Genetyka molekularna Prokaryota -...
Transcript of Genetyka molekularna Prokaryota -...
Genomy bakterii i archeonów
2
Od 0,5 (mykoplazmy) do ~ 5 Mb Wyjątkowo 9 Mb (Bradyrhizobium japonicum) – 13 Mb
(Sorangium cellulosum) archeony z reguły 1,5-2,5 Mb
Gęste upakowanie genów (~1 gen/kb) Krótkie obszary międzygenowe i regulatorowe Tylko sporadycznie występują introny Kodowane białka krótsze, niż u Eukaryota
Tworzy z białkami upakowaną strukturę nukleoidu
Organizacja genomu
6
Typowa – pojedynczy “chromosom” kolisty Możliwe liczne warianty
Więcej cząsteczek kolistych Cząsteczki liniowe
“Chromosomy” i plazmidy Plazmidy mogą być koliste lub liniowe Z reguły mniejsze od chromosomów, ale mogą być bardzo
duże (megaplazmidy) Plazmidy zwykle są opcjonalne, mogą też występować u
wielu gatunków Rozróżnienie – chromosomy zawierają geny metabolizmu
podstawowego, niezbędne do życia, plazmidy – nie.
Figure 8.5 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Ewolucyjna zmienność Prokaryota
7
Przy podobnej liczbie genów ogromna różnorodność zestawu genów
Duże różnice między szczepami np. E. coli O157:H7 vs. E. coli K12 - ~1300 genów w O nie
w K i ~500 w K nie w O(!) Częsty poziomy transfer genów (do kilkunastu procent
genomu), nawet między odległymi gatunkami Problem definicji gatunku
Bakterie mają genomy podobnej wielkości, mieszczące 2000-6000 genów
Około połowy genomu tworzą rodziny podobnych genów powstałych przez powielenie (duplikację) – tzw. rodziny paralogów
To, które geny są powielone świadczy o kierunku specjalizacji ewolucyjnej bakterii
Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii
Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii
9
H. influenzae – heterotrof pasożytniczy – powielone geny kodujące białka rozkładające różne związki organiczne
Methanococcus janaschii – chemoautotrof – powielone geny kodujące enzymy szlaków biosyntetycznych
Pseudomonas aeruginosa – groźny patogen oporny na wiele leków i szybko dostosowujący się do zmian środowiska – powielone geny kodujące białka usuwające antybiotyki, rozkładające substancje organiczne, umożliwiające zagnieżdżanie się w powierzchniach.
Droga od DNA do białka
Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem
Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których kazdy może podlegać regulacji
10
Ekspresja genów prokariotycznych Prokaryota
dominuje regulacja na poziomie transkrypcji policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji
transkrypcyjnej – operony mRNA szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo
równocześnie z transkrypcją
12
Elementy systemów regulacji Elementy cis
Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji Elementy cis w obrębie DNA
np. promotory, operatory, enhancery Elementy cis w obrębie RNA
sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp.
13
Elementy systemów regulacji Elementy trans
Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne),
aktywatory, represory itp. Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory
translacji, splicingu itp.) RNA regulatorowe (siRNA, miRNA itp.)
14
Podstawy regulacji genu Regulacja pozytywna
czynnik trans jest aktywatorem – zwiększa ekspresję Regulacja negatywna
czynnik trans jest represorem – osłabia ekspresję
15
Podstawy regulacji genu Regulacja indukowalna
Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję Regulacja reprymowalna
Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję
Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna
Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności czynnika trans a indukowalna/reprymowalna – odpowiedzi na sygnał
16
Operony
17
Typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji Policistronowy transkrypt – wspólna ekspresja wielu
genów z jednego promotora Przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki
Figure 8.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Regulacja
18
Polimeraza stosunkowo prosta, proste sekwencje promotorowe Rdzeń katalityczny wspólny, kilka podejednostek sigma o
różnej specyficzności odpowiadających za rozpoznanie promotorów σ70 (RpoD) – główny czynnik sigma ("housekeeping”) – większość
genów σ54 (RpoN) – głód azotowy σ38 (RpoS) – głód/faza stacjonarna σ32 (RpoH) – szok cieplny σ28 (RpoF) – wić
Aktywatory i represory wpływają na wiązanie polimerazy z DNA
Przykład – operon lac
W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005 19
Operon lac – regulacja przez CAP
20 W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005
Operon lac
21
Regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji Negatywna indukowalna – przez laktozę/represor lacI Pozytywna reprymowalna – przez glukozę/białko CAP
Białko to reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem źródeł węgla - regulon
Terminacja transkrypcji
22
Podczas transkrypcji cały czas konkurencja między kontynuowaniem a dysocjacją polimerazy
Zależy od związanych białek, struktury transkryptu Terminatory
samodzielne Rho zależne
Figure 12.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Regulacja na poziomie terminacji - antyterminacja
23
Antyterminacja Regulacja pozytywna, czynnik trans wiążąc się z DNA znosi
działanie terminatora Typowy przykład – geny kaskady litycznej faga λ
Najwcześniejsze
Wczesne-opóźnione
Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Regulacja na poziomie terminacji - atenuacja
24
Fakultatywna sekwencja terminatora na początku transkryptu, zależnie od warunków Kinetyka translacji – dostępność naładowanego tRNA Wiązanie specyficznych białek Wiązanie ligandów drobnocząsteczkowych –
ryboprzełączniki (niektóre)
Atenuacja – operon trp E. coli
25
Zależnie od dostępności załadowanego tRNATrp sekwencja lidera mRNA przyjmuje różne konformacje
tRNATrp dostępny tRNATrp niedostępny
W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005
Operon trp u Bacillus subtilis
26
Białko TRAP wiąże naładowany tRNATrp
Kompleks TRAP z tRNATrp wiąże mRNA
Dodatkowo białko AT (anty-TRAP) wiąże TRAP gdy bardzo mało naładowanego tRNATrp
tRNATrp dostępny W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005
Ryboprzełączniki
27
Wiązanie związków drobnocząsteczkowych bezpośrednio z mRNA zmienia konformację, wpływając na ekspresję Atenuacja Dostępność miejsca wiązania rybosomu
Ryboprzełącznik TPP – operon thi E. coli
28
Odpowiada za biosyntezę tiaminy
SD- Shine-Dalgarno TPP- pirofosforan tiaminy
Winkler et al. (2002) Nature 419, 952-956
Transdukcja sygnału – systemy dwuskładnikowe
29
Systemy umożliwiające regulację genów w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne (transdukcja sygnału) Sensor– domena wiążąca ligand + domena kinazy histydynowej
(HK) – autofosforylacja w odpowiedzi na sygnał Efektor (RR – response regulator) – fosforylowany przez aktywny
sensor (w asparaginie) reguluje transkrypcję
West & Stock (2001) . Trends Biochem. Sci., 26, 369-376
Globalne systemy regulujące - regulony
30
Skoordynowana regulacja działania wielu operonów Represja kataboliczna (aktywator CAP)
zależny od poziomu glukozy poziom cAMP Odpowiedź ścisła
brak składników odżywczych, alarmon ppGpp, interakcja z polimerazą RNA, wybór podjednostki σ38 (RpoS)
Odpowiedź SOS uszkodzenia genomu, białko RecA – indukowana aktywność
proteazy, tnie m. in. represor LexA
Życie społeczne bakterii – quorum sensing
31
Mechanizm wyczuwania liczebności Ekspresja zależna od gęstości bakterii Komórki wydzielają cząsteczki sygnałowe – autoinduktory
(peptydy, związki laktonowe, pochodne S-AM) Przekroczenie progowego stężenia autoinduktorów –
aktywacja systemu dwuskładnikowego, zmiana ekspresji
Quorum sensing Vibrio fischeri
32
Bioluminescencja tylko przy dużej gęstości w planktonie - nie w symbiozie z głowonogiem - tak
Produkowany przez enzym LuxI autoinduktor wiąże aktywator LuxR, co aktywuje operon lucyferazy
http://www.che.caltech.edu/groups/fha/quorum.html
Quorum sensing - biofilmy
33
Tworzenie biofilmu – kluczowe dla patogenezy, oporności na antybiotyki Np. Pseudomonas aeruginosa – przewlekłe
infekcje w płucach Infekcje oportunistyczne, np. u chorych na
mukowiscydozę
Fuqua & Greenberg (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 685-695
Kod genetyczny Trójkowy
20 aminokwasów kodony po 3 nukleotydy: 34=64 możliwości (dwa: za mało) Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3
kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje)
34
Kod genetyczny Nienakładający się
Dowody: załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i
ACA (nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie “centralnym”, możliwe tylko 42 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje trzyaminokwasowe (202=400).
Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie
35
Kod genetyczny Bezprzecinkowy Zdegenerowany
3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów
36
Regularności w kodzie Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca
(np. UCx – Ser) Aminokwasy o podobnych właściwościach często z
podobnymi kodonami Np.
AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina UCx: seryna; ACx: treonina
38
Parowanie wobble
W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I – inozyna)
39