UNIVERSIDAD AUT6NOMA DE NAYARITUNIDAD ACAD~MICADE ODONTOLOG(A

DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION

IDENTIFICACJON MOLECULAR DE Fusobacterium nucleatum EN

PACIENTES DEL POSGRADO DE ENDODONCIA DE LA UNIVERSIDAD

AUTONOMA DE YUCATAN, CON PERIODONTITIS APICAL CRONICA

TESIS

Que para obtener el grado de:

MAESTRO EN ODONTOLOGfA

Presenta:

GABRIEL ALVARADO cARDENAS

DirectoresdeTesis

. M.O. NARDA YADIRA AGUILAR OROZCO

M. EN C. SANDRA ELENA HERNANDEZ SOLis

Tepic, Nayarit, diciembre de 2010

~ ~ u_ni_ve_r_s~~-d~:-;~-,~~-;~-;:-;M-:~-3~:-;;-d:_::_;_.~_~;._:~~U DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADD ~, "' , •• ~." ••"E INVESTIGACION

Tepic, Nay'!ril, 6 dediciembrede 2010OficioNo.139/10

C.D. Gabriel Alvarado CardenasCandidatoa Maestro en OdontologiaPresente.

En virtud de haber recibido informacion de los revisores asignados por eslaComision acerca de que ellrabajo de lesis de Maeslria litulado: Identiflcacionmolecular de Fusobacterium nucleatum en pacientes del posgrado deendodoncia de la Universldad Aut6noma de Yucatan, con periodontitis apicalcr6nica, en la cual participan como Directores M.O. Narda Yadira AguilarOrozco y M.C. Sandra Elena Hernandez Soils, ha side revisada y se hanextendido en forma escrita las recomendaciones que ellos han consideradonecesarias, en nuestra caJidad de cuerpo colegiado, estamos otorgandoautorizaci6nparaqueseprocedaalaimpresiondedichotrabajo.

Una vez concluidos los tramites administralivos correspondientes. Ie serannotificados lugar, fecha y hora, donde se lIevara a cabo el examen de gradedefendiendosu tesis con replica oral

C.c.p.-InteresadoC.c.p.-Archivo

Agradezco ala Universidad Aut6noma de Nayarit por brindarrne la confianza yaceptanne

en su Programade Maestriapennitiendome crecerprofesionalmente.

A la Facultad de Odontologia de la U.A.D.Y. por todo su apoyo durante estos 2 ai'ios, asi

como aI Departamento de Microbiologia de la misma, por el tiempo y asesoria que me

brindarondurantelarealizaci6ndeesteproyecto.

A mis Directoras de tesis, M. en O. Narda Yadira Aguilar Orozco y M. en C. Sandra Elena

Hernandez Solisportodo el apoyo, respaldo ytiempo que dedicaron para elaborareste

trabajode investigaci6n.

A mi esposa Luz y mi hijo Gabriel que siempre fueron mi motivaci6n y fuente de apoyo

duranteestostiltimosai'ios.Graciasporlapacienciaylaconfianzaquemebrindaron.

A mi padre Gabriel y mi madre Addy, por todo el apoyo que me han brindado durante

toda la vida, siempre seran mis ejemplos a seguir.

RESUME

Las patologlas de origen pulpar constituyen uno de los padecimientosde mayor frecuencia

enlacavidadbucal,manifestandoseprincipalmentecomopulpitis,periodontitisoabscesos

periapicales. Una de las bacterias mas frecuentementeasociada a infecciones endod6nticas,

esFwobacteriumnuc/eatum.

ElobjetivodeesteestudiofuedeterminarlaprevalenciadeFwobacteriumnuc/eatumen

pacientesconperiodontitisapicalcr6nicaqueacudieronalPosgradodeEndodonciadela

Facultad de Odontologla de la Universidad Aut6noma de Yucatan.

El estudio fue descriptivo, observacional y transversal. Se tomaron muestras de 92

conductosradicularesydeestasen83fueposibJeextraerelDNA,alasqueselesrealiz61a

tecnica de Reacci6n en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la identificaci6n de F.

CAPITuLO

I. INTRODUCCI6N

II. MATERIAL Y METODOS

III. RESULTADOS

IV. DISCUSI6N

V. CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

pAGINA

I. INTRODUCCI6

Lasbacteriaspresentesenel interior de losconductos radiculares son laprincipal causade

patologlasperlapicales como laperiodontitis apical cr6nica. La periodontitis apica1cr6nica,

es una infecci6n endod6ntica primaria, lacua1 estAcompuestaporunamicrofloramixta

dominadaporbacteriasanaerobiasgram-negativas.Porotrolado.lasbacteriasendod6ntica

podrianestarimplicadasencomplicacionesextra-orales.comolasinusitismaxilarcr6nica,

la celulitis orbitaria, endocarditis infecciosa, la artritis reumatoide y abscesos cerebrales

{Saitoetal.2006).F. nucleatum es una de las bacterias mas frecuentementeasociadaa

infeccionesendod6nticas{Fouadetal.2oo2)yhasidoposiblerecuperarlaeneltorrente

sanguineo despues de 10 minutos del tratamiento endod6ntico (Moromi. 2004). Por otro

lado. tambien se ha visto que su asociaci6n con otras especies bacterianas como P.

gingivalis y P. intermedia en cultivos mixtos puede aumentar la patogenicidad de dichos

microorganismos (Baumgartner et ai, 2002) y que su combinaci6n con Streptococcus spp.

se asocia significativamente con la presencia de sintomas preoperatorios (Fouad et al.

