Gıda Örneklerinde ğiştirilmiş · 2010-10-05 · poliklonal antikorlardan daha saftır....
Transcript of Gıda Örneklerinde ğiştirilmiş · 2010-10-05 · poliklonal antikorlardan daha saftır....
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması
F. Eyquem
WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION R E
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
EGIONALBÜRO FÜR UROPA
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 2
İçindekiler
Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması
Giriş 3
ELISA Tekniği 7
Deneysel 11
Kaynaklar 21
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 3
Giriş
Transformasyon sonrasında aktarılan gen tarafından sentezlenen yeni proteinin özel
immunolojik tayini, genetik olarak değiştirilmiş bitkilerin belirlenmesi için alternatif bir
yaklaşımdır. Ancak genetik modifikasyonun her zaman yeni bir proteinin
sentezlenmesini yönlendirmediği ve protein ifade seviyelerinin analiz metodları için
her zaman yeterli olmayacağı bilinmelidir. Buna ek olarak bazı proteinler bitkinin
sadece özel bölgelerinde (özel amaçlar için genellikle dokuya özel (doku hedefli)
promotörler kullanılır) ya da fizyolojik gelişimin farklı fazlarında veya belli bölgelerde
farklı seviyelerde ifade edilebilir.
En kuvvetli konstitütif promotörler kullanıldığında bile, transgenik ürünlerin ifade
seviyelerinin bitkilerde toplam çözünen proteinin yüzde 0 ile 2 arasında olduğu
belirtilmiştir (Longstaff, 1995). Birçok durumda, ifade seviyeleri (örneğin onaylanmış
GD tahıllar) üst sınır yüzde ikiden daha azdır (Hemmer 1997).
İmmunoanalizler, antikorları test maddesi olarak kullanan analitik ölçüm sistemleridir.
Antikorlar hayvanların serumundan izole edilen ve spesifik üretimlerine yol açan
(antijen) maddeye fiziksel olarak tutunan özel proteinlerdir. Antikorlar, tespiti gereken
maddeyi (örneğin CP4 EPSPS, herbisit Roundup®’a direnç sağlayan protein) fare,
tavşan gibi deney hayvanlarına enjekte ederek vücut hücrelerinin yabancı olarak
tanımladıkları bu proteine karşı antikor üretmesi ile elde edilir. Antikorlar saflaştırılır,
tespit edilebilir bir şaretleyici ile imlenir ve ilgi duyulan maddenin tayininde kullanılır.
İmmunolojik yöntemlerin geliştirilmesi için ilk koşul, tanımlanacak yeni protein için
yüksek hassasiyette antikorların bulunmasıdır. Buna ek olarak, numune ya da ilgi
duyulan proteinlerin önemli derecede parçalanmamış olması tayin için önemlidir.
Antikorlar bileşik karışımlardaki antijenlerin belirlenmesi ve nicel tespitinde biyologlar
için yüksek hassasiyetli araçlardır. Bütün immunoanalizler antikorun antijene özel
olarak bağlanması esasına dayanır.
Antikor-Antijen Etkileşimi
İmmunologlar antikorları çoklukla solüsyondaki antijenleri çöktürme özelliğine sahip
olan proteinler olarak tanımlasalar da bazı otoimmun hastalıklar hariç in vivo
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 4
koşullarda antikorlar antijenleri nadiren çöktürür. Antijenlerin belirlenmesi ve
izolasyonunda da ”çöktürme” artık nadiren kullanılmaktadır.
Antikor çöktürme reaksiyonlarının bilgilendirici değeri, Şekil 1’de gösterildiği gibi, bu
reaksiyonun antikor moleküllerinin temel ve evrensel özelliklerinin bir çoğunu
muntazam bir şekilde, bir bütün halinde ortaya koymasıdır.
Bu teknikle gösterilen bazı özellikler;
-serum IgG antikorları antijenle reaksiyonlarında bivalenttir ve farklı antijenlerle
çapraz bağlanma yapabilirler,
-antijenler antikorlarla olan reaksiyonlarında çok değerliklidir ( multivalent)
-serum antikorları doğada poliklonaldir
-antikorlar antijenleri moleküler düzeyde tanıyabilmek için çok özelleşmişlerdir.
Şekil 1. Bir antijen ve ona ait antikorun çökme grafiği
Çöken antikorun miktarının antijen derişimine karşı grafiği çizildiğinde üç bölge
görülür.
