Genomas, contenido de genes. - biblioceop...La secuencia cis-regulatoria del lac-operon +1 tss Jacob...
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Genomas, contenido de genes.
REGULACION DE LA EXPRESION GENICA
-Donde, cual, cuanto, cuando, se expresa la información génica?-Elementos cis- y transregulatorios
-Operon lac Jacob Monod,- regulación positiva y negativa, represión por catabolito
-Regulación en eucariotas- elementos cis, función de un enhancer- elementos trans, factores de transcripción, cofactores
-Características de hetero- y eucromatina, -regulación por modificaciones epigeneticas
-Métodos de análisis funcional de secuencias regulatorias- in silico, in vitro, in vivo , gen reportero
Dr. G.Kausel, 2009
ESTRUCTURA de un GEN
Inicio
transcrip
ción
Inicio
traducción termino
traducción
termino
transcripción
5’-n
o-tr
aduc
ida
codificantepromotor
Sitio de entra
da de la
RNA polimera
sa
Sitio de entra
da de la
riboso
ma
3’-n
o-tr
aduc
ida
intergenico
DNA
RNA
proteina
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Secuencias de consenso en la región promotora predice sitios de unión de factores de transcripción
Análisis in silico para la predicción de secuencias cis-regulatorias
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En procariotas:
Lodish, 10.1
En procariotas el factor sigma determina cual, donde y cuando se transcribe un gen
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REGULACION
-Estudiado en procariotas en el operon lactosa
-modelo: OPERON, Francoise Jacob y Jaques Monod 1961
-Mutantes constitutivos y mutantes no-inducibles
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EXPRESION en PROCARIOTAS
- transcripción y traducción espacial y temporalmente acoplada- mensajeros policistronicos- la síntesis de varios proteínas está bajo control de un promotor
5’ 3’ un mRNApolicistrónico
PROMOTOR+1
Varias proteínas
Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3
gen 1 gen 2 gen 3
REGULACION NEGATIVA
El gen está en OFF y se activa por que se une un activador
El gen está en OFF por un represor unido al operador y se activa por sacar el represor
REGULACION POSITIVA
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galactosa glucosa
alolactosa
entra lactosa a la célula bacteriana
Una pequeña parte de lactosa se transforma en alolactosa
(el inductor que saca el inhibidor del operador)
La -galactosidasa cataliza la digestión a galactosa y glucosa
lactosa permeasa
galactosidasa:
acetilasa no se sabe bien su rol
E. coli sintetiza tres proteínas para utilizar lactosa como fuente de energía
-galactosidasa
lacZ lacY lacA
PROMOTOR
operadorP O
gen represor/inductor
I
OPERON lactosa
-galactosidasa3072bp
permeasa1251bp
acetilasa609pb
represor1040bp
genes estructurales
Regulación por elementos cis (secuencias) y elementos trans (proteínas regulatorias)
CAP
RNA Pol
Repressor
CAP: catabolite activating protein
La secuencia cis-regulatoria del lac-operon
+1
tss
Jacob y Monod (1962) estudiaron mutantes que constitutivamente utilizan lactosa y revelaron la regulación del operon de la lactosa en E. coli.
Alberts, 7-38
Z Y A
P OI
1.) cuando no hay lactosa, la célula no transcribe los genes del operon-lac, el represor estáunido al operador, que inhibe la unión de la RNA polimerasa al promotor
represor/inhibidor
La lactosa saca el represor del operador y solamente cuando no hay glucosa se transcribe el operon-lac
2.) cuando hay lactosa, la lactosa (alolactosa) se une al represor y el represor ya no está en el operador
alolactosa
3.) cuando hay glucosa y lactosa, la célula prefiere usar glucosa la presencia de glucosa reprime la degradación de la lactosa = represión por catabolito
4.) cuando no hay glucosa aumenta la concentración del cAMP, el cAMP se une a una proteína (CAP) y estimula la unión de la RNA Pol al promotor transcripción del operon-lac
Estructura de un gen Eucariotico
GEN EUCARIOTICO
tss: transcription start site Dr. G.Kausel, 2009
POSIBLES PUNTOS DE CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
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TRANSCRIPCION POL II en EUCARIOTAS
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secuencias cis-regulatorios en promotor eucariota
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FUNCION DE UN ENHANCER
Secuencia enhancer puede ubicarse río arriba (5’) o rio abajo (3) o detro del gen para modular la expresión
Proteínas regulatorias: diseño modular
región unión al DNAregión transactivadora +
Ej:- homeobox- leucin zipper- dedos de zinc
FACTORES DE TRANSCRIPCION
Elementos trans-regulatorios
TIPOS DE MOTIVOS DE UNION AL DNAEj.: el motivo helice-vuelta-helice se encuentra en el dominio homeobox, el dominio de unión al DNA
Secuencias especificas pueden ser reconocidas sin que se abren las hebras complementarias, de
afuera en el surco mayor y menor
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El dominio homeo de 60 aá está codificado en el homeo-box de 180 bp
el homeodominio, que contienen el motivo helice-vuelta-helice, se compone de 60aa codificado por 180bp “homeo-box”, altamente conservada, presente en multiples proteinas regulatorios como los factores de transcripcion con homeo-box, ej. genes hox en eucariotas, que determinan eje anterior-posterior
Wolberger et al., Cell 67:517 528, 1991
Otro tipo de motivo de unión al DNA:
Ej.: fragmento del receptor de glucocorticoide
Luisi et al., Nature 352:497 505, 1991
Células detectan y responden a nivel transcripcional a hormonas glucocorticoidesque están producidos por la glándula adrenal en respuesta al estrés
DEDOS DE ZINC zinc-finger
esta proteína participa en complejos activadoras y represoras
proteínas regulatorias que no se unen directamente DNA se
llaman co-activador o co-represor
INTERACCION PROTEINA-PROTEINA
Transcripción y procesamiento
EPIGENETICA
PATRON HEREDABLE DE LA ACTIVIDAD DE GENES QUE NO IMPLICA CAMBIOS A NIVEL DE NUCLEOTIDOS, SI NO MEDIANTE EL ESTADO DE ORGANIZACION DEL DNA (ESTRUCTURA DE LA CROMATINA)
-Modificación química del DNA (metilación)-Modificación química de las proteínas histonas
(acetilación, metilación, fosforilación, poliadenilación)- Unión de otras proteínas al DNA
Regulación del aceso a ser transcrito
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! Efecto ambiental !
