Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe Jahrgang: ...2008/2010

Memmingen Leistungskurs:...................Biologie

Kollegiatin: .......Anja Rießenberger

Facharbeit

GFP - Klonierung in E.coli

Abgegeben am __________

Bewertung:

Facharbeit: Note: ________ Punkte: ________

Mündliche Prüfung: Note: ________ Punkte: ________

Gesamtergebnis: Note: ________ Punkte: ________

Datum und Unterschrift des Kursleiters: _____________________________________

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Gliederung

1. Einleitung ..................................................................................................................... 3

2. Allgemeines.................................................................................................................... 3

2.1 GFP ..................................................................................................................... 3

2.2 E.coli ..................................................................................................................... 4

3. Wie kommt die Qualle ins Bakterium? – Methoden und Materialien................................ 4

3.1 Agar-Ampicillin-Platten............................................................................................ 4

3.1.1 Materialien.................................................................................................... 4

3.1.2 Herstellung ................................................................................................... 5

3.2 Ausstreichen der Agarplatten.................................................................................. 5

3.3 Anlegen einer Übernachtkultur................................................................................ 6

3.4 Plasmidpräparation................................................................................................. 7

3.4.1 Materialien.................................................................................................... 7

3.4.2 Durchführung................................................................................................ 8

3.5 Gelelektrophorese .................................................................................................. 9

3.5.1 Materialien.................................................................................................... 9

3.5.2 Durchführung.............................................................................................. 10

3.6 Restriktionsverdau ................................................................................................ 11

3.6.1 Restriktionsenzyme .................................................................................... 11

3.6.2 Durchführung.............................................................................................. 12

3.6.3 Analyse durch Gelelektrophorese............................................................... 12

4. Ausblick ................................................................................................................... 13

5. Quellenverzeichnis ....................................................................................................... 15

6. Schülererklärung .......................................................................................................... 17

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1. Einleitung

“The wonderful future that fluorescent proteins will bring us cannot be imagined at this

point“(gfp.conncoll.edu, 2009).

Meine Aufgabe für diese Facharbeit bestand darin, Bakterien zum Leuchten zu bringen, was

dadurch erreicht wird, dass ein grün fluoreszierendes Protein in ein E.coli Bakterium

transformiert wird.

2. Allgemeines

Im Folgenden eine kurze Beschreibung der Protagonisten dieser Facharbeit:

2.1 GFP

Green Fluorescent Protein taucht ausschließlich in einer bestimmten Quallenart auf – der

Aequorea victoria. Für die Wichtigkeit der „Entdeckung und Entwicklung des grün

fluoreszierenden Proteins, GFP“ wurden 2008 Osamu Shimomura, Marty Chalfie und Roger

Tsien mit dem Nobelpreis in der Chemie ausgezeichnet.

M. ZIMMER (gfp.conncoll.edu, 2009) misst GFP sogar eine derart hohe Bedeutung in der

Molekularbiologie bei, dass er es als „Mikroskop des 21. Jahrhunderts“ bezeichnet hat .

Abb. 1: Aquorea victoria (gfp.conncoll.edu, 2009)

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2.2 E.coli

„Das in der menschlichen Darmflora vorkommende Escherichia coli ist das ‚Haustier‘ der

Molekularbiologen. Lange Zeit war E.coli molekularbiologisch und genetisch der am besten

untersuchte Organismus. Das Genom ist vollständig sequenziert und die meisten der 4288 Gene sind

in ihrer Funktion charakterisiert. […]

Genetisch veränderte E.coli - Stämme werden eingesetzt, um bestimmte Proteine […] zu produzieren.

E.coli dient aber auch im Labor als Vermehrungssystem, etwa um bestimmte Gen-Sequenzen oder

Vektoren zu ‚klonieren‘“ (www.biosicherheit.de, 2009).

Letzteres spielt im Folgenden eine tragende Rolle.

