultados e Discussões 99
No espectro de RMN de 13C de 8 (Figura 59 e Figura 60) foram observados
sinais correspondentes a dezessete átomos de carbono. A atribuição dos
deslocamentos químicos foi realizada de acordo com os espectro de RMN 2D,
HSQC e HMBC (Figura 62). Foram observados dois sinais correspondentes a
carbono carbonílico, sendo um deles atribuído ao carbono C-4 em 196,0 e o
segundo em 198,3 foi atribuído ao carbono C-4’ do anel B, sugerindo a presença
de uma segunda carbonila no anel B não aromático. Esta modificação não usual no
anel B foi confirmada com as correlações HMBC observadas entre H-2’ com a
carbonila em 198,3 (C-4’), um carbono carbinólico em 69,7 (C-1’) além de um
carbono alifático em 30,9 (C-6’).
A conexão do anel B ao anel C foi confirmada com as correlações observadas
entre H-2’ e C-2, além de H-2 com C-2’. No experimento de HMBC observou-se
também correlação entre H-3’ com os carbonos em C-1’ e C-5’. Ao carbono C-1’ foi
associado uma segunda hidroxila (Figura 58).
Figura 58. Principais correlações HMBC observadas nos anéis B e C de 8.
O
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO
H
H
H
8
6
2
4
3'
5'
Resultados e Discussões 100
Figura 59. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3).
Figura 60. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3) (ampliação de 210 a 120 ppm e de 105 a 30 ppm).
As posições dos grupos metoxilas foram estabelecidas de acordo com as
correlações HMBC e NOESY observadas. No experimento de HMBC, o hidrogênio
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
30.8
633.2
035.7
5
56.2
060.8
3
69.7
076.7
577.0
077.2
581.8
391.4
8
102.8
5
130.2
5130.6
5
147.6
8154.8
0157.7
0160.7
6
195.9
6198.3
4
Current Data Parameters
NAME Sub 08EXPNO 13
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20100317
Time 23.51INSTRUM spect
PROBHD 5 mm Dual 13C/
PULPROG zgpg30TD 65536
SOLVENT CDCl3
NS 6327DS 4
SWH 32679.738 Hz
FIDRES 0.498653 HzAQ 1.0027508 sec
RG 32768DW 15.300 usec
DE 10.00 usec
TE 297.8 KD1 1.00000000 sec
d11 0.03000000 sec
DELTA 0.89999998 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 13C
P1 10.70 usec
PL1 2.00 dBSFO1 125.7716224 MHz
======== CHANNEL f2 ========
CPDPRG2 waltz16
NUC2 1H
PCPD2 92.00 usecPL2 -5.00 dB
PL12 12.69 dBPL13 17.00 dB
SFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536
SF 125.7577985 MHzWDW EM
SSB 0
LB 1.00 HzGB 0
PC 1.40
130135140145150155160165170175180185190195200 ppm
130.2
5
130.6
5
147.6
8
154.8
0
157.7
0
160.7
6
195.9
6
198.3
4
35404550556065707580859095100105 ppm
30.8
6
33.2
0
35.7
5
56.2
0
60.8
3
69.7
0
76.7
577.0
077.2
5
81.8
3
91.4
8
102.8
5
C-4a
C-8 C-2 C-1’ OCH3-7 C-3 C-5’
C-6’
C-4’ C-4 C-6
C-8a
C-5 C-2’
C-3’
C-7
OCH3-6
C-8a
C-7
Resultados e Discussões 101
H-8 ( 6,09) apresentou correlações com os carbonos em 130,7 (C-7) e 160,8 (C-
6) enquanto o hidrogênio da hidroxila em C-5 ( 11,76) apresentou correlação com
os carbonos em 160,8 (C-6), 102,9 (C-4a), 130,7 (C-7) e 154,9 (C-5).
Os hidrogênios de metoxila observados em 3,83 apresentaram correlação J3
com o carbono atribuído à C-6 e os hidrogênios da segunda metoxila em 3,90
apresentaram correlação com C-7. O experimento de NOESY (Figura 63) confirmou
o posicionamento dos grupos metoxilícos devido à correlação NOE observada entre
os hidrogênios metoxílicos de OCH3-7 com o hidrogênio aromático H-8 (Figura 61).
O
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO
H8
6
2
4
1'3'
5'
Figura 61. Correlações NOE (----) e HMBC ( ____) observadas no anel A de 8.
Figura 62. Mapa de contorno HMBC de 8 (ampliação nas regiões de 13,5 a 3,0
ppm em F2 e de 80,0 a 220,0 ppm em F1).
ppm
45678910111213 ppm
80
100
120
140
160
180
200
220
Current Data Parameters
NAME Sub 08
EXPNO 11
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20110416
Time 1.30
INSTRUM spectPROBHD 5 mm TBI 1H-13
PULPROG hmbcgplpndqf
TD 4096
SOLVENT DMSONS 64
DS 16
SWH 7485.030 Hz
FIDRES 1.827400 Hz
AQ 0.2736628 sec
RG 16384
DW 66.800 usec
DE 6.00 usec
TE 298.8 K
CNST2 145.0000000CNST13 6.0000000
d0 0.00000300 sec
D1 1.50000000 sec
d2 0.00344828 secd6 0.08333334 sec
D16 0.00020000 sec
IN0 0.00001530 sec
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 10.90 usec
p2 21.80 usec
PL1 -1.00 dB
SFO1 500.1335009 MHz
======== CHANNEL f2 ========
NUC2 13C
P3 12.60 usecPL2 -5.00 dB
SFO2 125.7716224 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====
GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100
GPNAM3 SINE.100
GPZ1 50.00 %
GPZ2 30.00 %GPZ3 40.10 %
P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parameters
TD 256SFO1 125.7716 MHz
FIDRES 127.655228 Hz
SW 259.834 ppm
FnMODE QF
F2 - Processing parameters
SI 2048
SF 500.1300087 MHz
WDW SINESSB 0
LB 0 Hz
GB 0
PC 1.40
F1 - Processing parameters
SI 512
MC2 QF
SF 125.7577426 MHz
WDW echo-antiechoSSB 0
LB 0 Hz
GB 0
OH-5/C-6 H-8/C-6 OCH3/C-6
OCH3/C-7 H-8/C-7
O
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO
H8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 102
Figura 63. Mapa de contorno do experimento 2D NOESY de 8 (ampliação na região de 7,5 a 3,5 ppm em F1 e F2).
A substância 8 (Figura 64), de estrutura inédita, foi caracterizada como sendo
a flavanona 2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’-cicloexen-1’-il)-6,7-dimetoxi-
4H-1-benzopiran-4-ona, os deslocamentos químicos de RMN de 1H e de 13C e as
correlações observadas nos experimentos de RMN 2D (Tabela 14).
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
8
2
45
71'
4'
2'
Figura 64. Estrutura da substância 8.
ppm
4.04.55.05.56.06.57.07.5 ppm
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
Current Data Parameters
NAME Sub 08
EXPNO 2
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20110412
Time 0.13
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm TBI 1H-13
PULPROG noesygpph
TD 2048
SOLVENT CDCl3
NS 16
DS 16
SWH 6983.240 Hz
FIDRES 3.409785 HzAQ 0.1466868 sec
RG 812.7
DW 71.600 usec
DE 6.00 usec
TE 300.0 K
d0 0.00005772 sec
D1 2.00000000 sec
D8 0.75000000 sec
D16 0.00030000 sec
IN0 0.00014320 sec
ST1CNT 0
TAU 0.37369999 sec
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 10.90 usec
p2 21.80 usec
PL1 -1.00 dBSFO1 500.1330008 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====
GPNAM1 SINE.100
GPNAM2 SINE.100
GPZ1 80.00 %
GPZ2 40.00 %
P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parameters
TD 512
SFO1 500.133 MHz
FIDRES 13.639141 Hz
SW 13.963 ppm
FnMODE States-TPPI
F2 - Processing parametersSI 1024
SF 500.1300093 MHz
WDW QSINE
SSB 2
LB 0 Hz
GB 0
PC 1.00
F1 - Processing parameters
SI 1024
MC2 States-TPPI
SF 500.1300086 MHz
WDW SINE
SSB 2
LB 0 Hz
GB 0
OCH3-7 / H-8
O
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO
H8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 103
Tabela 14. Dados de RMN de 1H e13C de 8 (500 e 125 MHz, DMSO-d6).
Posição 1H
13C HMBC COSY
2 4,44 (dd , 2,8, 13,8, 1H) 81,8 C4, C2’ H3a, H3b
3 -Ha
3-Hb
3,09 (dd, 13,8, 17,2, 1H)
2,68 (dd, 2,8, 17,2, 1H)
35,8 C2, C4, C1’
C4a, C4,
H2, H3b
H2, H3a
4 - 196,0 - -
4 a - 102,8 - -
5 - 154,8 - -
6 - 130,7 - -
7 - 160,8 - -
8 6,09 (s, 1H) 91,5 C4, C4a, C6, C7, C8a -
8 a - 157,8 - -
1’ - 69,7 - -
2’ 7,10 (dd, 1,4 e 10,3, 1H) 147,7 C2, C1’, C4’ e C6’ H3’
3’ 6,11 (dd, 0,5 e 10,3, 1H) 130,3 C1’ e C5’ H2’
4’ - 198,3 - -
5’-Ha
5’-Hb
2,79 (ddd, 5,3, 10,2, 17,3, 1H)
2,50 (dddd, 0,5, 4,8, 6,3, 17,3, 1H)
33,2 C1’, C4’, C6’
C1’, C4’, C6’
H6’b, H5’b
H6’a, H5’a
6’-Ha
6’-Hb
2,16 (dddd, 1,4, 5,3, 6,3,13,5, 1H)
2,08 (ddd, 4,8, 10,2, 13,5, 1H)
30,9 C2, C1’, C2’, C4’, C5’
C2, C1’, C2’, C4’, C5’
H6’b, H5’b
H6’a, H5’a
-OCH3 -6 3,83 (s, 3H) 60,8 C6 -
-OCH3-7 3,90 (s, 3H) 56,2 C7 -
-OH – 5 11,76 (s, 1H) - C4, C4a , C5, C6 e C7 -
-OH – 1’ 2,4 (s, 1H) - - -
J em Hertz; em ppm;
Substância 9
A fórmula molecular da substância 9 (Figura 65), isolada de P.
carniconnectivum, foi estabelecida como C17H20O8 baseada no espectro de HRESI-
MS ([M+H]+ 353,1236, calcd. 353,1236) (Figura 66) e dados de RMN.
Figura 65. Estrutura da substância 9.
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
OH
2
45
71'
4'
2'
Resultados e Discussões 104
Figura 66. Espectro de massas de alta resolução de 9 (ESI-TOF).
O espectro de absorção na região do infravermelho de 9 (Figura 67)
apresentou bandas de absorção em frequências semelhantes às observadas para 8,
sendo possível sugerir novamente a presença de grupos hidroxílicos devido à
presença das bandas em 3380 e 3309 cm-1 proveniente da deformação axial de O-H
e com a banda em 1296 cm-1 proveniente da deformação axial da ligação C-O de
grupo fenol. Foram observadas também bandas de absorção em 1717, 1644 e 1632
cm-1 referentes à deformação axial de C=O dos grupos carbonilícos. As bandas
referentes às deformações axiais simétricas e assimétricas da ligação C-H dos
grupos metilícos e metilênicos foram observadas na região entre 2969 e 2829 cm-1.
Figura 67. Espectro de absorção na região do Infravermelhor de 9 (KBr).
349.1803351.1733
353.1236
354.1266
355.1396
+MS, 4.5-4.6min #(266-275)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.254x10
Intens.
350 352 354 356 358 360 m/z
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
100
2829
29112969
3380
3309
3709
Absorb
ance (
%)
Wavenumber (cm-1)
[M+H]+
Resultados e Discussões 105
De acordo com os espectros de RMN de 1H e 13C, a substância 9 apresentou
um padrão de substituição similar ao da substância 8, com um simpleto em 6,15
(H-8) correspondente a um hidrogênio em um sistema aromático
pentassubstitituído, com duas metoxilas em 3,64 (s, 3H) e 3,84 (s, 3H) localizadas
nas posições C-6 e C-7, respectivamente (Figura 68, Figura 69 e Figura 70).
Figura 68. Espectro de RMN de 1H de 9 (DMSO-d6, 500 MHz).
Três duplos dupletos com padrão de acoplamento ABX do anel C da
flavanona foram observados em 4,62 (1H, J 13,7 e 3,0, H-2), 3,02 (1H, J 17,3 e
13,7, H-3a) e 2,57 (1H, J 17,3 e 3,0, H-3b). Os anéis A e C de 9 apresentaram a
mesma substituição observada para 8, no entanto os sinais correspondentes aos
hidrogênios da dupla ligação da enona no anel B de 8 não apareceram no espectro
de 9.
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
1.6
91
.87
1.8
82
.01
2.0
42
.05
2.0
82
.14
2.1
42
.15
2.1
72
.17
2.1
82
.49
2.5
02
.50
2.5
02
.51
2.5
32
.54
2.5
52
.56
2.5
72
.86
2.8
62
.88
2.8
92
.99
3.0
23
.02
3.0
53
.30
3.3
43
.42
3.6
33
.84
3.8
54
.42
4.6
04
.61
4.6
34
.64
5.3
25
.33
6.1
51
1.9
3
1.0
11
.02
1.0
41
.05
2.0
80
.99
0.9
5
2.9
02
.99
1.0
61
.07
1.9
9
1.0
0
0.8
9
Current Data ParametersNAME Sub 09EXPNO 7PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110902Time 18.54INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG zgTD 65536SOLVENT DMSONS 32DS 2SWH 8278.146 HzFIDRES 0.126314 HzAQ 3.9584243 secRG 114DW 60.400 usecDE 6.00 usecTE 297.0 KD1 3.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 8.70 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1336325 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 500.1300050 MHzWDW EMSSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
OH-5
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
H
OH
OH8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 106
Figura 69. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 6,5 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz).
Figura 70. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 3,2 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz).
2.02.53.03.54.04.55.05.56.0 ppm
1.6
91
.70
1.8
71
.88
2.0
12
.04
2.0
52
.08
2.1
42
.14
2.1
52
.17
2.1
72
.18
2.4
92
.50
2.5
02
.50
2.5
12
.53
2.5
42
.55
2.5
62
.57
2.8
62
.86
2.8
82
.89
2.9
93
.02
3.0
23
.05
3.3
03
.34
3.4
23
.63
3.8
43
.85
4.4
24
.60
4.6
14
.63
4.6
45
.32
5.3
36
.15
1.0
1
1.0
2
1.0
4
1.0
5
2.0
8
0.9
9
0.9
5
2.9
0
2.9
9
1.0
6
1.0
7
1.9
9
1.0
0
Current Data ParametersNAME Sub 09EXPNO 7PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110902Time 18.54INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG zgTD 65536SOLVENT DMSONS 32DS 2SWH 8278.146 HzFIDRES 0.126314 HzAQ 3.9584243 secRG 114DW 60.400 usecDE 6.00 usecTE 297.0 KD1 3.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 8.70 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1336325 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 500.1300050 MHzWDW EMSSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
4.54.6 ppm
1.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.1 ppm
1.6
81.6
91.7
11.8
51.8
61.8
81.8
91.9
11.9
21.9
92.0
22.0
22.0
32.0
52.0
52.0
62.1
42.1
52.1
52.1
72.1
82.1
82.4
92.5
02.5
02.5
02.5
12.5
32.5
42.5
52.5
72.5
72.5
92.6
1
2.8
62.8
72.8
92.9
0
2.9
93.0
23.0
33.0
6
1.0
0
1.0
2
1.0
3
1.0
2
2.3
0
1.0
1
1.0
2
Current Data ParametersNAME Sub 09EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110829Time 14.03INSTRUM spectPROBHD 5 mm Dual 13C/PULPROG zg30TD 65536SOLVENT DMSONS 128DS 4SWH 8012.820 HzFIDRES 0.122266 HzAQ 4.0894966 secRG 406.4DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.0 KD1 3.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 10.90 usecPL1 -5.00 dBSFO1 500.1334992 MHz
F2 - Processing parametersSI 65536SF 500.1300051 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
H-8 OH-1’ OH-2’
H-2 dd. 13,7 e 3,0 H-2’
OCH3-7
OCH3-6
H-3a dd, 17,3 e 13,7
H-3’b dd, 14,5 e 3,3 H-3’a
dt,14,5, 3,0
H-5’b td, 14,1 e 7,0
H-3b dd, 17,3 e 3,0
H-6’b td, 13,2 e 5,4
H-6’a ddd,13,2, 7,0
e 2,0
H-5’a ddd, 14,1, 5,4
e 2,0
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
H
OH
OH8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 107
No espectro de RMN de 13C foi possível observar a presença de dois
carbonos carbinólicos, sugerindo a hidratação da dupla ligação e mantendo a
hidroxila observada em C-1’ (72,2) , foi observada também uma cetona em C-4’
(210,2) (Figura 71).
Figura 71. Espectro de RMN de 13C de 9 (DMSO-d6, 125 MHz).
O experimento de HMBC (Figura 72 e Figura 74) mostrou uma correlação
entre OH-1’ com C-2’ e de OH-2’ com C-1’, C-3’ e C-4’. A conexão do anel B ao anel
C foi também confirmada com as correlações HMBC observadas entre H-2 com C-1’,
C-2’ e C-6’. As posições dos grupos metoxilícos foram confirmadas através do
espectro de NOESY (Figura 72), no qual foi observada uma correlação entre H-8 e
OCH3-7.
90100110120130140150160170180190200210 ppm
91
.76
10
2.3
3
12
9.3
9
15
3.8
6
15
8.5
51
60
.45
19
8.0
0
21
0.1
6
Current Data ParametersNAME Sub 09EXPNO 40PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110826Time 8.19INSTRUM spectPROBHD 5 mm Dual 13C/PULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 10847DS 16SWH 19607.844 HzFIDRES 0.299192 HzAQ 1.6712180 secRG 8192DW 25.500 usecDE 10.00 usecTE 300.0 KD1 2.00000000 secd11 0.03000000 secDELTA 1.89999998 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 10.50 usecPL1 4.00 dBSFO1 75.4760505 MHz
======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 100.00 usecPL2 0 dBPL12 20.92 dBPL13 120.00 dBSFO2 300.1312005 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 75.4677855 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ppm
27
.27
35
.54
35
.73
38
.68
38
.95
39
.23
39
.51
39
.79
40
.07
40
.35
44
.90
56
.20
60
.05
69
.77
72
.16
79
.23
C-4 C-4’
C-7
C-8a C-5
C-6 C-4a
C-8
C-2
C-1’
C-2’
OCH3-6
C-3’
C-3 e C-5’ C-6’
OCH3-7
Resultados e Discussões 108
Figura 72. Principais correlações NOE (----) e HMBC (____) observadas para 9.
Figura 73. Mapa de contorno HSQC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz).
O
O
O
OH
OH
H3CO
H3CO
H
OH
8
6
2
4
1' 3'
5'
ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Current Data ParametersNAME Sub 09 - Proto 2EXPNO 4PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110831Time 17.12INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hsqcetgpsi2TD 2048SOLVENT DMSONS 16DS 16SWH 8012.820 HzFIDRES 3.912510 HzAQ 0.1278452 secRG 1024DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.1 KCNST2 145.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd4 0.00172414 secd11 0.03000000 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secD24 0.00086207 secDELTA 0.00117340 secDELTA1 0.00110800 secDELTA2 0.00016207 secDELTA3 0.00062414 secIN0 0.00001530 secST1CNT 0ZGOPTNS
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 8.70 usecp2 17.40 usecP28 1000.00 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1335009 MHz
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====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPNAM4 SINE.100GPZ1 80.00 %GPZ2 20.10 %GPZ3 11.00 %GPZ4 -5.00 %P16 1000.00 usecP19 600.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 512SFO1 125.7716 MHzFIDRES 63.827614 HzSW 259.834 ppmFnMODE Echo-Antiecho
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.1300011 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0PC 1.40
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 echo-antiechoSF 125.7578679 MHzWDW GMSSB 2LB 0 HzGB 0
Resultados e Discussões 109
Figura 74. Mapa de contorno HMBC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz)
Figura 75. Mapa de contorno COSY de 9 (DMSO-d6, 500 MHz).
ppm
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Current Data ParametersNAME Sub 09 - Proto 2EXPNO 5PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110831Time 20.59INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hmbcgplpndqfTD 4096SOLVENT DMSONS 32DS 16SWH 8012.820 HzFIDRES 1.956255 HzAQ 0.2556404 secRG 1024DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.0 KCNST2 145.0000000CNST13 8.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd2 0.00344828 secd6 0.06250000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00001530 sec
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 8.70 usecp2 17.40 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1335009 MHz
======== CHANNEL f2 ========NUC2 13CP3 12.90 usecPL2 -2.50 dBSFO2 125.7716224 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPZ1 50.00 %GPZ2 30.00 %GPZ3 40.10 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 512SFO1 125.7716 MHzFIDRES 63.827614 HzSW 259.834 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 4096SF 500.1299978 MHzWDW SINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.40
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 125.7578478 MHzWDW GMSSB 0LB 0 HzGB 0
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Current Data ParametersNAME Sub 09 - Proto 2EXPNO 3PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110831Time 15.52INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG cosygpqfTD 4096SOLVENT DMSONS 8DS 8SWH 8012.820 HzFIDRES 1.956255 HzAQ 0.2556404 secRG 362DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.0 Kd0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secIN0 0.00012480 sec
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP0 8.70 usecP1 8.70 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1335009 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 256SFO1 500.1335 MHzFIDRES 31.300079 HzSW 16.021 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.1299995 MHzWDW SINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.1300016 MHzWDWSSB 0LB 0 HzGB 0
Resultados e Discussões 110
A substância 9 (Figura 76), de estrutura inédita foi caracterizada como sendo
a flavanona 2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’,2’-dihidroxi-4’-oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-
benzopiran-4-ona, com base nos deslocamentos químicos de RMN de 1H e de 13C e
nas correlações observadas nos experimentos de RMN 2D (Figura 73, Figura 74 e
Figura 75) (Tabela 15).
