GeneticaMicrobiana B

8/18/2019 GeneticaMicrobiana B

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Recombinación

La recombinación esel proceso por el quela informacióngenética se veredistribuida, tras latransferencia dematerial genéticoexterno al interno.

La recombinaciónpermite intercambiar

grandes conjuntos degenes, suministrandouna fuente devariación y selecciónpara la evolución,más rápida que la

mutación.


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Recombinación homólogaImplica la ruptura física y posterior unión de hebras de ADN de forma talque se intercambia el contenido de ADN resultando en dos hebrasdistintas.

• Ocurre en zonas con alta homología en sitios distintos del genoma.• Permite reparar cromosomas dañados durante la replicación(mantenimiento de información).• Depende de la intervención de un equipo enzimático característico,en el que la proteína RecA (o equivalente) es central en el proceso.


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• Ruptura de la hebra(endonucleasa).• Proteínas de unión a ADNss.• Invasión del extremo 3’OH en

zonas de homología (helicasa).• RecBCD en E. coli (endonucleasay helicasa).• Unión de RecA (invasión).• Movimientos de la horquilla derecombinación.• Intermediario de Holliday.• Resolución de la cruz de Hollidaypor resolvasas (cortan y pegan).• Productos: parches o empalmes.

Mecanismo de recombinaciónhomóloga


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• RecA se une a una simple hebra y una doble hebra.

• La formación de una triple hélice permite identificar la región dehomología

Mecanismo de recombinaciónhomóloga


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Recombinación específica(no-homóloga)

• Recombinación específica ilegítima: fenómenos de transposición~ No depende de homologías.~ Es independiente de RecA.~ El elemento transponible codifica para la transposasa.~ Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un mecanismoreplicativo.

• Recombinación específica legítima(conservativa)~ Requiere cortas secuencias dehomología (sitio-específica), que sonreconocidas por proteínas específicas.~ Es independiente de RecA.~ Típica la integración de fagos en sitiosconcretos del genoma de bacteriashospederas.


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Aplicaciones de la genéticamicrobiana


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Modificación deplantas


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Producción de insulina


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X-galβ -Galactosidase is an enzyme thathydrolyzes lactose to glucose and alsoacts broadly on allyl and alkyl β -D-galactosides. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β -D-galactopyranoside (X-Gal),which is a substrate of β -galactosidase, is hydrolyzed togalactose and 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole by the action of theenzyme. 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole generated by thereaction is oxidized and converts to5,5’-bromo-4,4’-dichloroindigo, whichforms a blue insoluble precipitate. Thechromogenic signal of the precipitate

offers the detection of the enzymaticactivity with high sensitivity. Thus, X-Galis widely used for assays, for example,color selection (Blue-white selection) ofgenetically-modified organisms with anintroduced lacZ gene, in molecular

biology, biochemistry, andhistochemistry.

http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/

category_index/00317/


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X-gal

http://info.agscientific.com/blog/bid/174211/19-X-GAL-Facts-and-Uses-You-Should-Know

http://www.scq.ubc.ca/wp-content/plasmid2text.gif


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Luciferase substrateLuciferase is an enzyme that catalyzesluminescent reactions in bioluminescentorganisms. Luciferase from the beetlecatalyzes the two steps of luciferinoxidation in the presence of ATP, Mg 2+,and oxygen molecules. The beetle's

bioluminescence system, for example,the rey system, is applied to theanalysis of biological materials at theforefront of life sciences. For instance,the transcription activity of a specialgene in cells is frequently assayed as an

index for analysis and evaluation of thetoxicity or medicinal e ! ect ofchemicals.As the method of measuring genetranscription, i.e., gene expression assay(reporter assay) system, luciferase is an

important tool in today's life sciences.http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/category_index/00317/


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Luciferase reporter vector• Reporter Construct

The Luciferase Reporter Vectorshave been specially constructed toreport the binding activity of a singleTF. Multiple copies of the cis-actingenhancer element have beeninserted into each vector upstreamof a minimal TA promoter and theTATA box from the Herpes simplexvirus thymidine kinase promoter. Thispromoter sequence drivesexpression of the luciferase gene(luc). The backbone of the vectorcontains an ampicillin resistancegene for cloning purposes, an originof replication, and an f1 origin forsingle-stranded DNA production.