2002).

Existen diversos estudios encaminados a identificar los microorganismos presentes en la

microflora endod6ntica, sin embargo. sus resultados varian considerablemente. esta

variaci6npuededeberse.almenosenparte.aladisminuci6ndelafiabilidadysensibilidad

de las tecnicasde cultivomicrobiol6gicasempleadas.

La tecmca de la Reacci6n en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un metoda de diagn6stico

molecular que permite detectartanto amicroorganismo cultivables como los nocultivables.

posee alta especificidad ysensibilidad yperrnitelaidentificaci6nnipiday precisa de una

gran variedadde especiesmicrobianas.

La literatura demuestra que es muy distinta la microflora bacteriana que se encuentra en los

diferentestiposdeinfeccionesendod6nticas,porloqueesdegranimportancialadetecci6n

eidentificaci6ndelosmicroorganismosasociadosaestasinfecciones.

En Mexico no existe a1gUn tipo de estudio mediante el uso de PCR que evidencie la

prevalencia de Fusobacterium nuclearum en dientesconperiodontitisapicalcr6nica.

Conbase en 10 anterior, surgela siguiente pregunta de investigaci6n:

i,cwu sera la prevalencia de Fusobacterium nucleatum en los conductos radiculares deUr/f:l\IMn~,:!lIJl1UL1A.1ll1II

dientesconperiodontitisapicalcr6nica?

Mlcroblologiadelaslnfecclonesendod6ntlcas

La endodoncia se define como la rama de la odontologia que se ocuiWijylR.E~Q1ft~

diagn6stico, prevenci6n y tratarniento de las enfermedades pulpares con 0 sin

complicaciones periapicales (Mondrag6n, 1995).

Entre los principalesobjetivos del tratarniento endod6ntico,estlllaelirninaci6n de todos los

microorganismos que existen en el sistema de conductos radicular y de esta forma eliminar

lainfecci6noprevenirlareinfecci6ndelosespaciospulparesydelostejidosperiapicales

(Cohen y Bums, 2002).

Diferentes estudios. mencionan a las bacterias como el principal enernigo de los

tratamientos endod6nticos, asi como la importancia de las diferentes medidas terapeuticas

para la erradicaci6n de las mismas (Cohen y Burns, 2002).

Los microorganismos que se encuentran en eltejido pulparnecr6tico se han establecido

como la principal causa de inflamaci6n periapical aguda y cr6nica. Sin embargo, pasaron

casi 200ailos antes de que los microorganismos del conductoradicularestuvieranbajo

investigaci6n biol6gica. Un estudio realizado por Miller, dernoslr6 invasi6n bacteriana

tanto en tlibulos dentinarios como en tejido pulpar necr6tico (Cohen yBurns, 2(02).

Lateoriadelainfecci6nfocal,quedatadelosailos 1920-1928,mencionaquelosdientes

infectados podrian causar infecciones en olras partes del cuerpo, asi como tambien

enfermedades sistemicas. Esto trajo consigo extracciones masivas en todo diente

sospechosodeportarinfecci6n, yretras6elorigendellratamientoendod6ntico, peroigual

trajo consigo los principios de tratamientos biol6gicamente sanos, incluyendo la

eliminaci6n de la infecci6n (Cohen y Bums, 2002).

Durante la necrosis pulpar, lasbacterias,susproductosylosmediadoresinflamatoriosse

acumulan en e1 sistema de conductos radiculares y se pueden diseminar mas aliA del

foramen apical yprovocarlesionesen lostejidosperiodontales. Debidoaqueestaslesiones

son denaturaleza inflamatoria, ysiempreestAnlocalizadasenel periApice,las infecciones

deestetiposeconocencomoperiodontitisapical(Molanderelal,1998).

La periodontitis apical posee una funci6n protectora importante y busca prevenir la

diseminaci6ndelasbacleriasysuselementosaOlrosespaciosdelcuerpo,yaquelimitala

infecci6nalespaciodelconductoradicularyprevienequesedisemine. Porlolanto,apesar

dequealaperiodontitisperiapicalseleconsideraunalesi6n,tambiendebeserconsiderada

como una irnportanle zona inflamatoria, amortiguadora y protectora. No obstante, en

ocasiones el proceso puede asociarse con sinlomas clinicos severos y, aunque es raro,

tambien puede ser una condici6n que ponga en riesgo la vida. Casi siempre, la periodontitis

apical permanecesinsintomasyporlotantonoesmuynotorioparaelpaciente, porloque

soloserareveladaporWlexamenradiograficoderutina(Molanderetal,1998).

LaperiodontitisapicalevolucionaprincipalmentecomoWlarespuestaalataquebacleriano

quesurgedeunapulpanecr6ticainfectada.Lasbacteriasinfectanlapulpadespuesdeuna

lesi6n, porlo general caries, trauma denIal 0 lesi6n iatrogernca (Silva etal,2006).