Figura 76. Estrutura da substância 9. Tabela 15. Dados de RMN de 1H e13C de 9 (500 e 125 MHz, DMSO-d6).
1H 13C HMBC COSY
2 4,62 (dd, 3,0, 13,7, 1H) 79,2 C3, C4, C8a, C1’, C2’, C6’
H3a, H3b
3 -Ha
3-Hb
3,02 (dd, 13,7, 17,3, 1H)
2,57 (dd, 3,0, 17,3, 1H)
35,5 C2, C4, C1’
C4, C4a
H3b
H3a
4 - 198,0 - -
4 a - 102,3 - -
5 - 153,9 - -
6 - 129,4 - -
7 - 160,5 - -
8 6,15 (s, 1H) 91,8 C4, C4a, C5, C6, C7, C8a
-
8 a - 158,5 - -
1’ - 72,2 - -
2’ 4,42 (m, 1H) 69,8 H3’a, H3’b
3’Ha
3’Hb
2,16 (dt, 3,0, 14,5, 1H)
2,88 (dd, 3,3, 14,5, 1H)
44,9 C1’, C2’, C4’, C5’, C6’
C2’, C4’, C5’
H3’b, H2’
H3’a, H2’
4’ - 210,2 - -
5’-Ha
5’-Hb
2,04 (ddd, 2,0, 5,4, 14,1, 1H)
2,56 (td, 7,0, 14,1, 1H)
35,7 C1’, C2’, C3’, C4’, C6’
C1’, C4’, C6’
H5’b, H6’a ,H6’b
H5’a, H6’a ,H6’b
6’-Ha
6’-Hb
1,70 (ddd, 2,0, 7,0, 13,2, 1H)
1,87 (td, 5,4, 13,2, 1H)
27,3 C1’, C2’, C4’, C5’
C2, C1’, C4’, C5’
H6’b, H5’a ,H5’b
H6’a, H5’a ,H5’b
-OCH3-6 3,64 (s, 3H) 60,0 C6 -
-OCH3-7 3,84 (s, 3H) 56,2 C7 -
-OH – 5 11,92 (s, 1H) - C4, C4a, C5, C6, C7 -
-OH – 1’ 5,32 (s, 1H) - C2’, C6’ -
-OH – 2’ 5,31 (s, 1H) - C1’, C3’,C4’ -
J em Hertz; em ppm;
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
OH
9
2
45
71'
4'
2'
Resultados e Discussões 111
Configuração absoluta de 8 e 9
As substâncias 8 e 9 foram dissolvidas em metanol na concentração 0,01
g/ml, o valor do ângulo de [α]D medido foi +115,5º e +92º, respectivamente. O ângulo
positivo medido significa que há um desvio da luz plano polarizada para a direita,
indicando que tratam-se de substâncias dextrogiras.
As curvas de DC (dicroísmo circular) foram medidas para ambas as
substâncias e os resultados foram comparados aos das curvas teóricas de DC
calculadas por TDDFT (Time-dependent density functional theory). Para a
substância 8 os cálculos foram realizados considerando todos os estereoisômeros
possíveis: 2S,1’R; 2S,1’S; 2R,1’S e 2R,1’R. Após as etapas de analise
conformacional apenas dois confôrmeros foram constatados na temperatura
investigada: (2S,1’R)-8 e (2S,1’S)-8.
A configuração pôde então ser determinada através da comparação entre os
espectros de DC calculados e o experimental (Figura 78). Para (2S,1’R)-8 foram
observados EC (Efeito Cotton) positivo em ~325 nm e ~250 nm, e EC negativo em
~280 nm. Estes resultados foram consistentes com os dados experimentais. Para
(2S,1’S)-8 foram observados EC (Efeito Cotton) positivo em ~325 nm e EC negativo
em ~280 nm e ~250 nm, sendo este último com sinal contrário ao observado
experimentalmente. Essas observações permitiram determinar de forma inequívoca
a configuração absoluta de (+)-8 como sendo 2S, 1’R (Figura 77).
Figura 77. Estrutura da substância 8 com estereoquímica definida.
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
OH
H
8
S
R
Resultados e Discussões 112
Figura 78. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S)-8; b) Espectro DC experimental obtido para 8; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R)-8.
O espectro de DC obtido para a substância 9 (Figura 79) foi muito similar ao
da substância (+)-8 permitindo sugerir a configuração absoluta também como
2S,1’R, o que foi confirmado por cálculos de TDDFT. No entanto nestes cálculos não
foi possível obter informações sobre a configuração absoluta do terceiro centro
estereogênico em C-2’. Os espectros teóricos de ambos diastereômeros
(2S,1’R,2’R)-9 e (2S,1’R,2’S)-9 apresentaram-se indistinguíveis, isto ocorreu
principalmente devido ao fato de que nenhuma das transições do cromóforo principal
benzoila nem do grupo carbonilíco em C-4 terem sido suficientemente perturbadas
pela introdução de um novo centro estereogênico (Figura 80).
a)
b)
c)
Resultados e Discussões 113
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
OHOH
H
9
Figura 79. Estrutura da substância 9 com estereoquímica definida.
Figura 80. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S,2’S)-9; b) Espectro DC experimental obtido para 9; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R,2’R)-9.
Resultados e Discussões 114
Substância 8a
A substância 8a (Figura 81) obtida através da reação hidrogenação da
substância 8, foi caracterizada a partir dos espectros de RMN de 1H, RMN de 13C,
HSQC, HMBC e por ESIMS.
Figura 81. Estrutura da substância 8a.
No espectro de massas (ESI+) de alta resolução da substância 8a (Figura 82)
observou-se um sinal em m/z 337,1286 Da correspondente ao íon quasimolecular
[M+H]+ e um sinal em m/z 359,1091 Da correspondente ao aduto de sódio [M+Na]+,
compatível com a fórmula molecular C17H20O7, esperada como produto da reação de
hidrogenação de 2 (valor calculado: [M+H]+ 337,1287 Da e [M+Na]+ 359,1107 Da).
Figura 82. Espectro de massas de alta resolução de 8a (ESI-TOF).
No espectro de RMN de 1H de 8a (Figura 83 e Figura 84) os sinais de
ressonância mais importantes para a confirmação da formação do produto são o
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
8a
337.1286
359.1091
+MS, 9.82-10.02min #(587-599)
0
2
4
6
5x10
Intens.
335 340 345 350 355 360 365 m/z
[M+H]+
[M+Na]+
Resultados e Discussões 115
desaparecimento dos sinais olefínicos conjugados à carbonila do anel B (J 10 Hz) e
o aparecimento de sinais metilênicos adicionais.
Além destes sinais foi observada no espectro de RMN de 13C (Figura 85) a
presença de dois carbonos metilênicos adicionais. A atribuição dos sinais de RMN
(Tabela 16) foi realizada através das correlações COSY, HSQC e HMBC, permitindo
assim a determinação de 8a como sendo 2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-
oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, de estrutura inédita.
Figura 83. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) da substância 8a.
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
-0.0
01
.25
1.8
11
.82
1.8
41
.85
1.8
81
.90
1.9
01
.92
1.9
32
.04
2.3
32
.34
2.3
42
.35
2.3
52
.36
2.3
62
.37
2.3
72
.38
2.3
92
.62
2.6
22
.65
2.6
62
.77
2.7
82
.79
2.8
12
.82
2.8
32
.99
3.0
23
.03
3.0
63
.83
3.9
04
.26
4.2
74
.29
4.2
96
.06
7.2
71
1.8
0
1.2
91.1
91.1
23.2
21.0
52.0
01.0
0
2.9
83.0
30.9
5
0.9
4
0.8
3
Current Data ParametersNAME Sub 08aEXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120423Time 17.00INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 0SWH 7002.801 HzFIDRES 0.106854 HzAQ 4.6793203 secRG 80.6DW 71.400 usecDE 6.50 usecTE 293.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 WSFO1 500.1330008 MHz
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1300077 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
4.3 ppm
H-2 dd, 2,7 e 14,0
OH-5
H-8
OCH3-6
OCH3-7
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
OH
H
S
8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 116
Figura 84. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 8a (500 MHz, CDCl3) na região de 3,1 a 1,7 ppm.
Figura 85. Espectro de RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) da substância 8a.
1.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.0 ppm
1.7
81
.79
1.8
11
.82
1.8
41
.85
1.8
81
.90
1.9
01
.92
1.9
32
.03
2.0
42
.04
2.0
52
.06
2.0
62
.33
2.3
42
.34
2.3
52
.35
2.3
62
.36
2.3
72
.37
2.3
82
.39
2.3
92
.40
2.4
22
.42
2.6
22
.62
2.6
52
.66
2.7
72
.78
2.7
92
.81
2.8
22
.83
2.9
93
.02
3.0
33
.06
1.2
9
1.1
9
1.1
2
3.2
2
1.0
5
2.0
0
1.0
0
Current Data ParametersNAME Sub 08aEXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120423Time 17.00INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 0SWH 7002.801 HzFIDRES 0.106854 HzAQ 4.6793203 secRG 80.6DW 71.400 usecDE 6.50 usecTE 293.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 WSFO1 500.1330008 MHz
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1300077 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
90100110120130140150160170180190200210 ppm
82.9
8
91.4
0
102.9
4
130.7
4
154.9
4157.8
7160.8
4
196.3
4
210.7
4
Current Data ParametersNAME Sub 08aEXPNO 2PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120423Time 17.08INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 20480DS 0SWH 29761.904 HzFIDRES 0.454131 HzAQ 1.1010548 secRG 203DW 16.800 usecDE 6.50 usecTE 293.1 KD1 1.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7716224 MHz
======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 80.00 usecPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7577913 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ppm
-0.0
0
31.9
933.7
036.1
036.2
2
36.3
8
56.2
5
60.9
3
70.9
3
H-3b dd, 14,0 e 17,0
H-2’ td 6,1 e
14,0 H-3’b/ H-6’
m
H-5’b dq, 3,3 e
13,6
H-3a dd, 2,7 e
17,0
H-3’a
td, 5,0 e 14,2
H-5’a td, 5,0 e
13,6
C-4 C-4’
C-7
C-8a
C-5
C-6 C-4a
C-8
C-2
C-1’
C-2’ C-3 C-6’ e OCH3-6 C-3’
C-5’
OCH3-7
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
OH
H
S
8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 117
Tabela 16. Dados de RMN de 1H e 13C de 8a (500 e 125 MHz, CDCl3).
Posição
1H
13C
2 4,28 (dd, 2,7 e 14,0 Hz, 1H) 83,0
3 -Ha
3-Hb
2,64 (dd, 2,7 e 17,0 Hz, 1H)
3,02 (dd, 14,0 e 17,0 Hz, 1H)
36,4
4 - 196,3
4 a - 102,9
5 - 157,9
6 - 130,7
7 - 160,9
8 6,06 (s, 1H) 91,4
8 a - 154,9
1’ - 70,9
2’ 2,80 (td, 6,1 e 14,0 Hz, 2H) 36,2
3’Ha
3’Hb
1,90 (td, 5,0 e 14,0 Hz, 1H)
2,43 (m, 1H)
33,7
4’ - 210,7
5’-Ha
5’-Hb
1,84 (td, 5,0 e 13,6, 1H)
2,05 (td, 3,3 e 13,6, 1H)
32,0
6’ 2,38 (m, 2H) 36,1
-OCH3-6 3,83 (s, 1H) 60,9
-OCH3-7 3,90 (s, 1H) 56,3
-OH – 5 11,80 (s, 1H) -
em ppm; J em Hz.
O
O
O
OH
H3CO
H3CO
OH
H
S
8
6
2
4
1'3'
5'
Resultados e Discussões 118
4.7 Identificação das substâncias 10 e 11
As substâncias 10 e 11 (Figura 86) foram isoladas e identificadas a partir da
partição orgânica (CHCl3) do extrato das folhas de P. carniconnectivum (código: K-
1600 FC) e tiveram suas estruturas determinadas a partir dos dados de RMN de 1H,
13C, HSQC, HMBC e EM.
Figura 86. Estruturas das substâncias 10 e 11.
Substância 10
A fórmula molecular de 10 (Figura 87), isolada de P. carniconnectivum, foi
estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF), no
qual se observou um pico em m/z 331,0820 Da correspondente ao íon
quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C17H14O7 (valor calculado para
[M+H]+: 331,0818 Da) (Figura 88).
Figura 87. Estrutura da substância 10.
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
10
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
11
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 119
Figura 88. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 10.
No espectro de RMN de 1H de 10 (Figura 89) observou-se sinais referentes a
treze hidrogênios, sendo um simpleto em 12,30 (1H, OH-5) correspondente ao
grupo hidroxila em C-5, dois simpletos em 3,92 (3H) e 3,88 (3H) referentes aos
grupos metoxilícos em C-6 e C-7. Observou-se também um simpleto em 6,59 (1H)
correspondente ao sinal do hidrogênio olefínico do anel C em C-3, e um simpleto em
6,33 referente ao hidrogênio aromático em C-8 (anel A). Os hidrogênios do anel B
foram observados com dois dupletos e 6,92 e 6,40 com constante de acoplamento
J=9,9 Hz e com integração para dois hidrogênios cada sinal, sugerindo a presença
de um anel B não aromático, similar aos observados em 8 e 9, mas agora com a
presença de duas ligações duplas simétricas e conjugadas à uma carbonila.
331.0820
+MS, 10.3min #615
0
1
2
5x10
Intens.
320 325 330 335 340 345 m/z
[M+H]+
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 120
Figura 89. Espectro de RMN de 1H de 10 (CDCl3, 500 MHz).
No espectro de RMN de 13C (Figura 90) (CDCl3, 125 MHz) observou-se 15
sinais correspondentes a 17 átomos de carbono, os quais foram atribuídos de
acordo com os dados de HSQC e HMBC. Observou-se a presença de dois carbonos
carbonílicos, sendo um correspondente a C-4 em 182,7 e o segundo em 184,9
referente ao C-4’. O sinal referente aos carbonos simétricos C-2’ e C-6’ foi
observado em 145,8 e o dos carbonos C-3’ e C-5’ em 130,3. O carbono
carbinólico em 69,8 corresponde à C-1’.
A substância 10, de estrutura inédita, foi caracterizada como sendo a flavona
5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-
ona.
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
-0.0
0
3.8
83
.92
6.3
46
.40
6.4
26
.59
6.9
16
.93
7.2
6
12
.30
2.9
43
.08
0.9
42
.04
1.0
01
.98
0.9
9
Current Data ParametersNAME 167 P2EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121212Time 11.54INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 0SWH 7500.000 HzFIDRES 0.114441 HzAQ 4.3691168 secRG 203DW 66.667 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.1332538 MHzNUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 W
F2 - Processing parametersSI 65536SF 500.1300115 MHzWDW EMSSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00
6.46.56.66.76.86.97.0 ppm
H-2’/H-6’ d, 9,9 Hz
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
2
45
71'
4'
H-3’/H-5’ d, 9,9 Hz
H-3
H-8
OH-5
OCH3-6
OCH3-7
Resultados e Discussões 121
Figura 90. Espectro de RMN de 13C de 10 (CDCl3, 125 MHz).
Substância 11
A fórmula molecular de 11 (Figura 91), isolada de P. carniconnectivum, foi
estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF)
(Figura 92), no qual se observou um pico em m/z 333,0975 Da, correspondente ao
íon quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C17H16O7 (valor calculado
para [M+H]+: 333,0975 Da).
Figura 91. Estrutura da substância 11.
130135140145150155160165170175180185 ppm
130.3
0
132.6
7
145.9
3
152.9
5153.5
0
159.3
7
166.2
4
182.7
1
184.9
5
Current Data ParametersNAME Sub 12EXPNO 2PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121212Time 14.28INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 32768SOLVENT CDCl3NS 3572DS 0SWH 32894.738 HzFIDRES 1.003868 HzAQ 0.4981236 secRG 64DW 15.200 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 0.50000000 secd11 0.03000000 secDELTA 0.40000001 secTD0 1NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7728799 MHzCPDPRG2NUC2 1HPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7577623 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
556065707580859095100105110 ppm
56.7
2
61.1
5
69.7
6
76.9
877.2
377.4
8
91.1
4
106.1
7107.3
6
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
2
45
71'
4'
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
2
45
71'
4'
C-4a
C-8
C-2
C-1’
OCH3-7 C-3
C-4’ C-4 C-6
C-5
C-2’/C-6’ C-3’/C-5’
OCH3-6
C-8a
C-7
Resultados e Discussões 122
Figura 92. Espectro de massas de alta resolução de 11 (ESI-TOF).
A substância 11 apresentou sinais de RMN de 1H (Figura 93) muito
semelhantes aos de 10, sendo os anéis A e C idênticos. No anel B, os duplos
dupletos observados em 5,94 (1,8 e 10,1 Hz, 2H) e 6,23 (3,3 e 10,1 Hz, 2H)
indicaram a presença de um anel B não aromático com duplas simétricas, no
entanto, com presença de um hidrogênio adicional em 4,55 (m, 1H). Também foi
observado no espectro de RMN de 13C (Figura 94) um carbono carbinólico adicional
em 62,5, com a ausência de uma segunda carbonila, como observado para 8, 9 e
10, na posição C-4’ do anel B. Os sinais observados indicaram a presença de uma
hidroxila adicional posicionada em C-4’. O simpleto correspondente ao hidrogênio
olefínico H-3 foi observado em 6,51 e o correspondente ao hidrogênio aromático
H-8 em 6,77. As metoxilas OCH3-6 e OCH3-7 foram observadas em 3,80 e 3,92,
respectivamente.
A substância 11, de estrutura inédita, foi caracterizada como sendo a flavona
5-hidroxi-2-(1’,4’-dihidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-
benzopiran-4-ona.
333.0975
1. +MS, 4.9-5.7min #(293-340)
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10
Intens.
320 325 330 335 340 345 m/z
[M+H]+
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 123
Figura 93. Espectro de RMN de 1H de 11 (MeOD, 500 MHz).
Figura 94. Espectro de RMN de 13C de 11 (MeOD, 125 MHz)
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm
3.3
13.3
53.8
03.9
24.5
3
4.5
44.5
44.5
44.5
54.5
54.5
54.8
55.9
35.9
35.9
55.9
56.2
16.2
16.2
36.2
36.5
16.7
7
3.0
6
3.0
3
0.8
7
1.8
8
1.8
1
0.8
9
1.0
0
Current Data ParametersNAME K1600FC Prep1EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121229Time 19.51INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT MeODNS 32DS 4SWH 4504.504 HzFIDRES 0.068733 HzAQ 7.2745461 secRG 128DW 111.000 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.1320005 MHzNUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 W
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1300121 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
6.06.26.46.66.8 ppm
4.04.24.44.6 ppm
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
56.2
857.0
257.5
458.3
761.0
962.4
662.9
868.9
9
92.5
0
106.6
9
130.5
6133.4
8133.7
3
153.6
4155.3
1160.7
9
172.9
3
184.7
2
H-2’/H-6’ d, 10,1 Hz
H-3’/H-5’ d, 10,1 Hz
H-3 H-8
OCH3-6 OCH3-7
H-4’
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
2
45
71'
4'
C-4a
C-8
C-2 C-1’
C-3
C-4’
C-4 C-6
C-5 C-8a
C-2’/C-6’
C-3’/C-5’
C-7
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 124
Os valores de RMN de 1H e 13C das substâncias 10 e 11 (Tabela 17) foram
atribuídos de acordo com as correlações observadas nos experimentos de RMN 2D,
HSQC e HMBC.