Yüksek antikor (Fazla antikor) bölgesi: çökelme önlenir ve fazla antikor
supernatantda tespit edilebilir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 5
Denge (Eşitlik) bölgesi: en fazla çökelmenin görüldüğü, antijen ve antikorun büyük
erimez yapılar (mavi ile gölgelendirilmiş) oluşturduğu ve ne antijen ne de antikorun
supernatantda tespit edilemediği bölgedir.
Yüksek Antijen bölgesi: çökelti engellenir ve fazla antijen supernatant içinde tespit
edilebilir.
Çökelme reaksiyonu poliklonal antikorlar ile çok değerlikli antijenler arasındaki
etkileşim karakterize etmek için uygundur.Antijenler aynı epitopu çoğul biçimde
taşımadıkları sürece (örneğin polisakkaritlerde bulunan tekrarlayan karbonhidrat
yapıları), monoklonal antikorlar ve antijenler arasındaki etkileşimi tanımlamak için
çökelme reaksiyonu pek yararlı değildir.Sadece bu koşullarda tek özellikli monoklonal
antikorlar bağlanarak antijeni çökertebilir. Monoklonal antikorlar, antikor-antijen
etkileşimi hakkında daha detaylı bilgi sağlayabilmek için denge sabiti, kinetik hız gibi
daha hassas ölçüm yöntemleri ile tanımlanırlar.
Yıllar boyunca geliştirilen çok hassas antikor uygulamaları göz önünde tutulduğunda,
antikorların antijenlerin izolasyonu ve belirlenmesi için ne denli yararlı bir yöntem
olduğu daha kolay analaşılır. Antikorların kullanımları antijenlere bağlanma
kapasitelerini etkilemeden, çeşitli kimyasal modifikasyon reaksiyonlarında
dayanıklılıkları ve yapısal dengelerini koruyabilme özellikle ile de yaygınlaşmıştır.
Çeşitli deneysel koşullar altında antikorlar, antijen tanımlaması ve izolasyonunu
artırmak amacı ile, kimyasal modifikasyon yöntemleri ile floresan, magnetik,
radyoaktif vb. işaretliyiciler ile antjiene bağlanma hassasiyetleri hiç etkilenmeden
imlenmiş ve kullanılmıştır.
Monoklonal antikorlar nasıl hazırlanır?
Vücuda yabancı olan maddeler örneğin hastalık yapan bakteriler, virüsler, ve diğer
enfeksiyon ajanları vücut bağışıklık sistemi tarafında istilacı olarak tanımlanır. Bu
yabancı ajanlara karşı doğal savunmamız, antijenleri tanımaya ve yok etmeye
yarayan antikorlardır.
Antikorlar iki yararlı özelliğe sahiptirler. Birinci olarak çok özelleşmişlerdir. Her antikor
özel olarak bir antijene bağlanır ve ona saldırır. İkinci olarak bazı antikorlar bir
hastalık sonucu aktive olduktan sonra bu hastalığa karşı direncin devamını sağlar.
Antikorların ikinci özelliği aşıların geliştirilmesine olanak sağlar. Aşı zayıflatılmış ya
da öldürülmüş bakteri ya da virüslerdir, vücuda verildiği zaman aşının içerdiği
antijenlere karşı antikorların üretilmesini tetikler.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 6
Antikorların özelliği olan kendine özgülük monoklonal antikor teknolojisini değerli
yapar. Antikorlar yanlızca tedavi amaçlı hastalıktan korunmak için değil çeşitli
hastalıkların tanısına, viral ve bakteri ürünlerinin ve kandaki anormal maddelerin
teşhisine de yardımcı olur.
Hastalıklara karşı savaşan maddeler olarak çeşitli kullanımları, antikorların saf
miktarlarda üretimini bilimsel incelemelerin odağı yapmıştır. Geleneksel yöntem, bir
laboratuvar hayvanına antijen enjekte edilmesi ve antikorların oluşmasını takiben bu
antikorları kan serumundan toplamak şeklindedir (antikor içeren seruma anti-serum
adı verilir). Bu yöntem ile ilgili iki problem vardır: antiserum istenmeyen maddeleri de
içerir ve elde edilen kullanılabilir antikor miktarı çok azdır.
Monoklonal antikor teknolojisi, hücrelerden doğal olarak antikor eldesi yolu ile yüksek
miktarlarda saf antikor ve hücre kültüründe sürekli büyüyebilen hücrelerin üretimine
olanak verir. Hücre ölümsüzlüğü ve istenilen maddenin üretimini birleştiren bir hibrid
oluşturulduğunda zamana karşı antikor üreten bir fabrika sahibi olunur.
