PengantarKromatografi Gas Fase Gerak berupa Gas

Kromatografi GasI M A Gelgel Wirasuta

Kromatografi Gas-Cair (partisi) Kromatografi Gas-padat (adsorpsi)

Parameter retensiwaktu retensi tR adalah waktu yang dibutuhkan untuk mengelusi maksimum zone dihitung dari waktu menyuntikan sampel, dimana tM adalah waktu retensi suatu senyawa yang tidak ditambat oleh kolom volume retensi (VR) adalah: volume fase gerak kolom VMVR = t R F dimana F: laju aliran rata-rata gas VM = tM F VM sering juga disebut volum mati, yaitu volume minimum gas pembawa yang harus dipindahkan sebelum suatu puncak dielusi Tekanan di dalam kolom, dan Suhu dalam kolom

Baik (VR) maupun VM dipengaruhi oleh;

PengantarJika tekanan turun tiba-tiba, perlu dilakukan koreksi terhadap VR dan VM, dengan faktor j, dimanaj=3 2

Skematis Instrumen

( ) ( )Pi Po Pi Po

2 3

1 1

Pi: tekanan inlet, Po: tekanan outlet

Volum retensi koreksi (VoR) = j VR

(VoR) ini banyak digunakan untuk mengukur retensi senyawa, karena mempunyai hubungan dengan koefisien partisi senyawa dapat digunakan untuk identifikasi senyawa

Sistem injeksi sampel1.

Detektorpersyaratan:Diharapkan/diperlukan:Sensitiv (10-8 s/d 10-15 g solute/s) Beroperasi pada rentang suhu tinggi ( 1 s.d 400oC) Stabil dan reprodusible Memiliki respon linier

Injeksi langsung menggunakan semprit1- 10 l atau 10-3 l kapileri kolom

2.

Sistem pentil putar dengan sampel loop1- 10 l atau 10-3 l kapileri kolom

Dibutuhkan (keharusan)Memiliki rentang dinamik yang luas Responnya cepat Sederhana (reliabel) Non-destrutiv Respons yang seragam pada semua analit

1

Jenis DetektorDetektor konduktivitas termal (thermal condacctnIty detector, TCD)Hantaran panas gas He, H2 jauh lebih besar dari senyawa organik, senyawa organik akan meningkatkan suhu pada kawat filamen prinsip bahwa panas akan hilang dari kawat panas yang diletakkan di dalam gas dengan laju yang dipengaruhi oleh sifat dari gas. dengan mengukur tahanan listrik kawat, konduktivitas termal gas dapat diukur

Jenis DetektorDetektor ionisasi nyala (flame ionisation detector, FID). efluen dialirkan ke nyala hidrogen. Senyawa dalam efluen akan terbakar dalam nyala dan menghasilkan ion. Nyala ditempatkan diantara dua elektroda yang diberi potensial. Arus yang dibawa di antara elektroda ini oleh nyala, adalah proporsional terhadap konsentrasi senyawa di dalam efluen, sinyal listrik yang terjadi diamplifikasi dan direkam. Sifat-sifat Rugged Wide dinamic range (107) Sensitiv (10-13 g/s) Sinyal tergantung pada jumlah atom Carbon dari analit, sinyal sebanding dgn massa bukan konsentrasi Kurang sensitiv terhadap gugus: karbonil, alkohol, amin Tidak sensitiv terhadap senyawa yang tidak menyala: H2O, SO2, CO2, NOx Destruktiv

Sifat-sifatRugged (tangguh) Rentang dinamik luas (105) Non-destruktif Kurang sensitiv (10-8 g/s) Non-uniform

Jenis Detektor

Jenis Detektor lainAAS FTIR MS Chemieluminisence reaction (S)

Detektor penangkap elektron (electron capture detector. ECD),didasarkan juga pada proses ionisasi gas, tetapi dalam hal ini gas pembawa yang terionisasi, bukan senyawanya. Jika suatu molekul senyawa mengandung atom elektronegatif kuat masuk kearah efluat, elektron akan ditangkap oleh senyawa yang akan mengakibatkan berkurangnya arus latar belakang. Perubahan dalam arus ini yang memberikan sinyal pada kromatogram. Detektor ini sangat resposif terhadap molekul yang mengandung halogen dan senyawa elektronegatif lainnya, oleh karena itu banyak digunakan dalam analisis pestisida,

Sifat-sifat:Simpel dan reliabel Sensitiv (10-15 g/s) terhadap molekul elektronegativ (halogen, peroksida) Non destruktiv Tidak sensitiv terhadap: amin, alkohol, dan hidrokarbon Rentang dinamik terbatas (102)

Fase diam (Kolom)Kolom terpakPartikel-partikel silika ( 100 300 m) yang dilapisi cairan dipak ke dalam tabung gelas,baik untuk analit skala besar, tetapi lambat dan inefisien

Capillary/ open tubularWall coated (WCOT) < 1m lapisan cairan tipis dalam tabung kapiler silika Support-coated (SCOT) 30 m lapisan cairan-pendukung di dalam tabung kapilerEfisien, cepat dalam analisis, jumlah sampel terbatas