Abb. 2: E.coli (microvet.arizona.edu, 2010)

3. Wie kommt die Qualle ins Bakterium - Methoden und Materialien

Um die E.col i- Bakterien später unter ultraviolettem Licht leuchten lassen zu können, sind

meherer Arbeitsschritte nötig:

3.1 Agar-Ampicillin-Platten

Wie sie hergestellt werden und was dafür benötigt wird nun näher erklärt:

3.1.1 Material

• Glasflasche

• 1,31 g Lactose-Agar

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• 65 ml steriles Wasser

• Handschuhe

• 65 µl Ampicillin

• 5 sterile Petrischalen

3.1.2 Herstellung

Der Lactose-Agar wird mit dem sterilen Wasser in der Glasflasche vermengt. Danach wird

die Mischung in der Mikrowelle so lange gekocht, bis eine klare Lösung entsteht.

Anschließend wird dies autoklaviert. (SCHMITT, 2008: S. 14) Dieses Verfahren wird im

Folgenden erläutert:

„Autoklavieren ist eines der wichtigsten Verfahren zur Keimabtötung. Das

Autoklavierverfahren (121°C, 1 bar Wasserdampfüberdruck, 20 min) stellt einen sehr

wichtigen Schritt bei mikrobiologischen und molekularbiologischen Experimenten dar. Mit

diesem Verfahren töten Sie alle lebensfähigen Keime und sogar deren Dauerstadien sicher

ab. Zusätzlich inaktivieren Sie auf diese Weise eine Reihe von Chemikalien wie z.B.

Antibiotika“ (www.nugi-zentrum.de, 2010 a).

Das Medium wird deswegen erst nach dem Autoklavieren mit dem Ampicillin beimpft. Durch

die Ampicillin - Beimpfung wird erreicht, dass unerwünschte Bakterienkulturen sich nicht

entwickeln können, sondern nur die gewollten ampicillinresistenten pHAT-GFPuv Bakterien

wachsen.

Weil Agar oberhalb von 50°C noch flüssig ist, wartet man so lange, bis es auf 60°C

abgekühlt ist, um es dann vorsichtig in die Petrischalen bis zu einer Höhe von 2-3 mm zu

gießen. Damit eine Kontamination vermieden wird, sollten die Platten sofort wieder mit dem

Deckel verschlossen werden. Nun werden die Platten ein bis zwei Tage auf der Laborbank

stehen gelassen, damit überschüssige Feuchtigkeit verdunstet. (SCHMITT, 2008: S. 14)

3.2 Ausstreichen der Agar-Platten

„Diese Technik wird z.B. angewendet für das Anlegen von Stammkulturen. Solche

Stammkulturen auf Agaroberflächen stehen über Tage, Wochen oder einige Monate für

Experimente zur Verfügung. Im Verlauf des Ausstriches kommt es zur Vereinzelung von

Bakterienzellen. Also können auch mit dieser Technik Klone erhalten werden“ (www.nugi-

zentrum.de, 2010 b)

Material:

• Agarplatten

• Bunsenbrenner

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• Platinimpföse

• 80%iger Alkohol zum Desinfizieren

Zu allererst wird die Öse mit dem Bunsenbrenner abgeflammt, um eventuelle sich an der

Öse befindliche Keime und Bakterien abzutöten. Mit der erkalteten Öse wird nun ein Teil

einer pHAT-GFPuv-Kolonie aufgenommen. Nachdem man mit einer Hand den Deckel einer

Agarplatte geöffnet hat, wird dieser mit der Innenfläche nach unten auf die zuvor desinfizierte

Arbeitsplatte gelegt. Nun wird die Öse auf die Agaroberfläche gelegt und ohne Druck oder

Verkanten der Öse über die Agaroberfläche gezogen.