• Vector Map

http://www.isogen-lifescience.com/luciferase-reporter-vector


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Luciferasa usos

Luminómetro (URL)Tabaco transgénicomostrando luminiscencia


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Mutación

• Mutacionesespontáneas . Se danmanera natural porradiaciones, radicalesde oxígeno y porreplicación.

• Mutaciones

inducidas . Songeneralmenteproducidas pormutágenos o agentesfísicos.

Es una modificación heredable en la secuencia de bases del genoma.


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Fenotiposbacterianos

Utilización de fuentes de carbonoy energía . Capacidad de las

bacterias para utilizardeterminados sustratos como

galactosa (gal -/gal +),lactosa (lac -/lac +), etc.

Resistencia/Susceptibilidad .Capacidad de crecen en

presencia de inhibidores, como

antibióticos como estreptomicina(str R/str S), ampicilina (amp R/amp S),kanamicina (kan R/kan S), etc.

Otras características comomorfología colonial y pruebas

bioquímicas también se emplean.

Las cepas silvestres son protótrofas (crecimiento en medio mínimo), sepueden identificar mutantesauxótrofas incapaces de sintetizaralgún metabolito esencial, por lo queeste debe ser añadido al mediocomo biotina (bio -), arginina(arg -),

metionina (met-

), etc.


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Mutaciones

• Mutaciones puntuales. Un par de basesremplaza a otro.

Transiciones , una pirimidina (o purina) essubstituida por otra. C por T ó A por G .

Transversiones , una pirimidina esremplazada por una purina o viceversa.C(T) por A o G ó bien A(G) por C o T .

• Mutaciones por inserción. Adición debases a una secuencia.

• Mutaciones por deleción. Pérdida debases en una secuencia.


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Mutaciones (consecuencias)

Mutaciones silenciosas . Proteínas completas con aa iguales.

Mutaciones de cambio de sentido . Proteínas completas con aaincorrectos.

Mutaciones sin sentido . Terminación temprana por aparición de un

triplete de terminación.

Mutaciones polares . Ocurren en un operón por una mutación sinsentido, afecta la síntesis de proteínas alejadas.


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Mecanismos pre replicativos• Reparación fotoenzimática

(fotorreactivación)•

Reparación por escisión y resíntesis

Mecanismos post replicativos• Reparación posterior a la replicación• Reparación por recombinación• Reparación inducible propensa a error

(SOS)

Mecanismos de reparación delos fotoproductos del ADN


19/46Nature Reviews Microbiology 4, 826-836 (November 2006)


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Fotorreactivación• Sistema de reparación directa de losdaños producidos por la luz UV(200-300nm). La luz UV produce dímerosde pirimidinas, fundamentalmentedímeros de Timinas.

• El enzima Fotoliasa codificada por elgen phr reconoce en la oscuridad losdímeros de Timina y se une a ellos, ycuando se expone a la luz (mediante un

fotón) deshace el dímero de Timinas.

Moat, 2003

Nature 421, 436-440 (23 January 2003)


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Reparación por escisión denucleótidos

• La Endonucleasa UvrABC esuna escilnucleasa codificadapor los genes uvrA, uvrB y uvrC que corta el ADN.

• La Helicasa II de ADN separalas dos hélices y retira 12nucleótidos.

• La ADN polimerasa I rellena elhueco producido por laHelicasa II y la Ligasa sella losextremos.

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm


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Reparación post replicativa

• Reparación posterior ala replicación

• Reparación por

recombinación

Nature 421, 436-440 (23 January 2003)


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Reparación de apareamientosincorrectos

La reparación deapareamientosincorrectos posterior a lareplicación requiere laexistencia de un sistemaque sea capaz de realizarlas siguientes operaciones:

• Reconocer las bases malapareadas.• Determinar cual de lasdos bases es la incorrecta.• Eliminar la baseincorrecta y sintetizar.

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm


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Reparación por recombinación• Cuando la ADN-polimerasa-IIIbacteriana se encuentra, en la cadenaque está usando como molde, con undímero de pirimidina, deja de replicar esazona, y salta unos 1000 nucleótidos másadelante para seguir la replicación y dejauna mella de unos 1000 nucleótidos.

