GEN MUTASYONU ve DNA ONARIMIkisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Moleküler Biyoloji/6-Gen... ·...
Transcript of GEN MUTASYONU ve DNA ONARIMIkisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Moleküler Biyoloji/6-Gen... ·...
1. Gen mutasyonlarının sınıflandırılması1. Mutasyonun nasıl oluştuğuna göre2. Mutasyonun yerine göre3. Moleküler değişimin tipine göre4. Fenotipteki etkisine göre
2. Kendiliğinden oluşan mutasyonlar sebepleri3. Tetiklenmiş mutasyonların sebepleri4. Mutasyon tanısı5. Mutasyonların araştırmalarda kullanımı6. DNA onarımı
Konular
1. Mutasyonların sınıflandırılması
3
• Mutasyon, DNA dizisindeki değişiklik olaraktanımlanabilir.
• Mutasyon:
• Tek bir baz çifti değişiminden,
• Bir silinme ya da
• Bir veya daha fazla baz çiftinineklenmesinden oluşabilir.
4
• Mutasyonlar fenotipte değişikliğe yol açabilir ya da açmayabilir.
• Organizmanın karakteristiklerini değiştirme derecesi, mutasyonun nerde olduğuna ve mutasyonun geni ne denli
değiştirdiğinin derecesine bağlıdır.
• Mutasyonlar somatik hücrelerde ya da eşey hücrelerinde
olabilir.
• Eşey hücrelerinde olanlar kalıtılır ve bu sebeple,
genetik çeşitlilik ve evrimin de temelini oluşturur.
1. Mutasyonların sınıflandırılması
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
5
• Mutasyonlar, kendiliğinden ya da tetiklenmiş olarak
sınıflandırılabilir
1) Kendiliğinden mutasyon genlerin nükleotid dizilerindeki
rastgele değişikliktir.
• Bu duruma herhangi bir dış etken sebep olmaz
• Hücre içi biyolojik ve kimyasal tepkimeler sonucu oluşur
• Genellikle DNA eşlenmesi (replikasyonu) sırasında oluşan hatalardır.
• Mutasyon hızı: Bir nesilde veya gamet oluşumunda bir
mutasyonun oluşma olasılığı
• Kendiliğinden oluşan mutasyonlarda mutasyon hızı için 3
genelleme:
1. Tüm canllarda mutasyon hızı oldukça yavaştır
2. Türler arasında mutasyon hızı farklılık gösterir
3. Aynı organizmada genler arasında mutasyon hızı farklılık gösterir
• Organizmalar arasındaki değişkenlik, onların hata okuma ve
onarım sistemlerinin göreceli etkinliklerinden dolayı oluşabilir.
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
Farklı organizmalar ve bunların farklı genlerinde mutasyon hızları
Hız
Hızlar faj için bir gen eşlenmesiE.coli için bir hücre bölünmesiDiğer canlılar için bir nesilde gamet oluşumu olarak verilmiştir1X10-8 = 100 milyon eşlenmede 1 mutasyon
8
2) Tetiklenmiş mutasyon, herhangi bir dış faktörün etkisi sonucu oluşan mutasyonlardır.
• Doğal ya da yapay ajanlar sonucu oluşabilir.
• Ör: UV ışınlar, kimyasallar
• Mutasyonların yapay olarak tetiklendiklerine dair örnekler:
• Hermann J. Muller, X ışınlarının Drosophila’damutasyona yol açtığını rapor etmiştir.
• Lewis J. Stadler, X ışınlarının arpa üzerinde aynı etkiyi yaptığını belirlemiştir.
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
9
Luria-Delbrück düzensiz değişim testi
• Mutasyonlar rastgele mi oluşur yoksa çevresel etkenler
sonucu uyum amacıyla mı oluşur?
• Salvador Luria ve Max Delbrück, mutasyonların rastgele
olarak oluştuğuna dair ilk doğrudan kanıtı sundular.
• deneylerini E. coli / T1 sistemi ile gerçekleştirdiler.