Abb. 3: Ausstrichart auf Agaroberflächen (www.nugi-zentrum.de, 2010 c)

Anschließend wird die Agarplatte wieder mit ihrem Deckel verschlossen und die Öse

nochmals abgeflammt. Um Verwechslungen zu vermeiden und den Überblick zu behalten,

sollten die Agarplatten außen mit Datum und Stamm beschriftet werden. Zuletzt werden

diese Agarplatten bei 37°C mehrere Tage lang bebrütet. (vgl. www.nugi-zentrum.de, 2010 b)

3.3 Anlegen einer Übernachtkultur

Dies ist wohl die einfachste Möglichkeit zur Anzucht von Bakterien. Hierfür beimpft man 3 ml

des Kulturmediums in einem Kulturröhrchen mittels einer sterilen Pipettenspitze mit den zu

züchtenden Bakterien und mit 65µl Ampicillin. Die Pipettenspitze wird kurz in die

Stammkultur von pHAT-GFPuv eingetaucht und anschließend mit Hilfe des Abwerfers in das

Kulturröhrchen eingeworfen. Dabei ist darauf zu achten, dass man mit keinem Teil der

Pipette an den Behälter der Stammkultur und das Röhrchen stößt, um eine Kontamination zu

vermeiden. (SCHMITT, 2008: S. 14) Anschließend wird das Kulturröhrchen in den Schüttler

gestellt und bei 35°C 24 Stunden lang inkubiert. Erfolgreiches Bakterienwachstum kann am

nächsten Tag daran erkannt werden, dass sich das Kulturmedium getrübt hat.

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3.4 Plasmidpräparation

Ein Plasmid ist DNA in Ringform und dient unter anderem dazu, Gene in andere Bakterien

zu übertragen. Plasmid-DNA stellt nur einen Bruchteil der Gesamt-DNA einer Bakterienzelle

dar, was es schwer macht, sie zu erreichen. (www.nugi-zentrum.de, 2010 d)

Abb. 4: Darstellung der Anteile in einer Zelle (www.nugi-zentrum.de, 2010 d)

3.4.1 Materialien

• Pipette und passende sterile Spitzen

• 1,5 ml Übernachtkultur

• Zentrifuge

• Sammelgefäß

• Eppendorf Caps

• 250 µl Puffer P1

• 250 µl Puffer P2

• 350 µl Puffer N3

• Quiagen-Säule und 2 ml Eppendorfgefäß

• 0,5 ml Puffer PB

• 0,75 ml Puffer PE

• 50 µl Puffer TE

Feuchte Zelle

Wasser 80%

Trockenmasse 20%

Trockenmasse

Protein

Membranen undZellwand

RibonukleinsäurenDNA

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3.4.2 Durchführung

Abb. 5: Schematische Übersicht zur Plasmidisolation (www.nugi-zentrum.de, 2010 e)

Zunächst werden 1,5ml der Übernachtkultur in einem Epi für fünf Minuten bei 5000xg

abzentrifugiert. Die Bakterien befinden sich danach am Boden des Epis, sichtbar als weißer

Niederschlag. Der restliche Überstand wird nicht benötigt und deswegen in ein Sammelgefäß

pipettiert. Die übrigen Zellen im Epi werden nun resuspendiert mit dem RNase A haltigen

Puffer P1. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Zellklumpen übrig bleiben dürfen. Bei

diesem Schritt werden die Zellmembranen aufgelöst. Jetzt ist das Plasmid aus der Zelle

freigesetzt und das größere Chromosom bleibt in den Zellen zurück. Anschließend wird der

Puffer P2 hinzugegeben. Diese Lösung wird durch Schwenken über der Längsachse des

Gefäßes vorsichtig gemischt. Der Ansatz wird für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der Zugabe des Puffers N3 wird das Epi fünf bis sechs Mal umgedreht, wobei die

Lösung trübe werden kann. Bei maximaler Leistung wird die Lösung nun für zehn Minuten

abzentrifugiert. Diesmal wird jedoch mit dem Überstand weitergearbeitet. Er enthält die

gesuchten Plasmide, der Niederschlag lediglich die Zelltrümmer und wird deswegen

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verworfen. Dieser Überstand wird nun abpipettiert und auf eine Qiagen - Säule gegeben, die

wiederum in das 2 ml Epi gesteckt wird. Hierbei sind dringend Scherkräfte zu vermeiden, da

diese das Plasmid – DNA - Molekül teilweise brechen können. Die Qiagen - Säule im Epi

wird nun bei voller Leistung 30-60 Sekunden lang zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen,

weil die Plasmide auf der Säule hängen bleiben. Daraufhin wird die Säule mit dem Puffer PB

gewaschen, wobei der Puffer auf die Säule gegeben wird und dies wiederum für 30

Sekunden bei voller Leistung zentrifugiert wird. Das Plasmid bleibt weiterhin auf der Säule

hängen, Puffersalze und Proteine jedoch befinden sich im Durchlauf, der wieder verworfen

wird. Anschließend wird der Puffer PE auf die QIAprep - Säule aufgetragen und nochmals

bei voller Leistung 30-60 Sekunden lang zentrifugiert. Der Durchlauf, in dem sich diesmal