Tabela 17. Dados de RMN de 1H e 13C de 10 e 11 (500 e 125 MHz).
Posição 1H * 13C * 1H ** 13C **
2 - 166,2 - 172,9
3 6,59 (s, 1H) 107,4 6,77 (s, 1H) 106,7
4 - 182,7 - 184,7
4 a - 106,2 - 106,7
5 - 153,0 - 155,3
6 - 132,7 - 133,7
7 - 159,4 - 160,8
8 6,33 (s, 1H) 91,1 6,51 (s, 1H) 92,5
8 a - 153,5 - 153,6
1' - 69,8 - 69,0
2' 6,92 (d, 9,9, 1H) 145,8 5,94 (dd, 1,8 e 10,1, 1H) 130,6
3' 6,40 (d, 9,9, 1H) 130,3 6,23 (dd, 3,3 e 10,1, 1H) 133,5
4' - 184,9 4,55 (m, 1H) 62,5
5' 6,40 (d, 9,9, 1H) 130,3 6,23 (dd, 3,3 e 10,1, 1H) 133,5
6' 6,92 (d, 9,9, 1H) 145,8 5,94 (dd, 1,8 e 9,9, 1H) 130,6
-OCH3-6 3,88 (s, 3H) 61,2 3,80 (s, 3H) 61,1
-OCH3-7 3,92 (s, 3H) 56,7 3,92 (s, 3H) 57,0
-OH-5 12,30 (s, 1H) - *** -
*CDCl3;** MeOD; *** não observado; em ppm; J em Hz.
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
O
10
2
45
71'
4'
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
OH
11
2
45
71'
4'
Resultados e Discussões 125
4.8 Identificação das substâncias 12, 13 e derivados
As substâncias 12 e 13 (Figura 95) foram isoladas e identificadas a partir
extrato das folhas de P. caldense e dos frutos de P. carniconnectivum (código: K-
1441 FrA) e tiveram suas estruturas determinadas a partir dos espectros de RMN de
1H, 13C, HSQC, HMBC e EM.
COOH
OH
OH
COOH 12
COOHOCH3
COOH 13
Figura 95. Estruturas das substâncias 12 e 13.
Substância 12
A fórmula molecular de 12 (Figura 96), isolada de P. caldense, foi
estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF)
(Figura 97), no qual foi observado um pico em m/z 457,2596 Da, correspondente ao
íon quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C27H36O6 (valor calculado
para [M+H]+: 457,2590 Da).
Resultados e Discussões 126
Figura 96. Estrutura da substância 12.
Figura 97. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 12.
O espectro de absorção na região do IV de 12 (Figura 98) indicou a presença
de grupo hidroxila com a banda em 3380 cm-1 proveniente da deformação axial de
O-H e com a banda em1299 cm-1 proveniente da deformação axial da ligação C-O
de grupo fenol. A banda de deformação axial de C=O de grupo carbonílico foi
observada em 1682 cm-1 e a banda proveniente da deformação axial de C=C do
anel aromático foi observada em1602 cm-1.
COOH
OH
COOH
OH
1
3 5
1' 5' 9'
13'
16'17' 18'
19'
20'
455.2422
457.2596
477.2371
479.2422
+MS, 14.2-14.3min #(847-851)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5x10
Intens.
450 455 460 465 470 475 480 m/z
[M+H]+
[M+Na]+
Resultados e Discussões 127
Figura 98. Espectro de absorção na região do infravermelho de 12.
No espectro de RMN de 1H de 12 (Figura 99 e Figura 100) (MeOD, 500 MHz)
observou-se dois dupletos correspondentes a H-2 em 7,35 (J 2,0 Hz, 1H) e H-6 em
7,31 (J 2,0 Hz, 1H), sinais indicativos de um sistema aromático 1,3,4,5-
tetrassubstituído.
Foram observados na região de 1,75 a 1,60 ppm quatro dupletos
correspondentes às metilas H-16’ em 1,65 (1,4 Hz, 3H), H-17’ em 1,72 (1,2 Hz,
3H), H-18’ em 1,61 (1,2 Hz, 3H) e H-20’ em 1,57 (1,4 Hz, 3H), cujas constantes de
acoplamento correspondem ao acoplamento alílico a quatro ligações (J4) com os
hidrogênios H-2’ (tq, 1,2 e 7,4 Hz, 1H), H-6’ (tq, 1,2 e 7,4 Hz, 1H) e H-14’ (tqt, 1,4 e
7,4 Hz, 1H). O hidrogênio alílico H-9’ foi observado como um tripleto (J 7,5 Hz, 1H)
devido ao acoplamento deste com o dupleto H-8’ (J 7,5 Hz, 2H), o deslocamento
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
78
80
82
84
86
88
90
92
94
96
98
100
776999
1103
1299
1442
1602
1682
2853
2920
2970
Ab
so
rban
ce (
%)
Wavenumber (cm-1)
3380
Resultados e Discussões 128
químico e multiplicidade observados sugerem a oxidação da metila da unidade
prenila correspondente a um grupo carboxílico.
O conjunto de sinais observados confirma a presença de um grupo geranil-
geranila na cadeia lateral de um derivado de ácido benzoico.
Figura 99. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD).
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm
-0.0
01
.57
1.5
7
1.6
11
.61
1.6
11
.65
1.6
51
.72
1.7
21
.72
2.0
52
.06
2.0
6
2.0
82
.14
2.1
62
.22
2.2
32
.25
2.2
62
.26
2.2
72
.29
2.6
53
.30
3.3
03
.31
3.3
13
.31
3.3
34
.86
5.1
15
.34
5.3
4
5.4
86
.73
6.7
46
.76
7.3
17
.31
7.3
47
.35
7.3
57
.35
7.3
5
4.2
64
.12
4.4
14
.22
8.4
93
.17
5.6
1
2.6
8
1.5
71
.49
1.4
0
1.3
9
1.3
01
.39
Current Data Parameters
NAME Sub 02- ac cald
EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20120419Time 11.43
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm TXI 13C Z
PULPROG zg30TD 65536
SOLVENT MeOD
NS 32DS 2
SWH 6756.757 Hz
FIDRES 0.103100 Hz
AQ 4.8497138 secRG 114
DW 74.000 usec
DE 6.50 usec
TE 298.1 KD1 1.00000000 sec
TD0 1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 7.64 usec
PLW1 13.69999981 WSFO1 500.1327848 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536SF 500.1300118 MHz
WDW GM
SSB 0LB -0.50 Hz
GB 0.1
PC 1.00
7.35 ppm 6.8 ppm
2.12.22.3 ppm
H2 d, 2,0 Hz
H6 d, 2,0 Hz
H10’ t, 7,5 Hz
H12’/ H9’ t, 7,6 e q, 7,5 Hz
H5’
q, 7,1 Hz
H4’/ H8’/ H13’ m
COOH
OH
COOH
OH
1
3 5
1' 5' 9'
13'
16'17' 18'
19'
20'
Resultados e Discussões 129
Figura 100. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD), ampliação de 5,38 a 5,05 ppm e de 1,76 a 1,53 ppm.
O espectro de RMN de 13C de 12 (Figura 101 e Figura 102) apresentou sinais
referentes a vinte e sete átomos de carbono. O anel aromático foi determinado como
ácido 3-alquil-4,5-di-hidroxibenzoico, sendo os sinais em 122,4, 124,3, 129,2,
149,5, 146,6 e 115,2 atribuídos aos carbonos C-1 a C-6, respectivamente, e um
carbono carboxílico em 170,9 ligado ao carbono C-1.
Os vinte carbonos restantes foram associados à unidade geranil-geranila
com a presença de quatro metilas em 26,1 (C-16’),16,3 (C-17’),16,4 (C-18’), 17,9
(C-20’), um grupo carboxílico em 171,8 (C-19), oito carbonos olefínicos em 123,9
(C-2’), 137,1 (C-3’), 126,4 (C-6’), 135,3 (C-7’), 144,3 (C-10’), 133,3 (C-11’), 125,1 (C-
14’), 131,1 (C-15’) e sete carbonos metilênicos em 29,1 (C-1’), 40,9 (C-4’), 27,7
(C-5’), 39,8 (C-8’), 28,0 (C-9’), 28,6 (C-12’) e 28,9 (C-13’).
5.105.155.205.255.305.35 ppm
5.1
05
.11
5.1
1
5.1
85
.18
5.3
45
.34
1.601.651.701.75 ppm
1.5
71
.57
1.6
11
.61
1.6
1
1.6
5
1.6
5
1.7
21
.72
1.7
2
COOH
OH
OH
COOH
1
35
1'
3'
5'
7'
9'
11'
19'
13'
16'
20'
17' 18'
H2’ tq, 7,4 e 1,2 Hz H6’
tq, 6,9 e 1,2 Hz
H14’ tst, 7,4 e 1,4 Hz
H17’
d, 1,2 Hz H16’
d, 1,4 Hz
H18’ d, 1,2 Hz
H20’ d, 1,4 Hz
Resultados e Discussões 130
Figura 101. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD).
Figura 102. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação de 42 a 15 ppm e de 175 a 113 ppm.
220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
16
.29
16
.39
17
.90
26
.09
27
.65
28
.00
28
.61
28
.89
29
.08
39
.78
40
.89
48
.64
48
.81
48
.98
49
.15
49
.32
49
.49
49
.66
11
5.2
21
22
.40
12
3.8
41
24
.31
12
5.0
41
26
.33
12
9.2
11
33
.11
13
3.3
31
35
.32
13
7.0
51
44
.29
14
5.5
51
49
.52
17
0.8
91
71
.77 Current Data Parameters
NAME Sub 02- ac cald
EXPNO 5
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20080806Time 8.03
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm TXI 1H-13
PULPROG zgpg30
TD 65536
SOLVENT MeOD
NS 13990
DS 4
SWH 32679.738 Hz
FIDRES 0.498653 Hz
AQ 1.0027508 sec
RG 32768
DW 15.300 usec
DE 6.00 usec
TE 298.0 K
D1 1.00000000 secd11 0.03000000 sec
DELTA 0.89999998 sec
TD0 1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 13C
P1 12.75 usec
PL1 -2.50 dBSFO1 125.7716224 MHz
======== CHANNEL f2 ========
CPDPRG2 waltz16
NUC2 1H
PCPD2 86.00 usec
PL2 0 dB
PL12 16.82 dBPL13 21.00 dB
SFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536
SF 125.7575957 MHz
WDW EM
SSB 0LB 3.00 Hz
GB 0
PC 1.40
120125130135140145150155160165170 ppm
115.2
2
122.4
0123.8
4124.3
1125.0
4126.3
3
129.2
1
133.1
1133.3
3
135.3
2
137.0
5
144.2
9
145.5
5
149.5
2
170.8
9171.7
7
17181920212223242526272829303132333435363738394041 ppm
16.2
916.3
9
17.9
0
26.0
9
27.6
528.0
028.6
128.8
929.0
8
39.7
8
40.8
9
COOH
OH
OH
COOH
1
35
1'
3'
5'
7'
9'
11'
19'
13'
16'
20'
17' 18'
C4’ C8’ C1’
C13’
C12’
C9’ C5’
C16’ C20’ C18’ / C17’
C19’ COOH
C4 C5
C10’
C3’
C7’ C3
C20’
C11’/C15’
C20’
C1
C20’
C6
C20’
C6’/C14’/C2/C2’
Resultados e Discussões 131
Figura 103. Mapa de contorno de HSQC de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação 8,0 a 1,2 ppm em F1 e de 160,0 a 0,0 ppm em F2.
As posições dos substituintes no ácido benzoico e do grupo carboxílico na
cadeia lateral foram definidas através da análise dos dados de HSQC (Figura 103),
HMBC (Figura 103, Figura 104, Figura 105 e Figura 106) e COSY (Figura 107).
As correlações observadas no experimento de HMBC entre H-2 com C-4, C-6,
C-1’ e COOH e entre H-6 com C-4, C-5 e COOH permitiram confirmar o
posicionamento das hidroxilas nos carbonos C-4 e do grupo carboxílico no C-1 do
anel aromático.
As correlações HMBC permitiram também definir a posição do segundo grupo
carboxílico no C-19’ devido às correlações observadas entre H-10’ com C-8’, C-9’, C-
11’, C-12’ e C-19’, H-12’ com C-11’, C-14’ e C-19’, H-16’ com C-14’ e C-20’ e de H-
20’ com C-14’, C-15’ e C-16’ (Figura 104).
ppm
1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 ppm
140
120
100
80
60
40
20
Current Data ParametersNAME Sub 02EXPNO 4PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080806Time 0.12INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hsqcetgpsi2TD 1024SOLVENT MeODNS 88DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 6.562920 HzAQ 0.0762356 secRG 18390.4DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KCNST2 145.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd4 0.00172414 secd11 0.03000000 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secD24 0.00086207 secDELTA 0.00117520 secDELTA1 0.00110800 secDELTA2 0.00016207 secDELTA3 0.00062414 secIN0 0.00001530 secST1CNT 0ZGOPTNS
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecp2 19.20 usecP28 1000.00 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz
======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 garpNUC2 13CP3 12.80 usecp4 25.60 usecPCPD2 68.00 usecPL2 -2.50 dBPL12 12.01 dBSFO2 125.7716224 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPNAM4 SINE.100GPZ1 80.00 %GPZ2 20.10 %GPZ3 11.00 %GPZ4 -5.00 %P16 1000.00 usecP19 600.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 200SFO1 125.7716 MHzFIDRES 163.398697 HzSW 259.834 ppmFnMODE Echo-Antiecho
F2 - Processing parametersSI 2048SF 500.1300074 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0PC 1.40
F1 - Processing parametersSI 512MC2 echo-antiechoSF 125.7576207 MHzWDW GMSSB 2LB 0 HzGB 0
ppm
1.82.02.22.4 ppm
20
25
30
35
40
2
6
10’
2’
6’
14’
1’
9’/12’ 5’
13’
4’/8’
16’
17’
20’ 18’
COOH
OH
OH
COOH
1
35
1'
3'
5'
7'
9'
11'
19'
13'
16'
20'
17' 18'
Resultados e Discussões 132
Figura 104. Correlações HMBC selecionadas para a substância 12.
Figura 105. Ampliação do mapa de contorno HMBC de 12 (de 4,85 a 7,70 ppm em
F1 e de 10,0 a 190,0 ppm em F2)
ppm
5.05.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.47.6 ppm
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Current Data ParametersNAME Sub 02EXPNO 6PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080806Time 16.18INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hmbcgplpndqfTD 4096SOLVENT MeODNS 92DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 1.640730 HzAQ 0.3047924 secRG 16384DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KCNST2 145.0000000CNST13 10.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd2 0.00344828 secd6 0.05000000 secD16 0.00010000 secIN0 0.00001530 sec
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecp2 19.20 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz
======== CHANNEL f2 ========NUC2 13CP3 12.80 usecPL2 -2.50 dBSFO2 125.7716224 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPZ1 50.00 %GPZ2 30.00 %GPZ3 40.10 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 200SFO1 125.7716 MHzFIDRES 163.398697 HzSW 259.834 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 2048SF 500.1300073 MHzWDW SINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.40
F1 - Processing parametersSI 512MC2 QFSF 125.7575483 MHzWDW GMSSB 0LB 0 HzGB 0
ppm
5.15.25.35.4 ppm
20
25
30
35
40
45
H2 H6 H10’
H2’ H6’ H14
’
C1’
C6
COOH
C4 C5
C1/C2
C19’
C11’
C8’
C12’
C17’
C1’
C4’ C8’
C6’
C18’
C12’
C16’
C20’
COOH
OH
OH
COOH
1
35
1'
3'
5'
7'
9'
11'
19'
13'
16'
20'
17' 18'
Resultados e Discussões 133
Figura 106. Ampliação do mapa de contorno HMBC de 12 (de 3,50 a 1,40 ppm em
F1 e de 10,0 a 180,0 ppm em F2).
Para determinar as configurações das duplas foram realizados os
experimentos de COSY (Figura 107) e NOESY (Figura 109). Através das
correlações observadas no COSY foi possível confirmar as posições das duplas
ligações.
As configurações das duplas ligações foram determinadas como E através do
experimento NOESY. As correlações observadas entre os hidrogênios H-1’ e H-5’
com os hidrogênios da metila H-17’, e do hidrogênio olefínico H-2’ com H-4’, são
possíveis apenas com a configuração E da dupla. Do mesmo modo que as
correlações entre H-5’ e H-9’ com os hidrogênios da metila H-18’ e dos hidrogênios
olefínicos H-6’ e H-10’ com H-8’, determinam as duplas ligações com as
configurações 6’E e 10’E.
ppm
1.61.82.02.22.42.62.83.03.23.4 ppm
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Current Data ParametersNAME Sub 02EXPNO 6PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080806Time 16.18INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hmbcgplpndqfTD 4096SOLVENT MeODNS 92DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 1.640730 HzAQ 0.3047924 secRG 16384DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KCNST2 145.0000000CNST13 10.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd2 0.00344828 secd6 0.05000000 secD16 0.00010000 secIN0 0.00001530 sec
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecp2 19.20 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz
======== CHANNEL f2 ========NUC2 13CP3 12.80 usecPL2 -2.50 dBSFO2 125.7716224 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPZ1 50.00 %GPZ2 30.00 %GPZ3 40.10 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 200SFO1 125.7716 MHzFIDRES 163.398697 HzSW 259.834 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 2048SF 500.1300073 MHzWDW SINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.40
F1 - Processing parametersSI 512MC2 QFSF 125.7575483 MHzWDW GMSSB 0LB 0 HzGB 0
H1’
H17’ H16’ H20’
H18’
C4’ C8’
C16’
C20’
C2’
C3’
C14’
C15’
C7’
C6’
C19’
C10’
C11’
C14’
C13’
C8’ C4’
C3’
C3’
C6’/C2' C6’
C3’/C7’
H12’/H9’ H5’
H4’ H8’ H13’
COOH
OH
OH
COOH
1
35
1'
3'
5'
7'
9'
11'
19'
13'
16'
20'
17' 18'
Resultados e Discussões 134
Figura 107. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 12 (500 MHz, MeOD).
O experimento de NOESY de 12 (Figura 108) permitiu também determinar as
posições das metilas H-16’ e H-20’, através da correlação NOE observada entre o
hidrogênio olefínico H-14’ com o hidrogênio da metila H-16’.
Figura 108. Correlações NOE observadas para 12.
ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Current Data ParametersNAME Sub 02EXPNO 3PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080805Time 16.27INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG cosygpqfTD 2048SOLVENT MeODNS 84DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 3.281460 HzAQ 0.1524212 secRG 64DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 Kd0 0.00000300 secD1 1.48689198 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secIN0 0.00014880 sec
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP0 9.60 usecP1 9.60 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPZ1 10.00 %GPZ2 10.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 200SFO1 500.1329 MHzFIDRES 33.602150 HzSW 13.437 ppmFnMODE QF
F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.1300067 MHzWDW SINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.40
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.1300084 MHzWDW GMSSB 0LB 0 HzGB 0
COOH
OH
OH
COOH
1
35
1'
3'
5'
7'
9'
11'
19'
13'
16'17' 18'
Resultados e Discussões 135
Figura 109. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 12 (500 MHz, MeOD).
Os dados de RMN de 12 (Tabela 18), de estrutura inédita, foram comparados
aos da literatura para substâncias similares, confirmando a identificação de 12 como
o ácido-3-[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-
il]-4,5-di-hidroxibenzoico, de estrutura inédita, denominado ácido caldensínico
(Freitas, 2009).
ppm
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 ppm
1
2
3
4
5
6
7
8
Current Data ParametersNAME Sub 02 NoesyEXPNO 2PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120704Time 12.11INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG noesygpphppTD 2048SOLVENT MeODNS 16DS 16SWH 6493.506 HzFIDRES 3.170657 HzAQ 0.1577460 secRG 203DW 77.000 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD0 0.00006727 secD1 2.00000000 secD8 0.75000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00015400 sec
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecP2 15.28 usecP17 2500.00 usecPLW1 13.69999981 WPLW10 1.18289995 WSFO1 500.1327507 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SMSQ10.100GPZ1 40.00 %P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parametersTD 208SFO1 500.1328 MHzFIDRES 31.218779 HzSW 12.984 ppmFnMODE States-TPPI
F2 - Processing parametersSI 2048SF 500.1300098 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0PC 1.00
F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 500.1300100 MHzWDW GMSSB 2LB 0 HzGB 0
Resultados e Discussões 136
Substância 13
A fórmula molecular de 13 (Figura 110), isolada de P. carniconnectivum, foi
estabelecida de acordo com o espectro de massas obtido por HR-ESI-TOF (Figura
111), no qual foi observado um pico em m/z 453,2647 Da, correspondente ao íon
quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C28H38O5 (valor calculado para
[M+H]+: 453,2641 Da).
