TEMA 17

GENÉTICA MOLECULAR

1.- EL ADN COMO MATERIAL HEREDITARIO

El DNA fue aislado y estudiado por primera vez por el suizo Friedrich Miescher en 1869.

Hacia 1890, el químico alemán Albrecht Kossel, hidrolizó el ácido nucleico, descubriendo la existencia de hidratos de carbono y de unos compuestos o bases nitrogenadas a las que dio los nombres de "adenina", "guanina", "citosina" y "timina".

En 1911, el bioquímico estadounidense de origen ruso, Theodore Leven, demostró que los hidratos de carbono eran pentosas

Poco después, el británico Alexander R. Todd sintetizó nucleótidos en situaciones controladas

1928 F. Griffith, trabajando con dos cepas de neumococos, una de envoltura lisa y otra de envoltura rugosa obtuvo la primera evidencia de que el ADN era el material hereditario

Cuando Griffith mezclaba bacterias rugosas vivas con bacterias lisas muertas y esta mezcla se inyectaba en ratones, de éstos se obtenían bacterias lisas vivas, lo cual sólo se podía explicar si algo de las lisas muertas había pasado a las rugosas vivas y las había transformado. La cuestión era averiguar la naturaleza de ese "algo".

No sería hasta 1944 cuando Avery, McLeod y McCarthy repitieron los experimentos de Griffith y demostraron que el "Principio transformante" que convertía a las bacterias rugosas en lisas era, precisamente, el DNA, descubrimiento que marcó un hito importante en la historia de la Genética.

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Otro experimento que apoya al ADN lo realizan Hersey y Chase en 1952 usando virus bacteriófagos marcados con un isótopo de fósforo (32P), que es un elemento del ADN y con un isótopo de azufre (35S), elemento de las proteínas

2.- CONCEPTO MOLECULAR DE GEN

Los estadounidenses, George W. Beadle y Edward L. Tatum, trabajando con hongos filamentosos, como Neurospora y Penicillium, descubrieron que los genes dirigían la formación de las enzimas a través de los polipéptidos que las constituyen, de tal forma que cada polipéptido está producido por un gen específico

Este descubrimiento fue el origen de la hipótesis UN GEN = UNA ENZIMA.

Posteriormente , puesto que no todas las proteínas son enzimas y que algunas proteínas están formadas por más de una cadena polipeptídica, la hipótesis se transformó en UN GEN=UNA CADENA POLIPEPTÍDICA

Un GEN se define como la unidad mínima de información genética

En procariotas prácticamente todo el ADN se emplea como información para la síntesis de proteínas, y el gen codificador se compone de una secuencia continua de nucleótidos

En eucariotas:- Existe un exceso de ADN, sólo el 10% se emplea para codificar proteínas

- Casi la mitad del ADN es altamente repetitivo ( parece estar relacionado con la estabilidad de la estructura de los cromosomas

- Es frecuente que un gen esté constituido por varios fragmentos de DNA separados por secuencias sin sentido que no codifican ninguna proteína. A las partes con sentido que sirven para fabricar la proteína se les llama EXONES, y a las partes sin sentido intercaladas en el gen INTRONES, que deben ser eliminados tras la transcripción.

3.- LA TRANSMISIÓN DE LA INFORMACIÓN: EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍALos problemas que se plantearon, una vez conocida la estructura del ADN, fueron: ¿cómo se transmite la información de una a la siguiente generación celular? y ¿cómo el ADN puede dirigir la construcción y el funcionamiento de un ser vivo?La respuesta constituye lo que hoy se llama el dogma central de la biología. El ADN es capaz de autoduplicarse antes de una división celular mediante un proceso de replicación además, transmite su información a una molécula de ARNm por el proceso de transcripcióny el ARNm lo transmite a una secuencia de aminoácidos de una proteína en el proceso denominado traducción

Este "dogma" se ha completado con dos nuevos procesos como son la transcripción inversa y la autorreplicación del ARN ambos encontrados en ciertos grupos de virus que tienen como material genético ARN y no ADN.