Puffersalze und Zellinhaltsstoffe befinden, wird abermals verworfen. Das Plasmid befindet

sich nach wie vor auf der Säule. Um sicher zu gehen, dass wirklich alle Puffersalze aus der

Säule entfernt wurden, wird die Säule nochmals für 60 Sekunden bei voller Leistung

zentrifugiert. Schließlich wird die Säule in ein frisches, steriles Epi gesteckt und der Puffer TE

darauf gegeben. Dadurch wird die Salzkonzentration auf der Säule erniedrigt und das

Plasmid eluiert [=herausgelöst, ausgespült]. Danach wird der Ansatz für eine Minute bei

Raumtemperatur inkubiert und im Folgenden für eine Minute bei voller Leistung zentrifugiert.

Diesmal enthält der Durchlauf die Plasmid-DNA. Abschließend werden 2 µl der

Plasmidlösung in einer Agarosegelelektrophorese analysiert, um festzustellen, ob und

wieviel Plasmid isoliert wurde. (vgl. www.nugi-zentrum.de, 2010 e)

3.5 Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese wird im Labor bevorzugt dafür verwendet, um schnell nachzuweisen,

ob eine Plasmidisolation oder ein Restriktionsverdau erfolgreich waren.

3.5.1 Materialien

• 0,2 g Agarose

• TAE-Puffer (1 fach)

• Schraubdeckelflasche

• Mikrowelle

• Handschuhe

• Agarosegelkammer

• Kunststoffkamm

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• Pipette mit dazugehörigen sterilen Spitzen

• sterile Eppis

• 3 µl Plasmidlösung

• 1 µl Gelladungspuffer

• Zentrifuge

• zweimal 5 µl Größenmarker 100 bp Plus

• Spannungsquelle

3.5.2 Durchführung

Um ein 1% iges Agarosegel zu erhalten, werden 20 ml des TAE-Puffers mit der Agarose in

einer Schraubdeckelflasche vermengt. Anschließend wird dies (ohne Deckel) in der

Mikrowelle solange erhitzt, bis keine Klümpchen mehr sichtbar sind. Beim Herausnehmen

der nun heißen Schraubdeckelflasche empfiehlt es sich, Handschuhe zu tragen, um die

Hand vor Verbrennungen zu schützen. Sobald die Schraubdeckelflasche auf einem

schmelzfesten Untergrund zum Abkühlen gestellt worden ist, sofort den Deckel darauf

schrauben, um zu vermeiden, dass zu viel der Gellösung verdunstet. Wenn die Flasche so

weit abgekühlt ist, dass sie angenehm in die Hand genommen werden kann, wird das Gel

vorsichtig in die Agarosegelkammer gegossen, so dass keine Löcher entstehen.

Darauf folgend wird der Kunststoffkamm an dem Ende eingesetzt, an welchem der Minuspol

der Spannungsquelle angeschlossen werden soll. Nachdem das Gel komplett abgekühlt ist,

wird der Kamm vorsichtig herausgezogen und die Gelkammer so weit mit TAE-Puffer

angefüllt, bis das ganze Gel und die entstandenen Probentaschen damit bedeckt sind.

Nun werden die Plasmidlösung mit 38,5 µg/ml DNA-Konzentration und der Gelladungspuffer

„Loading Dye“ in ein steriles Epi pippetiert. Damit ein homogenes Gemisch entsteht, wird

dies kurz mit Gegengewicht von 4 µl Wasser in die Zentrifuge gegeben.