Figura 110. Estrutura da substância 13.
Figura 111. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 13.
A substância 13, também um derivado de ácido benzoico prenilado,
apresentou sinais de RMN de 1H referentes a um sistema aromático 1,3,4-
trissubstituído, sendo um duplo dupleto em 7,95 (2,1 e 8,5 Hz, 1H) e dois dupletos,
um em 6,86 (8,5, 1H) e outro em 7,88 (2,1, 1H) (Figura 112).
COOHOCH3
COOH1
355' 9'
19'
13'16'
20'17' 18'
453.2647
-MS, 28.5-28.6min #(1701-1712)
0
1
2
3
4
5x10
Intens.
430 435 440 445 450 455 460 m/z
[M+H]+
Resultados e Discussões 137
Os sinais de RMN de 1H e 13C (Figura 113 e Figura 114) indicaram
novamente a presença de um substituinte geranil-geranila em C-3, com a presença
de quatro metilas em 15,8 (C-18’), 16,1 (C-17’), 17,7 (C-20’) e 25,6 (C-16’) e dois
ácidos carboxílicos em 172,4 (COOH) e 173,8 (C-19).
Diferentemente de 12, foi observada a presença de uma metoxila em 55,5
como substituinte na posição C-4. As posições dos ácidos carboxílicos e da metoxila
foram determinadas através dos espectros de HSQC, HMBC e COSY.
Figura 112. Espectro de RMN de 1H de 13 (500 MHz, CDCl3).
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm
1.5
71.5
71.6
01.6
01.6
61.6
61.7
01.7
02.0
52.0
72.0
82.1
12.1
12.1
22.1
32.2
32.2
52.2
62.5
62.5
82.5
92.6
13.3
33.3
43.8
95.0
65.0
75.0
85.0
85.0
95.1
65.1
65.1
7
5.3
15.3
15.9
85.9
96.0
16.8
56.8
77.2
67.8
77.8
87.9
47.9
47.9
5
7.9
6
3.0
9
2.8
23.0
32.9
57.6
82.0
1
1.8
8
1.9
2
2.8
9
1.0
30.9
90.9
0
0.9
3
1.0
0
0.9
31.0
1
Current Data ParametersNAME K1441FrA 5b.2 f 23EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120817Time 22.06INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 0SWH 6493.506 HzFIDRES 0.099083 HzAQ 5.0463219 secRG 101DW 77.000 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 WSFO1 500.1327507 MHz
F2 - Processing parametersSI 65536SF 500.1300138 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.006.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.1 ppm
COOH
OCH3
COOH
1
35
1' 5' 9'
13'
16'17' 18'
19'
20'
Resultados e Discussões 138
Figura 113. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3).
Figura 114. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3) (Ampliação).
As configurações das duplas ligações foram determinadas através dos
experimentos COSY (Figura 116) e NOESY (Figura 117). As correlações NOE
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
15
.81
15
.87
16
.07
17
.65
25
.62
26
.33
26
.50
27
.88
28
.04
28
.14
34
.48
39
.04
39
.67
55
.50
76
.75
77
.00
77
.26
10
9.5
01
21
.26
12
1.5
51
23
.48
12
4.8
91
30
.17
13
0.1
91
30
.54
13
1.2
71
31
.32
13
2.1
41
34
.17
13
6.6
91
45
.82
16
1.7
9
17
2.3
51
73
.76
Current Data ParametersNAME K1441FrA 5b.2 f 23EXPNO 9PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120818Time 21.03INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 2048DS 16SWH 32894.738 HzFIDRES 0.501934 HzAQ 0.9961972 secRG 128DW 15.200 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 1.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7728799 MHz
======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 80.00 usecPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7577952 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
110115120125130135140145150155160165170175 ppm
10
9.5
0
12
1.2
61
21
.55
12
3.4
81
24
.89
13
0.1
71
30
.19
13
0.5
41
31
.27
13
1.3
21
32
.14
13
4.1
71
36
.69
14
5.8
2
16
1.7
9
17
2.3
51
73
.76
Current Data ParametersNAME K1441FrA 5b.2 f 23EXPNO 9PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120818Time 21.03INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 2048DS 16SWH 32894.738 HzFIDRES 0.501934 HzAQ 0.9961972 secRG 128DW 15.200 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 1.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7728799 MHz
======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 80.00 usecPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7577952 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
152025303540455055 ppm
15
.81
15
.87
16
.07
17
.65
25
.62
26
.33
26
.50
27
.88
28
.04
28
.14
34
.48
39
.04
39
.67
55
.50
OCH3-4 C4’
C8’ C12’
C-19’ COOH C4 C10’
C5
C1’/C5’/C9’
C13’/C16’ C17’/C18’C20’
C2/C3/C6/C3’ C7’/C11’/C15’
C1/C2’/C6’/C14’
Resultados e Discussões 139
observadas entre os hidrogênios H-1’ e H-5’ com os hidrogênios da metila H-17’, e
do hidrogênio olefínico H-2’ com H-4’, são possíveis apenas com a configuração E
da dupla. Assim como as correlações observadas entre H-5’ e H-9’ com os
hidrogênios da metila H-18’ e dos hidrogênios olefínicos H-6’ e H-10’ com H-8’,
determinam dupla ligação com configuração 6’E, e diferentemente do observado
para a substância 12, em 13 observou-se a correlação entre os hidrogênios H-10’ e
H-12’, possível apenas com configuração da dupla sendo 10’Z (Figura 115).
O experimento de NOESY de 13 permitiu também determinar as posições das
metilas H-16’ e H-20’, através da correlação NOE observada entre o hidrogênio
olefínico H-14’ com os hidrogênios da metila H-16’ e dos hidrogênios H-13’ com os
da metila H-20’.
Figura 115. Correlações NOE observadas para 13.
Os dados de RMN de 13 (Tabela 18), de estrutura inédita, foram comparados
aos da literatura para substâncias similares, confirmando sua identificação como o
ácido-3-[(2’E,6’E,10’Z)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-
il]-4-metoxibenzoico.
COOHOCH3
COOH1
355' 9'
19'
13'16'
20'17' 18'
Resultados e Discussões 140
Figura 116. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 13 (500 MHz, MeOD).
Figura 117. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 13 (500 MHz, MeOD).
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Current Data Parameters
NAME Sub 10
EXPNO 3
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20120328
Time 11.20
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm BBO BB-1H
PULPROG cosygpppqf
TD 2048
SOLVENT CDCl3
NS 16
DS 16
SWH 3898.129 Hz
FIDRES 1.903383 Hz
AQ 0.2627401 sec
RG 64DW 128.267 usec
DE 6.50 usec
TE 296.1 K
D0 0.00000300 sec
D1 2.00000000 sec
D11 0.03000000 sec
D12 0.00002000 sec
D13 0.00000400 sec
D16 0.00020000 sec
IN0 0.00025655 sec
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P0 9.75 usec
P1 9.75 usec
P17 2500.00 usec
PLW1 16.50000000 W
PLW10 2.32030010 W
SFO1 300.1316507 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====
GPNAM1 SMSQ10.100
GPZ1 10.00 %
P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parameters
TD 256
SFO1 300.1317 MHz
FIDRES 15.227066 Hz
SW 12.988 ppm
FnMODE QF
F2 - Processing parameters
SI 2048
SF 300.1300053 MHz
WDW QSINE
SSB 0
LB 0 Hz
GB 0
PC 1.40
F1 - Processing parameters
SI 1024
MC2 QF
SF 300.1300048 MHz
WDW States-TPPI
SSB 0
LB 0 Hz
GB 0
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Current Data Parameters
NAME K1441FrA 5.2 b
EXPNO 3
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20120403
Time 10.59
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm TXI 13C Z
PULPROG noesygpphpp
TD 2048
SOLVENT CDCl3
NS 32
DS 16
SWH 6493.506 Hz
FIDRES 3.170657 Hz
AQ 0.1577460 sec
RG 1820
DW 77.000 usec
DE 6.50 usec
TE 298.1 K
D0 0.00006672 sec
D1 2.00000000 sec
D8 0.75000000 sec
D11 0.03000000 sec
D12 0.00002000 sec
D16 0.00020000 sec
IN0 0.00015380 sec
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 8.00 usec
P2 16.00 usec
P17 2500.00 usec
PLW1 13.69999981 W
PLW10 1.29700005 W
SFO1 500.1327507 MHz
====== GRADIENT CHANNEL =====
GPNAM1 SMSQ10.100
GPZ1 40.00 %
P16 1000.00 usec
F1 - Acquisition parameters
TD 207
SFO1 500.1328 MHz
FIDRES 31.409275 Hz
SW 13.000 ppm
FnMODE States-TPPI
F2 - Processing parametersSI 2048
SF 500.1300119 MHz
WDW QSINE
SSB 2
LB 0 Hz
GB 0
PC 1.00
F1 - Processing parameters
SI 1024
MC2 States-TPPI
SF 500.1300103 MHz
WDW SINE
SSB 2
LB 0 Hz
GB 0
Resultados e Discussões 141
Tabela 18. Dados de RMN de 1H e 13C de 12 e 13 (500 e 125 MHz).
Posição 1H 13C 1H 13C
1 - 122,4 - 121,1 2 7,35 (d, 2,0, 1H) 124,3 7,88 (d, 2,1, 1H) 131,3 3 - 129,2 - 130,5 4 - 149,5 - 161,8 5 - 145,6 6,86 (d, 8,5, 1H) 109,5 6 7,31 (d, 2,0 , 1H) 115,2 7,95 (dd, 8,5 e 2,1, 1H) 130,2 1’ 3,31 (d, 7,4, 2H) 29,1 3,33 (d, 7,3, 2H) 28,2 2’ 5,34 (tq, 7,4 e 1,2, 1H) 123,9 5,31 (t, 7,5, 1H) 121,5 3’ - 137,1 - 136,7 4’ 2,04-2,08 (m, 6H) 40,9 2,10 (m, 2H) 39,7 5’ 2,14 (q, 7,1, 2H) 27,7 2,10 (m, 2H) 26,5 6’ 5,18 (tq, 6,9 e 1,2, 1H) 126,4 5,16 (t, 6,0, 1H) 124,9 7’ - 135,3 - 134,2 8’ 2,04-2,08 (m, 6H) 39,8 2,10 (m, 2H) 39,1 9’ 2,24 (q, 7,5, 2H) 28,0 2,60 (q, 7,4, 2H) 28,1 10’ 6,74 (t, 7,5, 1H) 144,3 6,01 (t, 7,4, 1H) 145,9 11’ - 133,3 - 130,5 12’ 2,27 (t, 7,6, 2H) 28,6 2,25 (m, 2H) 34,5 13’ 2,04-2,08 (m, 6H) 28,9 2,10 (m, 2H) 27,9 14’ 5,11 (tsep, 7,4 e 1,4, 1H) 125,1 5,08 (tqt, 7,1 e 1,4, 1H) 123,5 15’ - 131,1 - 132,2 16’ 1,65 (d, 1,4, 3H) 26,1 1,66 (sl, 3H) 25,6 17’ 1,72 (d, 1,2, 3H) 16,3 1,71 (sl, 3H) 16,1 18’ 1,61 (d, 1,2, 3H) 16,4 1,60 (sl, 3H) 15,8 19’ - 171,8 - 173,8 20’ 1,57 (d, 1,4, 3H) 17,9 1,58 (sl, 3H) 17,7
COOH - 170,9 - 172,4 OCH3-4 3,88 (s, 3H) 55,5
em ppm; J em Hz.
COOH
OH
OH
COOH
121
3 5
1' 5' 9'
13'
16'17' 18'
19'
20'
COOHOCH3
COOH1
355' 9'
19'
13'16'
20'17' 18'
Resultados e Discussões 142
Substâncias 12a, 12b e 12c e 13a
As substâncias 12a, 12b e 12c obtidas através das reações de metilação,
hidrogenação e acetilação da substância 12, respectivamente, e 13a obtida através
da reação de metilação de 13 (Figura 118), foram caracterizadas a partir dos dados
de RMN de 1H, RMN de 13C, DEPT 135º, HSQC, HMBC e por ESIMS.
Figura 118. Estruturas das substâncias 12a, 12b, 12c e 13a.
As fórmulas moleculares esperadas como produtos das reações realizadas
foram confirmadas através do espectro de massas de alta resolução, sendo 12a
C31H44O6 (m/z 513,3216 Da, calculado para [M+H]+: 513,3216 Da), 12b C31H40O8
(m/z 563,2621 Da, calculado para [M+Na]+: 563,2621 Da), 12c C27H44O6
(m/z 487,3035 Da, calculado para [M+Na]+: 487,3036 Da) (Figura 119).
COOCH3
OCH3
H3CO
COOCH3
12a
COOH
OAc
AcO
COOH
12b
COOH
OH
OH
COOH12c 13a
COOMeOMe
COOMe
Resultados e Discussões 143
Figura 119. Espectro de massas de alta resolução (ESI+) de a) 12a; b) 12b; c) 12c.
Para a substância 12a (Figura 120), o espectro de RMN de 1H (Figura 121 e
Figura 122) (CDCl3, 500 MHz) foram observados os simpletos referentes às
metoxilas provenientes da reação de metilação em 3,72 (-OCH3-20’), 3,86 (-OCH3-
4), 3,89 (-OCH3-17’) e 3,90 (-OCH3-5).
Figura 120. Estrutura do derivado 12a.
513.3216
522.6009
530.3480
535.3045
+MS, 0.7min #44
0
2
4
6
4x10
Intens.
510 515 520 525 530 535 m/z
562.2496
563.2621
564.2656
565.2603
+MS, 0.2-0.4min #(14-23)
0
1
2
3
4x10
Intens.
561.5 562.0 562.5 563.0 563.5 564.0 564.5 565.0 565.5 566.0 m/z
304.2618
360.3256
393.2989437.1970
487.3035
550.6337 585.5367
+MS, 0.9min #51
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Intens.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z
a)
b)
c)
Resultados e Discussões 144
Figura 121. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3).
Figura 122. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3) ampliação de 4,2 a 1,4 ppm.
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm
1.5
81.6
01.6
71.6
71.7
42.0
42.0
42.0
62.0
82.0
92.1
02.1
22.2
22.2
32.2
52.2
62.2
92.3
02.3
23.3
63.3
83.7
23.8
63.8
83.9
05.1
25.1
25.1
35.1
35.1
35.1
45.1
45.1
45.1
45.1
55.2
75.2
86.7
06.7
26.7
37.2
77.4
57.4
57.5
17.5
1
3.1
23.1
33.1
63.1
28.4
12.0
92.0
1
2.0
42.9
03.0
02.9
83.0
7
2.0
41.0
3
0.9
5
1.0
01.0
0
Current Data Parameters
NAME Sub 02a
EXPNO 3PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20080617Time 10.00
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm TXI 1H-13
PULPROG zgTD 65536
SOLVENT CDCl3
NS 24DS 0
SWH 7267.442 Hz
FIDRES 0.110892 Hz
AQ 4.5089269 secRG 14.3
DW 68.800 usec
DE 6.00 usec
TE 298.0 KD1 7.00000000 sec
TD0 1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 9.60 usec
PL1 0 dBSFO1 500.1329965 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536SF 500.1300072 MHz
WDW EM
SSB 0LB 0.10 Hz
GB 0
PC 1.00
7.457.50 ppm 6.75 ppm
5.25.3 ppm
1.51.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.83.94.04.1 ppm
1.5
81
.60
1.6
21
.67
1.6
71
.70
1.7
42
.02
2.0
42
.04
2.0
62
.08
2.0
92
.10
2.1
22
.13
2.2
22
.23
2.2
52
.26
2.2
92
.30
2.3
2
3.3
6
3.3
8
3.7
23
.86
3.8
73
.87
3.8
83
.88
3.9
0
3.1
23
.13
3.1
6
3.1
2
8.4
1
2.0
9
2.0
1
2.0
4
2.9
0
3.0
02
.98
3.0
7
H2
d, 2,0 Hz
H6
d, 2,0 Hz H10’
d, 7,5 Hz
H2’ dq, 7,2 e 1.3 Hz
H6’ e H14’ m
H1’
d, 7,2 Hz
OCH3-20’
OCH3-4
OCH3-17’
OCH3-5
H12’
t, 7,5 Hz
H9’
q, 7,5 Hz
H4’, H5’, H8’ e H13’
m
H18’
H21’
H19’ H17’
Resultados e Discussões 145
O espectro de RMN de 13C (Figura 123) apresentou 31 sinais, sendo os sinais
correspondentes aos carbonos carboxílicos de éster foram observados em 166,9
(C-17’) e 168,4 (C-20’). Observou-se também os carbonos dos grupos metoxílicos
em 51,5 (OCH3-20’), 52,0 (OCH3-5), 55,8 (OCH3-17’) e 60,5 (OCH3-4).
Figura 123. Espectro de RMN de 13C de 12a (125 MHz, CDCl3) ampliação de 171 a 108 ppm e de 62 a 9 ppm.
Os dados obtidos (Tabela 19) confirmam a obtenção da substância 12a como
4,5-dimetoxi-3-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca 2’E, 6’E, 10’E tetraen-1’-il]
benzoato de metila.
.
115120125130135140145150155160165170 ppm
11
1.1
9
12
2.2
91
23
.65
12
3.7
11
24
.93
12
5.3
4
13
1.6
7
13
2.1
2
13
3.9
3
13
5.4
71
36
.24
14
2.6
3
15
1.0
4
15
2.3
4
16
6.8
5
16
8.3
4
202530354045505560 ppm
15
.91
16
.16
17
.53
25
.64
26
.52
26
.97
27
.23
27
.66
28
.43
38
.50
39
.58
51
.48
51
.97
55
.79
60
.46
C20’ C17’ C5
C4
C10’
C3’ C3
C7’ C15’
C11’ C1
C6’
C2/C14’
C2’ C6
OCH3-4 C8’
C4’
C1’/C13’/C9’ C12’/C5’
C16’
C21’ C18’/C19’
OCH3-17’
OCH3-5 OCH3-20’
Resultados e Discussões 146
Tabela 19. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a substância 12a.
Posição 1H (J em Hz) 13C HMBC
1 - 125,3 -
2 7,51 (d, 2,0, 1H) 123,7 C4, C6, C1’, C17’
3 - 135,5 -
4 - 151,0 -
5 - 152,4 -
6 7,45 (d, 2,0, 1H) 111,2 C2, C4,C17’
1’ 3,37 (d, 7,2, 2H) 28,5 C2, C3, C4, C3’, C4’,
C18’
2’ 5,27 (t, 7,2, 1H) 122,3 C1’, C4’, C18’
3’ - 136,2 -
4’ 2,02-2,13 (m, 8H) 39,6 C3’, C5’ C18’
5’ 2,02-2,13 (m, 8H) 26,6 C4’, C6’, C7’
6’ 5,11-5,16 (m, 2H) 124,9 C5’, C8’, C19’
7’ - 133,9 -
8’ 2,02-2,13 (m, 8H) 38,5 C10’
9’ 2,24 (q, 7,5, 2H) 27,3 C7’, C8’, C10’, C11’
10’ 6,71 (t, 7,5, 1H) 142,6 C8’, C9’, C11’, C20’
11’ - 131,7 -
12’ 2,30 (t, 7,5, 2H) 27,0 C10’,C11’,C13’,C14’
13’ 2,02-2,13 (m, 8H) 27,7 C12’,C14’
14’ 5,11-5,16 (m, 2H) 123,6 C13’, C16’, C21’
15’ - 132,1 -
16’ 1,58 (d, 1,1, 3H) 17,6 C14’, C15’, C21’
17’ - 166,9 -
18’ 1,74 (d, 1,3, 3H) 16,2 C2’, C3’, C4’
19’ 1,60 (d, 1,2, 3H) 15,9 C6’, C7’, C8’
20’ - 168,4 -
21’ 1,67 (d, 1,3, 3H) 25,7 C13’, C14’, C15’, C16’
-OCH3 -4 3,86 (s, 3H) 60,5 C4
-OCH3 -5 3,90 (s, 3H) 52,0 C5, C6
-OCH3 -17’ 3,89 (s, 3H) 55,8 C1’, C17’
-OCH3 -20’ 3,72 (s, 3H) 51,5 C11’, C20’
em ppm; J em Hz.
