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Einführung

Transkription in Prokaryoten (Bakterien)

Transkription in Eukaryoten - Eukaryotische RNA-Polymerasen - Transkription durch RNA-Polymerase II - Transkription durch RNA-Polymerase I & III - Genregulation in Eukaryonten

Eukaryotische RNA-Polymerasen

RNA-Polymerase Ort Produkte

RNA-Polymerase I Nucleolus 18S, 28S, 5.8S rRNA

RNA-Polymerase II Nucleoplasma mRNA, U1, U2, U4, U5 snRNA

RNA-Polymerase III Nucleoplasma tRNA, 5S rRNA, U6 snRNA

mt-RNA-Polymerase Mitochondrien alle mitochondrialen RNAs

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Evolution von RNA-Polymerasen

Eukarya

Archaea

Bacteria

Prokarya

Transkription ist evolutionär konserviert

Untereinheiten von RNA-Polymerasen

β’-ähnlich

β-ähnlich α-ähnlich

konserviert in Archaea und Eukarya nur in Archaea nur in Eukarya

Bacteria Archaea Eukarya I II III

2x

β’

β

α

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Untereinheiten der RNA-Polymerase II in Hefen

UE Funktion

RPB1

RPB2 RPB3 RPB4

RPB5 RPB6 RPB7

RPB8 RPB9 RPB10 RPB11 RPB12 Total

bindet DNA trägt CTD bindet NTPs Assemblierung nicht essential, Stress-Antwort Ziel von Aktivatoren Assemblierung nicht essential, Stress-Antwort nicht bekannt Selektion der Startstelle Proteinkinase Assemblierung nicht bekannt

E. coli Homolog

βʼ

β α

ω

α

Größe (kD)

191,6

138,8 35,3 25,4

25,1 17,9 19,1

16,5 14,3 8,3

13,6 7,7

513,6

Die größte UE der RNAP II besitzt eine spezielle C-terminale Domäne (CTD)

Rpb1 = größte UE der RNAP II

Rpc1 = größte UE der RNAP III

β' = größte UE der bakt. RNAP

CTD

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Die größte UE der RNAP II besitzt eine spezielle C-terminale Domäne (CTD)

CTD spielt wichtige Rolle bei der Interaktion der RNAP II mit Aktivator-Proteinen und beim Übergang von der Initiations- zur Elongationsphase.

Im Initiationskomplex ist CTD nur wenig phosphoryliert, und wird vor der Elongations-phase an den zahlreichen S- und T-Resten stark phosphoryliert. Dies bewirkt eine deutliche konformationelle Änderung der CTDs und ermöglicht den Übergang zur Elongationphase.

CTD

Bakterielle und eukaryotische RNAPs haben eine ähnliche Architektur

Bakterielle RNAP Hefe RNAP II

•  ähnliche Gesamtstruktur ('Krabbenschere') •  vergleichbare Positionen der homologen UE im Komplex

Rpb2

Rpb3

Rpb11 Rpb6

Rpb1 β'

β

αΙ

αΙI ω

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Transkription durch RNA-Polymerase II

- Struktur und Komplexität von mRNAs

- Promotor-Struktur von RNAP II-Genen

- Allgemeine Transkriptionsfaktoren

- Ausbildung des Präinitiationskomplexes

- Elongation und Termination

- Regulation der Transkriptionsinitiation

Im Unterschied zum bakteriellen RNAP-Holoenzym benötigt die RNAP II von Eukaryoten an die 80 verschiedene Proteine (Faktoren) für die Anlagerung an Promotoren, und weitere Faktoren während der Elongation.

Struktur eukaryotischer mRNA

7mGppp Kappe

5ʼ 5ʼ-nicht-translatierte Region AUG

Initiation

translatierte Region

(A)~200

poly(A)-Schwanz

3ʼ-nicht-translatierte Region

UGA Termination

3ʼ AAUAAA Polyadenylierungs-Signal

- Alle mRNAs haben eine 5ʼ-Kappe und einen poly(A)-Schwanz (mit Ausnahme der mRNAs für Histone).