In die beiden äußersten Probentaschen werden je 5 µl Größenmarker pipettiert. Dies dient

dazu, um einen „Maßstab [zu haben], anhand dessen man beurteilen kann, welche Größe

die nachgewiesenen [DNA-] Fragmente haben.“(SCHMITT, 2008: S. 23)

Die wieder aus der Zentrifuge herausgenommene Plasmid- / Markerlösung wird jetzt in eine

der Geltaschen pipettiert. Anschließend wird die Spannungsquelle angeschlossen. Dabei ist

zu beachten, dass der Minus-Pol an dem Ende angeschlossen wird, an der sich die

beladenen Probentaschen befinden und die Spannung maximal sieben Volt je Zentimeter

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Elektrodenabstand beträgt. In den nächsten 30 - 60 Minuten kann beobachtet werden, wie

die negativ geladene DNA zum Pluspol wandert. Dies wird durch den Gelladungspuffer

sichtbar gemacht, welcher die DNA-Proben daran hindert, „zu schnell wieder heraus zu

diffundieren […] [und] meistens aus Glycerin und zwei verschiedenen Farbstoffen besteht.

Das Glycerin erhöht die Dichte der Probenlösung im Vergleich zum Elektrophorosepuffer und

führt somit dazu, dass die Proben, wenn sie einmal in die Geltaschen pipettiert wurden, auch

dort ‚liegen bleiben‘. Die anionischen Farbstoffe dienen der optischen Kontrolle während der

Elektrophorese, da sie parallel zu den Nukleinsäuren durch das Gel wandern.“ (SCHMITT,

2008: S. 22)

3.6 Restriktionsverdau

„Eigentlich ist es ganz einfach. Man sucht sich aus der Enzymaktivitätsliste des Herstellers

den passenden Puffer aus, pipettiert DNA, Wasser, Puffer und Enzym zusammen, mischt gut

und inkubiert das Ganze für eine Stunde bei 37 °C.

Soweit die Theorie. Meistens funktioniert das auch. Meistens.“(MÜLHARDT, 2003: S. 45)

3.6.1 Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonucleasen

Eine Definiton hierfür wäre „(lat. restringere zurückziehen, öffnen): Enzym, das DNA an

spezifischen Basensequenzen schneidet.“ (LINDER, 2006: S. 546) MÜLHARDT bezeichnet sie

sogar als „wahre Wunder der Biologie, [weil] sie (je nach Spezifität) vier bis acht Basenpaare

in einem DNA-Strang erkennen […] [und] sie dabei von ungeheurer Präzision sind, denn sie

schneiden nur ihre Zielsequenz und […] nichts anderes.“(MÜLHARDT, 2003: S. 42)

In diesem Fall werden das Restriktionsenzym mit voller Aktivität Hind III, der

Restriktionsenzympuffer EcoR I mit Staraktivität und der dazugehörige Puffer TangoTM

benötigt.

Wo diese Restriktionsenzyme im

Plasmid pHAT-GFPuv ansetzen,

es dann auch schneiden und

welche Basenpaare davon

betroffen sind, wird in der

folgenden Abbildung dargestellt.

Hind III schneidet nach dem 141.

Basenpaar und EcoR I nach

dem 979. Basenpaar.

Abb. 6: Vektorbeschreibung des Plasmids pHat-GFPuv

(www.clontech.de, 2009)

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3.6.2 Durchführung

Mengenangaben:

• 1 µl Plasmidlösung

• 15 µl steriles, denaturiertes Wasser

• 2 µl zehnfach konzentrierter Puffer TangoTM

• 1 µl EcoR I

• 1 µl Hind III

Bevor man mit den eigentlichen Arbeitsschritten beginnt, sollte man zuerst den Inkubator

einschalten, damit sich dieser währenddessen auf 37°C erhitzen kann. Die verschiedenen

Komponenten werden nacheinander in ein Eppendorf-Cap pipettiert. Allerdings ist bei den

auf Eis gelagerten Restriktionsenzymen Vorsicht zu wahren, damit diese wirklich nur kurz

angetaut und nicht vollständig aufgetaut werden! Nachdem das Gemisch abzentrifugiert

worden ist, wird es für 30 - 60 Minuten in den Inkubator gestellt. Damit man sich hierbei nicht

die Finger verbrennt, sollte man darauf achten, nur das Epi zu berühren.