Unavezqueseestablecelainfecci6ndelconducto radicular sin tratar,perrnanececomo un

proceso cr6nico y expone al organismo de forma continua a los elementos bacterianos

(Silvaetal,2006).

En la periodontitis apical cronica el pacienle se encuentra asinlomatico, con lesion

periapicalradiograficamentevisible, confrecuenciael pacientenoreporta historiadedolor

en el diente y las pruebasde vitalidad yde preparacionde lacavidad, confirmanel eslado

necrotico de la pulpa. Ocasionalmenle, puede haber agudizacion de la lesion cronica,

causando inflamacion y dolor del area, comunmente llamado "absceso fenix" 0

exacerbacion aguda de unaperiodontilis apical cr6nica (Hashioka etal. 1992).

Un estudio report6 la presencia de un alto porcentaje de bacterias anaerobias estrictas,

demostrando la necesidad de emplear medios de cultivo adecuados y tecnicas para la

identificacion de microorganismos anaerobios para el avance del conocimiento de la

microbiologiadelsistemadeconductosradiculares(Fabriciusetal.1982).

En general, las especies mas frecuentemente encontradas en una infecci6n primaria

pertenecen al genero Bacteroides. Fusobacterium. Prevotella. Porphyromonas. Treponema.

PeptoestreptococClIS. Eubacterium. Actinomices y Streptococcus (Fabricius et al. 1982).

Existendiferentestiposdeinfeccionesendod6nticasdelsistemadeconductosradiculares.

lascualesusualmenteestAnasociadasacondicionesclinicasdistintas.Sedescribencuatro

tipos:primaria,secundaria,persistenteyextrarradicular(Siqueiraera/.2004).

Lainfecci6nprimariaes aquella causada poria colonizaci6n de microorganismos en el

tejido pulpar necr6tico. Lamicrobiotainvolucradafrecuentementedependedel tiempo de

infccci6n,aunquetarnbiensehasugeridoquepuedediferirseg6neltipodelesi6n

perirradicular asociada Mientras que un amplio rango de microorganismos se asocian a

lesiones perirradiculares cr6nicas, un grupo mas restringido de especies se asocian a

lesiones perirradiculares sintomaticas como la periodontitis apical aguda y el absceso

perirradicularagudo(Hashiokaera/.1992).

Las infecciones secundarias son causadas por microorganismos ausentes duranle la

infecci6nprimariayquehanpenetradoalsistemadeconductosradiculares,yaseaduranle

el tratarniento endod6nlico, entre citas 0 despues de haberculminado. En eslos casos. si

estosrnicroorganismoslogran sobrevivirycolonizarel sistema de conduclos, seeslablecera

lainfecci6nsecundaria(Hashiokaera/.1992).

Otro tipo de infecci6n endod6ntica es la infecci6n intrarradicular persislente. Esla es

causadapormicroorganismosinvolucradosenlainfecci6nprimariaosecundaria(Siqueria

era/,2004).

En cuanto a las infycciones endod6nticasextrarradiculares, estas pueden serprimarias,

secundarias0 persistentes. Laforrnamascomuneselabscesoperirradicularagudoyla

fuentedeinfecci6nesusualmentelainfecci6nintrarradicular.(Silvaera/.2006).

Porotrolado, sehaobservado quealgunasespeciesmicrobianassoncapacesderesistirlos

cambios de ambiente efectuados durante la terapia endod6ntica, y cuando esto sucede se

presentaelfracasodeltratamientodeconductos(Lanaeta/,2001).

Despues de Miller en 1890,sedesarrollaronmultiplesinvestigacionessobrelamicrobiota

de los conductos radiculares las cuales reportaron la presencia de numerosas especies

bacterianas. Dependiendo del medio de cultivo y las tecnicas utilizadas para la

identificaci6n bacteriana, los tipos y el nUmero de organismos aislados variaban

significativamente(Kakehashieta/.1965).

Enlasprimerasinvestigacionessereport6unapequeiiaincidenciadebacteriasanaerobias

en infecciones primarias, mientras que en estudios posteriores se inform6 de una

prevalenciadel 90% de estas bacterias en conductosradiculares infectados(Kakehashiet

a/.1965).

Las pulpas necr6ticas presentan una flora polimicrobiana caracterizada por una amplia

variedad de combinaciones debacterias, un promediode4 a 7 especiesporconducto,

predominantemente anaerobias y aproximadamenle igual proporci6n de bacterias gram-

positivasygram-negativas(Kakehashietal,1965).

Se ha demostrado una correlaci6n entre el tamalio de la lesion periapical y el nUmero de

especiesbacterianaspresentesenelsistemadeconductosradiculares.Dientescongrandes

lesiones usualmente ,alojan mayor nUmero de especies bacterianas y mayor densidad de

bacteriasenelconductoradicularqueaquellosdientesconlesionespequeilas (Kakehashi et

a/,1965).