Monoklonal antikor teknolojisinde, sonsuz çoğalabilen tümor hücreleri, antikor
üretebilen memeli hücreleri birleştirilir. Bu hücre füzyonunun sonucu ”hibridoma”
oluşur ve sürekli olarak antikor üretebilir. Bu antikorlar monoklonal olarak adlandırılır
çünkü tek tip bir hibridoma hücresinden gelir. Diğer yandan geleneksel yöntemlerle
üretilen antikorlar birçok hücre tipinin bulunduğu ortamlardan üretildiği için poliklonal
olarak adlandırılır. Monoklonal antikorların nasıl oluştuğu aşağıda örneklenmiştir.
Monoklonal antikor üretimi
Myeloma, hücre kültüründe sürekli olarak büyümeye adapte edilebilen bir kemik iliği
tümörüdür. Myeloma hücreleri antikor-üreten memeli dalak hücreleri ile
birleştirildiğinde, oluşan hibrid hücrelerin veya hibridomaların, çok sayıda monoklonal
antikor ürettiği gözlenmiştir. Bu hücre füzyon ürünü iki farklı hücre tipinin istenilen tüm
özelliklerini birleştirir; sürekli olarak büyüme ve yüksek miktarlarda saf antikor üretimi.
Seçilen hibrid hücreler tek bir antikor ürettikleri için, geleneksel yöntemlerle üretilen
poliklonal antikorlardan daha saftır. Hastalıklarla savaşta geleneksel ilaçlardan daha
etkilidir. Çünkü ilaçlar yalnızca yabancı maddeye değil vücut hücrelerine de saldırırlar
ve bazen alerji gibi istenmeyen yan etkilere de neden olur. Monoklonal antikorlar ise
çok az ya da hiç bir yan etki olmadan sadece hedef moleküle saldırır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 7
ELISA Tekniği
Enzim Bağlı İmmunosorbent Analizi: Bir immunosorbent (katı bir desteğe bağlı
antijen veya antikor) ve enzim bağlı bir immunoreaktant (tepki veren) kullanılan bir
enzim immuno analizidir. Çeşitli yöntemler (örn işaretlenmemiş bilinmeyen ile işaretli
reaktant arasındaki yarışçı bağlanma) bilinmeyen derişimleri ölçmek için kullanılır.
ELISA (Clark ve Adams 1977) yönteminde antijen ve antikorlar arasındaki özel
etkileşim esastır. ELISA’daki anahtar ayraç moleküller, antijen adı verilen yabancı
maddelere karşı vücut bağışıklık sistemi tarafından üretilen anitkor adı verilen
çözünür proteinlerdir. GDO’ların belirlenmesi durumunda bu antijen, genetik
modifikasyon sonucu sentezlenen yeni protein olabilir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 8
ELISA deneysel safhada yeni aktarılan gen tarafından sentezlenen protein ifade
seviyesinin belirlenmesinde kullanılır. Bu nedenle, özel antikorların üretimi ve
kullanımı ile ilgili bilgiler transgenik bitkilerin geliştirilmesi ile ilgili pek çok makale de
bulunabilir (Mohapatra ve ark. 1999).
Onaylanan genetiği değiştirilmiş tahıllarda kullanılan transgenlerin ürünleri olan
proteinlere karşı kullanılabilecek özgün antikorlardan sadece bir kaçı ticari olarak
mevcuttur. Buna örnek olarak nptII gen ürününe (npt II ve APH(3’)II) ve gus gen
ürününe karşı olan antikorlar örnek verilebilir.
ELISA testi 3 farklı yöntemle gerçekleştirilebilir:
Roundup Ready® soya için özel bir belirleme yöntemi olarak ELISA’ya bağlı yeni bir
teknik geliştirilmiş, test edilmiş ve onaylanmıştır (Lipp ve ark. 2000).
Yöntem, Roundup Ready® soyada herbisite karşı direnci sağlayan protein CP4
EPSPS enzimine (5-enolşikimat-3-fosfat sentaz) (Agrobacterium sp. Suş CP4) karşı
özel antikorların kullanımına dayanır (Padgette ve ark. 1995). İlk sonuçlarda bu
yöntem (ticari ELISA kiti ile) kullanılarak ham soyada (işlenmemiş) GDO varlığı %0,3
ve %0,5 arasındaki derişimlerde belirlenebilmiştir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 9
Prensip
CP4 EPSPS proteinin belirlenmesi için direkt sandviç enzime-bağlı immunosorbent
analizi (ELISA) aşağıda gösterilen şekilde kullanılmıştır.