3.6.3 Analyse durch Gelelektrophorese

Abb. 7: kontrastbearbeiteter Abb. 8: GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder Gelausschnitt (2009) (www.fermentas.com, 2010 a)

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Wie in Abbildung 6 ersichtlich, schneidet Hind III nach 144 bp und EcoR I nach dem 979. bp.

Was wiederum eine Basenpaarlänge von 835 für das herausgeschnittene Plasmidstück

ergibt.

In den oberen beiden Abbildungen werden Gel und Markerskala zur Orientierung

gegenübergestellt.

Nach einer Kontrastbearbeitung des Bildes vom fotografierten Gel unter ultraviolettem Licht

werden im linken Bild das Bandenmuster des Markers (links) und das des Plasmids (rechts)

deutlich sichtbar. Zu erkennen ist, dass das erste der drei Banden des Plasmids über der

ersten Bande des Markers liegt, welcher bei 3000 beginnt. Das geschnittene Plasmid hat

eine Gesamtlänge von 3500 bp. Die dritte Bande des Plasmids im Gel ist kaum sichtbar, weil

dies das kleinste und damit leichteste DNA-Bruchstück des Plasmids ist. Es ist am weitesten

durch das Gel gewandert und stoppte bei ungefähr 840 bp; der Länge, die das

herausgeschnittene Plasmidstück haben sollte.

Somit war der Restriktionsverdau zwar erfolgreich, jedoch ist die Menge der

Plasmidbruchstücke für die Beendigung der GFP Klonierung in E.coli nicht ausreichend (die

Bande bei 837 bp kann gerade mal als roter Schatten gesehen werden).

4. Ausblick

Dass dieses Kapitel lediglich die Überschrift „Ausblick“ trägt und nicht weiter bis zum Ende

des Verfahrens führt, ist wohl meiner falschen Prioritätensetzung im vergangenen Jahr

zuzuschreiben. Wäre dies anders gewesen, wäre noch genügend Zeit geblieben, den

Restriktionsverdau erneut durchzuführen, um ein ausreichendes Ergebnis zu bekommen, mit

welchem man hätte weiter arbeiten können.

Bei einer ausreichenden Menge an Plasmidbruchstücken wird mit einer Elimination des

DNA-Fragments aus dem Plasmid pHAT-GFPuv fortgefahren: zunächst wird das DNA-

Fragment mit einem scharfen Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten, wobei noch

überschüssige Agarose zum Verkleinern des Stücks zusätzlich entfernt werden sollte.

Anschließend wird das Fragment in ein Reagenzglas gesteckt, gewogen und mit dem Puffer

QG im Verhältnis 3 zu 1 angereichert wird, wobei der Puffer in µl und das DNA-Fragment in

mg gemessen wird. Nun wird dies bei 50°C solange inkubiert, bis sich das Gel vollständig

aufgelöst hat (ca. zehn Minuten). Danach muss kontrolliert werden, ob die Farbe der

Mischung gelb ist. Wenn dies nicht der Fall ist und sich eine Orange- bis Lilafärbung zeigt, ist

der pH-Wert zu hoch und muss mit 10µl 3 M Natriumacetats, pH 5.0, ausgeglichen werden.

Anschließend wird Propanol im Verhältnis 1:1 hinzugefügt und durch vorsichtiges

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Schwenken untergemischt. Im Folgenden wird eine MinElute-Säule in ein 2ml Epi gesteckt,

das Gemisch daraufgegeben und für eine Minute zentrifugiert, um die DNA

zusammenzubinden. Nachdem der Überstand verworfen worden ist und die Säule zurück ins

Epi gesteckt wurde, werden 500µl des Puffers QG hinzugegeben und das ganze für eine