• T1 bakteriyofajı E. coli hücrelerin enfekte eden ve onları parçalayan bir bakteri virüsüdür.
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
10
• E. coli’nin bir büyük bir de çok sayıda küçük sıvı kültürünü
oluşturdular.
• Büyük kaptaki hücreler yüksek yoğunluğa ulaşana
kadar büyütüldü
• Küçük tüplerde 20 milyon hücre olduğunda bunları T1
bakteriyofajı içeren petri kabına ektiler.
• Büyük kaptaki bakteriler de 20 milyonluk hücreler
halinde aynı şekilde ekildi.
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
11
• Bakteriyofaj varlığında büyüyebilen bakteriler
bu faja dirençli bakteriler olacaktı
• Büyüyen koloniler sayıldı
• Mutasyonların rastgele olup olmadığı iki
hipotez altında test edildi
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
12
Hipotez 1 – Canlının uyumunu artıran mutasyon ise:
• Her petri kutusunda sabit sayıda bakteri ve faj bulunur.
• Eğer mutasyonlar ortamda faj bulunduğu için oluşuyorsa
her bakterinin direnç oluşturma olasılığı sabit bir değer
olmalıdır
• Dolayısıyla dirençli bakteri sayısında, petri kabından petri
kabına ve deneyden deneye çok az oynama olur.
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
13
Hipotez 2 – Rastgele mutasyon ise:
• Eğer mutasyonlar fajın varlığından bağımsız, rastgele olarak meydana geliyorsa bakterinin büyümesi sırasında herhangi bir
anda oluşmuş olabilirler
• Mutasyonlar büyümenin geç döneminde oluştuklarında, çok daha az sayıda dirençli hücre üreyecektir.
• Mutasyonlar büyümenin erken döneminde oluştuysa çok
sayıda dirençli koloni üreyecektir
• Bu durumda kaptan kaba ve deneyden deneye koloni sayıları
değişkenlik gösterecektir.
1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar
• Deney sonucunda 2. hipotezi doğrular şekilde kaplardaki
koloni sayıları arasında büyük farklar görülmüştür.
• Tüpten tüpe farklı zamanlarda rastgele mutasyon oluştuğunu
gösterir
• Büyük kapta büyütülen bakteriler kontrol grubunu
oluşturmuştur.
• Bu kaptaki hücreler sürekli karıştırılmış ve bakterilerin eşit
dağılması sağlanmıştır
• Dolayısıyla aynı kaptan alınarak farklı petri kaplarında faj
üzerinde büyütülen bakterilerin birbirine benzer özellikleri
göstermesi beklenir
1.2 Mutasyonun yerine göre
17
• Mutasyonlar oluştukları hücre tipi ya da kromozom bölgelerine göre sınıflandırılabilirler.
• Somatik mutasyonlar; eşey hücreleri dışında herhangi bir hücrede olabilirler.
• Eşey hücre mutasyonları, gametlerde oluşur.
• Otozomal mutasyonlar, otozom kromozomlar
üzerinde yer alan genlerde oluşur.
• X veya Y’ye bağlı mutasyonlar
18
Somatik hücrelerdeki mutasyonlar gelecek nesillere
aktarılamaz.
• Diploid bir organizmanın somatik bir hücresinde bir
otozomal çekinik mutasyon oluştuğunda bu mutasyonlaryabanıl allel tarafından maskelenir!!!
• Ancak baskın olursa veya X’e bağlı olarak erkekte oluşursa tespit
edilebilir
• Bu tip mutasyonlar da gelişim evresinde oluşursa daha fazla fark
edilebilir
• Erişkin bireylerde oluştuğunda tek bir hücredeki baskın mutasyon
diğer binlerce normal hücre tarafından yine maskelenecektir!!!