• Esta discontinuidad (llamada mella postreplicativa) se puede rellenar por elmecanismo de reparación porrecombinación general, recurriendo a la

proteína RecA, que verifica unarecombinación con la hebra parentalhomóloga intacta.

http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/Topics/Repair.html


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Mecanismo de la reparaciónpor recombinación

• El extremo 3'-OH libre de la cadenadañada sirve de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevousando como molde la cadenacomplementaria intacta del dúplex.

• Ligación e isomerización espontáneas, queproduce la estructura de Holliday.

• Resolución de los dos sobrecruzamientos

por sendas roturas y religaciones, lo cualgenera dos dobles hélices ininterrumpidas.Como se ve en la figura, uno de estosdúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otroes una doble cadena intacta, aunque partede ella contiene ADN de nueva síntesis.

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=10760&pid=10026


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Reparación SOS

• Cuando la ADN polimerasa IIIencuentra un dímero de Timina (T)producido por luz UV no sabe quenucleótido poner saltando la región ydejando un hueco.

• Como consecuencia esa regiónqueda como ADN de hélice sencilla.

• Debido a que la luz UV producemuchos dímeros de Timina, se produceun bloqueo en la replicación y para

evitar que la célula muera y puedareplicarse se dispara el sistema deemergencia SOS.


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Reparación SOS• El ADN de hélice sencilla activa a la

proteína RecA que a su vezinteracciona con la proteína LexA. Laproteína LexA es un represor de losgenes uvrA, uvrB, uvrD, sulA y sulB .Todos estos genes tienen en elpromotor una secuencia denominada

caja SOS.• La proteína LexA normalmenteimpide la transcripción o expresión delos genes citados anteriormente, perocuando interacciona con la proteína

RecA deja de impedir la expresión deestos genes, pudiéndose sintetizar lasproteínas correspondientes y repararlos daños producidos por la luz UV.


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Reparación SOS


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Ames Assay

The suspected mutagen is mixed with the homogenate, where it ismetabolized to its reactive form, and then an appropriate tester

strain of Salmonella typhimurium is added to the mix. Theactivated mutagen enters the bacterium and reacts with DNA tocause mutations; mutations in the operon for histidine biosynthesisthat restore function ("reversions") allow the bacterium to grow onhistidine-deficient medium, and result in visible colonies on the

assay plate.

The greater the number of colonies, the moremutagenic the chemical

In a standard Amesassay a rat liverhomogenate is used toprovide thecytochromes P450

necessary for activationof mutagens to theirreactive forms.


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Control de la Transcripción • Sistemas inducibles . Cuando el sustrato sobre el que va actuar la enzimaprovoca la síntesis del enzima. Al efecto del sustrato se le denominainducción positiva . Al compuesto que desencadena la síntesis del enzimase le denomina Inductor .

Los sistemas inducibles se corresponden a procesos catabólicos de

degradación, por ejemplo, el operón lactosa, el operón arabinosa, eloperón maltosa. Se trata de sistemas enzimáticos encargados de degradar la lactosa, arabinosa, maltosa, etc.

• Sistemas represibles . cuando el producto final de la reacción que catalizael enzima impide la síntesis de la misma. Este fenómeno recibe el nombre

de inducción negativa . Al compuesto que impide la síntesis del enzima sele denomina correpresor .

Los sistemas represibles se corresponden con procesos síntesis oAnabolismo, por ejemplo el operón triptófano y el operón histina. Se tratade las rutas metabólicas que conducen a la síntesis de triptófano y síntesis

de histidina.


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Control Positivo y control Negativo • Control positivo . Se dice que un sistema está bajo control positivocuando el producto del gen regulador activa la expresión de los genes,actúa como un activador .

• Control negativo . Se dice que un sistema está bajo control negativocuando el producto del gen regulador reprime o impide la expresión delos genes, actúa como un represor .

The Nobel Prize in Physiology or Medicine1965 was awarded jointly to François Jacob,André Lwoff and Jacques Monod "for theirdiscoveries concerning genetic control ofenzyme and virus synthesis" .