Resultados e Discussões 147
Para a substância 12b (Figura 124), no espectro de RMN de 1H (Figura 125)
(CDCl3, 300 MHz) foram observados quatro simpletos em 1,71, 1,66, 1,61 e 1,58
referentes às metilas ligadas em C sp2 da cadeia lateral e dois simpletos em 2,31 e
2,28 provenientes do grupo acetílico, confirmando assim a obtenção do derivado
acetilado da substância 12.
Figura 124. Estrutura do derivado 12b.
Figura 125. Espectro de RMN de 1H de 12b (MeOD, 300 MHz).
O espectro de RMN de 13C (Figura 126) apresentou 31 sinais (CDCl3, 75
MHz), sendo dois sinais correspondentes aos carbonos carbonílicos dos ácidos
COOH
COOH
O
O
O
O1
2
34
5
6
1'
3'
5'
7'
9'
11'
13'
15'16'
18'
20'21' 22'
23'
24'
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
1.5
71.5
81.6
11.6
51.6
61.7
12.0
52.0
82.1
02.2
42.2
52.2
72.2
82.3
13.3
03.3
03.3
13.3
13.3
23.3
55.0
95.1
15.1
25.1
25.1
45.1
55.1
75.1
75.1
95.2
05.2
15.2
35.2
36.7
16.7
46.7
67.6
97.7
07.8
17.8
2
3.6
73.6
3
3.7
33.7
612.1
75.4
54.1
0
1.8
7
3.3
3
1.0
1
1.0
41.0
0
Current Data ParametersNAME Sub 02c_2EXPNO 2PROCNO 1
F2 - Processing parametersSI 32768SF 299.9535455 MHzWDW EMSSB 0LB 0.30 HzGB 0PC 1.00
6.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.9 ppm
1.61.71.81.92.02.12.22.32.4 ppm
H20’ H18’
H21’, H24’, H22’, H16’
H6 H2 H10’
Resultados e Discussões 148
carboxílicos em 167,2 (COOH) e 170,2 (C-23’) e dois correspondentes aos
carbonos carbonílicos dos grupos ésteres em 168,5 (C-17’) e 168,2 (C-19’). As
atribuições foram realizadas pela análise dos espectros de RMN de 1H, RMN de 13C,
HSQC e HMBC (Tabela 20).
Figura 126. Espectro de RMN de 13C de 12b (MeOD, 75 MHz).
A substância 12b foi caracterizada como ácido ácido-3,4-bis-(acetiloxi)-5-
[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1-il]-
benzoico.
120125130135140145150155160165170175 ppm
122.2
6123.9
0125.0
3126.1
6
129.6
2130.3
8
133.1
4
133.2
7
135.5
0
137.4
7138.8
0
144.1
4144.3
1145.9
6
168.5
7169.4
9169.9
0171.5
1
Current Data ParametersNAME Sub 02c_2EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Processing parametersSI 65536SF 75.4235457 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.00
1516171819202122232425262728293031323334353637383940414243 ppm
16.2
816.5
0
17.9
0
20.4
220.6
4
26.1
0
27.4
928.0
028.5
528.9
0
29.7
5
39.7
4
40.7
1
Resultados e Discussões 149
Tabela 20. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 300 e 75 MHz) obtidos para a substância 12b.
Carbono 1H 13C HMBC
1 - 129,1 -
2 7,69 (d, 1H, J 2,0) 122,6 C3, C4, C6, -COOH
3 - 142,8 -
4 - 144,6 -
5 - 136,1 -
6 7,81(d, 1H, J 2,0) 128,3 C2, C3, C4, C1’, -COOH
1’ 3,35 (sl, 2H) 28,4 C4, C5, C6, C2’, C3’
2’ 5,09-5,26 (m, 3H) 120,9 C1’, C4’, C21’
3’ - 137,5 -
4’ 2,05-2,25 (m, 12H) 39,4 *
5’ 2,05-2,25 (m, 12H) 26,2 *
6’ 5,09-5,26 (m, 3H) 124,8 C5’, C8’, C22’
7’ - 134,2 -
8’ 2,05-2,25 (m, 12H) 38,4 *
9’ 2,05-2,25 (m, 12H) 27,2ª *
10’ 6,74 (t, 1H, J 7,5) 143,0 C16’, C24’
11’ - 131,8b -
12’ 2,05-2,25 (m, 12H) 27,6ª *
13’ 2,05-2,25 (m, 12H) 26,7 *
14’ 5,09-5,26 (m, 3H) 123,7 C16’, C24’
15’ - 131,9b -
16’ 1,58 (s, 3H) 16,6 C14’, C15’, C24’
17’ - 168,5 -
18’ 2,28* (s, 3H) 19,1 C17’
19’ - 168,2 -
20’ 2,31* (s, 3H) 19,3 C19’
21’ 1,71 (s, 3H) 15,2 C2’, C3’, C4’
22’ 1,61 (s, 3H) 15,0 C6’, C7’, C8’
23’ - 170,2 -
24’ 1,66 (s, 3H) 24,8 C14’, C15’, C16’
COOH - 167,2 - a,
b Os sinais podem estar invertidos, * as correlações estavam sobrepostas; em ppm; J em Hz.
Para a substância 12c (Figura 127), no espectro de RMN de 1H (MeOD, 500
MHz) (Figura 128) foram observados dois dupletos em 7,34 (J 2,0 Hz, 1H) e 7,31
(J 2,0 Hz, 1H) referentes aos hidrogênios do anel aromático, quatro sinais em 0,85,
0,86, 0,87 e 0,94 referentes as metilas ligadas em carbono sp3. Observou-se
COOH
COOH
O
O
O
O1
2
34
5
6
1'
3'
5'
7'
9'
11'
13'
15'16'
18'
20'21' 22'
23'
24'
Resultados e Discussões 150
também três multipletos em 2,56-2,68 (2H), 2,25-2,32 (1H) e 1,06-1,63 (27H)
referentes aos hidrogênios ligados aos carbonos da cadeia lateral. Não foram
observados sinais referentes a hidrogênios ligados em carbono sp2, confirmando
assim a obtenção do derivado peridrogenado da substância 12.
Figura 127. Estrutura do derivado 12c.
Figura 128. Espectro de RMN de 1H de 12c (MeOD, 400 MHz)
O espectro de RMN de 13C e DEPT 135º (CDCl3, 125 MHz) (Figura 129 e
Figura 130) apresentou 27 sinais, sendo dois correspondentes aos carbonos
carbonílicos do ácido carboxílico. As atribuições para os carbonos do anel aromático
foram realizadas pela análise dos espectros de HSQC e HMBC (Tabela 21). A
OH
OH
COOH
COOH
1
2
34
5
6
1'
3'
5'
7'
9'
11'
13'
15'16'
17' 18'
19'
20'
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
-0.0
00
.85
0.8
50
.86
0.8
80
.94
0.9
61
.14
1.1
61
.17
1.1
81
.28
1.3
01
.32
1.3
81
.39
1.4
01
.41
1.4
21
.43
1.4
41
.50
1.5
21
.54
1.5
52
.28
2.2
92
.30
2.3
12
.32
2.5
92
.60
2.6
12
.62
2.6
32
.64
2.6
63
.30
3.3
13
.31
3.3
13
.32
7.3
17
.32
7.3
4
7.3
4
9.0
12
.81
23
.20
1.1
1
2.0
0
1.0
60
.95
Current Data ParametersNAME acido cald. hidrogenado 1EXPNO 1PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120804Time 12.37INSTRUM spectPROBHD 5 mm TBI 1H/13PULPROG zg30TD 32768SOLVENT MeODNS 1DS 0SWH 8223.685 HzFIDRES 0.250967 HzAQ 1.9923444 secRG 50.8DW 60.800 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========SFO1 400.1824710 MHzNUC1 1HP1 10.00 usecPLW1 10.64299965 W
F2 - Processing parametersSI 131072SF 400.1800122 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.00
7.35 ppm
COOH
OH
OH
COOH
Resultados e Discussões 151
substância 12c foi caracterizada como sendo o ácido 3-(11-carboxi-3’,7’,15’-
trimetilexadecil)-4,5-di-hidroxibenzoico.
Figura 129. Espectro de RMN de 13C de 12c (125 MHz, MeOD).
ppm (t1)
050100150200
18
1.2
1
17
1.1
7
14
9.3
9
14
5.4
1
13
0.3
1
12
4.5
2
12
2.7
1
12
2.6
9
11
5.0
1
47
.50
40
.10
38
.47
38
.42
38
.33
38
.31
38
.29
38
.18
38
.17
38
.08
38
.01
34
.15
34
.08
34
.01
33
.86
33
.84
33
.77
29
.06
28
.53
26
.45
26
.06
25
.43
23
.07
22
.95
20
.24
20
.18
20
.14
20
.08
COOH
OH
OH
COOH
Resultados e Discussões 152
Figura 130. Espectro de RMN de 13C/DEPT 135º de 12c (125 MHz, MeOD). Tabela 21. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 500 e 125 MHz) de 12c.
Posição 1H 13C HMBC
1 - 122,7 -
2 7,34 (sl) 124,5 C4,C6, C1’, COOH
3 - 130,3 -
4 - 149,4 -
5 - 145,4 -
6 7,31 (sl) 115,0 C1, C4, C5, COOH
1’ 2,60 (m) 28,5
2’-15’ 2,56-2,68 (2H), 2,25-2,32 (1H) e 1,06-1,63 (27H)
* -
16’-18’ e 20’
0,85-0,94 (12H) * -
19’ - 181,2 -
COOH - 171,2 -
* sinais sobrepostos, em ppm; J em Hz.
ppm (f1)
050100
12
4.5
2
11
5.0
1
49
.49
49
.32
49
.20
49
.15
49
.04
48
.86
47
.51
40
.11
38
.47
38
.43
38
.33
38
.30
38
.19
38
.09
38
.01
34
.16
34
.09
34
.02
33
.87
33
.85
33
.77
29
.06
28
.55
26
.45
26
.07
25
.44
23
.07
22
.95
20
.25
20
.19
20
.15
20
.09
OH
OH
COOH
COOH
1
2
34
5
6
1'
3'
5'
7'
9'
11'
13'
15'16'
17' 18'
19'
20'
Resultados e Discussões 153
Para a substância 13a (
Figura 131), no espectro de RMN de 1H (Figura 132) (CDCl3, 500 MHz) foram
observados dois simpletos adicionais referentes às metoxilas provenientes da
reação de metilação em 3,87 (-OCH3-17’) e 3,72 (-OCH3-20’).
Figura 131. Estrutura do derivado 13a.
Figura 132. Espectro de RMN de 1H de 13a (CDCl3, 500 MHz)
O espectro de RMN de 13C (Figura 133) apresentou 30 sinais, sendo os sinais
correspondentes aos carbonos carboxílicos de éster foram observados em 167,1
COOMeOMe
COOMe1
355' 9'
19'
13'16'
20'
17'
18' 21'
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
1.5
71.5
9
1.6
71.6
71.7
11.7
12.0
42.0
52.0
62.0
82.0
92.2
22.2
4
2.2
52.4
72.4
82.5
02.5
13.3
23.3
43.7
33.8
73.8
85.0
7
5.0
85.0
85.0
95.1
35.1
45.1
45.2
85.2
95.3
05.3
05.3
15.3
25.8
25.8
45.8
56.8
46.8
67.2
67.8
27.8
27.8
87.8
87.9
0
7.9
0
2.9
43.1
63.2
23.2
18.6
72.1
6
2.1
2
2.1
1
2.9
52.8
83.3
5
0.9
61.0
41.0
3
1.0
0
1.0
2
0.9
20.9
1
Current Data ParametersNAME Sub 10aEXPNO 2PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120819Time 17.58INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 4SWH 6487.889 HzFIDRES 0.098997 HzAQ 5.0506911 secRG 90.5DW 77.067 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 WSFO1 500.1327498 MHz
F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1300118 MHzWDW EMSSB 0LB 0.20 HzGB 0PC 1.00
3.753.803.853.90 ppm
Resultados e Discussões 154
(C-17’) e 168,5 (C-20’). Observou-se também os carbonos dos grupos metoxílicos
em 51,7 (OCH3-20’), 51,1 (OCH3-17’) e 55,5 (OCH3-4).
Figura 133. Espectro de RMN de 13C de 13a (CDCl3, 125 MHz)
Os dados obtidos (Tabela 22) confirmam a obtenção da substância 13a como
4-metoxi-3-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca-2’E, 6’E, 10’Z, 14’-tetraen-1’-
il]-benzoato de metila, de estrutura inédita.
190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm
15
.81
16
.12
17
.62
25
.64
26
.64
27
.85
28
.00
28
.24
34
.69
39
.16
39
.74
51
.07
51
.75
55
.47
10
9.4
51
21
.66
12
2.1
51
23
.50
12
4.8
41
29
.34
13
0.0
61
30
.75
13
1.3
51
32
.07
13
4.2
2
13
6.5
81
42
.13
16
1.0
9
16
7.1
21
68
.51
Current Data ParametersNAME Sub 10aEXPNO 3PROCNO 1
F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120819Time 18.04INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 512DS 0SWH 32894.738 HzFIDRES 0.501934 HzAQ 0.9961972 secRG 80.6DW 15.200 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1
======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7728799 MHz
======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 80.00 usecPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz
F2 - Processing parametersSI 32768SF 125.7577930 MHzWDW EMSSB 0LB 1.00 HzGB 0PC 1.40
Resultados e Discussões 155
Tabela 22. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a substância 13a.
Posição 1H (J em Hz) 13C
1 - 131,3
2 7,82 (d, 2,2, 1H) 130,7
3 - 130,1
4 - 161,1
5 6,85 (d, 8,5, 1H) 109,5
6 7,89 (d, 2,2 e 8,5, 1H) 129,3
1’ 3,33 (d, 7,3, 2H) 28,2
2’ 5,30 (tt, 1,3 e 7,3, 1H) 121,7
3’ - 136,6
4’ 2,08 (m, 2H) 26,6
5’ 2,08 (m, 2H) 39,7
6’ 5,14 (m, 2H) 124,8
7’ - 134,2
8’ 2,08 (m, 2H) 39,2
9’ 2,24 (q, 7,5, 2H) 34,7
10’ 5,84 (t, 7,5, 1H) 142,1
11’ - 122,1
12’ 2,49 (t, 7,5, 2H) 28,0
13’ 2,08 (m, 2H) 27,8
14’ 5,08 (m, 2H) 123,5
15’ - 132,1
16’ 1,59 (d, 1,1, 3H) 17,0
17’ - 167,1
18’ 1,71 (d, 1,3, 3H) 16,1
19’ 1,57 (d, 1,2, 3H) 15,8
20’ - 168,5
21’ 1,67 (d, 1,3, 3H) 25,6
-OCH3 -4 3,88 (s, 3H) 55,5
-OCH3 -17’ 3,87 (s, 3H) 51,7
-OCH3 -20’ 3,72 (s, 3H) 51,1
em ppm; J em Hz.
COOMeOMe
COOMe1
355' 9'
19'
13'16'
20'
17'
18' 21'
Resultados e Discussões 156
4.9 Ensaios de atividade biológica
4.9.1 Avaliação da atividade antifúngica contra Cladosporium
cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum.
Os extratos brutos das plantas foram avaliados qualitativamente quanto ao
potencial antifúngico contra as espécies de fungo Cladosporium cladosporioides e C.
sphaerospermum, através do ensaio de bioautografia. Este ensaio consiste na
observação da ação inibitória de extratos ou substâncias potencialmente
antifúngicas sobre esporos de fungos (Homans; Fuchs, 1970).
O ensaio foi realizado utilizando como reveladores os esporos dos fungos C.
cladosporioides e C. sphaerospermum. Estes fungos foram selecionados por
produzirem uma grande quantidade de esporos e apresentarem crescimento
uniforme em condições de cultura in vitro.
Algumas substâncias purificadas e descritas neste trabalho foram submetidas
aos ensaios de atividade antifúngica quantitativa frente aos fungos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum, de acordo com a disponibilidade de material
obtido no isolamento.
A Tabela 23 apresenta os resultados dos ensaios de limite de detecção das
amostras testadas e do padrão nistatina utilizado como controle positivo. O ensaio
de limite de detecção indica a quantidade mínima necessária de amostra que inibe o
crescimento dos fungos em placas cromatográficas de gel de sílica.
Os resultados observados para o ácido caldensínico (12) e seus derivados
(12a-12c) indicaram uma atividade moderada (Figura 134). As substâncias 12 e 12c
foram pouco ativas contra C. cladosporioides e apresentaram atividade moderada
contra C. sphaerospermum, sendo necessárias 10 e 25 g de amostra
Resultados e Discussões 157
respectivamente. As substâncias 12a e 12c também apresentaram atividade
moderada com 5 e 25 g de amostra respectivamente, contra o fungo C.
cladosporioides e 10 e 25 g contra C. sphaerospermum.
Os valores obtidos nesse ensaio de bioautografia indicam que os metabólitos
6 e 7 apresentaram maior potencial fungitóxico e a substância 8 apresentou
atividade moderada frente aos fungos C. cladosporioides e C. sphaerospermum.
De acordo com os valores observados a presença do anel B não aromático
causa uma diminuição do potencial apresentado por 6 e 7, que foram ativas com
apenas 1 g de amostra tanto contra C. cladosporioides quanto C. sphaerospermum
enquanto que para 8 foram necessários 5 e 25 g respectivamente.
Tabela 23. Atividade antifúngica contra C. cladosporioides e C. sphaerospermum.
Substâncias Atividade antigúngica (g)*
C. cladosporioides C. sphaerospermum
6 1 1
7 1 1
8 5 25
12 100 10
12a 5 10
12b 1 25
12c 25 5
Nistatina 1 1 *Quantidade mínima requerida para a inibição do crescimento do fungo na placa de CCDA.
Resultados e Discussões 158
UV
= 254
Cladosporium cladosporioides
Cladosporium shaerospermum
12
12a
12b
12c
Nistatina
100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g
6
7
Nistatina
100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g
8
Nistatina
100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g
Figura 134. Placas de CCDA reveladas com UV (=254 nm), esporos de C. cladosporioides e C. sphaerospermum.
Resultados e Discussões 159
4.9.2 Atividade antitumoral
Flavonoides são bastante conhecidos por apresentarem diversas atividades
biológicas, como antioxidante, anti-inflamatória e antifúngica e apresentam baixa
toxidade nos ensaios antitumorais. No entanto, a presença de anel B modificado
(oxidado e reduzido) tem potencializado a atividade antitumoral de flavonoides, um
exemplo é a substância protoapigenona (Figura 135) que apresentou uma potencial
atividade antitumoral frente a diversas linhagens de células tumorais: câncer de
fígado (Hep G2 e Hep 3B), câncer de pulmão (A459), câncer de mama (MCF-7 e
MDA-MB-231), câncer de próstata e câncer de ovário (MDAH-2774 e SKOV3)
(Chang; Su; et al., 2008; Chang; Wu; et al., 2008; Lin, A. S. et al., 2005).
O
O
O
OH
OH
OH
Figura 135. Estrutura da substância protoapigenona.
As flavanonas 6, 7 e 8 foram inicialmente submetidas ao ensaio de atividade
antitumoral contra as linhagens células leucêmicas K562 e Nalm-6. Os princípios
ativos Gleevec® e vincristina foram utilizados como controle positivo (Figura 136).
Resultados e Discussões 160
N
N
N
NH NH
O
N
N
O
O
O
OH
MeO
MeO
OH
O
OOH
OH
OMe
O
O
OH
OH
MeO
NH
N
H
OH
OO
O
N
N
O
O
OH
O
O
OHC HH
Vincristina
Gleevec
Sakuranetina (7)Diidrowogonina (6) Protoflavanona (8)
Figura 136. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (5, 6 e 8) e controles positivos (Gleevec e vincristina)
A tabela 24 apresenta os valores de IC50 obtidos no ensaio inicial contra as
células leucêmicas K-562 e Nalm-6.
Tabela 24. Citotoxidade de 5, 6 e 8 para as linhagens de células leucêmicas K-562 e NALM-6.
Cell line
6 IC50 (µM)
7 IC50 (µM)
8 IC50 (µM)
Gleevec IC50 (µM)
Vincristina IC50 (µM)
K-562 91 281 14 10 - NALM-6 80 288 11 - 0,17
*linhagens: K-562 Leucemia mielóide, NALM-6 Leucemia linfoblástica aguda B.