1.2 Mutasyonun yerine göre
19
Eşey hücrelerinde meydana gelen mutasyonlar
daha önemlidir çünkü yavrulara aktarılırlar
• Üstelik gametlerden köken alan bu
mutasyonlar yavru bireyin tüm hücrelerinde
görülecektir ve etkisi daha belirgin olacaktır
1.2 Mutasyonun yerine göre
1.3 Moleküler değişiklik tipine göre
20
• Nokta mutasyon
• Yanlış anlamlı (missense) mutasyon
• Anlamsız (nonsense) mutasyon
• Sessiz (silent) mutasyon
• Silinme veya eklenme
Mutasyon yokSessiz Anlamsız Yanlış anlamlı
Koruyan Korumayan
Nokta mutasyonlar
DNA düzeyi
mRNAdüzeyi
Protein düzeyi
BazikPolar
22
Bir DNA molekülünde bir baz çiftinin diğer bir baz çiftine dönüşümünokta mutasyonu olarak adlandırılır.
1) yanlış anlamlı mutasyon: Bir genin protein kodlayan kısmındakibir kodondaki bir nükleotidde nokta mutasyonu yeni bir
aminoasit oluşumuna yol açabilir
ÖR: Akondroplazi (cücelik): %80 FGFR2 geni 380 Glisin – Arjinin dönüşümü
2) anlamsız (nonsense) mutasyon: kodon, bir durdurucu kodona
dönüşür ve protein sentezinin sonlanmasını sağlar
ÖR: Marfan sendromu: Fibrillin geni tirozin – Dur kodonu dönüşümü
3) Sessiz mutasyon: Nokta mutasyonu bir kodonu değiştirir fakat
proteinin o pozisyonda bir aminoasit değişikliğine yol açmazsa sessiz
mutasyon oluşur.
1.3 Moleküler değişiklik tipine göre
23
• Gen içinde herhangi bir noktaya bir ya da
daha fazla nükleotitin girmesine eklenme,
çıkmasına ise silinme adı verilir.
• Tek bir harfin kaybedilmesi veya eklenmesi
sonraki tüm üç harfli kodonların değişmesine sebep olur buna çerçeve kayması mutasyonu
denir.
1.3 Moleküler değişiklik tipine göre
1.4 Fenotipik etkilerine göre
25
İşlev kaybı (loss of function) mutasyonu
İşlev kazancı (gain of function) mutasyonu
• Morfolojik bir özelliği etkileyen mutasyonlar
• Besinsel veya biyokimyasal etki gösteren mutasyonlar
• Davranış mutasyonları
• Öldürücü (letal) mutasyonlar
• Koşullu mutasyonlar
• Nötral mutasyonlar
1.4.1 İşlev kaybı/kazancı mutasyonları
26
• İşlev kaybı (loss-of-function) mutasyonu gen ürününün işleviniyok eden mutasyondur.
• yokluk (null) ya da nakavt(knockout) olarak bilinir.
• İşlev kaybı mutasyonlarının baskın ya da çekinik olmasıolasıdır.
• ÖR: Orak hücre anemisi
• İşlev kazancı (gain-of-function) mutasyonu yeni bir işlev kazanmasına yol açar.
• Bu mutasyonların çoğu baskındır
• ÖR: Huntington hastalığı.
Sessiz mutasyon
İşlev kaybı mutasyonuİşlevsiz protein kodlar
İşlev kazancı mutasyonuYeni bir işlevi olan protein kodlar
2. Kendiliğinden oluşan
mutasyonların sebepleri
28
1 DNA eşlenmesi hataları
• DNA polimerazlar eşlenme hatalarının çoğunu yapılarında
bulunan 3’-5’ yönünde çalışan ekzonükleazlarını kullanarak
düzeltebilmelerine karşın,
• Yanlış girmiş nükleotitler replikasyondan sonra kalabilirler.
• Bu hatalar ağırlıklı olarak nokta mutasyonlarına yol açar.
29
Nokta mutasyonlarına ek olarak, DNA replikasyonu küçük
eklenme ve silinmelere neden olabilir.
• Eşlenme sırasında kayma sebebiyle olur :
• DNA kalıbının bir zincirinin ilmik oluşturup ayrıldığı zamanveya
• DNA polimerazın kayıp yeniden başlangıç noktasına döndüğü zaman
oluşur.
• Replikasyon kayması DNA’nın herhangi bir bölgesinde olabilir.
