Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... ·...
Transcript of Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... ·...
![Page 2: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/2.jpg)
Genetikai vizsgálat fogalma
• A vizsgált egyén DNS állományában (genomjában)
történő elkésések kimutatása
• A genetikai vizsgálatot „A humángenetikai adatok
védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és
kutatások, valamint a biobankok működésének
szabályairól” szóló 2008. évi XXI. törvény alapján
minden esetben genetikai tanácsadásnak kell
megelőznie
![Page 3: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/3.jpg)
Genetikai vizsgálat céljai
1. Betegség hátterében álló patogén mutációk kimutatása
2. Genetikai rizikófaktorok vizsgálata – hajlamosító és
védő polimorfizmusok elemzése
3. Farmakogenomikai vizsgálatok
4. Személyazonosítás – igazságügyi DNS vizsgálatok
5. Apasági vizsgálatok
6. Prenatális vizsgálat – szűrés, ismert mutációk
kimutatása
7. Szervezetben lévő vírusok, baktériumok kimutatása
8. Transzplantációs genetika – HLA tipizálás
![Page 4: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/4.jpg)
• A talált eltérés patogenitásának eldöntése
– Irodalmi adatok
– Fenotípus – genotípus korreláció vizsgálata
– Kontroll személyekben történő vizsgálat
– Funkcionális vizsgálatok – RNS, fehérje
szinten
![Page 5: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/5.jpg)
Genetikai vizsgálatok főbb
csoportosítása
Citogenetika
Molekuláris genetika
„Biokémiai genetika”
![Page 6: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/6.jpg)
Biokémiai genetika
(protein- és metabolit-
rendellenességek) • Metabolitok:
– hosszú szénláncú zsírsavak
gázkromatográfiája
• Fehérje szerkezet:
– dystrophin Western blot
dystrophinopathiak esetében
• Enzimaktivitás:
– foszforiláz aktivitás – McArdle betegség
– alfa glükozidáz - Pompe kór
![Page 7: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/7.jpg)
Citogenetika
![Page 8: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/8.jpg)
A citogenetika feladata
• Különböző genom- és
kromoszómamutációk
azonosítása a
preimplantációs, pre-
és posztnatális
genetikában.
![Page 9: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/9.jpg)
Citogenetikai módszerek
Kariotipizálás
FISH
CGH
![Page 10: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/10.jpg)
Vizsgálati minták
• Lymphocyta – vér
• Csontvelő
• Fibroblast
• Amnionfolyadék
![Page 11: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/11.jpg)
(NOR)
heterokromatin
Kromoszóma azonosítás
szempontjai
- méret
- centromer helyzete
- másodlagos befűződés helye
- festési mintázat
- heterokromatin eloszlása
eukromatin
Kromoszómák morfológiája
![Page 12: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/12.jpg)
• A számbeli elváltozások – leggyakrabban a nemi kromoszómákat érintik (Turner-,
Klinefelter-szindróma).
– A testi sejteket érintő számbeli (Patau-, Edwards-, Down-szindróma) kromoszóma elváltozások több szerv rendellenességeihez vezetnek.
• Szerkezeti kromoszóma rendellenességek: – kromoszómaszakasz elvesztése (deléció).
– kromoszómadarab áthelyeződése egy másik kromoszómára (transzlokáció)
• Kiegyensúlyozott – a letörött nem vész el (más helyen megvan – másik kromoszómára rátapad) – az adott egyedre nincsen súlyos következményük – ivarsejteknél keletkezhetnek olyan ivarsejtek amelyek hiányos genetikai információval járó sejtek
• Kiegyensúlyozatlan: a letört darab kikerül a rdsz-ből – azon lévő gének hiányoznak (több 100 gén hatása is kieshet
– Kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulása (inverzió).
![Page 13: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/14.jpg)
• Kariotípus: – Az egyed kromoszómáinak összessége, iIl. az egyed
kromoszómáinak száma, alak és nagyság szerinti meghatározottsága.
– A kariotípust az idiogramm segítségével rögzítik.
– Az eljárás segítségével felismerhetők egyes kromoszóma rendellenességek illetve öröklődő betegségek.