Existenvariosfactorescapacesdeinfluenciarlacolonizaci6nmicrobianaenelinteriordel

sistema de conductos radiculares. La disponibilidad de nutrientes, la baja tensi6n de

oxlgeno molecular en pulpas necr6ticas y las interacciones microbianas pueden ser

determinantesen la ecologia del sistema de conductos radiculares (Lanaetal,2001 ).

En un estudio con ratas, se demostr6 la funci6n esencial de los microorganismos en la

patogenesis de las lesiones periapicales. Cuando las pulpas dentales de ratas gnobi6ticas

eranexpuestasalacavidadoral,laspulpaspermanecianvitaiesyningunapatologia

periapical era detectada radiognlficamente. Sin embargo, cuando los animales eran

expuestos a la flora bacteriana normal de otros animales, la pulpa se necrosaba y se

desarrollaban lesiones periapicales (Kakehashi etal, 1965).

Sundqvistdemostr6,que la periodontitis apical solo era detectable en piezas dentales que

contenian bacterias en el conducto radicular, mientras que las piezas con conductos

necr6ticosperoesterilesnopresentabanradiognlficamentesignosdepatosisperiapicalyasi

mismo encontr6 que la bacteria mas rrecuentemente aislada en conductos

Fusobacteriumnucieatum(Sundqvistetal,1989).

Lana et al. analizaron las especies involucradas en las infecciones endod6nticas. Sus

resultados mostraron el aislamiento de 308 microorganismos en 27 (87.1%) conductos

radicularesestudiados,lograndoidentificaren278(90.3%)elgeneroyespecie. Porotro

lado, tambien se observ6 que el 81.5% de los conductos mostraron infecciones

polimicrobianas,elnlimerodeespeciesaisladasencadaconductoinfectadofuedel all

especies,conunpromediode5especiesporconducto. En 88.9% de losconductos fueron

aisladosmicroorganismosanaerobiosestrictos,en51.8%anaerobiosfacultativos, en 18.5%

microaerofilicosyen7.4%delosconductosseaislaronhongos.Losautoreshacenenfasis

en la calidad polimicrobiana de 1a flora endod6ntica predominantemente mixta, con

predominiodebacilos anaerobiosgrarn-negativos (Lana el al. 2001).

EI desarrollo de tecnieas microbiol6gicas ha hecho posible el cultivo, aislamiento e

identificaci6n bacteriana. En las lesiones periapieales generalmente se presentan

infeccionespolimicrobianas,dominadasporbaeteriasanaer6biasobligadas. EI nUmerode

especiesdiferentesporeada easo es relativarnentepequeno, normalmente entredos yoeho

y praeticamente nunea mayor de veinte especies en un solo condueto (Rolph el al. 2001).

Los microorganismos presentes en conduetos infectados eomprenden un nUmero

restringido de especies eomparadas con el total delamieroflorabueal. La mayoria de las

especiesencontradasenconduetosradieularestarnbienhansidoaisladasdebolsas

periodontales, sin embargo, la microbiota endod6ntica no es tan compleja como la

periodontal(Rolphelal,2001).

Paraqueunmieroorganismopuedaestablecerseenel sistema de conductos radieulares y

consecuentementepartieiparenlaetiopatogeniadelaslesionesperirradieularesrequierede

I. El microorganismo debe presentarse en un nUmero suficiente para iniciar y

mantenerlalesi6nperirradicular.

2. EI microorgarnsmo debe poseerunamatriz de factoresdevirulencia, lacualdebe

expresarsedurantelainfecci6ndelconductoradicular.

3. EI microorganismo debe estar localizado espacialmente en el sistema de conductos

radicularesde tal maneraque sus factores de virulenciapuedan ganaracceso a los

tejidosperirradiculares.

4. EI ambiente del sistema de conductos radiculares debe permitir la supervivencia y

crecimientodeimicroorganismoyproveersei\aJesqueestimuienlaexpresi6nde

5. Los microorganismos inhibidoresdeben estarpresentes en bajo nfunero 0 ausentes

en el microambiente del sistema de conductos radiculares.

6. EI hospedero debe desarrollar una estrategia de defensa a nivel de los tejidos

perirradiculares, con la finaJidad de inhibir la diseminaci6n de la infecci6n. Este

proceso dani como resultado undaiio tisutar (Siqueira etal. 2004).

F. nucleatum, es un bacilo anaerobio estricto, Gram negativo, inm6vil, no formador de

esporas, perteneciente aJphylum Fusobacteria, que habitualmente sepresentaenlacavidad

bucaJ y ha sido frecuentemente aislado en conduclos radiculares infectados asi como

tambienenabscesosendod6nticos(Sundqvistetal.1989).

Se reportan siete tipos de Fusobacteria, sin embargo los mas comimmente aislados en

infecciones humanas son el Fusobacterium nucleatum y el Fusobacterium necrophorum

(Rogerioetal.2008).

F. nucleatum ha sido reportada como la especie encontrada con mayor frecuencia en

conductos necr6ticos y ha sido asociado a casos con sintomatologfa dolorosa y

agudizacionesendod6nticas(Fouadetal,2002).