De acordo com os valores observados a substância 8 apresentou um alto
potencial antitumoral frente às linhagens de células avaliadas com valor de IC50 = 14
M muito semelhante ao Gleevec® utilizado no ensaio contra K562. Para Nalm16 o
valor de IC50 apresentado pela substância 8 foi de 11 g/ml sendo 0,17 para o
controle vincristina. Apesar de a vincristina apresentar um potencial muito maior que
as amostras ensaiadas o valor observado para a substância 8 foi considerado
Resultados e Discussões 161
promissor, enquanto que as substâncias 6 e 7 apresentaram resultados
insatisfatórios.
Esses resultados revelam que a presença do anel B não aromático da
flavanona 8 tem um papel importante para a atividade antitumoral, resultando em
uma atividade citotóxica significante quando comparada com as de flavanonas com
anel B aromático (5 e 6).
Após a obtenção desses resultados iniciais, e com o posterior isolamento e
identificação da substância 9, foi realizado um novo ensaio onde as substâncias 8, 9
e o derivado 8a (Figura 137) foram testados contra doze linhagens de células
tumorais (Tabela 25).
O
O
O
OH
MeO
MeO
OH
O
O
O
OH
MeO
MeO
OHOH
O
O
O
OH
MeO
MeO
OH
8 9 8a
Figura 137. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (8, 8a e 9)
Tabela 25. Citotoxidade de 8, 8a e 9 para as doze linhagens de células leucêmicas avaliadas.
Cell line
8 IC50 (µM)
9 IC50 (µM)
8a IC50 (µM)
Vincristina IC50 (µM)
K-562 12,8 234,0 > 300 0,164 HL-60 8,7 168,4 > 300 0,011 NB4 3,4 75,5 222,7 0,003 P39 10,9 205,0 > 300 0,01
Daudi 14,6 > 300 > 300 0,01 U-937 13,1 > 300 > 300 0,005
RAMOS 8,2 187,5 > 300 0,029 Jurkat 5,9 131,0 > 300 0,164
MOLT-4 11,4 214,8 > 300 0,009 B15 8,5 172,5 > 300 0,504
NAMALWA 9,6 214,6 > 300 0,077 NALM-6 8,9 197,0 > 300 1,707
K562, HL60, NB4: Leucemia mielóide; P39: Síndrome mielodisplásica (SMD); NAMALWA, DAUDI, RAMOS: Linfoma de Burkitt; JURKAT, MOUT4: Leucemia linfoblástica aguda T; U937: Linfoma histiocítico; NALM6, B15: Leucemia linfoblástica aguda B.
Resultados e Discussões 162
A substância 8 apresentou uma potencial atividade antileucêmica para as
doze linhagens de células avaliadas, com valores de IC50 na faixa entre 3 a 15 M. A
substância 9 apresentou uma diminuição drástica na atividade com valores de IC50
na faixa de 200 M com exceção de NB4 e Jurkat que foram de 75,5 e 131,0 M,
respectivamente. Já a substância 8a mostrou-se totalmente inativa nas
concentrações testadas, com valores de IC50 > 300 M, exceto para NB4 que foi de
222,7 M.
Os resultados observados revelam que em flavanonas a presença de anel B
totalmente reduzido torna a substância inativa para a atividade antitumoral, sendo
ativa apenas na presença de dupla ligação conjugada à carbonila.
Estes resultados estão de acordo com relatos da literatura para substâncias
similares, dentre os quais a protoapigenona vem apresentando resultados
promissores contra inúmeras linhagens de células tumorais e a combinação dessas
substâncias com as drogas atualmente utilizadas no tratamento do câncer tem
apresentado um aumento no potencial citotóxico (Lin, A.-S. et al., 2005; Liu et al.,
2011; Wei et al., 2011). Ensaios como este devem também serem realizados além
de uma avaliação da atividade das protoflavanonas 10 e 11.
Apesar da existência de drogas muito potentes no tratamento da leucemia,
como Gleveec (Novartis) e Sprycel (Bristol-Myers Squibb), a busca por novas drogas
continua sendo importante. Estes fármacos atuam na inibição da enzima tirosina
quinase, que se apresenta hiperativa nas células brancas do sangue de pessoas
com leucemia. No entanto essa enzima tem sido susceptível à mutação pelo uso
desses medicamentos, tornando-os inativos para o tratamento. Recentemente o
novo fármaco Ponatinib foi aprovado pela FDA (EUA, dezembro/2012) como uma
Resultados e Discussões 163
droga candidata para o tratamento de leucemia mielóide crônica e leucemia
linfoblástica aguda (Dolgin, 2013).
4.10 Análises quimiométricas
O estudo fitoquímico das quatro espécies de Piper permitiu a identificação de
seus metabólitos majoritários, sendo agora possível relacioná-los com o gráfico de
scores do PCA obtido inicialmente para os espécimes analisados (Tabela 26)
(Seção 4.1).
Tabela 26. Espécies de Piper analisadas por PCA.
Espécie Parte da planta Código Local de coleta
Piper bowiei Folhas K-364 F São Paulo – SP
P. caldense Folhas K-484 F Ubatuba – SP
P. caldense Folhas K-842 F Ubatuba – SP
P. caldense Galhos K-842 G Ubatuba – SP
P. caldense Frutos K-842 Fr Ubatuba – SP
P. caldense Sementes K-842 S Ubatuba – SP
P. caldense Folhas K-951 F Ubatuba – SP
P. caldense Galhos K-951 G Santa Tereza – ES
P. caldense Frutos K-951 Fr Santa Tereza – ES
P. caldense Sementes K-951 S Santa Tereza – ES
P. caldense Caule K-951C Santa Tereza – ES
P. caldense Raiz K-951 R Santa Tereza – ES
P. permucronatum Folhas K-310 F São Paulo – SP
P. permucronatum Folhas K-1022 F Cubatão – SP
P. permucronatum Galhos K-1022 G Cubatão – SP
P. carniconnectivum Folhas K-963 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-976 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-978 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-991 F Carajás – PA
P. carniconnectivum Folhas K-989 F Carajás – PA
Resultados e Discussões 164
4.10.1 Espectrometria de massas com injeção direta
Para a realização desse estudo os extratos preparados foram analisados por
injeção direta no espectrômetro de massas, e os espectros obtidos submetidos ao
PCA.
No gráfico de scores (Figura 138) foi possível observar o agrupamento das
amostras de acordo com a espécie, baseado principalmente na similaridade da
composição química. A análise dos gráficos de scores e loadings (Figura 139)
juntamente com os resultados obtidos no estudo fitoquímico das plantas demonstrou
que nas amostras de P. carniconnectivum (grupo II) a variável de m/z 335 Da foi a
qual apresentou maior influência no agrupamento das amostras desta espécie, esta
variável corresponde ao metabólito majoritário identificado nos extratos das folhas, a
substância 8, uma protoflavanona.
Nos extratos das folhas de P. bowiei e P. permucronatum (grupo III) a maior
contribuição foi da variável m/z 287 Da, correspondente as flavanonas di-
hidrowogonina (6) e sakuranetina (7), identificadas como constituintes majoritários
nos respectivos extratos. Em função da presença de flavanonas isoméricas a análise
de PCA não permitiu a discriminação entre essas duas espécies.
No grupo I, constituído pelas amostras de P. caldense, observou-se a
presença de inúmeras variáveis na faixa de m/z 450 Da, sendo o metabólito
majoritário desses extratos o ácido caldensínico (12) de massa molecular 456 Da, há
indícios da presença de outros derivados de ácidos benzoicos prenilados no extrato
na faixa de m/z 400-470 Da (Espectros de EM-ESI nos apêndices A, B e C).
Resultados e Discussões 165
Figura 138. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper.
Figura 139. Gráfico de loadings (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper.
Este estudo preliminar permitiu obter uma visão geral das similaridades entre
as espécies e serviu como base para os experimentos realizados a seguir com o
emprego das técnicas analíticas de CLAE-EM e RMN de 1H, seguidos das análises
dos dados por PCA e HCA.
Resultados e Discussões 166
4.10.2 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria
de massas
Visando complementar os estudos quimiométricos os extratos de P. caldense,
P. permucronatum e P. carniconnectivum foram preparados em triplicada e
analisados por CLAE-EM (Tabela 27).
Tabela 27. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H.
Espécie Código Local coleta
P. caldense K1209A Ubatuba-SP
K1209B Ubatuba-SP
K1209C Ubatuba-SP
K1569A Cunha-SP
K1569B Cunha-SP
K1581A Cunha-SP
P. permucronatum K1210A Ubatuba-SP
K1210B Ubatuba-SP
K1210C Ubatuba-SP
K1220A Ubatuba-SP
K1220B Ubatuba-SP
P. carniconnectivum K1441A Belterra-PA
K1441B Belterra-PA
K1441C Belterra-PA
K1600A Manaus-AM
K1600B Manaus-AM
A seguir são mostrados alguns cromatogramas de CLAE obtidos com o
detector UV em 254 nm (Figura 140). Neles são possíveis observar que os perfis
cromatográficos são diferentes em cada uma das plantas.
Resultados e Discussões 167
Figura 140. Cromatogramas CLAE-UV de alguns extratos.
Os cromatogramas de íons obtidos nas análises de CLAE foram convertidos
em ASCII e os dados submetidos às análises pelos métodos quimiométricos de PCA
e HCA.
Na análise de PCA foi possível observar três agrupamentos no gráfico de
scores (Figura 141). No grupo I estão reunidas todas as amostras de P.
permucronatum (K1210A, B e C e K1220A e B), que segundo o gráfico de loadings
(Figura 142) esta separação foi influenciada pela presença dos íons com m/z 287 e
167 Da, ambos observados no tempo de retenção de 13,1 min. O íon m/z 287 Da
corresponde à massa molecular da sakuranetina (6), identificada como metabólito
majoritário nos extratos de P. permucronatum, enquanto que o íon m/z 167 Da
corresponde ao íon proveniente de uma fragmentação do tipo Retro-Diels-Alder no
anel C da sakuranetina (6).
No grupo II estão as amostras de P. carniconnectivum (K-1441A e C), espécie
na qual foram identificadas as protoflavanonas 8 e 9. De acordo com o gráfico de
254 nm
-20 -10
0 10
Intens. [mAU]
0
100
200
Intens. [mAU]
0
50
100
Intens. [mAU]
0 50
100 150
Intens. [mAU]
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time [min]
P. carniconnectivum K-1441
P. carniconnectivum K-1600
P. permucronatum
K-1220
P. caldense K-1209
8
10
11
5
7
12
Resultados e Discussões 168
loadings, a discriminação foi influênciada pela presença do íon com m/z 223 Da no
tempo de retenção 7,9 min, que corresponde provavelmente ao íon fragmentário
proveniente da fragmentação das protoflavanonas 8 e 9 com a saída do anel B não
aromático, conforme constatado durante a elucidação estrutural realizada
anteriormente para as substâncias puras.
No grupo III foram agrupadas as amostras de P. caldense (K-1209A, B e C),
P. carniconnectivum (K-1600A e B, K-1441B) além de K-1569A e B e K-1581A.
Neste caso o PCA não possibilitou a discriminação entre as espécies, e não foi
possível encontrar uma correlação entre o agrupamento observado e os valores
observados no gráfico de loadings com os metabólitos secundários identificados.
Figura 141. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM, dos extratos de espécies de Piper.
Resultados e Discussões 169
Figura 142. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM dos extratos de espécies de Piper.
Dando sequência à análise dos dados empregou-se o HCA, utilizando o
método Ward com distancia euclidiana. Os resultados observados no dendrograma
(Figura 143) permitiram uma melhor visualização das similaridades entre as
espécies quando comparado ao PCA. A região pontilhada destacada no
dendrograma apresenta as espécies que estão agrupadas no grupo III do PCA, pelo
qual não foi possível obter uma boa discriminação entre as espécies, sendo agora
possível observar as similaridades entre elas.
Foram observados cinco agrupamentos, sendo o grupo I composto por todas
as amostras de P. permucronatum e o grupo II pelas amostras de P.
carniconnectivum coletadas em Belterra-PA (K-1441A e C). No entanto o espécime
K-1441B (grupo IV ) coletado na mesma região foi agrupado próximo às amostras de
P. caldense coletadas em Cunha-SP (K-1569 e K-1581). As amostras de P.
carniconnectivum coletadas em Manaus-AM (K-1600) foram também agrupadas
separadamente no grupo III, apesar de apresentarem em sua composição química
metabólitos secundários de mesmo esqueleto raro identificados nas espécies de P.
Resultados e Discussões 170
carniconnectivum coletadas em Belterra-PA do grupo II (K-1441A e C). As espécies
de P. caldense foram agrupadas no grupo III.
Figura 143. Gráfico de HCA para análise de CLAE-EM.
4.10.3 Ressonância magnética nuclear da fase orgânica
Os espectros de RMN de 1H da fase orgânica CHCl3 dos extratos obtidos
foram integrados e os dados submetidos aos métodos quimiométricos de PCA e
HCA. Alguns espectros são apresentados no APÊNDICE B, nos quais é possível
observar a presença de muitos sinais na região dos aromáticos, os quais podem ser
correlacionados com os metabólitos secundários identificados no estudo fitoquímico.
A análise do PCA foi realizada em diferentes faixas dos espectros e os
resultados não permitiram observar uma boa distinção entre as espécies, sendo
P. p
erm
ucro
natu
m
P. carn
iconn
ectivu
m
P. carn
iconn
ectivu
m
P. cald
ense
(IV)
(V)
(I) (II)
(III)
Resultados e Discussões 171
apresentados a seguir os resultados obtidos para a região de 8,0 ppm a 5,0 ppm,
correspondente aos hidrogênios olefínicos e aromáticos.
No gráfico de scores (Figura 144), os grupos I e II agruparam diferentes
espécies, sendo identificadas no grupo I as amostras de P. permucronatum e P.
carniconnectivum (K-1600A e B), que segundo o gráfico de loadings (Figura 145)
essa separação foi influênciada pelas variáveis 7,33, 6,89, 6,87, 6,07 e 6,05,
correspondentes aos sinais dos hidrogênios aromáticos das flavonas e flavanonas
presentes nestas amostras. No grupo II, estão agrupadas as amostras de P.
caldense, P. carniconnectivum (K-1441B) e P. permucronatum (K-1569 e K-1581).
De acordo com o gráfico de loadings, esse agrupamento foi influênciado pelas
variáveis na região de 5,1 ppm, região correspondente as duplas ligações presentes
nas unidades de prenila dos metabólitos secundários identificados em P. caldense.
O grupo III, que ficou bem diferenciado das demais amostras apresentou as
amostras K-1441A e C de P. carniconnectivum, planta na qual foram identificadas
duas novas protoflavanonas, e a variável que teve maior influência neste
agrupamento foi 6,09 ppm.
Resultados e Discussões 172
Figura 144. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (66% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.
Figura 145. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3) dos extratos de espécies de Piper.
Devido ao resultado apresentado não ser satisfatório para a distinção entre as
espécies, foi realizado um novo cálculo removendo da matriz inicial as amostras de
P. carniconnectivum K1441A e C. No gráfico de scores (Figura 146) obtido foi
possível verificar uma melhor discriminação entre as espécies analisadas, onde
foram observados quatro agrupamentos. No grupo I observou-se o agrupamento das
Resultados e Discussões 173
amostras de P. caldense. No grupo II, encontram-se apenas as amostras de P.
carniconnectivum K-1441B, no grupo II, P. carniconnectivum K1600A e B e no grupo
IV, P. permucronatum.
No gráfico de loadings (Figura 147) pode-se verificar que as variáveis
responsáveis pela separação observada são as mesmas observadas na análise
anterior, sendo possível observar apenas as influências dos sinais na região de 5,1
ppm para o agrupamento I formado pelas amostras de P. caldense, e os sinais
correspondentes aos hidrogênios aromáticos das flavonas de P. permucronatum
que contribuem para a formação do agrupamento IV.
Figura 146. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.
Resultados e Discussões 174
Figura 147. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.
Dando sequência a análise dos dados empregou-se o HCA, utilizando o
método Ward com distância euclidiana. Os resultados observados no dendrograma
(Figura 148) permitiram uma melhor visualização das semelhanças entre as
espécies quando comparado ao PCA total. No dendrograma observa-se a formação
de sete agrupamentos definidos de acordo com a espécie. Os agrupamentos
observados foram semelhantes aos observados no PCA, no entanto foi possível
visualizar que algumas replicatas de P. permucronatum foram agrupadas no grupo
VI próximas à P. caldense, o mesmo vem acontecendo com as triplicatas de K-
1441B, grupo V.
Resultados e Discussões 175
Figura 148. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase orgânica.
4.10.4 Ressonância magnética nuclear da fase hidroalcoólica
Para a fase hidroalcoólica foi utilizado o espectro de RMN de 1H na região de
10,0 a 5,0 ppm e de 4,6 a 0,9 ppm, alguns espectros estão apresentados no
APÊNDICE C. O gráfico de scores (Figura 149) apresentou 3 grupos, sendo que o
grupo I agrupou as amostras de P. caldense, P. permucronatum, P.
carniconnectivum (K1441A) e P. caldense (K1569 e K1581). No grupo II observou-se
apenas as replicatas de P. carniconnectivum K-1441B, e no grupo III P.
carniconnectivum (K1441C, K1600A e B). De acordo com o gráfico de loadings
(Figura 150) não foi possível estabelecer uma correlação significativa para a
distribuição observada, sendo assim, nesta análise de PCA pode-se verificar que a
(IV)
(V) (I) (II)
(III)
(VI)
(VII) P. p
erm
ucro
natu
m
P. carn
iconn
ectivu
m
P. carn
iconn
ectivu
m
P. cald
ense
P. cald
ense
Resultados e Discussões 176
metodologia empregada não foi satisfatória, pois não permitiu a distinção entre as
espécies.
Figura 149. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper.
Figura 150. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper.
Os resultados obtidos para o HCA (Figura 151) foram semelhantes aos do
PCA no grupo I estão agrupadas as amostras de P. carniconnectivum (K-1441A/C e
K-1600A/B). As amostras de P. caldense e P. permucronatum aparecem em 3
Resultados e Discussões 177
grupos dentro de um grupo principal, delimitado pela linha tracejada. No grupo III,
estão agrupadas as amostras de P. caldense coletadas em Cunha-SP, no entanto
as amostras de P. caldense e P. permucronatum coletadas em Ubatuba-SP não
puderam ser discriminadas através desta metodologia e aparecem em ambos os
grupos IV e V.
Figura 151. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase hidroalcoólica.
(IV)
(I)
(II)
(III) P. cald
ense
P. carn
iconn
ectivu
m
P. cald
ense
P
. p
erm
ucro
natu
m
P. cald
ense
P
. p
erm
ucro
natu
m
(V)
Resultados e Discussões 178
Neste estudo baseado em análises quimiométricas foi possível obter algumas
conclusões sobre as espécies analisadas. Os espécimes de P. carniconnectivum
coletados em Manaus-AM e Belterra-PA, apresentaram-se em todos os momentos
em grupos distintos apesar de se tratarem da mesma espécie. Além disso, o
espécime K-1441B apesar de ser identificado como P. carniconnectivum se
assemelhou à P. caldense em todas as análises. Diversos fatores podem estar
relacionados a essa observação como, por exemplo, pode se tratar de outra espécie
ou variedade da mesma.
As espécies de P. permucronatum apresentaram-se no mesmo grupo ou
muito próximas ao longo de todo o estudo. As amostras de P. caldense foram
agrupadas na maioria das vezes, sendo que as amostras K-1569 e K-1581
apresentaram uma maior similaridade entre si do que com a K-1209, esse fato pode
estar associado ao local de coleta, que para K-1209 foi Ubatuba-SP e as demais
Cunha-SP.
Dentre as técnicas utilizadas o RMN de 1H da fase hidroalcoólica dos extratos
foi a qual apresentou resultados menos satisfatórios com a discriminação entre dois
grandes grupos, de um lado P. carniconnectivum e de outro P. caldense e P.
permucronatum, não sendo possível uma diferenciação entre essas últimas.
Resultados e Discussões 179
4.11 Vias biossintéticas envolvidas na formação dos metabólitos
secundários identificados
A ocorrência de derivados de ácidos benzoicos prenilados e flavonoides é
frequente em espécies de Piper (Flores et al., 2009; Freitas et al., 2009; Lago et al.,
2004; Yamaguchi et al., 2011). As rotas biossintéticas que levam a formação desses
metabólitos podem ser inferidas com base nas descritas na literatura e envolve as
vias do chiquimato e do MVA/MEP (Harborne, 1994; Kellogg; Poulter, 1997).