Minute zentrifugiert. Bevor nun zum Waschen der Säule 750µl des Puffers PE hinzugegeben

werden, wird der Überstand abermals verworfen und die Säule wieder zurück ins Epi

gesteckt. Dieser Überstand wird wieder verworfen und die Säule im Epi nochmals für eine

Minute zentrifugiert. Nun wird die MinElute-Säule in ein steriles 1,5 ml Epi gesteckt. Um die

DNA jetzt loszulösen, werden zuerst 10µl des Puffers EB direkt auf die Membran gegeben,

das Ganze dann eine Minute lang stehen gelassen und anschließend eine Minute lang

zentrifugiert. Die DNA hat sich von der Säule gelöst und befindet sich im Epi. (QUIAGEN,

2008)

Darauf folgend wird eine Klonierung dieses isolierten DNA-Fragments in pJET1.2/blunt

vorgenommen. Hierfür wird das CloneJetTM PCR Cloning Kit verwendet:

Abb. 9: Vector Map pJet1.2/blunt (www.fermentas.de, 2010 b)

“The kit contains a novel, ready-to-use positive selection cloning vector pJET1.2/blunt. The

vector contains a lethal restriction enzyme gene that is disrupted by ligation of a DNA insert

into the cloning site. As a result, only bacterial cells with recombinant plasmids are able to

form colonies. Recircularized pJET1.2/blunt vector molecules lacking an insert express a

lethal restriction enzyme which kills the host E.coli cell after transformation.”

(www.fermentas.com, 2010 a)

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Für ein Gesamtvolumen von 20µl werden folgende Komponenten benötigt:

• 10 µl 2 * Reaktionspuffer

• 2 µl PCR-Produkt

• 1 µl pJet1.2/blunt Klonierungsvektor

• 6 µl nukleasefreies Wasser

• 1 µl T4 DNA Ligase

Alle Komponente werden nacheinander in ein Epi pipettiert und nach kurzem Schwenken

drei bis fünf Sekunden lang zentrifugiert. Anschließend wird die Lösung bei 22°C für fünf

Minuten inkubiert. Nun muss die Lösung unmittelbar für die Transformation von Bakterien

verwendet werden (www.fermentas.com, 2010 b). Dies geschieht, wie folgt:

Es gibt mehrere Möglichkeiten, kompentente Zellen herzustellen. Zum einen kann für ein

schnelles Ergebnis das TransformAid™ Bacterial Transformation Kit verwendet werden.

Hierbei werden bis zu 2,5 µl der Ligasen – Reaktions - Mischung gebraucht, um 50 µl

kompetente E.coli Zellen zu transformieren, die zuvor mit diesem Kit vorbereitet wurden.

Zum anderen braucht man bis zu 5µl der Ligasen - Mischung um 50 µl derjenigen E.coli

Zellen, die durch die Calcium-Chlorid-Methode kompetent gemacht wurden, zu

transformieren.

Zu Beginn werden Agar – Ampicillin - Platten für mindestens 20 Minuten bei 37°C

vorgewärmt. Nachdem die E.coli - Zellen wie zum Beispiel im Protokoll des TransformAid™

Bacterial Transformation Kit beschrieben kompetent gemacht wurden, werden 2,5 µl der

Ligasen - Mischung in ein steriles Epi pipettiert und für zwei Minuten auf Eis gelegt. Darauf

folgend werden 50µl der kompetenten E.coli - Zellen hinzugegeben und für fünf Minuten auf

Eis inkubiert. Sofort im Anschluss muss das Gemisch auf die Agar – Ampicillin - Platten

ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. (www.fermentas.com, 2010 c)

5. Quellenverzeichnis

• Literaturverzeichnis

(1) LINDER, 2006: Linder Biologie Gesamtband, S. 546, 22., neu bearbeitete

Auflage, Braunschweig, Schroedel, ISBN 3507109301

(2) QIAGEN, März 2008: MinElute Handbook, S. 23 f

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(3) MÜLHARDT Cornel, 2003: Der Experimentator, Molekularbiologie/Genomics,

4.Auflage, München, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 3827414601