Sehan lIevado a cabo diversosestudiosquereportan laprevaJenciade F. nue/eatum en

infecciones endod6nticas. Kantz y Henry en 1974, lIevaron a cabo una evaluaci6n

bacteriana de piezas no vitales, presumiblemente infectadas y cuya camara pulpar se

encontraba fuera de contacto con lacavidad oral. De 104 especiesanaerobias aisladas, 41

(39%) pertenecieron a Fusobacterium spp.

Sundqvist,enl976,IIev6acaboestudiosbacteriologicosenpiezasconpuipasnecroticas.

De 18 piezas investigadas, Fusobacterium nue/eatum estuvo presente en 7 (33%). Fabricius

eta/enl982,evaluaronlacomplejidaddelatlorabacterianaenabscesosagudos de origen

endodontico, mediante la identificaci6n y enumeracion de las especies predominantes. Del

total debacterias aisladas, los bacilos anaerobios grarnnegativos fueron el mayor grupo

aislado (37%). De estos, el Fusobacterium nue/eatum fue la segunda especie mas

prevaJenteconun 14%,encontrandoseen6delos 10 casos estudiados. Heimdahl,enl985,

reporto una de prevaJencia del 34% de F.nue/eatum y que su presencia pudiera estar

asociadaconlaseveridaddeinfeccionesendodonticasagudas. HaapasaJo,en 1986,realiz6

unestudio para examinarlacomposici6n de la microtlora anaerobia de cavidadespulpares

infectadas.DeuntotaldeI9casos,fueronhalladosanaerobiosestrictosen 14 (74%) yF.

nue/eatum fueencontradoen3 (16%).

Sundqvisten1994,lIevoacabounarecopilaciondelosresultadosdevariosestudios

realizados y menciona a F. nue/eatum como la bacteria mas prevalente de la micro flora de

los conductosradicuJares infectados. Lo seilala con una prevalencia del 48%.Siqueiraen

1995,report6uncasoclinicoquepresent6sintomatologiapersistente,inclusiveluegodela

instrumentaci6nymedicacionintraconducto.Elanlllisismicrobiol6gicoreve161apresencia

de F. nue/eatum como el principal agente etio16gico. En otro estudio, encontraron una

prevalencia del 26% (Siqueira y Rocas, 2004) Y Fouad en conductos radiculares

infectados con pulpa necrosada enconlr6 una prevalencia del 82% (Fouad etaf. 2002).

Porolrolado,sehavistoqueestaespecieescapazdeagruparseconOlrasbacteriasoralesy

endod6nticas yquetambienesresponsableen las etapas iniciales y finales de la formaci6n

del biofilm (Rogerio etaf. 2008).

La asociaci6n sinCTgetica del F. nucfeatum con Prevoteffa intermedia. Porphyromonas

gingiva/is y Peptostreptococcus micros puede incret:nentar su potencial patogenico

(Rogerioetaf.2oo8).

De igual forma se ha reportado que infecciones sistemicas de Fusobacterium nucfeatum en

abscesoshepaticosyartritisseptica,fuCTondeorigendental(Rogerioetaf.2oo8).

Aunque las tecnicas de cultivo para el aislamiento e identificaci6n de microorganismos

anaCTobioshamejoradosignificativamenteenlas Ultimas3 decadas, los hallazgos de los

laboratoriossondifCTentesenlreunpaisyolro(BawngartnCTetaf.2004).

Aunque estas difCTencias pueden SCT atribuidas a las difCTentes variaciones en 1a

metodologiadeidentificaci6n,sesospechadelainfluenciageograficadelacomposici6nde

la microbiota del conducto radicular, ya que F. nucfeatum ha sido enconlrado con una

prevalenciadel73%enEstadosunidosmienlrasqueenBrasildichaprevalencia es del 4%,

(Bawngartneretaf.2004).

Estoshallazgossugieren que la composici6n de lamicrobiota endod6nticaesresultadode

lainfluenciageografica(Bawngartneretaf.2004).

Unamultituddefactorespuedeinfluiren lacolonizaci6nexitosadelacavidadoral por

determinadotipodeespeciesmicrobianas, loscuales incluyenmecanismosdedefensadel

huesped,predisposici6ngeneticayfactoresambientalestalescomotipodesuminislrode

aguadelacomunidad,porcentajedepersonasdentrodelapoblaci6ninfectadasconla

misma especie, estres fisiol6gico, tabaquismo, frecuencia de visitas al dentista y

enfermedadesinfecciosas.Enadici6nlascondicionesclimatol6gicasyhllbitosalimenticios

son otras variables que pueden influir en la composici6n de la microbiota (Baumgartner el

a/,2004).

La microflora de las pulpas necr6ticas ha sido estudiada por mas de 100 aiios,

principalmente pormicroscopia directa y cultivos, de tal manera que se ticne un amplio

conocimientoacercadelacomposici6n,ecologiaypotencial patol6gicodelamicroflora

(Cohen y Bums, 2002).

Laidentificaci6ndelamicrobiotadelosconductosradicularesesimportanteparaconocer

eltipodebacteriaogrupodebacteriasquejueganunpapeldecisivoenelprogresodela

enfermedad, si son resistentes a la terapia convencional 0 bien, estar implicadas en el

fracaso endod6ntico (Petcrselal. 2002).