Os meroterpenos identificados neste estudo possuem rotas biossintéticas
bem conhecidas, sendo a parte aromática proveniente da via do chiquimato gerando
os substratos ácido p-hidroxibenzoico e ácido protocatecuico. As preniltransferases
aromáticas catalisam a transferência de unidades de IPP, GPP, FPP e GGPP para
moléculas aceptoras aromáticas, como os derivados de ácidos benzoicos, e são
responsáveis pela origem de uma enorme diversidade de metabólitos secundários
em plantas, fungos e bactérias (Heide, 2009; Lopez et al., 2010).
Nos flavonoides, o anel B e parte do anel heterocíclico (anel C) são
provenientes do ácido cinâmico e seus análogos, oriundos da via do chiquimato. A
formação do esqueleto carbônico de flavonoides é catalisada pelas chalcona
sintases através de reações de condensação e ciclização de três unidades de
malonil-CoA. Outras enzimas como chalcona isomerases e hidroxilases estão
envolvidas para obtenção do produto final (Harborne, 1994). No entanto, apesar da
biossíntese de flavonoides ser bem conhecida, a oxidação e redução do anel B dos
protoflavonoides é uma etapa de grande relevância sob o ponto de vista de reações
enzimáticas inusitadas. Fato bastante intrigante é a ocorrência dos protoflavonoides
em espécies primitivas de plantas e a sua detecção em espécies de Piper (Figura
152).
Resultados e Discussões 180
Figura 152. Biossíntese de meroterpenos e flavonóides em espécies de Piper.
OH
OH
COOH
COOH
OCH3
COOH
COOH
OH
O
OH
OH
O
O
H3CO
OH
O
O
H3CO
OH
O
OH
O
OOH
R
RO
OH
R
R
O
OOH
H3CO
H3CO
O
OH
Via do
chiquimato
DMAPP
DMAPP
GGPP
GGPP
preniltransferases
preniltransferasespreniltransferases
preniltransferases
Chalcona sintases
Malonil-CoA
Via do
MVA/MEP
P. bowiei
P. bowieiP. caldense
P. permucronatumP. carniconnectivum
P. carniconnectivum
P. carniconnectivum
P. caldense
OH
COOH
ácido 4-hidroxibenzoico
OH
OH
COOH
ácido protocatecuico
OH
O
SCoA
O
OH
OH
O
OH
H3CO
Ácido cinâmico
4-cumaroil-CoA
Ácido ferrúlico
Conclusões 181
5. CONCLUSÕES
O estudo fitoquímico das espécies de Piper descritas abaixo resultou no
isolamento e identificação de treze substâncias. De P. bowiei foram identificados
dois cromenos (1 e 2) e uma flavanona (6), de P. permucronatum uma flavona (3) e
uma flavanona (7), de P. caldense uma flavona (4) e um derivado de ácido benzoico
prenilado (12) e de P. carniconnectivum uma flavona (5), um derivado de ácido
benzoico prenilado (13), duas protoflavanonas (8 e 9) e duas protoflavonas (10 e
11). As substâncias 8, 9, 10, 11, 12 e 13 são descritas pela primeira vez neste
trabalho.
Das substâncias isoladas, quatro delas apresentaram estruturas raras, sendo
que as protoflavanonas 8 e 9 foram avaliadas quanto à sua atividade antileucêmica
apresentando resultados promissores na buscas de substâncias antitumorais. As
protoflavonas 10 e 11 serão submetidas aos mesmos ensaios posteriormente.
Os resultados obtidos nas análises de PCA e HCA permitem concluir que as
técnicas analíticas EM, CLAE-EM e RMN de 1H em conjunto com a quimiometria
apresentam-se como uma potencial ferramenta na avaliação de dados provenientes
de matrizes complexas, como os extratos de plantas.
O teste de hipóteses no qual a química de espécies de Piper com frutos
pendentes e globosos foi avaliada quanto à composição química comparada aos
outros tipos de frutos indicou que não há relação aparente. As espécies de Piper
para os quais foram descritos ácidos benzoicos prenilados incluem Piper
crassinervium e P. gaudichaudianum (Lago et al., 2004). Uma avaliação das
relações entre essas espécies poderá ser realizada com a obtenção de sequências
de DNA.
Conclusões 182
A ocorrência de protoflavanonas é bastante limitada às Pteridofitas com cerca
de 20 ocorrências. O único relato em Angiospermas refere-se à ocorrência em
Ongokea e os dados aqui obtidos para Piper constituem-se em fatos inéditos. De
qualquer maneira, a perda de aromaticidade através de processos químicos ou
enzimáticos constitui-se num processo energeticamente desfavorável e a descrição
desse processo biossintético seria de grande relevância.
Referências 183
6. REFERÊNCIAS
ADAM, K. P. Phenolic constituents of the fern Phegopteris connectilis. Phytochemistry, v. 52, n. 5, p. 929-934, 1999.
AHMAD, V. U.; ALI, Z.; ZAHID, M.; ALAM, N.; SABA, N.; KHAN, T.; OAISAR, M.; NISAR, M. Phytochemical study of Salvia moorcroftiana. Fitoterapia, v. 71, n. 1, p. 84-85, 2000.
AKAHORI, Y.; KATAYAMA, S.; NORO, T.; FUKUSHIM.S; SAIKI, Y.; UENO, A. Studies on constituents of Leptorumohra migueliana H. Ito.4. NMR studies of protofarrerol and triacetylfarrerol. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 18, n. 3, p. 596-&, 1970.
ALLWOOD, J. W.; GOODACRE, R. An introduction to liquid chromatography-mass spectrometry instrumentation applied in plant metabolomic analyses. Phytochemical Analysis, v. 21, n. 1, p. 33-47, 2010.
BALDOQUI, D. C.; BOLZANI, V. D. S.; FURLAN, M.; KATO, M. J.; MARQUES, M. O. M. Flavones, lignans and terpene from Piper umbellata (Piperaceae). Quimica Nova, v. 32, n. 5, p. 1107-1109, 2009.
BALDOQUI, D. C.; KATO, M. J.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. D. S.; YOUNG, M. C. M.; FURLAN, M. A chromene and prenylated benzoic acid from Piper aduncum. Phytochemistry, v. 51, n. 7, p. 899-902, 1999.
BATISTA, J. M.; LOPES, A. A.; AMBROSIO, D. L.; REGASINI, L. O.; KATO, M. J.; BOLZANI, V. D.; CICARELLI, R. M. B.; FURLAN, M. Natural chromens and chromene derivatives as potential anti-trypanosomal agents. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 31, n. 3, p. 538-540, 2008.
BRERETON, R. G. Chemometrics : data analysis for the laboratory and chemical plant. John Wiley & Sons, Ltd., 2003. 489 p.
CABANILLAS, B. J.; LE, L. A.-C.; CASTILLO, D.; AREVALO, J.; ESTEVEZ, Y.; ROJAS, R.; VALADEAU, C.; BOURDY, G.; SAUVAIN, M.; FABRE, N. Dihydrochalcones and benzoic acid derivatives from Piper dennisii. Planta Medica, v. 78, n. 9, p. 914-8, 2012.
CABRAL, M. M. O.; ALENCAR, J. A.; GUIMARAES, A. E.; KATO, M. J. Larvicidal activity of grandisin against Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association, v. 25, n. 1, p. 103-105, 2009.
CARDOZO-JUNIOR, E. L.; CHAVES, A. C. O. Caldensin, A New Natural N-Methylaristolactam from Piper caldense. Pharmaceutical Biology, v. 41, n., p. 216-218, 2003.
CHANG, H. L.; SU, J. H.; YEH, Y. T.; LEE, Y. C.; CHEN, H. M.; WU, Y. C.; YUAN, S. S. F. Protoapigenone, a novel flavonoid, inhibits ovarian cancer cell growth in vitro and in vivo. Cancer Letters, v. 267, n. 1, p. 85-95, 2008.
Referências 184
CHANG, H. L.; WU, Y. C.; SU, J. H.; YEH, Y. T.; YUAN, S. S. F. Protoapigenone, a novel flavonoid, induces apoptosis in human prostate cancer cells through activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun NH2-terminal kinase 1/2. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 325, n. 3, p. 841-849, 2008.
DE MORAIS, S. M.; FACUNDO, V. A.; BERTINI, L. M.; CAVALCANTI, E. S. B.; DOS ANJOS, J. F.; FERREIRA, S. A.; DE BRITO, E. S.; DE SOUZA NETO, M. A. Chemical composition and larvicidal activity of essential oils from Piper species. Biochemical Systematics and Ecology, v. 35, n. 10, p. 670-675, 2007.
DIAZ, P. P.; ARIAS, T.; JOSEPH-NATHAN, P. A Chromene, an isoprenylated methyl hydroxybenzoate and a C-methyl flavanone from the bark of Piper hostmannianum. Phytochemistry, v. 26, n. 3, p. 809-811, 1987.
DOLGIN, E. As leukemia options grow, drugs jockey to be first-line therapies. Nat Med, v. 19, n. 1, p. 7-7, 2013.
DYER, L. A.; DODSON, C. D.; RICHARDS, J. Isolation, synthesis and evolutionary ecology of Piper amides. In: DYER, L. A.PALMER, A. N. (Ed.). Piper. A model genus for studies of evolution, chemical ecology, and trophic interactions.: Kluwer Academic Publishers, 2004. cap. 7, p.117-138.
FACUNDO, V. A.; BRAZ, R. C-methylated flavonoids from the roots of Piper carniconnectivum C.DC (Piperaceae). Biochemical Systematics and Ecology, v. 32, n. 12, p. 1215-1217, 2004.
FACUNDO, V. A.; SA, A. L.; SILVA, S. A. F.; MORAIS, S. M.; MATOS, C. R. R.; BRAZ, R. Three new natural cyclopentenedione derivatives from Piper carniconnectivum. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 15, n. 1, p. 140-145, 2004.
FLORES, N.; JIMENEZ, I. A.; GIMENES, A.; RUIZ, G.; GUTIERREZ, D.; BOURDY, G.; BAZZOCCHI, I. L. Benzoic acid derivatives from Piper species and their antiparasitic activity. Journal of Natural Products, v. 71, n. 9, p. 1538-1543, 2008.
FLORES, N.; JIMENEZ, I. A.; GIMENEZ, A.; RUIZ, G.; GUTIERREZ, D.; BOURDY, G.; BAZZOCCHI, I. L. Antiparasitic activity of prenylated benzoic acid derivatives from Piper species. Phytochemistry, v. 70, n. 5, p. 621-7, 2009.
FREITAS, G. C.; KITAMURA, R. O. S.; LAGO, J. H. G.; YOUNG, M. C. M.; GUIMARÃES, E. F.; KATO, M. J. Caldensinic acid, a prenylated benzoic acid from Piper caldense. Phytochemistry Letters, v. 2, n. 3, p. 119-122, 2009.
FRESHNEY, R. Culture of Animal Cells: A manual of basic techniques. New York, 1987.
FUKUSHIMA, S.; NORO, T.; AKAHORI, Y.; SAIKI, Y.; UENO, A. Studies on constituents of Leptorumohra miqueliana.3. Conformation of protofarrerol. Yakugaku Zasshi-Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, v. 89, n. 9, p. 1272-&, 1969.
GERIS, R., SIMPSON, T, J. Meroterpenoids produced by fungi. Natural Products Reports, v. 26, p. 1063-1094, 2009.
Referências 185
GREEN, T. P.; TREADWELL, E. M.; WIEMER, D. F. Arieianal, a Prenylated Benzoic Acid from Piper arieianum. Journal of Natural Products, v. 62, n. 2, p. 367-368, 1999.
GUIMARÃES, E. F.; CARVALHO-SILVA, M.; MONTEIRO, D.; MEDEIROS, E. Lista de Espécies da Flora do Brasil.: Jardim Botânico do Rio de Janeiro 2012.
HARBORNE, J. B. The flavonoids: advances in research since 1986. London: Chapman & Hall, 1994. 675 p.
HAUTEVILLE, M.; CHOPIN, J.; GEIGER, H.; SCHULER, L. Protogenkwanin, a new flavonoid from Equisetum arvense L. Tetrahedron, v. 37, n. 2, p. 377-381, 1981.
HEIDE, L. Prenyl transfer to aromatic substrates: genetics and enzymology. Current Opinion in Chemical Biology, v. 13, n. 2, p. 171-179, 2009.
HOMANS, A. L.; FUCHS, A. Direct Bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. Journal of Chromatography, v. 51, n. 2, p. 327-&, 1970.
JARAMILLO, M. A.; MANOS, P. S. Phylogeny and Patterns of Floral Diversity in the Genus Piper (Piperaceae). American Journal of Botany, v. 88, n. 4, p. 706-716, 2001.
JENSEN, S.; OLSEN, C. E.; DUTT TYAGI, O.; BOLL, P. M.; HUSSAINI, F. A.; GUPTA, S.; BISHT, K. S.; PARMAR, V. S. Neolignans and an isoprenylated phenol from Piper clarkii. Phytochemistry, v. 36, n. 3, p. 789-792, 1994.
JERZ, G.; WAIBEL, R.; ACHENBACH, H. Cyclohexanoid protoflavanones from the stem-bark and roots of Ongokea gore. Phytochemistry, v. 66, n. 14, p. 1698-1706, 2005.
KATO, M. J.; FURLAN, M. Chemistry and evolution of the Piperaceae. Pure and Applied Chemistry, v. 79, n. 4, p. 529-538, 2007.
KELLOGG, B. A.; POULTER, C. D. Chain elongation in the isoprenoid biosynthetic pathway. Current Opinion in Chemical Biology, v. 1, n. 4, p. 570-578, 1997.
KIM, H. K.; CHOI, Y. H.; VERPOORTE, R. NMR-based metabolomic analysis of plants. Nature Protocols, v. 5, n. 3, p. 536-549, 2010.
KIM, H. K.; CHOI, Y. H.; VERPOORTE, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends in Biotechnology, v. 29, n. 6, p. 267-275, 2011.
LAGO, J. H. G.; CHEN, A.; YOUNG, M. C. M.; GUIMARAES, E. F.; DE OLIVEIRA, A.; KATO, M. J. Prenylated benzoic acid derivatives from Piper aduncum L. and P. hostmannianum C. DC. (Piperaceae). Phytochemistry Letters, v. 2, n. 3, p. 96-98, 2009.
LAGO, J. H. G.; RAMOS, C. S.; CASANOVA, D. C. C.; MORANDIM, A. D.; BERGAMO, D. C. B.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. D.; FURLAN, M.; GUIMARAES, E. F.; YOUNG, M. C. M.; KATO, M. J. Benzoic acid derivatives from
Referências 186
Piper species and their fungitoxic activity against Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermum. Journal of Natural Products, v. 67, n. 11, p. 1783-1788, 2004.
LAGO, J. H. G.; YOUNG, M. C. M.; REIGADA, J. B.; SOARES, M. G.; ROESLER, B. P.; KATO, M. J. Antifungal derivatives from Piper mollicomum and P. lhotzkyanum (Piperaceae). Quimica Nova, v. 30, n. 5, p. 1222-1224, 2007.
LEITE, A. C. C. F.; KATO, M. J.; SOARES, R. O. A.; GUIMARAES, A. E.; SANTOS-MALLET, J. R.; CABRAL, M. M. O. Grandisin caused morphological changes larval and toxicity on Aedes aegypti. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 22, n. 3, p. 517-521, 2012.
LIN, A.-S.; CHANG, F.-R.; WU, C.-C.; LIAW, C.-C.; WU, Y.-C. New cytotoxic flavonoids from Thelypteris torresiana. Planta Medica, v. 71, p. 867-870, 2005.
LIN, A. S.; CHANG, F. R.; YEN, H. F.; BJORKEBORN, H.; NORLEN, P.; WU, Y. C. Novel flavonoids of Thelypteris torresiana. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 55, n. 4, p. 635-637, 2007.
LIN, A. S.; NAKAGAWA-GOTO, K.; CHANG, F. R.; YU, D. L.; MORRIS-NATSCHKE, S. L.; WU, C. C.; CHEN, S. L.; WU, Y. C.; LEE, K. H. First total synthesis of protoapigenone and its analogues as potent cytotoxic agents. Journal of Medicinal Chemistry, v. 50, n. 16, p. 3921-3927, 2007.
LIU, H.; XIAO, Y.; XIONG, C.; WEI, A.; RUAN, J. Apoptosis induced by a new flavonoid in human hepatoma HepG2 cells involves reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and MAPK activation. European Journal of Pharmacology, v. 654, n. 3, p. 209-216, 2011.
LIVINGSTONE, D. Data analysis for Chemists. Oxford Science Publications, 1995.
LOPES, A. A.; LOPEZ, S. N.; REGASINI, L. O.; BATISTA JUNIOR, J. M.; AMBROSIO, D. L.; KATO, M. J.; BOLZANI, V. D. S.; BARRETTO CICARELLI, R. M.; FURLAN, M. In vitro activity of compounds isolated from Piper crassinervium against Trypanosoma cruzi. Natural Product Research, v. 22, n. 12, p. 1040-1046, 2008.
LOPEZ, A.; MING, D. S.; TOWERS, G. H. N. Antifungal activity of benzoic acid derivatives from Piper lanceaefolium. Journal of Natural Products, v. 65, n. 1, p. 62-4, 2002.
LOPEZ, S. N.; LOPES, A. A.; BATISTA, J. M., JR.; FLAUSINO, O., JR.; BOLZANI, V. D. S.; KATO, M. J.; FURLAN, M. Geranylation of benzoic acid derivatives by enzymatic extracts from Piper crassinervium (Piperaceae). Bioresource Technology, v. 101, n. 12, p. 4251-4260, 2010.
MANLY, B. J. F. Métodos estatísticos multivariados: uma introdução. 3 ed. Porto Alegre: Bookman, 2008.
MARTINS, R. C. C.; LAGO, J. H. G.; ALBUQUERQUE, S.; KATO, M. J. Trypanocidal tetrahydrofuran lignans from inflorescences of Piper solmsianum. Phytochemistry, v. 64, n. 2, p. 667-670, 2003.
Referências 187
MAXWELL, A.; RAMPERSAD, D. Prenylated 4-Hydroxybenzoic Acid Derivatives from Piper marginatum. Journal of Natural Products, v. 51, n. 2, p. 370-373, 1988.
MORAES, J. D.; NASCIMENTO, C.; LOPES, P. O. M. V.; NAKANO, E.; YAMAGUCHI, L. F.; KATO, M. J.; KAWANO, T. Schistosoma mansoni: In vitro schistosomicidal activity of piplartine. Experimental Parasitology, v. 127, n. 2, p. 357-64, 2011.
MURAKAMI, T.; KIDO, T.; HORI, K.; SATAKE, T.; SAIKI, Y.; CHEN, C. M. Chemical and chemotaxonomical studies of filices. 67. The distribution of a flavanone with a modified B-ring, protofarrerol and its derivatives. Yakugaku Zasshi-Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, v. 107, n. 6, p. 416-419, 1987.
NAVICKIENE, H. M. D.; MIRANDA, J. E.; BORTOLI, S. A.; KATO, M. J.; BOLZANI, V. S.; FURLAN, M. Toxicity of extracts and isobutyl amides from Piper tuberculatum: potent compounds with potential for the control of the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis. Pest Management Science, v. 63, n. 4, p. 399-403, 2007.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products As Sources of New Drugs over the 30 Years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, n. 3, p. 311-335, 2012.
NORO, T.; FUKUSHIM.S; SAIKI, Y.; UENO, A.; AKAHORI, Y. Studies on constituents of Leptorimohra miqueliana.2. Structure of protofarrerol. Yakugaku Zasshi-Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, v. 89, n. 6, p. 851-&, 1969.
ORJALA, J.; ERDELMEIER, C. A.; WRIGHT, A. D.; RALI, T.; STICHER, O. Five new prenylated p-hydroxybenzoic acid derivatives with antimicrobial and molluscicidal activity from Piper aduncum leaves. Planta Medica, v. 59, n. 6, p. 546-51, 1993.
ORJALA, J.; ERDELMEIER, C. A. J.; WRIGHT, A. D.; RALI, T.; STICHER, O. Two chromenes and a prenylated benzoic acid derivative from Piper aduncum. Phytochemistry, v. 34, n. 3, p. 813-818, 1993.
PARMAR, V. S.; JAIN, S. C.; BISHT, K. S.; JAIN, R.; TANEJA, P.; JHA, A.; TYAGI, O. D.; PRASAD, A. K.; WENGEL, J.; OLSEN, C. E.; BOLL, P. M. Phytochemistry of the genus Piper. Phytochemistry, v. 46, n. 4, p. 597-673, 1997.