![Page 15: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/15.jpg)
Kromoszóma sávok:
• G-sávozás: savas-sós Giemsa festés
• R-sávozás: (reverse) emelt hőmérsékleten történő Giemsa festés
• C-sávozás: centroméra specifikus festés
• T-sávozás: teloméra specifikus festés
• Q-sávozás: quinacrin festés (fluoreszcens mikroszkópban vizsgálható)
![Page 16: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/16.jpg)
Kariotipizálás
• Phitohaemoglutinin növényi lektin) Go-G1 fázis átvitelét
segíti
• 1-3 napig tenyésztik
• Colhicin kezelés – gátolja az osztódási orsó működését,
de a mitózisba lépést nem
• Hipotonizálás KCL hatására a sejtek megdúzzadnak,
kromoszómák elkülönülnek egymástól
• Fixálás – metanol-ecetsav keverék
• Gimsa festés
![Page 17: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/17.jpg)
Standard karyotípus
Bármilyen metafázisos sejteket tartalmazó, osztódni képes sejtpopuláció
Általában: lymphocyta (ezek proliferációját könnyű indukálni)
egyéb szövetek – bőr (fibroblastok)
– Csontvelő
– amnion folyadék
– Chorionboholy
– szájnyálkahártya
![Page 18: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/19.jpg)
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) • A DNS fragmentumokat fluoreszkáló festékkel jelölünk meg és ezáltal
fénymikroszkóppal nem látható kromoszóma részleteket is azonosíthatunk.
• FISH-el kromoszómák, kromoszómaszegmentek, mint különálló egységek, vagy akár gének tehetők láthatóvá.
• Lehet – Direkt FISH - A fluoreszcensen jelölt
– Indirekt FISH - reporter molekula kell
• A módszer használható – Interfázisos sejtmagokban (pl. vérkenet, vagy akár 10-100 mikrométer vastagságú szöveti
metszet)
– Kromoszómapreparátumokon (metafázis)
![Page 20: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/20.jpg)
• Jellemzői:
– Nagy érzékenység
– 100 bázisnyi méret alatti szekvencia is kimutatható
– Lehetséges több DNS-szekvencia egyidejű kimutatása
• A kicsiny kromoszóma részletek kiesésével járó ún. mikrodeléciós kórképek (Prader-Willi-, Angelman-, Williams-, DiGeorge-,Miller-Dieker-, Smith-Magenis-szindróma) célzott FISH vizsgálattal diagnosztizálhatók.
• Az ismeretlen eredetű értelmi fogyatékossággal társuló mikrodeléciókat a kromoszóma végdarabjait elemző szubtelomérikus próbákkal lehet kimutatni
• Tumor specifikus transzlokációk kimutatása
![Page 21: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/21.jpg)
![Page 22: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/22.jpg)
Multikolor FISH
(Spektrális kariotipizálás)
![Page 23: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/23.jpg)
Komparatív genomikus hibridizáció
(CGH)
• Egészséges egyénből származó, tárgylemezen fixált, metafázisban lévő kromoszómákat denaturáljuk és etanolban dehidratáljuk
• A beteg és a referencia DNS 1:1 arányú keverékét szintén denaturáljuk (a DNS – ket előzőleg eltérő fluoreszcens festékkel jelölik)
• Ezt hibridizáltatjuk a normális kromoszómákat tartalmazó preparátumra
• A nem hibridizált DNS-t eltávolítjuk
• A kromoszómákat „antifase”-ban oldott DAPI-val (kék festék, amely a DNS-t specifikusan jelzi és a G-sávozáshoz hasonló mintázatban kötödö molekula: 1,6 diamino-fenil-indol) jelöljük
• E három eredőjeként kapjuk meg a CGH képet
![Page 24: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/24.jpg)
![Page 25: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/25.jpg)
CGH értéklése
• Ha citogenetikai eltérés nem található: a két szín egyenlő arányú kombinációját narancssárga fluoreszcenciaként látjuk
• A fluoreszcencia intenzitás arányából valamennyi kromoszóma anomális feltérképezhető – deléció, duplikáció
• Digitális image analízis: a három fluoreszcencia intenzitást zöld, piros, kék optikai szűrőkkel CCD kamerával rögzítjük.
• A kromoszómák azonosítása a DAPI sávozott image segítségével automatizált színes kariotípus analizáló programmal történik.