• Fakat tekrarlayan dizilere sahip bölgelerinde ve mutasyona
daha açık olan sıcak noktalarda daha fazla görülür.
2.1. DNA eşlenme hataları
30
• Çift sarmal DNA’daki azotlu bazlardan birinin kaybolması
durumudur.
• Genellikle pürinlerde meydana gelir (adenin veya
guanin).
• Bu durum, DNA’nın bir zincirinde apürinik (AP) bölge
oluşumuna yol açar.
• Bu tip hasarların binlercesi memeli hücrelerinde bir günde oluşur
• AP bölgesi onarılmazsa DNA eşlenmesi sırasında o pozisyonda
kalıp rolü oynayacak hiçbir baz bulunmayacaktır.
• Sonuçta DNA polimeraz, bu bölgedeki nükleotitleri rastgele
yerleştirebilir.
2.2 Depürinasyon
2.3 Deaminasyon
31
• Adenin ve sitozindeki bir amino grubunun keto grubuna
dönüşmesidir.
• Sonuçta sitozin urasile ve adenin hipozantine dönüşür.
• Eşlenme sırasında her iki molekülün de baz eşleşme
özellikleri değişmiş olur.
• Deaminasyon kendiliğinden ya da nitröz asit (HNO2) gibi
kimyasal mutajenlerle muamele sonucu oluşabilir.
2.4 Oksidatif hasar
32
• Hücrelerde, normal oksijenli solunum sırasında reaktif
oksijen türleri (serbest radikaller) oluşur.
• Bu radikaller (süperoksitler, hidroksil radikalleri, hidrojen
peroksit vb.), DNA’nın yapısal bütünlüğü için tehdit
oluştururlar.
• Bu maddeler, yüksek enerjili radyasyon sonucunda da
oluşabilir.
• DNA’daki bazlar üzerinde 100’den fazla farklı tip kimyasal
modifikasyon oluşturabilirler.
2.5 Transpozonlar
33
• Yer değiştirebilen genetik elementlerdir.
• Kendiliğinden oluşan mutasyonlara neden
olurlar.
3. Tetiklenmiş mutasyonlar radyasyonveya kimyasallardan kaynaklanır
34
Yaşadığımız çevrede bol miktarda mutajen bulunmaktadır.
Doğal mutajenler;
Mantar toksinleri
Kozmik ışınlar
UV ışınları vb’dir.
Yapay mutajenler ise;
Endüstriyel kirleticiler,
Tıbbi X ışınları
Sigara dumanındaki kimyasallar vb’dir.
3.1 Baz analogları
• Nükleik asit biyosentezi sırasında
pürin ya da pirimidinlerin yerine
geçebilen mutajenik kimyasallardır.
• 5 bromourasil (5-BU), urasilin bir
türevidir.
• 5-BU timin yerine DNA’ya
girebilir.
• Diğer bir baz analoğu da adenin
yerine geçen 2- aminopurin’dir (2-
AP).
• 2-AP timin ile eşleşmeye
yatkındır. 35
3.2 Alkilleyici ajanlar
• I. Dünya Savaşı’nda keşfedilen kükürt içeren hardal gazı alkilleyici bir ajandır.
• Nükleotitlerdeki amino veya keto gruplarına CH3
veya CH3CH2 gibi bir alkil grubu ekler.
• Bu yolla oluşan 6-etil guanin, adeninin baz
analoğu gibi davranır ve timinle eşleşir.
36
3.3 UV ışınları
• Dünyadaki tüm enerji, çeşitli dalga boylarında bir seri elektromanyetik bileşenden oluşur.
• Kısa dalga boylu ışınlar yüksek enerji taşıdıklarından organik moleküllere zarar verirler.
37
3.3 UV ışınları
• UV radyasyonu, yanyana duran iki timin bazı üzerinde pirimidin dimerleri oluşturur.
• T-T dimerlerinin yanı sıra, daha az sayıda da olsa C-C ve T-Cdimerleri meydana gelebilir.
