Giardia duodenalis Toxoplasma gondii Plasmodium berghei · Giardia duodenalis La 14-3-3 del Giardia...
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ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ LE PROTEINE 14-3-3 NEI PROTOZOI PARASSITI: RUOLO FUNZIONALE NEI PROCESSI PATOGENETICI E TARGET MOLECOLARI PER LO SVILUPPO DI TERAPIE INNOVATIVE Marco Lalle 1 , Serena Camerini 2 , Serena Cecchetti 2 , Marialuisa Casella 2 , Andrea Ilari 3 , Maurizio Botta 4 , Marta Ponzi 2 , Furio Spano 1 , Edoardo Pozio 1 . 1 Dipartimento Malattie Infettive e 2 Servizio Grandi Strumentazioni e Core Facilities, Istituto Superiore di Sanità; 3 Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, CNR, Roma; 4 Dipartimento di Biotecnologie, Chimica e Farmacia, Università di Siena, Siena. Contatto: dr. Marco Lalle,PhD, [email protected] I protozoi parassiti hanno, a livello globale, un impatto rilevante per la salute umana causando gravi patologie, anche fatali, quali malaria, toxoplasmosi e giardiasi. La comprensione dei meccanismi patogenetici è fondamentale per identificare nuovi bersagli terapeutici, contrastare resistenze ed ampliare l’armamentario di farmaci disponibili. Le 14-3-3 sono proteine dimeriche di 30 kDa, presenti in tutti gli eucarioti. Sono codificate da una famiglia multigenica, ma nei protozoi sono presenti in singolo o duplice copia. Sono in grado di formare dimeri assumendo una caratteristica struttura ad U. Sono in grado di legare agire da adattatori molecolari, legando un ampio ventaglio di proteine, generalmente contenenti fosfo-serine/treonine in sequenze aminoacidiche conservate. Le 14-3-3 sono in grado di regolare la funzione delle proteine bersaglio e sono quindi coinvolte in processi cellulari fondamentali (apoptosi, regolazione del ciclo cellulare, esocitosi, trasduzione del segnale). Mediante spettrometria di massa, microscopia confocale, cristallografia, dinamica molecolare e l’uso di mutanti abbiamo identificato e caratterizzato sia modificazioni post-traduzionali uniche delle 14-3-3 sia il loro interattoma in G. duodenalis, T. gondii e P. berghei, il modello murino della malaria. Abbiamo dimostrato che alterando le modificazioni post-traduzionali si regola la capacità di legame delle 14-3-3 e che interazioni specifiche svolgono ruoli cruciali in diverse fasi del ciclo biologico di questi organismi. La possibilità di modulare quindi l’interazione con le 14-3-3 potrebbe rivelarsi una strategia promettente per il trattamento di queste infezioni. Plasmodium berghei La 14-3-3 del Plasmodio è espressa in tutti gli stadi del parassita ed interagisce con numerose proteine, comprese la dematina dell’eritrocita In eritrociti infettati con Plasmodio, la dematina si ri-localizza progressivamente dalla membrana del RBC al parassita La dematina dell’eritrocita interagisce con la 14-3-3 di Plasmodio in modo diretto e l’interazione è mediata dalla fosforilazione della Ser124 e Ser333 della dematina da parte della PKA La dematina è parte del complesso che unisce il citoscheletro e la membrana plasmatica. Contribuisce alla stabilità strutturale della membrana eritrocitaria. Interagisce con l’actina e la ß-spectrina Lega e favorisce la formazione delle fibre di actina. Delezioni della dematina causano eritrociti osmoticamente fragili. Plasmodium berghei Plasmodium falciparum Effetto potenziale delle 14-3-3 sulle proteine target • alterazione della conformazione • alterazione dell’attività o della stabilità • alterazione della localizzazione intracellulare • alterazione dell’intrazione con altre proteine University of Rome “Sapienza“ Department of Biochemical Sciences Annarita Fiorillo (Crystallography) Department of Physics Allegra Via (Molecular Dynamics) Daniele di Marino (Molecular Dynamics) Ahmed Sayadi (Biocomputing) University of Siena, Siena, Italy Department of Biotechnology, Chemistry and Pharmacy Ylenia Cau (Molecular Dynamics) Mattia Mori (Molecular Dynamics) Istituto Superiore di Sanità Tommasino Pace Chiara Currà Leonardo Picci Federica Fratini Luca Fantozzi Simona Cherchi Lucia Bertuccini Marco Crescenzi Carlo Bavassano Claudia Blasetti Fantauzzi Fabio Ciccarone Gabriele Paris Bossi University of Rome “Tor Vergata” Gianni Cesareni Simona Panni (Pep-Spot) Charite-UniversityBerlin, Germany Prisca Boisguerin (Pep-Spot) Giardia duodenalis La 14-3-3 del Giardia mostra una localizzazione stadio specifica, ed è parzialmente ri-localizzata nel nucleo durante la fase di incistamento del parassita. La 14-3-3 è costitutivamente fosforilata (Thr214) e poliglicilata al C- terminale in modo stadio specifico (Polimodificazione reversibile generata mediante legame covalente di sequenza di residui di glicina ad un residuo di acido glutammico di una proteina). Spettro MS del peptide polyglicilato Spettro MS del peptide fosforilato In assenza di poliglicilazione la 14-3-3 si localizza nel nucleo ma la sovraespressione delle deglicilasi riduce la formazione delle cisti La struttura cristallografica mostra che in assenza di poliglicilazione la 14-3-3 forma filamenti mediante “domain swapping” del C-terminale. Pep-SPOT/overlay In assenza di fosforilazione della 14-3-3 il parassita ha ridotta capacità di formare cisti e il mutante che mima la fosforilazione interagisce con un più ampio spettro di sequenze La dinamica molecolare suggerisce che la fosforilazione riduce la mobilità del C-terminale, promuove una transizione conformazionale che espone una superficie elettrostatica che favorisce l’interazione con i bersagli. Toxoplasma gondii La 14-3-3 di Toxoplasma è espressa in tutti gli stadi del parassita ed è parzialmente fosforilata sulla Ser222 Il mutante fosfomimetico S222D interagisce in modo più “stabile” con proteine target rispetto al WT. Il mutante S222D è più sensibile and una molecola che inibisce la capacità di legame delle 14-3-3 L’espressione inducibile di un peptide (difopeina) che lega in vivo la Tg14- 3-3 induce difetti nel ciclo litico del parassita e induce delocalizzazione intracellulare della Tg14-3-3 La molecola inibitrice della capacità di legame della Tg14-3-3 non ha effetto sulle 14-3-3 umane Il trattamento con la molecola inibitrice della capacità di legame della Tg14-3-3 induce difetti nel ciclo litico del parassita
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ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ
LE PROTEINE 14-3-3 NEI PROTOZOI PARASSITI: RUOLO FUNZIONALE NEI PROCESSI PATOGENETICI E
TARGET MOLECOLARI PER LO SVILUPPO DI TERAPIE INNOVATIVE
Marco Lalle1, Serena Camerini2, Serena Cecchetti2, Marialuisa Casella2, Andrea Ilari3, Maurizio Botta4, Marta Ponzi2, Furio Spano1, Edoardo Pozio1.
1Dipartimento Malattie Infettive e 2Servizio Grandi Strumentazioni e Core Facilities, Istituto Superiore di Sanità; 3Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, CNR, Roma;4Dipartimento di Biotecnologie, Chimica e Farmacia, Università di Siena, Siena. Contatto: dr. Marco Lalle,PhD,[email protected]
I protozoi parassiti hanno, a livello globale, un impatto rilevante per la salute umana causando gravi patologie, anchefatali, quali malaria, toxoplasmosi e giardiasi. La comprensione dei meccanismi patogenetici è fondamentale peridentificare nuovi bersagli terapeutici, contrastare resistenze ed ampliare l’armamentario di farmaci disponibili.Le 14-3-3 sono proteine dimeriche di 30 kDa, presenti in tutti gli eucarioti. Sono codificate da una famiglia multigenica,ma nei protozoi sono presenti in singolo o duplice copia. Sono in grado di formare dimeri assumendo una caratteristicastruttura ad U. Sono in grado di legare agire da adattatori molecolari, legando un ampio ventaglio di proteine,generalmente contenenti fosfo-serine/treonine in sequenze aminoacidiche conservate. Le 14-3-3 sono in grado diregolare la funzione delle proteine bersaglio e sono quindi coinvolte in processi cellulari fondamentali (apoptosi,regolazione del ciclo cellulare, esocitosi, trasduzione del segnale).Mediante spettrometria di massa, microscopia confocale, cristallografia, dinamica molecolare e l’uso di mutanti abbiamoidentificato e caratterizzato sia modificazioni post-traduzionali uniche delle 14-3-3 sia il loro interattoma in G.duodenalis, T. gondii e P. berghei, il modello murino della malaria. Abbiamo dimostrato che alterando le modificazionipost-traduzionali si regola la capacità di legame delle 14-3-3 e che interazioni specifiche svolgono ruoli cruciali indiverse fasi del ciclo biologico di questi organismi.La possibilità di modulare quindi l’interazione con le 14-3-3 potrebbe rivelarsi una strategia promettente per iltrattamento di queste infezioni.