- Die 5ʼ-Kappe und der 3ʼ poly(A)-Schwanz sind wichtig für die Stabilität und die Translation der mRNA.

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Regulatorische Elemente für die Transkriptionsinitiation

Promotor Regulator- Sequenz Bakterien (prokaryotische RNAP)

Hefen (eukaryotische RNAP II)

Säuger (eukaryotische RNAP II)

Grundelemente eukaryotischer Promotoren

Promotorbereich ('core promotor') - Assemblierungsbereich für den Prä-Initiationskomplex - Bindestelle für allgemeine Transkriptionsfaktoren - bestimmt Startstelle und Richtung der Transkription - oft aktiv in vitro, aber inaktiv in vivo - nicht jedes Element kommt in jedem Promotor vor, ca. 65% aller Gene im Humangenom haben z.B. keine TATA-Box

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Grundelemente eukaryotischer Promotoren

TFIIB Recognition Element TATA Box INitiatoR Element Downstream Core Element Downstream Promoter Element

Identifizierung der allgemeinen Transkriptionfaktoren (mit Hilfe eines in vitro-Transkriptionssystems)

Transkribierte Region

Promotor

DNA-Matrize

Analyse der Transkripte (Gel-Elektrophorese)

A B C D

A B C

A B

A C

B C hinzugefügte

Kernfraktionen

Fraktionen A und C enthalten die notwendigen Faktoren

Analyse durch weitere Fraktionierung

+ gereinigte RNAP II + 32P-NTPs, Mg2+

+ fraktionierte Kernextrakte

Transkript

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Allgemeine Transkriptionfaktoren der RNAP II

TFIID besteht aus dem TATA-Bindeprotein und TAFs

TAFs sind TBP-assoziierte Faktoren mit unterschiedlichen Funktionen: - TAF1 und TAF2: Erkennung von Inr-Elementen (wichtig in Promotoren ohne TATA-Box) - TAF1: Phosphorylierung und Acetylierung von Histonen - TAF6 und TAF9: Erkennung von DPE-Elementen

- TAF4 (und andere): Interaktion mit stromaufwärts gebundenen Transkriptionsfaktoren

TBP ist das TATA-Bindeprotein: - bindet an die TATA-Box in der kleinen Rinne und krümmt die DNA - ist mit den TAFs assoziiert

C

N

+1

TBP-DNA-Komplex

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Aufbau des Prä-Initiationskomplexes (PIC)

1. Bildung des DAB-Komplex

2. Rekrutierung von RNAP II und TFIIF

3. Rekrutierung von TFIIF und TFIIH

4. Entwindung der DNA und Phosphorylierung des CTD (Ser 5 in YSPTSPS)

5. Übergang zur Elongation

Die Initiation der Transkription erfordert zusätzliche Faktoren

•  Mediator stellt Verbindung zwischen CDT und Aktivatoren her •  Chromatin-Remodelling-Maschinen und Chromatin-Modifizierende Komplexe verändern die lokale Chromatin-Struktur und Zugänglichkeit

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Regulation der Transkriptionsinitiation

In vivo wird der Prä-Initiationskomplex durch weitere Faktoren reguliert :

- Gen-spezifische Regulator-Proteine (Transkriptionsfaktoren) binden an stromaufwärts

gelegene Sequenzen und regulieren die Ausbildung des PIC durch direkte oder indirekte

Interaktion mit der RNAP II.

- Der Mediator-Komplex aus ca. 25 Proteinen vermittelt zwischen Regulator-Proteinen und

und der RNAP II.

- Chromatin-Remodeling-Komplexe und Histon-Acetyl-Transferasen (HAT) ermöglichen

oder verhindern den Zugang zur DNA.