4.- LA REPLICACIÓN DEL ADN

El primer proceso necesario para la transmisión de la información genética es su duplicación, es decir, la realización de una copia que pueda ser transportada por los gametos hasta la fecundación y luego pueda ser utilizada por el nuevo individuo.

La REPLICACIÓN es el proceso por el cual el DNA se copia para poder ser transmitido a nuevos individuos. Ocurre en la fase Sde la interfase

Con el modelo de la doble hélice de Watson y Crick se desarrolló la idea de que las hebras originales debían servir de patrón para hacer la copia, aunque en principio había tres posibles modelos de replicación:

Modelo conservativo: Proponía que tras la replicación se mantenía la molécula original de DNA intacta, obteniéndose una molécula idéntica de DNA completamente nueva, es decir, con las dos hebras nuevas.

Modelo semiconservativo: Se obtienen dos moléculas de DNA hijas, formadas ambas por una hebra original y una hebra nueva.

Modelo dispersivo: El resultado final son dos moléculas nuevas formadas por hebras en las que se mezclan fragmentos originales con fragmentos nuevos. Todo ello mezclado al azar, es decir, no se conservan hebras originales ni se fabrican hebras nuevas, sino que aparecen ambas mezcladas.

Meselson y Stahl demostraron en 1958 que el modelo válido era el semiconservativo. Para ello utilizaron nucleótidos marcados con nitrógeno pesado.

Aunque existen pequeñas variaciones entre procariotas y eucariotas, el mecanismo básico es bastante similar:

Aunque existen pequeñas variaciones entre procariotas y eucariotas, el mecanismo básico es bastante similar

1.- Inicio de la replicación: Comienza en ciertas zonas del ADN donde existen determinadas secuencias de nucleótidos (ORIGEN DE REPLICACIÓN).

En primer lugar interviene una enzima helicasa que separa las dos hebras del ADN al romper los puentes de hidrógeno entre bases complementarias

Cuando la doble hélice se rompe se produce un desenrollamiento en esa zona que crea unas tensiones. La acción de enzimas como las girasas y las topoisomerasas evitan esas tensiones

Las proteínas SSB se unen a las hebras molde e impiden que se vuelvan a enrollar

En el lugar origen de la replicación se ha formado una burbuja de replicación en el que hay zonas con forma de Y denomindas horquillas de replicación, donde se van a sintetizar las nuevas hebras en ambos sentidos por ello decimos que la replicación es bidireccional

2.- Formación de las nuevas hebras:El proceso se lleva a cabo mediente la enzima ADN polimerasa III que presenta las siguientes características:

a) Necesita una hebra molde de ADN que recorre en sentido 3’-->5’

b) Une los nucleótidos en sentido 5’-->3’

c) Utiliza nucleótidos trifosfato, los cuales proporcionan al mismo tiempo la energía necesaria para la unión

d) No puede comenzar la síntesis por misma, pues sólo puede añadir nucleótidos sobre el extremo 3’ libre de una cadena polinucleótida. Por este motivo es necesario que exista una cadena corta de ARN, denominada ARN cebador o primer. Este primer es sintetizado por la enzima primasa que utiliza ADN como molde para sintetizar ARN

Dado que el ADN polimerasa recorre la hebra molde en sentido 3’-->5’ la síntesis de un de las hebras es continua y se le denomina hebra conductora o líder. Sin embargo en la otra cadena ( antiparalela) ; el ADN no puede unir los nucleótidos en ese sentido.

