UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

RAPORT DE PRACTICĂ

PROFESOR COORDONATOR: SILVANA DĂNĂILĂ-GUIDEA

STUDENT: GHIBAN IULIA ANUL III, GRUPA 6303

Bucureşti 2012

Nume şi prenume student: Ghiban Iulia Universitatea/Facultatea: Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină veterinară Bucureşti, Facultatea de Biotehnologii Insituţia şi departamentul în care am desfăşurat stagiul de pregătire practică: INCDCF-ICCF Bucureşti, laboratoarele de microbiologie industrială, laboratorul de biotehnologii microbiene ,laboratorul de biotehnologii vegetale,laboratorul de analize biochimic şi fizico-chimice. Domeniul de activitate: cercetare şi dezvoltare de produse şi tehnologii de interes farmaceutic şi similare Date de contact instituţie: Adresă: Calea Vitan nr.112,sector 3, Bucureşti.Telefon: 0213224404, Fax: 0213222917 Perioada şi durata stagiului de pregătire practică: 9.07.2012-27.97.2012, 90 de ore Apreciere tutore: Foarte bine 10(zece) Apreciere profesor responsabil practică: 10(zece) Obiectul de activitate al partenerului de practică: cercetare si dezvoltare în scopul elaborării de noi tehnologii, produse şi servicii pentru industria farmaceutică şi practică terapeutică ca şi pentru alte domenii necesitând expertiză similară(suplimente alimentare,agricultură ecologică,etc.) Obiective de practică: Însuşirea unor deprinderi şi abilităţi de aplicare practică a cunoştiinţelor teoretice,interpretarea rezultatelor şi elaborarea de concluzii prin colerarea cunoştiinţelor teoretice cu rezultatele experimentale. Prezentarea activităţilor planificate: lucrări practice de microbiologie industrială (întreţinerea culturilor microbiene,conservarea tulpinilor,etc.),metode moderne de dozare a proteinelor, metode moderne de extracţie a principiilor active din materii prime vegetale, tipuri de echipamante utilizate pentru caracterizarea substanţelor organice naturale şi de sinteză prin spectrometrie de masă. Prezentarea pe zile a activităţilor întreprinse: Ziua 1: În prima zi de practică ne-am însuşit normele de protecţie a muncii în cadrul laboratorului de biotehnologii microbiene, prezentate de către Maria Spiridon,având fucnţia de subinginer principal. Ziua a 2-a: În această zi ne-a fost prezentată instituţia, laboratoarele de biotehnologii farmaceutice,laboratorul de biotehnologii microbiene, laboratorul de microbiologie industrială,laboratorul de analize,laboratorul de biotehnologii extractive vegetale. Ziua a 3-a: În cea de-a treia zi de practică,am luat parte la o prezentare de produse de spectrometrie de masă realizată de către firma AB Sciex. Ziua a 4-a: În această zi ne-au fost prezentate metoda Lowry de dozare a proteinelor şi metoda Kit Protein 80 destinată pentru măsurarea şi analiza poteinelor cuprinse între 5-80 kDa. Ziua a 5-a: În această zi ne+au fost arătate metodele de obţinere a solutiilor folosite în metoda Lowry,respectiv reactivul alcalin de cupru.

Ziua a 6-a: Am determinat proteinele dintr-un venin de viperă cu ajutorul metodei Lowry astfel: am preparat soluţiile necesare dozării proteinelor:reactivul alcalin de cupru, metodă prezentată în caietul de practică, după care am cântărit 0,350 g venin de viperă, l-am pus în balon cotat de 5ml şi am adus la semn cu apă distilată. Am luat 1 ml din probă peste care am adăugat reactiv alcalin de cupru. Am lăsat la repaus 10min după care am pus reactiv Folin Ciocâlteu 2ml (diluat 1:10) şi am aşteptat 40min după care am citit absorbanţa la 750 nm atât proba cât şi martorul care conţine aceleaşi substanţe mai puţin venin de viperă.

Ziua a 7-a: În această zi am citit rezultatele determinării proteinelor din veninul de viperă şi am realizat curba de etalonare.

Ziua a 8-a: Am lucrat cu Kitul Protein 80, metodă destinată măsurării şi analizei proteinelor cuprinse între 5-80 kDa. Am luat un cip nou şi l-am aşezat în locaşul corespunzător,am ridicat seringa până la 1ml şi am închis capacul până s-a auzit click,după care am împins seringa care a urcat. Am deschis capacul şi am adus seringa la 1ml pentru presurizarea cipului.În godeul G am încărcat 12 μl amestec Gel Dye, cipul l-am aşezat în locaş şi am închis capacul până la click. Am apăsat seringa până la nivelul cârligului iar după 60 de secunde l-am eliberat.În continuare am ridicat seringa până la 1ml,iar după 5 secunde am deschis capacul pentru distribuirea uniform a amestecului Gel Dye. În fiecare godeu marcat cu G am pipetat 12μl de amestec Gel Dye,în cel marcat cu DS 12μl de soluţie Destaining. Am pipetat 6μl probă în toate cele 10 godeuri,iar în cel cu simbolul unei scăriţe am pipetat 6μl soluţie ladder. Am aşezat cipul în bioanalizor şi am pornit programul corespunzător de citire.