La introducci6n de las tecnicas de cultivo anaer6bico permiti6 conocer que las bacterias

anaerobiasestrictaseranlasquedominabanenlosconductosradicularesinfectadosyque

estaspodrianabarcarhastae190%deltotaldelaflora(Siqueiraela/.2004).

Actualmenteel usodetecnicasgenl!ticasparaladetecci6ndeestosmicroorganismosha

mostradoqueseencuenlraneneI60%dedientesnecr6ticos(Petersela/.2002).

Enlapr8cticaclinica,loscultivosdelosconductosradicularespuedenutil~para

detenninar el estado rnicrobiol6gico y para evaluar la eficacia del tratamiento antes de

obturarelconductoradicular. Sin embargo, existendiversosproblernasmetodol6gicos por

superarenelmuestreodel cultivodebidoalalocalizaci6ndelosmicroorganismosya Ia

complejidad de larnicroflora (Lana et ai, 2001).

Durante mucho tiempo, los metodos de muestreo, transporte, cultivo e identificaci6n eran

inadecuadosparalosmicroorganismosanaerobiosfacultativosyestrictos.Portanto,eran

comunesloscultivosfalsosnegativos(Lanaetal.2001).

Entrelaslirnitacionesdelcultivomicrobiol6gico,seencuentranlassiguientes:

• lmposibilidad decultivartodo tipo de bacterias, especialmente anaerobios, en un solo

mediodecultivo.Sibienlapresenciadeanaerobiosestrictosenconductosinfectados

hasidoconfirrnada, su presencia no es significativadesdeel puntodevista clinicopues

sondestruidosalserexpuestosalaireunavezquesehapenetradoenelconductoy

probablernentetambien son destruidos con lasoluci6ndehipocloritodesodiodurante

lainstrumentaci6neirrigaci6ndelconductoradicular.

• Consume mucho tiernpo. Adernas del cultivo primario se necesitan realizar olto tipo de

pruebas microbiol6gicas enzimAticas para completar la identificaci6n de los

microorganismos.Estaspruebasincluyen,elernpleodemediosdecultivosenriquecidos

ypruebasdefermentaci6ndeazueares.

Como medios de cultivos primarios para el aislamiento se recomiendan: Agar base

Shaeldler, Agar Base Wilkins Chanlgren, Agar Base Columbia entre oltos.

Noobstante,debidoaladificultaddecultivaryrecuperartodoslosmicroorganismos en

los medios de cultivo y al tiempo prolongado de las pruebas (3 semanas) para obtener

resultados,variosautoresrecomiendanel uso de tecnicas moleculares como la Reacci6n

en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Monbelli et al, 1991).

La teeniea de PCR facilita la identificaci6n de especies bacterianas dificiles de aislar

mediantetecnicasdecultivoconvencionalesyalavez,permiteevidenciaraquellascepas

bacterianas que muestran diferencias fenotipicas que se traducen en comportamientos

clinicos diversos. Otras ventajas de la PCR sobre las tecnicas de cultivQ, radican en su

rapidez, altaespecificidad ye"actitud de los resultados (Perea, 2004).

Los primeros estudios sobre la microbiologia endod6ntica, sugerian que la microflora

bacterianasepresentabaconunpredominiodeespeciesaerobiasyanaerobiasfacultativas

sobreanaerobiasestrictas (Kakehashi etal. 1965).

Tambien se seiialaba un predominio debacterias sobrehongos, de cocos sobrebacilos y

espirilos, y predominio de gram positivos sobre gram negativos, reportlindose la presencia

de Streptococcus ssp., cocos gram negativos y lactobacilos junto a una variedad de

anaerobios (que varian en su resistencia al ox.igeno atrnosferico) en un n6mero que se

suponiaeramenordel50%deltotaidemicroorganismosaislados(Linetal.1992).

LosestudiosdeSundqvist,marcanpautaenlatipificaci6ndemicroorganismosanaerobios

estrictosyanaerobiqs facultativos involucrados en las lesiones pulpares yperiapicales, con

laintroducci6ndelastecnicasdeanaerobiosis(Sundqvisl,1992).

La genetica molecular, mas recientemente empleada para la identificaci6n de pat6genos

bucales,hapermitidolatipificaci6ndecadavezmasespeciesrelacionadasalainfecci6n

endod6ntica, asl como ha conllevado a variaciones en la taxonomia microbiol6gica,

provocando cambios serios en la definici6n de la microbiota predominante en el sistema de

conductosradiculares(SundqviSI,1992).

Recientemente, han sido reportados nuevos pat6genos en infecciones endod6nticas,

posterioresalaintroducci6n de los melodos degenetica molecular (Perea, 2004).

La informaci6nobtenidaporlas multiples investigaciones ltevadas a cabo en infecciones

primarias de conductos radiculares conileva a seiialar el caractermixtoycomplejo de la

microbiota del sistema de conductos radiculares. Con el continuo avance en las tecnicas

microbiol6gicas, cada vez mas sehaceinminentelaidentificaci6ndeespeciesinvolucradas

en las infeccionespulpares yperirradiculares,asi como surepercusi6n enel mejoramiento

de laterapeutica endod6ntica (Fouad etal. 2002).