• Módszer előnye – A teljes genom vizsgálható egyetlen hibridizáció során
– Sejtkultúra, vagy a vizsgálni kívánt sejtekből származó metafázis indukció nem szükséges
– A korábban nem ismert duplikált vagy deletált DNS szakasz kimutatására is alkalmas
![Page 26: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/26.jpg)
Deléció
Duplikáció
![Page 27: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/27.jpg)
Molekuláris biológiai
módszerek
![Page 28: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/28.jpg)
• PCR alapú technikák
– VNTR meghatározás
– PCR-RFLP
– Multiplex PCR
– Trinukleotid repeat meghatározások
• Real-time PCR
• MLPA
• Fragment elemzés
• Szekvenálási metodikák
– Sanger
– Piroszekvenálás
– Újgenerációs szekvenálás
• GWAS vizsgálatok
![Page 29: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/29.jpg)
PCR (polimeráz
láncreakció)
DNS megsokszorozása
![Page 30: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/31.jpg)
Elektroforézis
A töltéssel rendelkező
makromolekuláknak
(pl. DNS) az a
tulajdonsága, hogy
elektromos erőtér
hatására
elmozdulnak.
A negatív töltésű DNS
a pozitív töltés felé
vándorol
_
+
![Page 32: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/32.jpg)
Nested PCR
• PCR
specificitását
növeli
![Page 33: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/33.jpg)
Multiplex PCR • Egyszerre több primerrel történő PCR vizsgálat
• Pl. homozigóta exoni deléciók kimutatása
(dystrophin)
![Page 34: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/34.jpg)
VNTR vizsgálatok
![Page 35: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/35.jpg)
Trinukleotid repeat kimutatás
Huntington kór
Spinocerebelláris ataxiák (SCA)
Friedreich ataxia
Dystonia myotonica
Huntington kór
CAG repeats
4-es kromoszóma
IT 15 gén - huntingtin protein
![Page 36: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/36.jpg)
RFLP
(restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) Enzimatikus hasítás
![Page 37: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/37.jpg)
![Page 38: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/38.jpg)
Bioanalyser
![Page 39: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/39.jpg)
Real-time PCR
• PCR reakció eredménye valós időben követhető
• PCR-t követően olvadáspont analízis is elvégezhető (olvadáspont arányos a DNS összetétellel – GC arány/ és hossz) a fragmensek azonosíthatók
• SyberGreen – interkaláris festék, ha van termék zöld fluoreszcenciát mutat
• TaqMan próba – két hagyományos próba és egy hibridizáló próba a kettő között
• A PCR reakcióban a hibridizáló primer hozzátapad az egyszálúított DNS-hez
• Taq poliemeráz 3’>5’ exonukleáz aktivitással a hibridizáló primert nukleotidokra bontja
• A kioltótó enzim (qencer) nem gátolja a fluorokróm működését
• Nagyon specifikus, könnyen multiplexezhető
![Page 40: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/40.jpg)
![Page 41: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/41.jpg)
![Page 42: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/42.jpg)
TaqMan SNP assay
CC
TT
CT
C allél
T allél
T allél
C allél
![Page 43: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/43.jpg)
Génexpresziós változások mérése
Bcl-2
Bcl-XL Syn1
kontroll
Bcl-2 kezelt
kontroll
Bcl-XL kezelt Bcl-XL kezelt
Bcl-2 kezelt
kontroll
Bax
normoxia
hypoxia
![Page 44: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/44.jpg)
Fluoreszcens fragment analízis
![Page 45: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/45.jpg)
MLPA
• Multiplex ligation-dependent
probe amplification
• Génen belüli nagyobb
kópiaszám változások
kimutatására használható
• Egyszerre több gén is
vizsgálható
![Page 46: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/46.jpg)
Kontroll
PMP22 duplikáció
PMP22 deléció
![Page 47: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/47.jpg)
DNS szekvenáló módszerek
Sanger szekvenálás
Piroszekvenálás
Újgenerációs szekvenálás
![Page 48: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/48.jpg)
Sanger szekvenálás
![Page 49: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/49.jpg)
![Page 50: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/50.jpg)
Felhasználás
• Ismert gének szekvencia
analízise
• Patogén mutációk keresése
![Page 51: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/51.jpg)
Piroszekvenálás • DNS másolásakor beépülő nukleotidról leszakad egy pirofoszfát
• Ezt a luciferáz felvillanása jelzi
![Page 52: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/52.jpg)
Felhasználás
• Mutációk pontos
mozaicizmus rátájának a
megadása (pl. tumorokban
szomatikus mutációk
vizsgálata – KRAS 2.exon
12. és 13. kodon)
• Pontos heteroplazmia
arány
![Page 53: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/53.jpg)
Újgenerációs szekvenálás
• A genomot 50-1000bp közti
darabokban lehet
szekvenálni