Elongation Während der Elongation koordiniert der CTD wichtige Aktivitäten: - Interaktion der RNAP mit Elongationsfaktoren für Phosphorylierung des CTD an Ser 2 und für RNA-Korrekturlesen (TFIIS). - Interaktion der entstehenden Prä-mRNA mit Faktoren der RNA-Prozessierung

Capping Enzyme: - RNA-Triophosphatase - Guanyltransferase - Methyltransferase

Komponenten der Splicing-Maschine

TFIIH p-TEFb (positive transcription elongation factor b)

Phosphorylierung

CTD

Interaktion

Polyadenylierung: - CPSF: AAUAAA-Erkennung und Schneiden - Poly(A)-Polymerase: Poly(A)n-Synthese

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CAPPING

Addition von 7-Methyl-Guanosin

1: Abspalten des g-Phosphats vom 5´Ende der mRNA (RNA-Triphosphatase)

2: Übertragung GMP (Guanyltransferase)

3: Methylierung Guanin (Methyltransferase)

Polyadenylierung

Zwei Komplexe werden durch den CTD der Pol II eigebracht: CPSF (cleavage and polyadenylation factor) CstF (Cleavage stimulation factor)

- CPSF und CstF binden a Poly- Signal-Sequenz und schneiden mRNA

- Poly-A Polymerase synthetisiert poly- A-Sequenz

- poly-A-Bindeprotein bindet an poly-A-Sequenz

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Elongation durch Nukleosomenstruktur wird durch FACT (facilitates chromatin transcription) ermöglicht

FACT entfernt ein H2A-H2B Dimer VOR der Polymerase und assembliert das Histon NACH der Polymerase wieder

Termination

- kein Rho-ähnlicher Faktor bekannt - nach erfolgter 3'-Prozessierung synthetisiert die RNAP II weiter und beendet die Transkription oft erst hunderte von Basenpaaren weiter stromabwärts!!!!

Was beendet die Termination?

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1. Theorie (Torpedo-Modell) Eine 5'-3'-Ribonuclease (Hefe: Rat1; Mensch: Xrn2) bindet nach der 3'-Prozessierung an die zweite mRNA (nun ohne Kappe) und baut sie ab, was die Termination einleitet ("zieht" die RNA aus RNA-Pol II !?)

Termination

2. Theorie Transfer der Prozessierungsenzyme vom CTD zur mRNA führt innerhalb der RNAP II zu einer konformationellen Änderung, welche die spontane Termination begünstigt.

Termination

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Transkription durch RNA-Polymerase I - RNAP I ist auf die Transkription von rRNA-Genen spezialisiert - Transkription findet im Nucleolus statt - rRNA-Gene kommen in Batterien von mehreren hundert Kopien vor - rRNA entspricht bis zu 80% der Gesamt-RNA einer Zelle.

transkribiert NTS

18S 28S 5.8S

Transkription

18S 28S

Prozessierung

transkribiert NTS transkribiert NTS

Transkription durch RNA-Polymerase I

•  RNAP I Promotor besteht aus zwei Elementen •  Promotor ('Core') von Position -45 bis +20 •  'Upstream Control Element' (UCE) von Position -180 bis -107.

transkribierte Region Promotor UCE

UBF

UBF UBF = Upstream Binding Factor = Aktivator

SL1

SL1 SL1 besteht aus TBP (TATA-Bindeprotein) und 3 TAFs und bindet an das Kernelement

RNAP I

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Transkription durch RNA-Polymerase III

RNAP III ist zuständig für die Synthese kleiner RNAs - tRNAs - 5S rRNA - bestimmte snRNAs

RNAP III-transkribierte Gene sind über das gesamte Genom verteilt

Box A Box B

tRNA-Gene besitzen intragene Kontrollelemente

Transkription von tRNA-Genen

Box A Box B

Transkriptionsfaktor TFIIIC bindet an BoxA und BoxB

TFIIIC TFIIIB

Transkriptionsfaktor TFIIIB besteht aus TBP und TAFs

RNAP III

RNAP III

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Die Rolle von TBP

Vermutung: die drei eukaryotischen RNA-Polymerasen stammen von einem gemeinsamen Vorläufer ab, der bereits TBP verwendet hat.

Ein TBP-ähnliches Protein ist essentiell für die Transkription in Archaeen!