PORTET, B.; FABRE, N.; ROZENBERG, R.; HABIB-JIWAN, J.-L.; MOULIS, C.; QUETIN-LECLERCQ, J. Analysis of minor flavonoids in Piper hostmannianum var. berbicense using liquid chromatography coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1210, n. 1, p. 45-54, 2008.
POUNY, I.; ETIEVANT, C.; MARCOURT, L.; HUC-DUMAS, I.; BATUT, M.; GIRARD, F.; WRIGHT, M.; MASSIOT, G. Protoflavonoids from ferns impair centrosomal integrity of tumor cells. Planta Medica, v. 77, n. Copyright (C) 2012 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved., p. 461-466, 2011.
QUIJANO-ABRIL, M. A.; CALLEJAS-POSADA, R.; MIRANDA-ESQUIVEL, D. R. Areas of endemism and distribution patterns for Neotropical Piper species (Piperaceae). Journal of Biogeography, v. 33, n. 7, p. 1266-1278, 2006.
Referências 188
RAJUDIN, E.; AHMAD, F.; SIRAT, H. M.; ARBAIN, D.; ABOUL-ENEIN, H. Y. Chemical constituents from tiger's betel, Piper porphyrophyllum N.E.Br. (Fam. Piperaceae). Natural Product Research, v. 24, n. 4, p. 387-390, 2010.
RAO, M. M.; KINGSTON, D. G. I.; SPITTLER, T. D. Flavonoids from Flourensia cernua. Phytochemistry, v. 9, n. 1, p. 227-8, 1970.
RAPADO, L. N.; NAKANO, E.; OHLWEILER, F. P.; KATO, M. J.; YAMAGUCHI, L. F.; PEREIRA, C. A. B.; KAWANO, T. Molluscicidal and ovicidal activities of plant extracts of the Piperaceae on Biomphalaria glabrata (Say, 1818). Journal of Helminthology, v. 85, n. 1, p. 66-72, 2011.
REIGADA, J. B.; TCACENCO, C. M.; ANDRADE, L. H.; KATO, M. J.; PORTO, A. L. M.; LAGO, J. H. G. Chemical constituents from Piper marginatum Jacq. (Piperaceae) - antifungal activities and kinetic resolution of (RS)-marginatumol by Candida antarctica lipase (Novozym 435). Tetrahedron-Asymmetry, v. 18, n. 9, p. 1054-1058, 2007.
ROUSSIS, V.; AMPOFO, S. A.; WIEMER, D. F. A prenylated benzoic acid derivative from the leaves of Piper taboganum. Phytochemistry, v. 29, n. 6, p. 1787-8, 1990.
RÜEGG, T.; CALDERÓN, A. I.; QUEIROZ, E. F.; SOLÍS, P. N.; MARSTON, A.; RIVAS, F.; ORTEGA-BARRÍA, E.; HOSTETTMANN, K.; GUPTA, M. P. 3-Farnesyl-2-hydroxybenzoic acid is a new anti-Helicobacter pylori compound from Piper multiplinervium. Journal of Ethnopharmacology, v. 103, n. 3, p. 461-467, 2006.
SCHRIPSEMA, J. Application of NMR in plant metabolomics: techniques, problems and prospects. Phytochemical Analysis, v. 21, n. 1, p. 14-21, 2010.
SCOTT, I.; JENSEN, H.; PHILOGÈNE, B.; ARNASON, J. A review of Piper spp. (Piperaceae) phytochemistry, insecticidal activity and mode of action. Phytochemistry Reviews, v. 7, n. 1, p. 65-75, 2008.
SENGUPTA, S.; RAY, A. B. The chemistry of Piper species: a review. Fitoterapia, v. 58, n. 3, p. 147-165, 1987.
SOUZA, V. C. Botânica Sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias de Angiosperma da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2005.
TANG, Y.; XIONG, C.; ZHOU, D.; WEI, A.; FU, W.; CAI, Y.; RUAN, J. A new flavonoid from Macrothelypteris torresiana. Chemistry of Natural Compounds (Translation of Khimiya Prirodnykh Soedinenii), v. 46, n. 2, p. 209-211, 2010.
TAUTENHAHN, R.; PATTI, G. J.; RINEHART, D.; SIUZDAK, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry, v. 84, n. 11, p. 5035-5039, 2012.
TERREAUX, C.; HOSTETTMANN, M. P. G.; KURT. Antifungal benzoic acid derivatives from Piper Dilatatum in honour of Professor G. H. Neil Towers 75th birthday. Phytochemistry, v. 49, n. 2, p. 461-464, 1998.
Referências 189
VASCONCELOS, J. M. J.; SILVA, A. M. S.; CAVALEIRO, J. A. S. Chromones and flavanones from Artemisia campestris subsp. maritima. Phytochemistry, v. 49, n. 5, p. 1421-1424, 1998.
VERPOORTE, R.; CHOI, Y. H.; KIM, H. K. Metabolomics: Will it Stay? Phytochemical Analysis, v. 21, n. 1, p. 2-3, 2010.
VILLAS-BÔAS, S. G.; MAS, S.; ÅKESSON, M.; SMEDSGAARD, J.; NIELSEN, J. Mass spectrometry in metabolome analysis. Mass Spectrometry Reviews, v. 24, n. 5, p. 613-646, 2005.
VINCIGUERRA, V.; LUNA, M.; BISTONI, A.; ZOLLO, F. Variation in the composition of the heartwood flavonoids of Prunus avium by on-column capillary gas chromatography. Phytochemical Analysis, v. 14, n. 6, p. 371-377, 2003.
VIRSU, P.; LILJEBLAD, A.; KANERVA, A.; KANERVA, L. T. Preparation of the enantiomers of 1-phenylethan-1,2-diol. Regio- and enantioselectivity of acylase I and Candida antarctica lipases A and B. Tetrahedron-Asymmetry, v. 12, n. 17, p. 2447-2455, 2001.
WADA, H.; FUJITA, H.; MURAKAMI, T.; SAIKI, Y.; CHEN, C. M. Chemical and chemotaxonomical studies of ferns.73. New flavonoids with modified B-ring from the genus Pseudophegopteris (Thelypteridaceae). Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 35, n. 12, p. 4757-4762, 1987.
WEI, A.; WU, G.; XIONG, C.; ZHOU, D.; CAI, Y.; RUAN, J. Flavonoids with special B-ring from Macrothelypteris viridifrons and their anti-proliferative effects on tumor cell. Zhongguo Zhongyao Zazhi, v. 36, p. 582-584, 2011.
WEI, A.; ZHOU, D.; RUAN, J.; CAI, Y.; XIONG, C.; WU, G. Anti-tumor and anti-angiogenic effects of Macrothelypteris viridifrons and its constituents by HPLC–DAD/MS analysis. Journal of Ethnopharmacology, v. 139, n. 2, p. 373-380, 2012.
WOLD, S.; ESBENSEN, K.; GELADI, P. Principal component analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, v. 2, n. 1-3, p. 37-52, 1987.
YAMAGUCHI, L. F.; FREITAS, G. C.; YOSHIDA, N. C.; SILVA, R. A.; GAIA, A. M.; SILVA, A. M.; SCOTTI, M. T.; EMERENCIANO, V. D. P.; GUIMARAES, E. F.; FLOH, E. I. S.; COLOMBO, C. A.; SIQUEIRA, W. J.; KATO, M. J. Chemometric Analysis of ESIMS and NMR Data from Piper Species. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 22, n. 12, p. 2371-U170, 2011.
YAMAGUCHI, L. F.; LAGO, J. H. G.; TANIZAKI, T. M.; DI MASCIO, P.; KATO, M. J. Antioxidant activity of prenylated hydroquinone and benzoic acid derivatives from Piper crassinervium Kunth. Phytochemistry, v. 67, n. 16, p. 1838-1843, 2006.
Apêndice 190
APÊNDICE A –Espectros de massas por injeção direta dos
extratos analisados por PCA
Figura A1. Espectros de massas obtidos por EM-ESI (Infusão direta) de K-484F, K-842F, K-842Fr, K-842S e K-842G.
Figura A2. Espectros de massas obtidos por EM-ESI (Infusão direta) de K-951F, K-951Fr, K-951S, K-951G, K-951R e K-951C.
Apêndice 191
Figura A3. Espectros de massas obtidos por EM-ESI (Infusão direta) de K-310F, K-364F, K-976F, K-978F e K-991F.
Apêndice 192
APÊNDICE B - Espectros de RMN de 1H dos extratos
analisados por PCA (fase orgânica)
Figura B1. Espectros de RMN de 1H, das espécies analisadas por PCA e HCA (500 MHz, CDCl3).
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
P. carniconnectivum K-1441
P. carniconnectivum K-1600
P. permucronatum K-1220
P. caldense K-1209
P. caldense K-1569
P. caldense
K-1581
Apêndice 193
APÊNDICE C - Espectros de RMN de 1H dos extratos
analisados por PCA (fase hidro alcoólica)
Figura C1. Espectros de RMN de 1H, das espécies analisadas por PCA e HCA (500 MHz, D2O).
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
P. carniconnectivum K-1441
P. carniconnectivum K-1600
P. permucronatum K-1220
P. caldense K-1209
P. caldense K-1569
P. caldense K-1581
Súmula curricular 194
SUMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS
Nome: Giovana Cássia de Freitas Lemeszenski
Local de nascimento: Valinhos-SP
Data de nascimento: 21 de março de 1983
EDUCAÇÃO:
Ensino Médio: Fundação Bradesco – Campinas-SP
1998-2000
Ensino Técnico: Fundação Bradesco – Campinas-SP
Técnico em informática
2001-2002
Graduação: Universidade Federal de São Carlos – UFSCar
Bacharelado em Química
2003-2006
Doutorado direto: Universidade de São Paulo-USP
Instituto de Química
Doutorado em Química
2007-2013
Súmula curricular 195
FORMAÇÃO COMPLEMENTAR:
2011 Validação de Métodos em Espectrometria de Massas.
Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas
2009 Oficina de Filogenia. Universidade de São Paulo, USP, Brasil.
2007 Proteção Radiológica 2007. Universidade de São Paulo, USP, Brasil.
2006 Química de Materiais de Revestimento. Universidade de São Paulo, USP, Brasil.
2006 Descoberta de Novos Fármacos: Estratégias Clássicas. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.
2006 Macromoléculas como Alvos para Produção de Fármaco. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.
2005 RMN Aplicada a Alimentos. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.
2005 Análise Orgânica de Ambientes e Amostras Forenses. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.
2005 The Biology, Chemistry and Genetics of Endophytes. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.
2005 Planejamento Síntese e Avaliação Farmacológica. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.
OCUPAÇÃO PROFISSIONAL:
Universidade de São Paulo-USP
Instituto de Química – Central Analítica
Especialista de laboratório, 2010 – atual
Súmula curricular 196
BOLSAS:
Bolsista de mestrado: CNPQ – mar/2007 – ago/2007
Bolsista de mestrado: FAPESP – set/2007 – fev/2009
Bolsista de doutorado direto: FAPESP – mar/2009 – fev/2010
MONITORIAS:
Programa de Aperfeiçoamento de Ensino da USP:
1º sem/2008 – Química Orgânica III –Prof. Dr. Massuo Jorge Kato
2º sem/2008 – Química Geral – Profa. Dra. Denise Freitas S. Petri
2º sem/2009 – Química Geral – Prof. Dra. Dalva Lúcia de Farias
ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS
1. Yamaguchi, Lydia F.; Freitas, Giovana C.; Yoshida, Nidia C.; Silva, Renata A. ;
Gaia, Anderson M.; Silva, Adalberto M.; Scotti, Marcus T.; Emerenciano, Vicente
de P.; Guimarães, Elsie F. ; Floh, Eny I. S.; Colombo, Carlos A.; Siqueira, Walter
J.; Kato, Massuo J. Chemometric analysis of ESIMS and NMR data from Piper species. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 22, p. 2371-2382, 2011.
2. Freitas, Giovana C.; Kitamura, Rodrigo O. Saga; Lago, João Henrique G.; Young, Maria Claudia M.; Guimarães, Elsie F.; Kato, Massuo J. Caldensinic acid, a prenylated benzoic acid from Piper caldense. Phytochemistry Letters v. 2, p. 119-122, 2009.
Súmula curricular 197
TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS 1. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. Occurence of protoflavanones in Piper
carniconnectivum. 2011. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
2. KATO, M. J.; YAMAGUCHI, L. F.; FREITAS, G. C.; YOSHIDA, N. C.; SILVA, R.
A.; GAIA, A. M. Análisis Metabolomico de Espécies de Piperaceae
Empleando ESI-EM, RMN de 1H y Análisis Multivariado. 2010. (Apresentação
de Trabalho/Congresso).
3. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. ; YAMAGUCHI, L. F.; SCOTTI, M.T. Multivariate
data analysis on ESIMS data of Piper species. 2009. (Apresentação de
Trabalho/Congresso).
4. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. Carniconnectivone, a novel protoflavanone
from Piper carniconnectivum. 2009. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
5. FREITAS, G. C.; KATO, M. J.; YAMAGUCHI, L. F. Análise multivariada por
ESIMS em espécies de Piper. 2009. (Apresentação de Trabalho/Conferência
ou palestra).
6. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. Flavona em folhas de Piper caldense
(Piperaceae). 2008. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
Anexos 198
ANEXO A - Cálculos de DFT das substâncias 8 e 9
Os cálculos de DFT dos espectros de dicroísmo circular das substâncias 8 e 9
foram realizados com a finalidade de determinar a configuração absoluta de ambas
substâncias. Esse trabalho foi realizado em colaboração com o Dr. João Marcos
Batista Junior, UNESP e faz parte do artigo em fase de submissão “Antileukemic
non-aromatic B-ring flavanones from Piper carniconnectivum C. DC”.
.
Methodology
All DFT and TDDFT calculations were carried out at 298 K in MeOH or EtOH
solution using the PCM solvent model incorporated in Gaussian 09 software.
Regarding compound 8, the calculations were performed for the arbitrarily chosen
(2S,1’R)- and (2S,1’S)-8. The theoretical spectra of their enantiomers were
generated by multiplying the obtained spectra by (-1). Conformational searches were
carried out at the molecular mechanics level of theory with the Monte Carlos
algorithm using the MMFF force field implemented in Spartan 08 software package.
For (2S,1’R)-8, eleven conformers with relative energy (rel E.) within 10 kcal/mol of
the lowest-energy conformer were selected and further geometry optimized at the
B3LYP/PCM/6-31G(d) level in EtOH. From these, the two conformers indentified
within an energy window of 2.0 kcal/mol, which corresponded to 96% of the total
Boltzmann distribution, were selected for EA and ECD spectral calculations. As for
(2S,1’S)-8, the nine conformers with rel E. within 10 kcal/mol identified at the
molecular mechanics level were selected and further geometry optimized at the
B3LYP/PCM/6-31G(d) level in EtOH. From these, two conformers were found within
an energy window of 2.0 kcal/mol (> 97% of the total Boltzmann distribution), which
Anexos 199
were selected for EA and ECD spectral calculations. The Boltzmann factor for each
conformer was calculated based on Gibbs free energy. Vibrational analysis at the
B3LYP/PCM/6-31G(d) in EtOH level resulted in no imaginary frequencies, confirming
the considered conformers as real minima. TDDFT was employed to calculate
excitation energy (in nm), oscillator strength (dimensionless), and rotatory strength R
in dipole velocity (Rvel in cgs units: 10–40 esu2 cm2) form, at the B3PW91/PCM/TZVP
level in EtOH. The calculated oscillator and rotatory strengths from the first 15 singlet
electronic transitions were simulated into an EA and ECD curve, respectively, using
Gaussian band shapes and 10 nm half-width at 1/e of peak height. Regarding
compound 9, the calculations were performed for the arbitrarily chosen (2S,1’R,2’R)-
and (2S,1’R,2’S)-9. Conformational searches were also run at the molecular
mechanics level using the same algorithm, force field, and software as described
above. For (2S,1’R,2’R)-9, 28 conformers with rel E. within 10 kcal/mol of the lowest-
energy conformer were selected and further geometry optimized at the
B3LYP/PCM/6-31G(d) level in MeOH. From these, the seven conformers indentified
within an energy window of 1.5 kcal/mol, which corresponded to 94% of the total
Boltzmann distribution, were selected for EA and ECD spectral calculations at the
B3PW91/PCM(MeOH)/TZVP level. As for (2S,1’R,2’S)-9, the 34 conformers with rel
E. within 10 kcal/mol identified at the molecular mechanics level were selected and
further geometry optimized at the B3LYP/PCM/6-31G(d) level in MeOH. From these,
eight conformers were found within an energy window of 1.5 kcal/mol (> 92% of the
total Boltzmann distribution), which were selected for EA and ECD spectral
calculations at the B3PW91/PCM(MeOH)/TZVP level. The Boltzmann factor for each
conformer was also calculated based on Gibbs free energy. Vibrational analysis at
the B3LYP/PCM(MeOH)/6-31G(d) level also resulted in no imaginary frequencies.
Anexos 200
The TDDFT theoretical EA and ECD spectra were simulated from the first 20 singlet
→ singlet electronic transitions using Gaussian band shapes and 10 nm half-width at
1/e of peak height. All the predicted wavelength transitions were used as such
without any scaling.
Results
The planar structures of compounds 8 and 9 were firmly established
elucidated but the free rotation of the non-aromatic B ring precluded the
determination of its relative configurations. Thus, the assignment of their absolute
configurations was attempted using TTDFT calculations of ECD spectra. The
calculations were performed considering all possible stereoisomers, namely, 2S,1’R;
2S,1’S; 2R,1’S and 2R,1’R. Nevertheless, the calculations were carried out only for
the diastereomers (2S,1’R)- and (2S,1’S)-8 while the spectra of their corresponding
enantiomers were generated by multiplying the obtained spectra by (-1). After
conformational analysis and geometry optimization steps only two conformers of
each configuration (2S,1’R)- and (2S,1’S)-8 were found to predominate (Figure D1).
These conformers, which differed mainly with respect to the relative positioning of the
rotatable aromatic OCH3 groups, were used to simulate the ECD curves at the
B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) level in EtOH using PCM method.
Anexos 201
Figure D1. Optimized structures and relative energies [B3LYP/PCM(EtOH)/6-31G(d)] of the two lowest-energy conformers of (2S,1’R)-8 (upper frame) and (2S,1’S)-8 (lower frame) used for ECD calculations at the B3PW91/PCM/TZVP level in EtOH.
The overall pattern of the calculated weighted ECD spectrum for (2S,1’R)-8
was consistent with those of the experimental one, i.e., a positive Cotton effect (CE)
near 325 nm, a negative CE around 280, and a positive CE at around 250 nm (Figure
y). The predicted transition wavelengths were not scaled since a uniform scaling
factor may not be satisfactory for all electronic transition energies (Polavarapu et al.,
2011). Regarding the configuration (2S,1’S)-8, the calculated spectrum presented
basically the same sign and intensity for the first two CEs (~325 and 280 nm) as
those of (2S,1’R)-8. However, the CE for the highest-energy transition at around 250
nm was of opposite sign (Figure D2). The electronic transitions in question involved
mainly alkene and aromatic -* transitions (250 and 280 nm, respectively) with
some charge transfer (alkene to carbonyl) contribution as well as ketone n-*
transitions (325-350 nm). These findings allowed us to determined unambiguously
the absolute configuration of ()-8 as 2S,1’R.
Anexos 202
Figure D2. Center: experimental ECD spectrum of ()-8 in EtOH assigned as 2S,1’R. Lower frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in EtOH using PCM] of the Boltzmann average of the two lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’R)-8. Upper frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in EtOH using PCM] of the Boltzmann average of the two lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’S)-8. The bars represent the rotational strengths for the weighted ECD spectrum.
The experimental ECD spectrum of 9 was very similar to that of compound ()-
8 suggesting its absolute configuration also as 2S,1’R, which was confirmed by
TDDFT calculations at the B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) level in MeOH using
PCM (Figure D2). Nevertheless, these calculations did not allow the determination of
absolute configuration of the stereogenic center at C-2’. The theoretical spectra for
both diastereomers (2S,1’R,2’S)- and (2S,1’R,2’R)-9 were indistinguishable (Figure
D3) possibly because the introduction of a new stereogenic center do not perturb
Anexos 203
significantly the transitions of the dominant benzoyl chromophore or those of the
carbonyl group at position C-4’.
Figure D3. Center: experimental ECD spectrum of ()-9 in MeOH. Lower frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in MeOH using PCM] of the Boltzmann average of the seven lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’R,2’S)-9. Upper frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in MeOH using PCM] of the Boltzmann average of the eight lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’R,2’R)-9. The bars represent the rotational strengths for the weighted ECD spectrum.