A pesarde que laperiodontitis apical cr6nica es una de las patologias periapicales mas

frecuentes, en Mexico no se tienen datos que reporten la prevalencia de Fusobacterium

nucieatumenestetipodeinfecciones.Porloquelosresultadosdeesteestudiocontribuiran

a establecer la epidemiologia de Fusobacterium nucleatum en dientes con conduclos

radiculares con periodontitis apical cr6nica de pacientes de la ciudad de Merida, Yucatan.

La identificaci6n de este microorganismo se realizara mediante la tecnica de PCR, tecnica

quedebidoasurapidez,altaespecificidad yexactitudresultauna utiI herramientapara la

identificaci6n de especies bacterianas de muy dificil 0 imposible aislamiento mediante

tecnicasdecultivoconvencionales.

Estudios de estetipo son de importanciaclinica ya que proveen bases para lainvestigaci6n

de sustancias antimicrobianas efectivas, asi como tarnbien el desarrollo de estrategias

apropiadas para a1canzar y eliminar los componentes de la microbiota del sistema de

conductosradiculares.

Objetivo

Identificar Fusobacterium nucleatum en conductos radiculares con periodontitis apical

cr6nicadepacientesatendidosenPosgradodeEndodonciadelaUniversidadAul6nomade

Yucatan empleando la teenica de Reacci6n en cadena de la polimerasa.

II. MATERIAL Y METODOS

Descriptivo,observacionalytransversal.

Defmici6n del universo

Pacientes del Posgrado de Endodoncia de la Facultad de Odontologia de la Universidad

AutonomadeYucatancondiagnosticodeperiodontitisapicaicronica.

I. Dientesperrnanentescon fonnacionradicularcompleta.

2. Pacientesque dieronsuconsentimientopara pmiciparen elestudio.

3. Tododientequepudoseraisladoadecuadamente.

Criteriosde exclusl6n

I. Pacientes con tratamiento deantibi6ticos durante los U1timostres meses

2. Pacientes con discapacidad fisicao mental.

3. Dientescon fracturaradicular.

4. Dientesconbolsasperiodontales.

5. Dientesobliterados0 con calcificaciones.

Criteriosde eliminaci6n

I.Conductosconfracturadeinstrurnentosduranteelprocesodeexploraci6n.

2. Contaminaci6n del campo operatorio durante la toma de la muestra.

Noventa y dos pacientes que acudieron aI Posgrado de Endodoncia de la Facultad de

Odontologfa de la UADY de mayo de 2009 a mano de 2010 y que presentaron piezas

dentalesalascualesselesdiagnostic6periodontitisapicalcr6nica.

Preceptosl\tlcosyrlesgos

EI paciente firm6 carta de consentimiento informado (Anexo 2). No existieron riesgos ni

paraelpacienteniparaelinvesligador.

Procedimleotoexperimental

Cultivomlcrobiaoodelacepadereferencia

Se utiliz61a cepa de referencia de F. nucleatum ATCC 25586,Ia cual fue cultivada en el

medio Agar Sangre Schaedler en condiciones de anaerobiosis a 37°C duranle48 horas

(Anexo 3, foto I). Posteriormenle se congelo para su conservacion en caldo Soya

Tripticaseinaconglicerinaal5%a-82°C.

Tomademuestradeconductosradlculares

I.Seadminislr6lalecnicadeaneslesianecesariayseaisl6eldientecondiquede hule.

2.Secoloc6malerialdeobturaci6nprovisionalprovisilparaevilarlafiltracionde saliva a

lraves del dique al area de lrabajo.

3.Paraelareadeltabajosedesinfect6eldique,lagrapaylacoronadeldiente con

per6xidodehidr6genoal30%ytinturadeyodoal5%,posterioraestoselimpi6con

hipocloritodesodioaI5.25%.

4. Se acceso ala camara pulpar con fresas de alta velocidad de fisura no.701 esteriles, sin

empleode refrigerante.

5. Sedetermin6 la longitud de trabajo con un iocalizador electr6nico apical ysecomprob6

radiogr.ificameotequeesta fueralacorrecta

6. Seinstrurnent6 sinutilizaralgunasoiuci6nirrigadora, a iongitud de trabajo hasta una

lirnamanualn6mer025tipoK.

7.Sielconductoseencontr6seco,sedeposit6soluci6nsalinaesterilparaevitarla

contaminaci6n proveniente de lacamara pulpar.

8. Las muestras seobtuvieron colocando 3 conosdepapel esteril No. 20 durante I minuto

cadaunoenelinteriordelconducto(enelmasamplio,encasodesermultirradicular)para

absorber el contenido del mismo Las puntas de papel esteriles fueron transferidas

inmediatamente a un tuba de ensayo con Tris-EDTA ImM, el cual se sello hermeticamente.

9. Losvialesconlasmuestrassecongelarona-70°Chastaelmomentodelaextraccion del

La extraccion de DNA se Ilevo a cabo mediante la tecnica de caientamiento-congelamiento.