La síntesis en este caso es discontinua y se realiza en fragmentos separados; esta cadena se le denomina hebra retardada y a los segmentos se les denomina fragmentos de Okazaki.Cada fragmento requiere de un ARN cebador

La enzima ADN polimerasa I elimina después los ARN cebadores de ambas cadenas ( actividad exonucleasa) y ella misma se encarga de rellenar el hueco dejado

Posteriormente tras la eliminación de los ARN cebadores, los fragmentos se unen entre sí gracias a la acción de enzimas ligasas

3.- Corrección de errores:

Participan varias enzimas: Endonucleasas que detectan los errores y cortan la cadena anómala; Exonucleasas que eliminan el fragmento incorrecto; ADN polimerasas que sintetizan la parte del segmento eliminado( ADN polimerasa I ; que tb tiene una actividad de exonucleasa); ADN ligasas que une el nuevo segmento al resto de la cadena

Las diferencias entre el proceso en procariotas y en eucariotas son:

a) Como el ADN de eucariotas está asociado con histonas; al replicarse éstas deben sintetizarse. Se ha comprobado que las histonas viejas se mantienen en la hebra conductora; mientras que las nuevas se unen a la hebra retardada

b) El tamaño de los fragmentos de Okazaki es menor en eucariotas que en procariotas

c) Existen tres ADN polimerasas en procariotas y cinco en eucariotas

d) La replicación en procariotas tiene un único origen ( oriC) mientras que en eucariotas existen múltiples. Cada unidad de replicación se denomina replicón

e) La velocidad de replicación en cada replicón es menor en eucariotas que en procariotas

El proceso de replicación del ADN se va completando hasta llegar al telómero. Cuando se elimina el último ARN cebador, la hebra retardada quedará incompleta ya que el ADN polimerasa no podrá rellenar el hueco por no tener un extremo 3´ libre

Este hecho hace que el telómero se vaya acortando un poco cada vez que la célula se divide , fenómeno que se asocia con el envejecimiento y muerte celular

5.- TRANSCRIPCIÓNLa transcripción del DNA es un mecanismo fundamental para el control celular y para la expresión de la información genética. Este mecanismo permite que la información del DNA llegue al resto de orgánulos celulares y salga del núcleo en el caso de los eucariotas. Para ello esa información debe copiarse en forma de ARN.

La TRANSCRIPCIÓN es el proceso de copia de un gen o fragmento de ADN utilizando ribonucléotidos y originándose diferentes tipos de ARN

Ocurre en el núcleo en eucariotas y en el citoplasma en procariotas.

Para realizarlo se necesita:

a) un cadena de ADN que actue como molde. La otra no se transcribe ( hebra informativa)

b) ARN polimerasas; en procariotas sólo interviene 1 mientras en eucariotas intervienen 3: ARN polimerasa I (formación de ARNr) ; II ( formación de ARNm) y III (ARNt y ARNr)

c) Ribonucleótidos trifosfato

El mecanismo de transcripción consta de tres etapas: iniciación, elongación y terminación tras ellas viene una etapa de maduración

1.- INICIACIÓN

En procariotas la ARN polimerasa se une a un cofactor ; cambia de conformación lo que permite su unión a una región del ADN llamada promotor, la cual posee una secuencia TATAAT ó TTGACA.

Una vez fijada la ARN polimerasa el cofactor se libera y se produce el desenrollamiento de la doble hélice En eucariotas para el ARNm la ARN polimerasa II se une a una zona del ADN llamada promotor (posee secuencias CAAT y TATA); pero no necesita cofactor

2.- ELONGACIÓN

En procariotas la ARN polimerasa recorre la hebra de ADN hacia su extremo 5´ sintetizando una hebra de ARNm en dirección 5´-3´

En eucariotas . Al poco ( 30 ribonucleótidos )se añade una caperuza (metil-guanosín trifosfato) al extremo 5´

3.- TERMINACIÓN

En procariotas presenta dos variantes. En una interviene un cofactor "p" y en otra no interviene dicho cofactor. El proceso finaliza al llegar a una secuencia palindrómica rica en G y C (zona llamada operador) y que da lugar a un bucle que favorece la separación del ADN . El ADN vuelve a su forma normal y el ARNm queda libre.

En eucariotas la señal de terminación parece que está relacionado con la secuencia TTATTT. Ahora interviene un poli-A polimerasa que añade una cola de poli-A al pre-ARNm (ARNhn)., que parece que interviene en los procesos de maduración y transporte

4.- MADURACIÓN

En procariotas si lo que se forma es un ARNm no hay maduración, pero si se trata de un ARNt o ARNr hay procesos de corte y empalme.