• Dimerler DNA yapısını bozar ve normal eşlenmeyidurdurur.
38
3.4 İyonize radyasyon
39
• X ışınları, gama ışınları ve kozmik ışınlar dokuların derinliklerine kadar girerler.
• Yolları boyunca karşılaştıkları moleküllerin iyonlaşmasınaneden olurlar.
• X ışınları hücreye girdiğinde karşılaştığı moleküllerin atomlarından elektron atılır.
• Böylece kararlı moleküller ve atomlar, serbest radikallere ve
reaktif iyonlara dönüşür.
3.3 İyonize radyasyon
40
• Bu reaksiyonlar DNA’yı etkileyerek nokta
mutasyonlar oluşturabilir.
• Fosfodiester bağlarını kırarak kromozom
bütünlüğünü bozar.
• Buna bağlı olarak silinmeler, yer değiştirmeler
ve kromozomal parçalanmalar oluşabilir.
4. Mutasyonların tanısı
41
• Mutasyon süreçlerini çalışabilmek için öncelikle mutasyonları tanılamak gerekmektedir.
• Bilim insanları genlerin işlevlerini anlamak için
mutasyonları incelerler
• Fakat doğada mutasyonlar nadir
görüldüğünden kendileri kimyasallarla
mutasyon oluştururlar ve bundan sonra oluşan
değişimleri normal organizmayla karşılaştırırlar
4.1 Bakteri ve mantarlarda tanı
42
• Mutasyonların tanısı haploid organizmalarda daha
kolaydır.
• Mutant hücreleri mutant olmayanlardan ayırmak içinseçilim (seleksiyon) yapılır.
ÖR: Neurospora ekmek üzerinde büyüyen pembe bir küftür.
• Normalde diploiddir ama vejetatif evrede haploid olduğu
için mutasyonlar daha kolay tanımlanabilir.
• Yabanıl tip, minimal kültür ortamında (glikoz, birkaç organik
asit, tuzlar, amonyum nitrat, biotin) üreyebilir.
• Besinsel mutantlar ise bu ortamda üreyemezler.
43
• Bu mutantlar ancak; aminoasitler, vitaminler ve nükleik asit
türevlerince desteklenmiş tam besi ortamında üreyebilirler.
• Mutant tip, her biri tek bir bileşik ilave edilmiş minimal
ortamlarda üremeye bırakılırsa, eksik olan bileşik tespit edilir.
• Bu yolla mutasyonlar tanımlanabilir.
4.1 Bakteri ve mantarlarda tanı
4.2 İnsanlarda tanı
• İnsanlar uygun deneysel organizmalar değillerdir.
• İnsanlarda mutasyona dayalı bir bozukluğun tespiti için
öncelikle soyağacı (pedigri) analizi yapılır.
• Mutasyonun kalıtımla geçtiği belirlenebiliyorsa;
• Mutant allelin baskın veya çekinik olup olmadığı veya
• X’e bağlı ya da otozomal olup olmadığı belirlenebilir.
44
4.2 Diğer teknikler
45
• Enzim aktivitesi analizi
• Jelde protein hareketliliği
• Protein ve DNA’nın doğrudan analizi
• Genomik
5. DNA onarım sistemleri
46
• Hata okuma (proofreading) ve yanlış eşleşme (mismatch) onarımı,
• Replikasyon sonrası (post-replication) onarım ve SOS
onarım sistemleri,
• Fotoreaktivasyon onarımı (bakterilerde UV hasarının geri
dönüşümü),
• Baz ve nükleotit kesip çıkarma onarımı (eksizyon),
• Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı
5.1 Hata okuma ve yanlışeşleşme onarımı
47
• Bakteri DNA polimeraz yaklaşık
olarak her 100.000 yerleştirmede bir hata yapar
• Enzim her basamakta hata okuması
yaparak hataların % 99’unu yakalar.
• Hatalı bazları tespit eder, kesip çıkararak
doğrusu ile yer değiştirir.
• Hata okuma sırasında kalan hataları gidermek için yanlış eşleşme (mismatch)
onarımı devreye girer.