Ziua a 9-a: În această zi am efectuat trei preparate proaspete în laboratorul de microbiologie, după care le-am analizat la microscop. Primul preparat era un bacil (Agrobacterium iradiata), al doilea un fung din calota glaciară de la Polul Nord, iar cel de-al treilea o drojdie.Ne-au mai fost prezentate nişte probe din laborator:probe din gheţarii Himalaya care au o populaţie microbiană mai bogată decât probele de la Polul Nord,probe din deşertul Sahara şi probe de la Polul Nord care sunt pure din punct de vedere microbiologic deoarece au fost prelevate dintr+ul loc mai izolat. Pentru determinarea exactă a microorganismului existent în aceste probe se efectuează determinări taxonomice pe bază de ADN. Preparatele proaspete au fost efectuate prin tehnica frotiului.

Ziua a 10-a: În această zi ne-a fost prezentată staţia pilot de obţinere a trufelor. Invenţia se referă la un produs de extracţie vegetală cu acţiune terapeutică în afecţiuni oftalmologice. Sursa vegetală constă în trufe brune de deşert ale fungilor din genul Terfezia. Trufele sunt în general larg utilizate în alimentaşie având un conţinut ridicat în protein şi grăsimi.Invenţia realizeayă un produs de origine natural de uz therapeutic foarte activ în afecţiuni oculareale corneei şi moderat activ în glaucoma.Produsul se obţine prin extracţie apoasă a trufelor după care extractul e purificat prin ultrafiltrare,concentrare şi formulare sub formă de colir.Astfel,trufele proaspete sau congelate se extrag în apă demineralizată la 4°C în raport de 3:1(v/g),extractul se separă prin filtrare pe strat de adjuvant sau centrifugare şi se supune purificării prin ultrafiltrarepe membrană cu limită de excludere de 10 kDa. Permeatul obţinut se concentrează sub vacuum la 1/6-1/9 (v/v) şi se adaugă clorură de benyalconiu 0,01% g/v şi NaCl 0,6%(g/v) după care se filtrează steril şi se obţine colir care se repartizează în flacoane sterile de 5-10ml.

Ziua a 11-a: În această zi am lucrat cu kitul Protein 230,protocol care este la fel cu cel prezentat pentru kitul 80 doar că este destinat pentru proteinele mai mari, cuprinse între 14-230 kDa.

Ziua a 12-a: În această zi ne-au fost prezentate testări farmaco-toxicologice şi testul micronucleilor din cadrul laboratorului de microbiologie.Testul micronucleilor este un test „in vivo” de scurtă durată pe celule de mamifere,utilizat pentru detectarea leziunilor cromozomale sau ale aparatuluimitotic datorate substanţelor chimice. Această tehnică se bazează pe creşterea numărului micronucleilor în eritrocitele policromatofile la animalele tratate faţă de martorul netratat. Scopul testului este să identifice substanţele care pot determina leziuni citogenetice care conduc la formarea unor micronuclei ce conţin fragmente de cromozomi.În acest test se foloseşte de obicei maduva osoasă a rozătoarelor deoarece eritrocitele policromatofile sunt produse în acest ţesut. Animalele sunt expuse la substanţe test printr-o cale de administrare adecvată. Animalele sunt sacrificate la 24 şi 48 de ore după tratamentul cu substanţa mutagenă pentru a permite desfăşurarea a două cicluri celulare în prezenţa agentului mutagen. În acest fel datele de mutageneză se corelează cele de farmacocinetică ale substanţei test.După sacrificare se extrage măduva hematogenă şi se prepară frotiuri care se colorează specific şi se evaluează la microscop.

Ziua a 14-a: În această zi am vizitat laboratorul de biotehnologii extractive vegetale care se ocupă cu extacţia substanţelor de interes din plante cât şi cu studii de literatură la un nivel superior pe baza cărora se ajunge la un produs final.

Ziua a 14-a: Am vizitat laboratorul de analize ( laboratorul de cromatografie de gaz şi laboratorul HPLC.

Ziua a 15-a: În această zi am fost prezenţi la colocviul de practică în cadrul facultăţii.

Observaţii personale: Activitatea desfaşurată în această perioadă în cadrul INCDCF-ICCF Bucureşti a avut ca obiectiv însuşirea unor deprinderi şi abilităţi de aplicare practică a cunoştiinţelor teoretice din domeniul biotehnologiei industriale referitoare la produsele farmaceutice şi similare precum şi din domeniul analizei biochimice şi fizico-chimice a substanţelor organice naturale şi de sinteză. În acest scop am efectuat lucrări practice de microbiologie, biosinteză şi extracţie microbiană, extracte din materii prime vegetale, analize biochimice şi fizico-chimice. Deasemenea, am dobândit capacitatea de a interpreta rezultate experimentale şi de a elabora concluzii pe baza corelării cunoştiinţelor teoretice cu rezultatele experimentale.

Concluzii: Consider că această perioadă de practică din cadrul programului POS DRU, BioPract a fost o experienţă benefică pentru dezvoltarea mea profesională, am învăţat multe lucruri noi, am pus în practică multe cunoştiinţe teoretice dobândite pe parcursul facultăţii.