En eucariotas se produce en el núcleo y la hace un enzima llamada RNPpn ( ribonucleoproteína pequeña nuclear) , El proceso se denomina splicing y comienza cuando las secuencias intrónicas forman unos bucles y se eliminan los intrones formados. Posteriormente las ARN ligasas empalman los exones (E) y forman el ARNm.Un mismo gen puede madurar de diferentes maneras dependiendo de cómo se eliminen los intronesEl ARN t también se produce en el núcleo; mientras que el ARNr se produce en el nucleolo

Los retrovirus son virus ARN, envueltos, que atacan a células eucariotas. Contienen transcriptasa inversa . Este enzima actúa por un mecanismo inverso a la transcripción normal, pues usando como molde al ARN viral genera ADN bicatenario,

6.- CODIGO GENÉTICOUno de los grandes misterios, una vez descubierto el ARNm, era comprender cómo la información del ADN se transformaba en una secuencia de aminoácidos en un polipéptido. Surge la necesidad de un código genético a modo de diccionario que establezca la relación entre la información del ARNm (sobre la base de 4 nucleótidos con bases diferentes) y el lenguaje de las proteínas (escrito con 20 aminoácidos distintos).

Después de muchos estudios (1955 Severo Ochoa y Grumberg; 1961 M.Nirenberg y H. Mattaei) se comprobó que a cada aminoácido la corresponden tres bases nitrogenadas o tripletes (61 tripletes codifican aminoácidos y tres tripletes carecen de sentido e indican terminación de mensaje).

El código genético presenta las siguientes características:

Es universal, pues lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo existen algunas excepciones en unos pocos tripletes en bacterias, protozoos y mitocondrias

Está degenerado, pues hay varios tripletes para un mismo aminoácido, es decir hay codones sinónimos.

.No presenta imperfecciones,no es ambiguo, pues cada triplete tiene su propio significado y sólo uno Todos los tripletes tienen sentido, bien codifican un aminoácido o bien indican terminación de lectura.

Carece de solapamiento,es decir los tripletes no comparten bases nitrogenadas; no existen espacios ni comas.. Es unidireccional, pues los tripletes se leen de manera continua en el sentido 5´-3 desde el codón de iniciación al de terminación

7.- TRADUCCIÓN.

La TRADUCCIÓN es el proceso de síntesis de proteínas llevado a cabo en los ribosomas, a partir de la información aportada por el RNA mensajero que es, a su vez, una copia de un gen.

Las proteínas de los seres vivos se fabrican en los RIBOSOMAS, orgánulos celulares que se encuentran en el citoplasma de los procariotas y en eucariotas, asociados al retículo endoplasmático.

Elementos que intervienen en la traducción

RNA-m, RNA-t.

Ribosomas.

Aminoacil RNA-t sintetasa, translocasas, peptidasas.

GTP, factores de iniciación y terminación.

Aminoácidos.

En el proceso de traducción intervienen de forma fundamental los tres tipos más frecuentes de ARN:

RNA-mensajero (RNA-m): es el encargado de transportar la información genética desde el núcleo hasta los ribosomas con el fin de que pueda ser expresada en forma de proteínas.

RNA-ribosómico (RNA-r): forma parte esencial de las dos subunidades que constituyen los ribosomas.

RNA-transferente (RNA-t): juega un papel fundamental transportando a los aminoácidos hasta los ribosomas en el orden correcto en que deben unirse para formar una proteína determinada, según la información genética.

Los RNA-t son cadenas cortas de ribonucleótidos arrolladas en el espacio de tal forma que se produce apareamiento entre bases complementarias que quedan próximas. Se origina así una configuración espacial en forma de "hoja de trébol", con cuatro brazos o bucles de RNA no apareado que cumplen diferentes funciones:

BRAZO ACEPTOR, formado por los extremos 3' y 5' de la cadena que se encuentran próximos. En el extremo 3’ es donde se unirá el aminoácido que debe ser transportado hasta el ribosoma.