Bir mikrotitre plağının yüzeyi özel monoklonal antikor ile kaplanmıştır.
İlgilenilen numune uygulandığında, yüzeye tutunmuş olan antikor özel antijenine
bağlanır. Bağlanmayan moleküller yıkama ile ortamdan uzaklaştırılır.
Yıkamadan sonra, CP4 EPSPS proteinin ikinci bir antijenik bölgesine özelleşmiş olan
ve yaban turbu peroksidaz enzimini (HRP) kovalent bağlanmış olarak taşıyan
poliklonal antikor eklenir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 10
İkinci yıkamadan sonra, peroksidaz enzim aktivitesi için tetrametilbenzidin (TM)
kromojeni eklenir. Yaban turpu peroksidaz, antijen derişimiyle doğru orantılı olan bir
renk sinyali üretir. Renk sinyalini durdurmak için durdurma sıvısı eklenir. Elde edilen
renk 450 nm dalga boyunda ölçülür.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 11
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Deneysel
(GDO Gıda içeriği testi, soya kit kullanıcı rehberi (1999) Strategic Diagnostics Inc.,
Rev. 052099, vers, 1.8)11
Giriş
Aşağıdaki protokol soya unu veya soya protein izolatları ve ham (işlenmemiş)
tarımsal ürünlerde bulunan Roundup Ready® soyada ifade edilen CP4 EPSPS
proteinin belirlenmesi için kullanılan ELISA yöntemini açıklamaktadır.
Yöntem hiç işlenmemiş ya da çok az işlemden geçmiş CP4 EPSPS proteinin
bozulmadığı örneklerde çalışılabilir. Örneğin gıdaların işlendiği çok yüksek sıcaklıklar
yöntemin protein tayini becersini etkileyebilir. Elde edilen veriler, güvenilir protein
tespiti için işlem sıcaklıklarının 65°C’den yüksek ve sürelerinin 60 dakikadan fazla
olmaması gerektiğini belirtmektedir.
Bu yöntem, CP4 EPSPS proteinin tayini için onaylanmıştır ve özel referans materyali
kullanılarak numune içinde %0,3 – 0,5 aralığı içinde bulunan proteinlerin miktarının
(derişimlerinin) belirlenmesinde kullanılabilir. Değiştirilmiş bir protokol kullanılarak
%0,05’den %0,3’e kadar olan daha düşük seviyelerde de kullanılabilir.
Malzemeler
15ml polipropilen konikal santrfüj tüpleri
12x75 mm cam test tüpleri
Sera film veya aliminyum folyo
Plastik band (manuel yıkama için) ya da otomatik plak yıkayıcı
Yıkama şişeleri, örn. 500 ml
20µl- 500 µl aralığında hassas pipetler
Vorteks karıştırıcı
Ağırlık dengeleri
Spatulalar
0,01 g hassasiyette terazi
5000- 10000 rpm aralığına sahip santrifuj 1 Bu bölümde bahsi geçen kit, kurs düzenlediğinde ve bu kitap hazırlandığında ticari olarak erişilebilen bir kittir. JRC ve WHO herhangi bir ticari marka kiti tavsiye etmemektedir.
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 12
450 nm dalga boyunda absorbans okuma kapasitesine sahip mikrotitre plak
okuyucu
37°C de sabitlenebilen inkubatör
450µm aralıklı filtre veya eşdeğeri
150µm aralıklı(100 meş) filtre veya eşdeğeri
Çok kanallı pipet, örneğin 50µl ile 300µl aralığında (opsiyonel)
Çok kanallı dağıtım için sıvı reservuarları (opsiyonel)
Otomatik plak yıkayıcı (opsiyonel)
Tüp taşıyıcı raf (15 ml santrifüj tüpleri için) (opsiyonel)
Kimyasallar
Genel
Analiz esnasında aksi belirtilmedikçe, deiyonize veya saf su ve tanımlanmış analitik
derecedeki kimyasallar kullanılmalıdır.
Belirlenmiş performans ölçütlerinden sapmalar kimyasalların stabilitesindeki
eksiklikten kaynaklanabilir. Eğer substrat içeriği şeffaftan maviye dönüştüyse, bu
kimyasal atılmalıdır. Bulanık tampon solüsyonları kullanılmamalıdır.
Bütün kit maddeleri 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit içindeki maddelerin
kullanım süreleri “son kullanma tarihi” biçiminde belirtilmiştir. Hızlandırılmış stabilite
testleri 2°C ile 8°C arasında test kitinin kullanım süresi 9 ay olarak belirlemiştir.