(4) SCHMITT Patrick, 2008: Einführung in die Grundarbeitstechniken der

Molekularbiologie

• Internetquellen

(1) www.biosicherheit.de, 2009: Gentechnik-Pflanzen-Umwelt, Lexikon, E.coli,

http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/97.ecoli_kolibakterien.html

(2) gfp.conncoll.edu, 2009: ZIMMER Marc, Green Fluorescent Protein, 18.11.2009,

http://gfp.conncoll.edu

(3) www.fermentas.com, 2010 a: CloneJetTM PCR Cloning Kit, Description,

http://www.fermentas.com/en/products/all/pcr-qpcr-rt-pcr/k123?print

www.fermentas.com, 2010 b: ZILINSKIENE Jurgita, CloneJetTM PCR Cloning Kit

Protocol, page 6

http://209.85.129.132/search?q=cache:tWlONKCKSeQJ:www.fermentas.com/te

mplates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_k1232.pdf+CloneJet%E2%84%A2+PCR+C

loning+Kit+Sticky-End+Cloning+Protocol&cd=2&hl=de&ct=clnk&gl=de

www.fermentas.com, 2010 c: ZILINSKIENE Jurgita, CloneJetTM PCR Cloning Kit

Protocol, page 8

http://209.85.129.132/search?q=cache:tWlONKCKSeQJ:www.fermentas.com/te

mplates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_k1232.pdf+CloneJet%E2%84%A2+PCR+C

loning+Kit+Sticky-End+Cloning+Protocol&cd=2&hl=de&ct=clnk&gl=de

(4) www.nugi-zentrum.de, 2010 a: Dr. STUPPERICH Erich, Autoklavieren,

Experimente, http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Grundlagen/

Autoklavieren.html

www.nugi-zentrum.de, 2010 b: Dr. STUPPERICH Erich, Ausstreichen,

Experimente, Kultivierungstechniken, http://www.nugi-

zentrum.de/Experimente/Mikrobiologie/Kultivieren/Methode.html

www.nugi-zentrum.de, 2010 d: Dr. STUPPERICH Erich, Plasmidisolation,

Experimente, http://www.nugi-

zentrum.de/Powerpoint_Dateien/Plasmid/Plasmidisolierung.ppt .

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• Abbildungsverzeichnis

Deckblatt: http://summercamps.dnalc.org/images/gfp_plate.png, 2010

Abbildung 1: gfp.conncoll.edu/, 2009: HADDOCK Steve, Aequorea victoria,

Bioluminescence, http://gfp.conncoll.edu/

Abbildung 2: mocrovet.arizona.edu/, 2010: The University Of Arizona 2007, Case

3: E.coli, http://microvet.arizona.edu/Courses/MIC419web/secure/

CaseEcoli/ EcoliEM4.jpg

Abbildung 3: www.nugi-zentrum.de, 2010 c: Dr. STUPPERICH Erich, Ausstrichart

auf Agaroberflächen, Experimente, Kultivierungstechniken,

Abbildung 4: www.nugi-zentrum.de, 2010 d: Dr. STUPPERICH Erich, Darstellung

der Anteile in einer Zelle, Experimente, http://www.nugi-

zentrum.de/Powerpoint_Dateien/Plasmid/Plasmidisolierung.ppt.

Abbildung 5: www.nugi-zentrum.de, 2010 d: Dr. STUPPERICH Erich, Schematische

Übersicht zur Plasmidisolation, Experimente

Abbildung 6: www.clontech.com, 2009: CLONETECH Laboratories, Inc., pHAT-

GFPuv+ Vector Information,

http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3312-5.pdf

Abbildung 7: Ergebnis der Gelelektrophorese, 2009: kontrastbearbeiteter

Gelausschnitt

Abbildung 8: www.fermentas.com, 2010 a: GeneRulerTM 100 bp Plus DNA

Ladder, Products, http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-

electrophoresis/generuler-dna-ladders/sm032

Abbildung 9: www.fermentas.com, 2010 b: pJet1.2/blunt,

6. Schülererklärung

Erklärung des Kollegiatin:

Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im

Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe.

Schlegelsberg, den 23.01.2010 ...............................................................

(Unterschrift der Kollegiatin)