BRAZO AMINOACIL RNA-t SINTETASA o TFIC, que interacciona con la enzima que va a unir al RNA-t con su aminoácido específico.

BRAZO ANTICODÓN: Es el más importante porque gracias a él el RNA-t se une a un aminoácido específico, según la secuencia de cada codón del RNA-m. El anticodón es una secuencia de tres bases complementaria de un codón o triplete de bases de un RNA-m. Según cual sea el codón, entrará al proceso de traducción un RNA-t u otro diferente. Es frecuente que la tercera base del anticodón sea una base rara (pseudouridina, metil guanosina, dihidrouridina, etc.)

El mecanismo de la traducción es muy semejante en eucariotas y procariotas. Antes de comenzar los aminoácidos deben estar activados

Activación de aminoácidos: Cada RNA-t busca a su aminoácido específico según el triplete de su anticodón y se une a él por la acción de una enzima específica llamada aminoacil RNA-t sintetasa, que une al aminoácido con su RNA-t en el brazo aceptor, gastándose una molécula de ATP. De este modo, un gran número de transferentes se encuentran unidos a su aminoácido antes de iniciarse la traducción. La unión se realiza entre el grupo carboxilo del aminoácido y el grupo OH del extremo 3’ del ARNt

1.-Iniciación. En eucariotas comienza por el triplete iniciador del ARNm (AUG), que está próximo a la caperuza 5'. Este triplete va precedido de la secuencia AGGAGG (secuencia de Shine-Dalgarno ) que es la zona de unión con el ribosoma.

Se forma el complejo de iniciación con los factores de iniciación (FI) y la energía suministrada por el GTP, la subunidad menor del ribosoma reconoce la caperuza y se une al ARNm en la zona próxima al triplete o codón iniciador.

Esta caperuza aporta el ARNt iniciador que a su vez aporta el aminoácido metionina. Este ARNt contiene un triplete complementario al AUG, es decir el UAC, llamado anticodón (la proteína sintetizada contiene en su extremo el aminoácido metionina)

Una vez encajado el ARNt-metionina, se liberan los FI y dejan paso a la subunidad mayor del ribosoma, formandose así el ribosoma completo y funcional. En él hay dos sitios claves:

.- Sitio P (sitio peptidil) ocupado por el ARNt-metionina

- Sitio A (sitio aminoacil) que está libre para recibir un segundo ARNt (sólo el que su anticodón coincida con el del codón del ARNm) cargado con un nuevo aminoácido

En procariotas los factores de iniciación son diferentes y el primer aminoácido no es la metionina sino la formil-metionina

2.- Elongación de la cadena peptídica: es un proceso catalizado por el enzima peptidil transferasa, el cual, mediante enlaces peptídicos va uniendo aminoácidos a la cadena peptídica. El nuevo aminoácido entra en el sitio A. Se produce el enlace peptídico. A continuación se produce la liberación del ARNt y la translocación del ribosoma , es decir el desplazamiento del ribosoma a lo largo del ARNm en sentido 5’-->3’ y el nuevo peptidil ARNt pasa al lugar P y así sucesivamente

3.- Terminación de la cadena peptídica: ocurre cuando aparece uno de los codones de terminación ( UAA,UAG,UGA ). En este momento un factor proteico de terminación (RF) se une al codón de terminación e impide que algún ARNt con otro aminoácido (ARNt-aminoacil) se aloje en el sitio A. En este momento se produce la hidrólisis de la cadena peptídica y se separan las dos subunidades del ribosoma.

A medida que se van sintetizando las proteínas adquieren la estructura secundaria y terciaria que les corresponde

Tanto en procariotas como en eucariotas, si el ARNm que se tiene que traducir es lo suficientemente largo , puede ser leído por más de un ribosoma a la vez, formando un polirribosoma o polisoma

En procariotas, al no haber división entre núcleo y citoplasma, la traducción es simultanea a la transcripción: el ARNm comienza a traducirse antes que termine la transcripción

•En eucariotas: se almacenan generalmente en el lumen del RER. Luego maduración en Golgi.