Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ; Science...
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Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila
Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ;Science 287, 1837 (2000)
INTRODUCTIONVisée de l’article
Introduction
• Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC
• Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie
• Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype
• Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain
DESCRIPTION DE LA MÉTHODEDescription et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln
Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln
• Lignées comportant des polyCAG– 20 répétitions : lignée 20Q (normales)– 127 répétitions : lignée 127Q (augmentées)
• Après traduction des ARNm, obtention de polyglutamines de ces 2 types
• Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux
Rappel : Mutagénèse par élément PPied P
w+
Site de clonage
Pied P
Origine de réplication
AmpiR
Plasmide avec Elément P
Transposase
Source de Transposase
A Pw-
Embryon de drosophile
Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques
Lignée UAS-polyCAG
5’ 3’
Poly CAG Promoteur UAS HA
Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile
• Insertion d’un élément P contenant :– Promoteur UAS– Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions)– Séquence codant pour un épitope de
l’hémagglutinine (HA)
Lignée GMR-Gal4
• Insertion d’un élément P contenant : – Promoteur GMR (expression au niveau des yeux)– Séquence GAL4 codant pour la protéine GAL4
5’ 3’
GAL 4 Promoteur GMR
Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile
Croisement des 2 lignées
• Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique)
• Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil.
• Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4
5’ 3’
Poly CAGPoly CAGUASUAS HAHA
5’ 3’
GAL 4GAL 4GMRGMR
Facteur de transcription spécifique de l’œil
Transcription de GAL4
Protéine Gal4
ARNm Gal4ARNm Gal4
Traduction de l’ARNm Gal4
Induction de la transcription
Induction de la transcription
Poly CAGPoly CAG HAHAARNm
Transcription
Traduction
Polyglutamine avec épitope HA
RÉSULTATSElaboration des lignées transgéniques poly-Gln
Phénotypes obtenus après croisement
• Lignées 20Q : [sauvage]• Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines]
Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODECriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs
Création des lignées transgéniques à testée
• 7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes)
• Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes.
• Croisement avec les lignées 127 Q
RÉSULTATSCriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs
Lignées intéressantes
Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve :• 29 lignées « Enhancer »• 30 lignées « Suppresseur »
• On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220
TECHNIQUES D’OBSERVATION
Mise en évidence des différents phénotypes
• Aspect extérieur : microscopie optique, et MEB
• Immunohistologie et observation microscopique : DAPI et FITC
Microscopie photonique
Microscopie électronique à balayages
FITC (Fluorescein isothiocyanate)
DAPI (Di aminido phényl indol)
Résultats
Lignée EU3500
• Code pour HDJ1 (en 3’ de EU3500) : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain
• Domaine J en NH2 terminal (jonction)
Lignée EU3220
• Code pour DTPR2 (en 3’ de EU3220) : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2)
• Domaine J en COOH terminal
DISCUSSION
Implication du domaine J
• Responsable la suppression• Domaine présent sur les HSP• Etudes complémentaires in vitro : domaine J
supprime les agrégations par fixation des protéines agrégées
• Ici dHdj1 ou dtpr2 se lieraient donc aux polyglutamines pour les empêcher de former des agrégats
CONCLUSION
Gènes suppresseurs déterminés
• Croisement de mouches présentant un phénotype à supprimer, par des mouches possédant chacune un élément P différent
• Détermination des descendants présentant un phénotype supprimé
• On peut déterminer quel gène est impliqué dans la suppression du phénotype mutant
Vers un traitement?
• Agrégats de polyglutamine = gain de fonction• On ne peut pas insérer un gène pour le
traiter : thérapie génique impossible• On pourrait tenter de surexprimer un gène
pour supprimer le phénotype. Problème : pléiotropie
• Difficile
THE END