François Jacob Jacques Monod


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Elementos del OperónUn Operón es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por los mismos

elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores.• Los genes estructurales llevan información para polipéptidos. Se trata de los genes cuyaexpresión está regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, sonpoligénicos o policistrónicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo geneestructural. Los operones eucarióticos suelen contener un sólo gen estructural siendomonocistrónicos.

• El promotor (P) se trata de un elemento de control que es una región del ADN con una secuenciaque es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentrainmediatamente antes de los genes estructurales.

• El operador (O) se trata de otro elemento de control que es una región del ADN con unasecuencia que es reconocida por la proteína reguladora. El operador se sitúa entre la regiónpromotora y los genes estructurales.

• El gen regulador (i) secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que reconoce lasecuencia de la región del operador. El gen regulador está cerca de los genes estructurales deloperón pero no está inmediatamente al lado.

• Proteína reguladora. Proteína codificada por el gen regulador. Está proteína se une a la regióndel operador.

• Inductor . Sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes.


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Operón Lac


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Genesestructurales

• El gen z+ . Codifica para la ! -galactosidasa que cataliza la hidrólisis dela lactosa en glucosa más galactosa.

• El gen y+. Codifica para la galactósido permeasa que transporta ! -galactósidos al interior de la célula bacteriana.

• El gen a +. Codifica para la tiogalactósido transacetilasa que cataliza latransferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de unaceptor tiogalactósido. Este gen no está relacionado con elmetabolismo de la lactosa, sino en el metabolismo de ciertos ! -

galactósidos diferentes a la lactosa.


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Operón Lac

Sin lactosa


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Operón Lac

Con lactosa (alolactosa)


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Efecto de la glucosa

• AMPc• CRP (Receptora de AMPc o proteína

activadora de catabolitos)

En un medio sin glucosa pero conlactosa los niveles de AMPc son altos.

La proteína CRP tiene sitios de uniónpara el ADN y para el AMPc. Elcomplejo AMPc-CAP se une a unazona cercana al promotor lac, yfavorece la unión de la ARNpolimerasa al promotor, aumentando

la transcripción hasta 50 veces. Se hademostrado que el AMPc y la CAPcontribuyen a al iniciación de latranscripción, ayudando alreconocimiento del sitio de iniciaciónpor la ARN polimerasa.


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Mutantes• Mutantes constitutivos . Son aquellos en los que siempre se expresan otranscriben los genes del operón lactosa, independientemente de si está ono está presente el inductor.

• Mutantes del Promotor (O O). Estos mutantes presentan una alteración enla secuencia de bases nitrogenadas de la región promotora, como

consecuencia la ARN-polimerasa no reconoce la secuencia promotora y,por consiguiente, no se produce la transcripción de los genes estructurales.

• Los mutantes que afectan a la adenilato ciclasa , enzima que transformael ATP en AMPc, muestran niveles muy bajos de expresión de los genes deloperón lactosa, debido a que los niveles de AMPc son muy bajos enausencia de glucosa.

• Los mutantes que afectan a la proteína CRP o CAP también presentanniveles muy bajos de expresión de los genes del operón lactosa enausencia de glucosa.


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Operón de Triptófano• El operón triptófano (operón trp) es un sistema de tipo represible, yaque el aminoácido triptófano (Correpresor) impide la expresión de losgenes necesarios para su propia síntesis cuando hay niveles elevados detriptófano. Sin embargo, en ausencia de triptófano o a niveles muy bajosse transcriben los genes del operón trp.

• Genes estructurales . existen cinco genes estructurales en el siguienteorden trpE-trpD-trpC-trpB-trpA .

• Elementos de control. promotor (P) y operador (O). El promotor y eloperador están al lado de los genes estructurales y en el siguiente orden:P O trpE-trpD-trpC-trpB-trpA . Las enzimas codificadas por estos cincogenes estructurales actúan en la ruta metabólica de síntesis deltriptófano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en elcromosoma.


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Operón de Triptófano

• Gen regulador trpR. Codifica para la proteína reguladora. Este gen seencuentra en otra región del cromosoma bacteriano aunque no muylejos del operón.

• Correpresor : triptófano.


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Sin triptófano


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Con triptófano

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