Antikor konjugatı ”soya konjugat” stok solüsyonu ve antikor konjugat çalışma
solüsyonu kitin kullanım süresinin sonuna kadar 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.
Seyreltilmiş çalışma yıkama tamponu yaklaşık 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit
son kullanım tarihinden sonra kullanılmamalıdır.
Test kitinde bulunan kimyasallar
Soya ekstrasyon tamponu, sodyum borat tamponu, pH 7.5
Soya Analiz Tamponu, PBS, Tween 20, Bovin Serum Albumin, pH:7.4
Kaplanmış şerit kuyucukları (12 şerit, her biri monoklonal antikorlarla kaplanmış 8
kuyucuğa sahip ve bir şerit tutucu)
Soya konjugatı, tavşan anti-CP4 EPSPS protein, liyofilize olmuş
Seyreltilmiş soya konjugat, %10 ısıyla inaktif olmuş fare serumu
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 13
Kromojenik madde, K-Blue TM, tetrametilbenzidin (TMB), hidrojen peroksit, temel
çözücü olarak %5 dimetilformamid
Durdurma solüsyonu, %0.5 sulfirik asit
10 kez konsantre yıkama tamponu, PBS, Tween 20, pH: 7.1
Negatif ve pozitif referans standartları
Deney
Prosedürün kısıtlamaları
Bu ELISA GDO testinin hassasiyeti CP4 EPSPS protein ifadesinin, kullanılan
referans standart içinde bulunan GDO materyalinin seviyesi ile ilişkili olduğu
numunelerle sınırlıdır.
ELISA test kiti 15°C ile 30°C arasındaki ortam sıcaklıklarında optimum performansı
vermek üzere tasarlanmıştır. En yüksek referans standartın absorbansı 0,8’den
büyük olmalı ve spektrofotometrenin lineer aralığı dışında olmamalıdır (üst sınır
spektrofotometre modeline göre değişebilir). OD değerlerinin 30°C den daha yüksek
sıcaklıklarda daha hızlı arttığını göz önünde bulundurmak gerekmektedir. Bu
nedenle, eğer sıcaklık yüksek ise substrat inkubasyon zamanını azaltmak
gerekmektedir. Düşük sıcaklıklarda (15°C’nin altında) substrat inkubasyon zamanı
arttırılmalıdır.
Numune hazırlama esnasında kontaminasyondan kaçınmak için alınması gereken
önlemler
Genel. ELISA GDO test sistemi çok düşük miktarlarda GDO kontaminasyonu
saptama kapasitesine sahip çok hassas bir tekniktir. Bu sebeple, numune serilerinin
değişimi sırasında soya numunelerini işlemek için kullanılan bütün ekipmanın
temizlenmesi zorunludur. Bu işlemlerde ilk basamak kalan materyal parçalarının
fiziksel temizlenmesidir. İkinci basamak ise alette kalabilecek GDO proteinin inaktif
hale getirmek için numuneyi alkol ile yıkamaktır.
Öğütücü temizliği. Yumuşak kıllı bir fırça ile fırçalayın. Periyodik olarak fırçayı
yıkayın ve alkol solüsyonuna batırın. Kullanmadan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak
bir havlu ile silin. Alkolü üzerine püskürterek ya da alkol içinde bekleterek yıkayın. İki
yıkama ya da püskürtme yeterlidir. Ardından su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya
bırakabilirsiniz ya da acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 14
Filtre temizliği. Filtreler soya unu ile kalıplaşma eğilimi gösterirler. Kalıplaşan
materyali temizlemek için filtreyi hızlı bir şekilde sert bir yüzeye vurun. Temiz
yumuşak kıllı bir fırçayla fırçalayın. Düzenli olarak fırçayı yıkayın ve en az 1 dakika
alkol solüsyonunda bekletin. Kullanımdan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak bir bez ile
silin.
5 dakika alkole batırın ve su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya bırakabilirsiniz ya da
acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.
Alternatif bir yöntem olarak ultrasonik banyo ve takiben kurumaya bırakmak
kullanılabilir.
Çalışma alanının temizliği. Çalışma alanının temizliği çok önemlidir. Analiz çok
hassas olduğu için çok az miktarlarda bir GDO pozitif toz kontaminasyonu bile yanlış
pozitif sonuç verebilir. Çalışma alanında soya toz kontaminasyonundan
kaçınılmalıdır. Bir önceki işlemde kullanılan soya tozunun aleti kontamine ederek bir
sonraki işlemi etkilemesine izin vermeyiniz. Numunenin ezilip hazırlandığı odanın,
analizin yapıldığı oda ile aynı olmaması optimum performans için gereklidir.