• Ezt de novo módszerekkel
lehet összerakni - min 30
millio fragment
• Covarage (lefedettség)
– 1 bp hányszor van előhívva –
humánnál min 10x-es
lefedettség kell
![Page 54: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/54.jpg)
• Sanger szekvenálás
– Max 1000bp
– Nagy pontosság
– Kicsi akapcitás
– Drága
– Munka és időigényes
– Nem multiplexezhető
– Elektroforetikus elvű
• Újgenerációs
– Több millió bp
egyidejű szekvenálása
– gyors
– olcsóbb
– Jól automatizálható
– Nincs elektroforetikus
elválasztás
– multiplexezhető
![Page 55: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/55.jpg)
![Page 56: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/56.jpg)
NGS vizsgálatok felhasználhatósága
• Teljes genom
• Teljes exom
• Teljes transzkriptom
• NGS panelek (enrichment)
– Célzottan, betegségre specifikus gének
egyidejű szekvenálása
![Page 57: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/57.jpg)
NGS szakaszai
• Könyvtárkészítés
– A genomot szekvenálható darabokra bontjuk
– Ismert szekvenciájú oligonukleotidokat mindkét végére
hozzáadjuk - egységessen szekvenálható a minta
– Barcode adható hozzá (megjelöli melyik minta)
• Klonális amplifikáció
– 1 fragmentből kb 1 millió
• Szekvenálás
• Bioinformatikai kiértékelés
![Page 58: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/58.jpg)
Könyvtárkészítés
![Page 59: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/59.jpg)
Klonális amplifikáció
• Emúlziós PCR
– Olajban vízcseppek vannak
(mikroreaktorok) amiben minden
benne van
– Fragmentet juttatjuk bele
– SOLID és Roche
• Bridge amplifikáció
– A komplamenter oligok
üveglemezen vannak és a pH
változás miatt lesz grid képzés
– Illumina
![Page 60: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/60.jpg)
![Page 61: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/61.jpg)
![Page 62: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/62.jpg)
Szekvenálás
• Sanger alapú - Illumina
• Piroszekvenálás alapú – SOLID és Roche
• Proton detektálás - Iontorrent
![Page 63: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/63.jpg)
![Page 64: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/64.jpg)
![Page 65: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/65.jpg)
![Page 66: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/66.jpg)
Blot technikák
Western blot – fehérje
Southern blot - DNS
Northern blot - RNS
![Page 67: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/67.jpg)
Fehérje meghatározás
Western blot
• biomolekulák
komplexében lévő fehérje
kimutatására
• Ez egy analitikus
technológia, a fehérje
expressziójának,
mérésére
• Detektálás:
autoradiográfiával, rtg
filmre
• Kiértékelés:
denzitometrálás
Pl. Qantity One Software
![Page 68: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/68.jpg)
Denzitás meghatározás meghatározás
Kvantifikálás
![Page 69: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/69.jpg)
![Page 70: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/70.jpg)
Northern blot
![Page 71: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/71.jpg)
Southern blot
![Page 72: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/72.jpg)
GWAS
![Page 73: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/73.jpg)
![Page 74: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/74.jpg)
• A fenotípusos jellel (pl. beteg) rendelkező, illetve
kontroll populációt genotipizálnak
• Megkeresik, hogy melyik marker (SNP)
gyakorisága különbözött a két populáció között
• Multifaktoriális jellegek genomikai hátterének
tisztázására
![Page 75: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/75.jpg)
Microarray („génchip”) technológia
• Nagyságrendekkel emelik az egyidejűleg vizsgálható gének számát
• Szerkezeti (nukleotidsorrend) és funkcionális (génkifejeződés-mRNS) információk tömegét képes nyújtani
• A génchipek (génlapok) rendezetten (microarray), sorokban és oszlopokban több tízezer ismert nukleotidszálat tartalmaznak, ezekhez kapcsolódik a jelzett minta nukleinsav
• A fluoreszcens festékekkel láthatóvá tett kötődési mintázatot a komputer értékeli, és ismerve a génlapon levő elrendezést, a pozitív/negatív reakció alapján jellemzi a minta genetikai tartalmát
• Egyszerre több tízezer (akár a teljes genom) gén kifejeződése értékelhető ezzel az eljárással
![Page 76: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/76.jpg)
![Page 77: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/77.jpg)
![Page 78: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/78.jpg)
![Page 79: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/79.jpg)
![Page 80: Genetikai vizsgálatok módszereisemmelweis.hu/genomikai-medicina/files/2013/11/Genetikai... · 2013-11-18 · (protein- és metabolit-rendellenességek) • Metabolitok: –hosszú](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052516/5b84e8957f8b9aef498d4a5c/html5/thumbnails/80.jpg)