2

Fase diamFase diam cairan yang ditambatkan/ikatkan:Umumnya dgn struktur dasar polisilosan atau polietilenglikol

Elusi dengan temperatur terprogramPeningkatan pemanasan suhu kolom diprogram dengan kecepatan terntentu selama proses pemisahan Bertujuan untuk meningkatkan pemisahan dan mempersempit waktu analisis

Analisis KualitatifTerdapat dua pendekatan untuk melakukan analisis kualitatif:i) Pada khasus dimana terdapat indikasi kuat untuk mengidentifikasi senyawa yang diduga, kromatografi gas digunakan sebagai tahap untuk pembuktian senyawa kimia tersebut. ii) Indikasi suatu senyawa tidak diketahui, kromatografi gas sebagai metode untuk mereduksi sejumlah jumlah kemungkinan dengan mengkunjugasikan dengan spektrofotometer atau teknik lainnya.

Analisis kualitatifBerdasarkan parameter waktu/volum tambatPembandingan waktu tambat.Analisa dari suatu senyawa dapat dilakukan dengan membandingkan waktu tambat senyawa yang diduga dengan baku pembanding Variasi waktu tambat oleh perlakuan atau radas dalam instrumen

Waktu tambat relatifMenggunakan waktu tambat relatif senyawa yang belum diketahui dibandingkan dengan membandingkan waktu tambatnya terhadap sejumlah senyawa pembanding pada kondisi yang sama Kelemahan penggunaan pembanding antar lab yang berbeda

Indek Waktu TambatMetode berikutnya adalah metode Kovats atau indeks waktu tambat yang menggunakan n-alkana sebagai standard. Pada kondisi isotermal, logaritmik waktu tambat dari alkana adalah sebanding dengan jumlah atom C-nya. Keuntungan dari metode ini adalah relativ tidak bergantung pada laju aliran gas, persen fase diam dan panjang kolom.

Indek responmembandingkan respon relatif senyawa tersebut pada dua detektor yang berbeda

Menggunakan detektor MSPaling spesifik dan selektif

Pengantar Kromatografi KolomKromatografi kolom pertama kali dikerjakan oleh TSWETT, menggunakanglas 1- 5cm dan p= 50 100 cm fase diam partikel padat 150 200 m laju aliran < 0,1 ml/min

HPLCI M A Gelgel Wirasuta

3

Pengantar Kromatografi Kolom

Pemanfaatan Kromatografi CairTerdapat 4 jenis sistem pemisahan dalam LC/ HPLC, yaitu:Partisi adsorpsi (cair-padat) pertukaran ion, dan Permeasi gel / uklusi molekul (pemisahan berdasarkan ukuran molekul)

Waktu tambat (tR) menggambarkan lamanya suatu analit tertambat dalam kolom Faktor kapasitas (kA): digunakan untuk menggambarkan laju migrasi dari suatu analitkA = (tR-tM)/tM kA 1,0 pemisahan jelek kA > 5,0 pemisahan lambat kA diantara 1 s/d 5 pemisahan optimum = [(tR)B tM] / [ (tR)A tM] > 1 diperoleh pemisahan tM adalah waktu tambat dari eluent, dikenal juga dengan dead time

Faktor selektivitas () menggambarkan resolusi kolom

Efisiensi Kolom Kromatografi CairEfisiensi pemisahan pada kromatografi dapat dinyatakan sebagai jumlah plat teoritis (N), berhubungan dengan:L panjang plat KLT / kolom pada kromatografi kolom, dan H adalah tinggi plat teoritis (Height equivalent of one theoretical plat)H dinyatakan dengan persamaan van deemter

Faktor penting yang berpengaruh pada pelebaran pita (dalam kromatografi kolom cair)

Ukuran partikelDalam persamaan van deemter ukuran partikel akan berpengaruh pada koefisien transfer massa pada fase grak (CM) Dimana efesiensi kolom akan meningkat dengan drastis dengan menurunnya ukuran partikel

N=L

H2

t H = 16 R W H = A+ B

A = term difusi Eddy B/ = term difusi molekular C. = term ketidaksetimbangan = kecepatan arus linier fase gerak CS dan CM disebut juga koefisien transfer-massa antara fase diam dan gerak

+ C s + Cm

Faktor penting yang berpengaruh pada pelebaran pita (dalam kromatografi kolom cair)

Faktor penting yang berpengaruh pada pelebaran pita (dalam kromatografi kolom cair)Jumlah sampelTelah dibahas sebelumnya jumlah sampel juga berpengaruh pada pelebaran pita Pada k>1 semakin banyak sampel akan menurunkan efesiensi kolom (terjadi pelebaran pita) Jumlah sampel sedikit pengaruhnya pada kolom fase balik

Extra Column Band Broadening Pelebaran pita disebabkan oleh sistem pemipaan diluar kolom

H ex =

r 2 24 DM(analit

r = jari-jari pipa (cm) DM = koefesien difusi solute dalam fase mobil)