Numune hazırlanması
Laboratuar örneğinden homojen artan bir alt örnek alınmalıdır. Eğer örnek
işlenmemiş soya ise en az 500 g uygun bir öğütücüde yaklaşık 3 dakika ya da
filtreden geçecek kadar ufak olana kadar ezin. Nicel analiz için 150 µm daha küçük
partikül boyutu, nitel analiz için 450 µm’den daha az partikül boyutu elde etmek
gerekir. Kontaminasyondan kaçınmak için filtreleme basamağına dikkat edilmelidir.
Buna ek olarak, fazla ısıtmaktan da kaçınılmalıdır. Blender (parçalayıcı), örneği hem
karıştıracak hem de parçalayacaktır. Ana materyalden yaklaşık 100 gr’lık bir örnek
alınıp 450 µm’lık filtreden geçirilmelidir. Bu örneğin en az %90’ı 450 µm’lik filtreden
geçirilmelidir. Nitel analiz için bu materyal direkt olarak kullanılabilir, nicel analiz için
filtrelenen materyal tekrar 150 µm’lik filtreden geçirilmelidir. 450 µm’lik filtreden geçen
materyalin homojen olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, 150 µm’lik filtreden yalnızca
son örneği sağlayacak kadar materyali geçirmek gereklidir. Son örnek için, prosedür
için gerekli olacak miktarda materyali filtrelemek yeterlidir.
Diğer tipteki örnekler daha küçük numune miktarları kullanılsa bile aynı biçimde işlem
görmelidir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 15
Analiz işlemi
Kullanımdan önce bütün sıvıları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kaplanmış şerit
ve şerit tutucuları folyo kutusundan çıkarın. Uygun sayıda şeriti çıkardıktan sonra
folyo kutusunu mutlaka kapatın. Referans standartları ve analiz körleri için 10
kuyucuk gereklidir. Her plak kendi standart ve kontrollerine sahip olmalıdır. Normal
yıkama kullanılıyorsa yıkama basamaklarında bütün şeritleri kenarlarından tutturmak
gereklidir.
Antikor konjugatın hazırlanması
Antikor konjugat stok solüsyonu: 1ml soya konjugat çözücü, soya konjugat
viyolünee alınır. Karıştırmak için 10 sn vortekslenir.
Antikor konjugat çalışma solüsyonu: Yeniden oluşturulmuş soya konjugatından
240 µl soya konjugat çözücü şişesine geri aktarılır ve tarih atılır. 20 kez çevirerek
karıştırılır.
Yıkama tamponunun hazırlanması
10x yıkama tamponunu oda sıcaklığına getiriniz.
Çalışma yıkama tamponu hazırlamak için bu tamponu deiyonize su ile seyreltin (örn
50 ml 10x yıkama tamponu 450 ml deiyonize su içine)
Yıkama şişesine koyun (ya da otomatik yıkayıcı)
Örnek ve referans standartlarının ekstrasyonu
Örnekler, pozitif ve negatif referans standartları, aynı koşullar altında, duplike olarak
aşağıda belirtildiği gibi esktrakte edilir.
Örnekleri tartarken, her referans standartı ve örnekler artan derişimlerde sıralanır.
Her referans standartı ve örnekden 0,5±0,01 g. tartarak polipropilen santrifuj tüplerine
koyun. Kontaminasyonu önlemek için her tartıda spatulayı temizleyin. 0,5 g numune
içeren her tüpe 4,5 ml soya ekstrasyon tamponu ekleyip 10 sn vorteksleyin.
Karışımları 5000 rpm de 15 dakika santrifüjleyin. Transfer pipeti kullanılarak çökeltiye
zarar vermeden supernatantı ayırınız. Supernatantı işaretlenmiş 15 ml lik temiz yeni
bir santrifuj tüpüne alınız. Analize başlamadan önce numuneler ve referans standart
ekstraktları soya tamponu ile Tablo 1’e göre seyreltilir. Protein ekstraktları bir çalışma
gününden uzun olmamak şartı ile 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.
Tablo 1. Matrikse göre seyreltme oranları
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 16
Matriks Seyreltme
Soya fasülyesi
Soya unu
Yağı alınmış soya unu
Protein izolatı
1:300
1:300
1:300
1:10
Örnek ekstraktlarının seyreltilmesi
Ekstraksiyon yapılan negatif kontrol, ekstraksiyon yapılan pozitif referans ve her
örnek için seyreltme işlemi yapmak üzere iki adet 12x75 mm boyutlarında test tüpü
gereklidir.