• Bu sistemde de yanlış eşleşmeler tanınır,
nükleotitler kesilip çıkarılarak yenileriyle yer
değiştirilir.
5.1.2 Yanlış eşleşme onarım sistemindeproblem !
48
• Onarım sistemi, hangi zincirin doğru hangisinin yanlış olduğunu nasıl tespit edecektir?
• Zincir seçimi işlevinin, zincir üzerindeki DNA metilasyonuna
dayandığı tahmin edilmektedir.
• Yeni sentezlenmiş zincir geçici bir süre metillenmiş olarak kalır.
• Onarım enzimi bu zincire bağlanarak yanlış eşlemiş bazları
değiştirir.
• Bakterilerde bu işlem olağanüstü etkilidir, hata sıklığı bin misli azaltılır (hataların % 99.99’u)
5.2 SOS onarım sistemi
49
• E. coli’de bulunan farklı bir hasar onarım sistemidir.
• Bu tip onarım, DNA hasarına karşı son çare olduğundan SOS onarımı olarak bilinmektedir.
• Yanlış eşleşmelerin ve boşlukların bulunduğu kısımlara
rastgele ve olasılıkla yanlış nükleotitler yerleştirilir.
• Bu nedenle SOS onarımı mutajeniktir.
• Bununla beraber, hücreye, aksi halde onu öldürecek olan
DNA hasarıyla yaşama şansı verir.
5.3 Baz ve nükleotit kesip çıkarmaonarımı
50
• Tüm prokaryot ve ökaryotlarda bulunan onarım sistemleridir.
• Bozuk bölge veya hata tanınır ve enzimatik olarak bir nükleaz
tarafından kesilip çıkarılır.
• Bu işlem sırasında hatanın bulunduğu bölgedeki komşu birkaçnükleotit de birlikte kesilip çıkarılır.
• Kesilen zincirde oluşan boşluk, sağlam zincir kalıp olarak kullanılarak doldurulur.
• Bu işlem genellikle DNA polimeraz I tarafından
gerçekleştirilir.
• DNA ligaz ise en son 3’-OH ucunda kalan çentiği yapıştırır ve boşluğu kapatır.
5.4 Xeroderma pigmentosum
52
• Bireylerde ağır deri anomalilerine yol açan nadir çekinik bir bozukluktur.
• Bu bireylerde nükleotit kesip çıkarma mekanizması
çalışmamaktadır.
• Güneş ışığında bulunan UV radyasyonuna maruz kaldıklarındabaşlangıçta çillenme ve deri yaralanmaları görülür.
• Daha sonra deri kanserine kadar giden değişik reaksiyonlar
ortaya çıkar.
• Hasta ve normal bireylerden elde edilen fibroblastkültürlerinde UV ile uyarılmış lezyonları onarma yeteneği
araştırılmıştır.
• Hasta bireylerde birden fazla mutant genin olduğu tespit
edilmiştir.
5.5 Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı
54
• Buraya kadar olan kısımda DNA’nın sadece bir
zincirindeki hasarla ilgilenen onarım yollarını tartıştık.
• Ancak iyonize radyasyona maruz kalma sonucunda
DNA’nın her iki zincirinde de kırıklar meydana gelebilir.
• Bu durumda DNA çift zincir kırık onarımı (DÇK) aktive edilir.
• Bu süreç aynı zamanda homolog rekombinasyon onarımı
olarak da adlandırılır.
5.5 Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı
55
• Hasarlı DNA, hasarsız homoloğu ile rekombinasyon yapar
ve yer değiştir.
• Bu işlem için çift zincir kırığını tanıyan bir enzime ihtiyaç vardır.
• Çıkarılan hasarlı çift zincir bölgesi, hasar görmemiş kardeş• kromatit ile etkileşir.
• Bu süreç sonucunda DNA polimeraz, hasarsız DNA dizilerini
kullanarak hasarlı DNA’nın her iki zincirini de yeniden
düzenler.
• Süreç genellikle replikasyondan sonraki S/G2 fazı
sonlarında gerçekleşir.