Faktor ini akan memberi masalah serius jika menggunakan small-bore colom

4

Skematis instrumen HPLCHPLC memerlukanLaju aliran yang relatif tinggi, tetapi dengan ukuran partiekel fase diam berkisar 3- 10 m Fase mobil (eluat) dipompakan dengan tekanan 1000 5000 psi untuk melawati kolom Solven harus bebas dari gas (degassed) Diperlukan sovent dengan derajat kemurniaan yg sangat tinggi

Skematis instrumen HPLC1) Resorvoar fase mobil dan sistem perlakuan solven Terdiri dari 1-4 botol yang dilengkapi dengan sistem penghilangan gas yang terlarut (biasanya oksigen dan nitrogen), Pada sistem ini degassed menggunakan sparging system, yaitu dengan mengalirkan gas inner dengan kelarutan rendah dalam solven. Gas innert akan mengusir gas yang terlarut dalam solven Serevoar lebih dari satu memungkinkan untuk melakukan elusi: isokratik dan gradien sampai campuran 4 pelarut.

Skematis instrumen HPLC2) Sistem Pompa: Membangkitkan tekanan hingga 6000 psi, Mengasilkan luaran aliran bebas denyut Aliran berkisar 0,1 s/d 10 ml per menit Kontrol aliran (reprodusibilatas relativ 0,5% atau lebih baik) Terdiri dari komponen tahan karat Sistem Pompa: Reciprokal/tandon aliran berdenyut diperlukan pulse damper/peredam denyut Keuntungan: volum internal kecil (35 400 l), tekanan tinggi hingga 10 ribu psi, baik untuk elusi gradien, aliran konstan, Kerugian: aliran denyut mengangu detektor peredam aliran Pompa semprit, menggunakan semprit besar Keuntungan aliran rata tidak berdenyut Kerigian: tandonya kecil Pompa Pneumatic: Keuntungan: murah, bebas aliran denyut, Kerugian: kapasitas dan tekanan rendah

Skematis instrumen HPLC

3) Sistem injeksi (sistem looping) Menginjeksikan sampel (5 500 l) Mikroloop (0,5 5 l)

Skematis instrumen HPLC4) Sistem Kolom: merupakan jantung kromatografi (keberhasilan atau kegagalan analitis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja) Dibagi 2 kelompok: i) Kolom analitik: garis tengah dalam 2 - 6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50 - 100 cm, untuk kemasan mikro pelikel 10 30 cm. Untuk analisis obat volume sampel yang diinjeksikan antara 20 - 50 L, mengandung 20-50 g obat. Untuk mengelusi analit diperlukan tekanan 1000 - 2500 psi dan volume elusi 50 ml. ii) Kolom preparatif ; umumnya bergaris tengah 6 mm atau Iebih besar dan panjangnya 25 100 cm. Guard Column ditempatkan sebelum kolom analitik, bertujuan untuk menjada kolom analiitik dari partikel2 kecil yang dapat menyumbat kolom analitik Kolom dapat juga dikemas/ditempatkan dalam ruang termostat untuk pengaturan suhu elusi

Skematis instrumen HPLC5) Detektor

5

Skematis instrumen HPLC5) Detektor (UV-Vis)Sumber lampu Single line (arc atau lampu hallow katode, laser) Continuum (lampu Xe atau D2) Detektor Multifotometer Diodearray fotometer

Analisis KuantitatifKromatogram memberikan informasi kuantitatifAUC pada kromatogram adalah proporsional dengan jumlah senyawa yang terkandung oleh zone yang terelusi

Analisis KuantitatifKalibrasi dengan standard eksternalSatu seri sampel yang mengandung jumlah senyawa yang hedak dianalisis dalam jumlah yang berbeda dikromatografi pada kondisi yang sama Kurva dari tinggi puncak / luas puncak versus ukuran konsentrasi sampel akan memberikan kurva kalibrasi linier. Suatu sampel yang tidak diketahui dapat dianalisis dengan mengkromatografinya pada kondisi yang sama, dan membaca jumlah komponen konsenirasi yang bersangkutan pada kurva kalibrasi. Kelemahan metode ini adalah bahwa diperlukan kondisi yang sama untuk standar dan sampel

Analisis KuantitatifKalibrasi dengan sandard internal, yang merupakan suatu senyawa yang ditambahkan pada sampelStandard internal ini harus terpisah sempurna dari semua komponen yang terdapat dalam sampel, dan mempunyai waktu tambat mendekati waktu tambat senyawa yang hendak ditentukan Kurva dibuat dari ratio As/Ais versus Ws/Wis, dimana A adalah luas puncak dan W adalah bobot, s = standard, dan is = standard internal. Dengan menambahkan jumlah standard internal yang sama ke dalam suatu rentang konsentrasi standard, kurva linier akan diperoleh dari As/Ais versus Ws/Wis karena Ais dan Wis adalah konstan pada rentang konsentrasi standard. Sampel yang tidak diketahui ditentukan dengan menambahkan suatu bobot internal standard yang sama seperti pada pembuatan kurva kalibrasi kepada sampel, campuran dikromatografi ratio luas puncak diukur, dan ratio bobot dibaca pada kurva.

6