280 µl soya analiz tamponunu bu tüplerden bir tanesine pipetleyin
380 µl soya analiz tamponunu diğer tüpe pipetleyin.
280 µl olan tüpü 1:15, 380 µl olan tüpü 1:300 olarak etiketleyin
Her örnekten 20 µl 1:15 olarak etiketlenmiş tüpe ekleyin ve vorteksleyin
Karıştırma sonrası 1:15 etiketli tüpten 20 µl alarak 1:300 etiketli tüpe ekleyerek
vorteksleyin
Bu basamakları her negatif kontrol, pozitif referans ve örnek ekstraktları için tekrar
edin
ELISA İmmunoanaliz prosedürü
Genel
ELISA analiz kiti 8 kuyucuklu şeritlerden herhangi biri kullanılarak çeşitli formatlarda
yürütülebilir. Rastgele yükleme şeması izlenmesi tavsiye edilmektedir.
Bütün reaksiyon kuyucukları eşli olarak yürütülmelidir. Her kuyucuk için ortalama
absorbans değerleri hesaplanmalıdır. Her yürütme tampon körü, negatif kontrol ve
pozitif referans standartlarının analizinden oluşur.
Analiz başlatıldığı zaman diğer basamaklar da ara vermeden tamamlanmalıdır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 17
Numune Eklenmesi
Seyreltilmiş ekstraktlar ve analiz tamponundan 100µl uygun kuyucuklara eklenir.
Kontaminasyonu önlemek için her pipetleme basamağında ayrı kullanılıp atılan pipet
uçları kullanılmalıdır.
Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için kuyucukların üstü sera film veya
aliminyum folyo ile kapatılır.
Örnek inkubasyonu
Mikrotitre plağı 37°C de 1 saat bekletilir.
Yıkama
300 µl yıkama tamponu ile 3 kere yıkanır.
Elle yapılan yıkama: Kuyucuklar ters çevrilerek uygun bir atık kutusuna boşaltılır.
Yıkama solüsyonu ile dolu 500ml yıkama şişesi kullanılarak her kuyucuk tepesine
kadar doldurulur. 60 sn bekletilir, daha sonra ters çevrilerek boşaltılır. Yıkama adımı
3 kez tekrar edilir. Kalan sıvıyı ve hava kabarcıkları birkaç kağıt havlu üzerine ters
yüz ederek alınır. Uygun bir bant ile şeritlerin düşmesi engellenir.
Otomatik yıkama: İnkubasyon safhasının ardından bütün kuyucukların içi mikro
kuyucuk yıkayıcısı ile aspire edilerek boşaltılır. Ardından bütün kuyucuklar yıkama
tamponu ile doldurulur. Aspirasyon ve doldurma safhaları toplam 3 kez tekrar edilir.
Son olarak mikro kuyucuk yıkayıcı bütün kuyucuklardaki sıvının buharlaşması için
kullanılır. Kalan yıkama tamponu veya hava kabarcıkları birkaç kat kağıt havlu
üzerine ters yüze ederk alınır.
Kuyucukların tamamen kurumasına izin vermeyiniz. Bu analiz performansını
etkileyebilir.
Yetersiz yıkama hatalı sonuç verebilir. Her iki yıkama yönteminde de kuyucukların
eşit miktarlarda sıvı ile yıkanması gerekmektedir.
Antikor konjugatın eklenmesi
Her kuyucuğa 100µl antikor konjugat çalışma solüsyonundan eklenir.
Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için plak örtülür.
İnkubasyon
Mikrotitre plak 37°C de 1 saat inkube edilir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 18
Yıkama
İnkubasyon safhasının sonunda tüm yıkama safhaları yukarıda belirtildiği gibi tekrar
edilir
Substrat eklenmesi
Her kuyucuğa 100 µl renk solüsyonu eklenir.
Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir.
Kromojenik substratın eklenmesi hemen yapılmalıdır.
Pipetleme safhasında aynı sıra ve zaman aralığı korunmalıdır.
Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi için güneş ışığından korunur.
Stop solusyonu eklenmesi
İnkubasyon safhasının sonunda her kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklenir.
Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir. Pipetleme
safhasında Kromojenik substratın eklenmesi ile aynı sıra ve zaman aralığı korunmalı,
ara verilmeden tamanlanmalıdır. Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi
için güneş ışığından korunur.
Absorbans okunması
450 nm’de ölçüm yapabilmek için uygun filtre takılmış mikroplak okuyabilen
spektrofotometre ile her analiz kuyucuğunun absorbansını ölçünüz.