IMPORTANCIA DE LA METILACION DEL DNA
-en mamíferos en dinucleotidos CpG-involucrado en funciones importantes como
- impronta- inactivación de la cromosoma X- silenciamiento de retrotransposones- inactivación de genes de tumores
- regulación de la expresión génica en embriones
Dnmt1 = mantención-MT; Dnmt3a y b = de novo MT
Heterocromatina DNA no acesible, no activaEucromatina DNA acesible, activa
Informacion adicional
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Estudios de todos los transcritos en un momento en un lugarTranscriptomics
Un gen en distintos tejido
Distintos genes en un tejido en diferentes momentos
Verde: ++++Rojo: -
No transcritos
Estudios de todas las proteínas en un momento en un lugarProteomics
En cerebro humano En hígado humano
Cada punto es una proteína
Separación de proteínas por electroforesis bi-dimensional (1. pI; 2. tamaño)
La actividad de la β-galactosidasa se visualiza con X-gal
-Región regulatoria 5’ y gen lacZ -galactosidasa, inductor in vivo: (allo)lactosa, in vitro: IPTG
-actividad del gen lacZ con sustrato X-Gal produce producto color azul
unión irreversible al represor
- -galactosidasa activa en presencia de X-Gal, IPTG AZUL
- -galactosidasa inactiva en presencia de X-Gal, IPTG sin color
X-gal
Aequorea victoria
GFP
Gen reportero GFP en rana transgénica bajo control de un promotor tejido-expecífico, que dicta la expresión del gen en el ojo Expresión in vivo del gen reportero GFP en ojo
Gen green fluoreszent protein GFP
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GEN REPORTERO
Región regulatoria modula expresión de secuencia codificante gen reportero
-In vitro:estudio promotor: inducción de la expresión gen reportero (fold-induction)transfección de constructos en líneas celulares, evaluar expresión gen reportero
ej: - gen lacZ -galactosidasa reacción colorimetrico- gen luciferasa con sustrato luciferin reacción colorimetrico
-in vivo: ej: - gen green fluorezcence protein detección in vivo, cualitativo
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PRINCIPIO DE LA APLICACIÓN DE RNA ANTISENTIDO
oligonucleotidos antisentido específicos se incorporan a la célula, hibridan con el mRNA específico y bloquean la síntesis de la proteína estudio del efecto al fenotipo indica la función
INTERACCION PROTEINA/DNA
footprinting
Ej:
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INTERACCION PROTEINA/DNA in vivo
Chromatin immune precipitation ChIP
Cross-link de las célulascon formaldehido
lisis de las células
romper cromatina
inmunoprecipitación
revertir el cross-linkeliminar proteínas y
limpiar DNA
amplificar secuencia especifica
La inmunoprecipitacion puede ser ej. con anticuerpo contra histona, histona modificada o factor de transcripción especifico
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INTERACCION PROTEINA/DNA in vitro
EMSA electromobility shift assay
Fraccionamiento en geles de poliacrilamida y
retardo del complejo DNA/proteína
DNA marcado radiactivmente
Extracto nuclear
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![[PPT]Embarazo Ectópico - biblioceop | Just another … · Web viewLIBRE EN DOUGLAS ECOGRAFIA EN EL EMBARAZO ECTOPICO = ECOGRAFIA TRANSVAGINAL LAPAROTOMÍA Title Embarazo Ectópico](https://static.fdocuments.net/doc/165x107/5b82a7567f8b9a64618b6f2b/pptembarazo-ectopico-biblioceop-just-another-web-viewlibre-en-douglas.jpg)