Plasmodium bergheiLa 14-3-3 del Plasmodio è espressa in tutti gli stadi del parassita edinteragisce con numerose proteine, comprese la dematina dell’eritrocita
In eritrociti infettati con Plasmodio, la dematina si ri-localizzaprogressivamente dalla membrana del RBC al parassita
La dematina dell’eritrocita interagisce con la 14-3-3 di Plasmodio in mododiretto e l’interazione è mediata dalla fosforilazione della Ser124 eSer333 della dematina da parte della PKA
La dematina è parte del complessoche unisce il citoscheletro e lamembrana plasmatica. Contribuiscealla stabilità strutturale dellamembrana eritrocitaria. Interagiscecon l’actina e la ß-spectrina Lega efavorisce la formazione delle fibredi actina. Delezioni della dematinacausano eritrociti osmoticamentefragili.
Plasmodium berghei Plasmodium falciparum
Effetto potenziale delle 14-3-3 sulle proteine target• alterazione della conformazione• alterazione dell’attività o della stabilità• alterazione della localizzazione intracellulare• alterazione dell’intrazione con altre proteine
University of Rome “Sapienza“Department of Biochemical SciencesAnnarita Fiorillo (Crystallography)Department of PhysicsAllegra Via (Molecular Dynamics)Daniele di Marino (Molecular Dynamics)Ahmed Sayadi (Biocomputing)
University of Siena, Siena, ItalyDepartment of Biotechnology, Chemistry and PharmacyYlenia Cau (Molecular Dynamics)Mattia Mori (Molecular Dynamics)
Istituto Superiore di SanitàTommasino PaceChiara CurràLeonardo PicciFederica FratiniLuca FantozziSimona Cherchi
Lucia BertucciniMarco CrescenziCarlo BavassanoClaudia Blasetti FantauzziFabio CiccaroneGabriele Paris Bossi
University of Rome “Tor Vergata”Gianni CesareniSimona Panni (Pep-Spot)
Charite-UniversityBerlin, GermanyPrisca Boisguerin (Pep-Spot)
Giardia duodenalisLa 14-3-3 del Giardia mostra una localizzazione stadio specifica, ed èparzialmente ri-localizzata nel nucleo durante la fase di incistamento delparassita.
La 14-3-3 è costitutivamente fosforilata (Thr214) e poliglicilata al C-terminale in modo stadio specifico (Polimodificazione reversibile generatamediante legame covalente di sequenza di residui di glicina ad un residuo di acidoglutammico di una proteina).
Spettro MS del peptide polyglicilato
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In assenza di poliglicilazione la 14-3-3 si localizza nel nucleo ma lasovraespressione delle deglicilasi riduce la formazione delle cisti
La struttura cristallograficamostra che in assenza dipoliglicilazione la 14-3-3 formafilamenti mediante “domainswapping” del C-terminale.
Pep-SPOT/overlay
In assenza di fosforilazione della 14-3-3 il parassita ha ridotta capacitàdi formare cisti e il mutante che mima la fosforilazione interagisce con unpiù ampio spettro di sequenze
La dinamica molecolare suggerisce chela fosforilazione riduce la mobilità delC-terminale, promuove unatransizione conformazionale cheespone una superficie elettrostaticache favorisce l’interazione con ibersagli.
Toxoplasma gondiiLa 14-3-3 di Toxoplasma è espressa in tutti gli stadi del parassita ed èparzialmente fosforilata sulla Ser222
Il mutante fosfomimetico S222D interagisce in modo più “stabile” conproteine target rispetto al WT. Il mutante S222D è più sensibile and unamolecola che inibisce la capacità di legame delle 14-3-3
L’espressione inducibile di un peptide (difopeina) che lega in vivo la Tg14-3-3 induce difetti nel ciclo litico del parassita e induce delocalizzazioneintracellulare della Tg14-3-3
La molecola inibitrice della capacità di legame della Tg14-3-3 non haeffetto sulle 14-3-3 umane
Il trattamento con la molecola inibitrice della capacità di legame dellaTg14-3-3 induce difetti nel ciclo litico del parassita