Bütün ölçümler durdurma solüsyonu ekledikten sonra 30 dakika içinde yapılmalıdır.
Elde edilen sonuçlar kaydedilir ve ortalama absorbans değerleri hesaplanır ya da
bilgisayar programı kullanılır.
Değerlendirme
Standart eğrinin çizilebilmesi için standart değerler kullanılır. Körün değeri bütün
numune ve referans standartlarından çıkarılmalıdır. Her çiftli referans noktasından
ortalama değerler standart eğri çizmek için kullanılır. Her çiftli numuneden elde edilen
ortalama veri bu grafikten derişim hesabı için kullanılır.
Kabul/Red Kriterleri
Geçerli olabilmesi için her yürütmenin prosedürdeki kabul/red kriterlerine uyması
gereklidir. Yürütme aşağıdakilerden oluşur; analiz körü, her GDO pozitif referans
standart ekstraktı, negatif kontrol ve her bilinmeyen numune. Bütün protein
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 19
ekstraktları ve analiz körü çiftli olarak yürütülür. Eğer yürütme analiz kabul ölçütlerine
uymazsa bütün yürütme tekrarlanır.
Yürütme Ölçüt
Analiz Tampon kör A450<0,30
%0 GDO standart A450<0,30
%2,5 Referans A450>0,8
Bütün pozitif standartlar Çiftlerin CVsi≤%15
Test edilen numuneler Çiftlerin CVsi≤%20
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 20
AKIŞ ŞEMASI
Örnek ve referans ekstrasyonu için akış şeması
İşlem Hacim/Ağırlık Tanım
Tartım 0,5 g Örnekler, analiz körü ve referans standartları tartılır.
Ekleme 4,5 ml Ekstrasyon tamponu eklenir.
Karıştırma Homojen olana kadar örnek ekstrasyon tamponu ile
karıştırılır.
Santrifüj 5000 rpm Örnek 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilir
Supernatant temiz bir tüpe alınır.
Seyreltme 1:300 veya 1:10
incelenen materyale göre
Örnek veya referans standartları seyreltilir.
ELISA Immunoanaliz için Akış Şeması
İşlem Hacim Tanım
Ekleme 100 µl Örnek, referans standart ve analiz tampon körü uygun analiz
kuyucuğuna pipetle konulur.
Inkubasyon 1 saat 37°C de inkubasyon yapılır.
Yıkama 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.
Ekleme 100 µl Antikor konjugatı her analiz kuyucuğuna dağıtılır.
Inkubasyon 1 saat 37 °C de inkubasyon yapılır.
Yıkama 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.
Ekleme 100 µl Her kuyucuğa renk solüsyonu eklenir.
İnkubasyon Ortam sıcaklığında 10 dakika bekletilir.
Ekleme 100 µl Her kuyucuğa durdurma reaksiyonu eklenir.
Absorbans Ölçümü Plak okuyucuda her kuyucuğun absorbansı 450 nm de
ölçülür.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 21
Kaynaklar
Clark, M.F. and Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of
enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of
General Virology 34, 475-483.
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assesment of Tehnology Impacts of
the Swiss Priority Program Biotechnology- Report 2/97, 61 pages.
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (accessed January
2010).
Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for
detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food
fractions usig reference materials. Journal of AOAC International 83, 919-927.
Longstaff, M., Edmonds, H.S. and Newell, C.A. (1995). An improved method for he
detection and quantification of recombinant protein in transgenic plants. Plant
Molecular Biology Reporter 13, 363-368.
Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F Vanderrarend, A., and
Davey, M.R. (1999). Expression of the bar gene confers herbicide resistance in
transgenic lettuce. Transgenic Research 8, 33-44.
Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Deannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,
Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,
Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification, and
characterzation of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 1451-
1161.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 22
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12
Ek Kaynaklar
Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. and Morgan, M.R.A. (1999). Design and
development of immunoassays for detection of proteins. Food Control 10,
401-406.
Commision Directive 79/700/EEC of 24 July 1979 establishing Community methods
of sampling for the official control of pesticide residues in and on fruit and
vegetables. OJ L 239, 22.9.1979, p.24.
Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,
J.N., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for
detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase in Roundup
Ready® soybeans. Food Control 10, 407-414.
Stave, J.W. (1999). Detection of new modified proteins in novel foods derived from
GMO-future needs. Food Control 10, 367-374.
Van der Hoeven, C., Dietz, A. and Landsmann, J. (1994). Variability of organ-specific
gene expression in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 3, 159-
165.