Ei vial con las puntas de papel se descongelo a temperatura ambiente, y la mueslra se

resuspendioenelbu~erTEagitandoenelv6rtexduranteunminuto. Paraellavadodela

muestra,lasuspensionmicrobianaselransfirioauntubodeependorffysecentrifug6a

2500g(6000 rpm) durante 5 minutos. Enseguidaelprecipitadoseresuspendi6 en 200liL de

aguainyectableesteril yse centrifug6 en las mismas condiciones, estepasoserealiz6tres

veces. Despues del Ultimo lavado, el precipitado se resuspendi6 en 200IlL de agua

inyectableyseca1ent6 a 95°C pordiezminulos, inmediatamenledespues seenfri6 por

cinco minutos a -80°C. EI vial se centrifug6 a 10,000 rpm a 4°C durante 3 minutos; para

removerlosdesechoscelularesasicomolascelulasquenosehayanrolo.Elsobrenadante

fue recoJectado y se midi6 la cantidad de DNA extraido por espectrofolometria para

posteriormente ser usado como templado para la arnplificaci6n por PCR.

Identificaci6nporeimetododePCR

Seutiliz6e1pardeoJigonucleotidosespecificoparaF. nucleatum,elcual arnplificauna

secuenciade500pb:

PRIMER: FN 5047-1 (DNA) - CAA ATG CIT GTG TCA ATA ATA CT

PRIMER: FN 5047- 2 (DNA) - TIT AGA AAT GGT AGA ATA AT

Se prepar6 una mezcla de reacci6n a un volumen total de 25 Ill: 2.5 pi de buffer PCR lOX,

I pI de cada 0ligonucle6tido (0.4 pM), 0.5 pi de dNTPs (0.2 pM), 0.1 pi de Taq DNA

poJimerasa (0.5 pM), I pi dellemplado de DNA (lOng) y 18.9 pI de agua inyeclable.

Laarnplificaci6n sellev6 a cabo deacuerdo al siguienteprolocolo: Calentarnienloa94°C

por 5 minutos, 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a nOc y un cicio de

extensi6n final de noc durante 5 minulos. En cadaarnplificaci6n se incluy6 un control

posilivo y uno negativo que no conlenia el tempiado de DNA.

Electroforesisengeideagarosa

Las muestras arnplificadas se colocaron en un gel de agarosa al 1% en Buffer TBE IX

(Tris-EDTA-Borato de sodio) y corri6 a un voltaje conslanle de 70 volts durante 2.5 horas.

En cada gel se utiliz6 un marcador de peso molecular de 100 pb. Al cabo de este liempo, el

gel setiii6conbromurodeetidioyseobserv6 con laayuda de una Illmpara de luz UV

(Anexo3,foto2).

Seestudiaronuntotalde92muestrasobtenidasdeconductosradicularesconperiodontilis

apicalcr6nica.

Dellotal de muestras estudiadas, en 83 fue posible aislar DNA y de eslas en 4 (4.81 %) se

obtuvieron arnplificados correspondienles a los oligonuc1e6lidos especificos de

Fusobacterium nuc/eatum (Anexo 4).

IV. DlSCUSI6N

La microbiota relacionada a la periodontitis apical cr6nica no ha sido ampliamente

estudiadacomolainvolucradaenpulpasnecr6ticas,sinembargo,sehanlogradoestablecer

diferenciassignificativasensucomposici6n.

La peR, es una tecnica microbiana de alta sensibilidad, usada para la detecci6n e

identificaci6n de microorganismos diflciles de cultivar como 10 son los de origen

En este estudio la prevalencia de F. nucleatum fue de14.81%, porcentaje muy similar aI

encontrado por Baumgartner en Brasil, donde mediante peR identific6 4% de la misma

Por otro lado, comparado con estudios realizados en Europa 0 Estados Unidos, el

porcentajeencontrado en estainvestigaci6n resulta ser menor, ya que en estos paisesseha

lIegado a reportar una prevalencia del 73% (Baurngartneretal. 2004). Fouad, de igual

manera,reportaunaprevalenciade deF.nucieatum.

Otrosestudioshanreportadodiferentesprevalencias,taleselcasodeKantzyHenry,que

en 1974, encontraron unaprevalencia del 39%; Sundqvist,en 1992, del 33%; Heimdahl,en

1985, del 34%; SiqueirayRocas, en 2004, prevalenciadel 26%; HaapasaJ0, en 1986, del

16% yporultimo Fabricius, en 1982, del 14%. Enestainvestigaci6n,en2010, sereporta

prevaJenciade F. nuc,leatum del 4.81%, resultando bajaencomparaci6ncon los autores

citados.

En este estudio, en 9 muestras no fue posible extraer el DNA, esto probablemente se haya

debidoaquelamuestratomadadelosconductosradicularesnofuesuficienteoaltiempo

transcunidoentrelatomadelamuestrayeltrasladoallaboratorioparasucongelamientoa

-70·C,loquetalvezpudoocasionarqueeIDNAsedegradara.

Esta investigaci6n, constituye el primer reporte en Mexico de F. nucleatum mediante una

tecn.icamolecularcomolaPCR.

Esimportantequesellevenacaboestudiosdeestetipo,utilizandoelmismo protocolo de

identificaci6n, para establecer con mas precisi6n la epidemiologfa de F. nucleatum en

Una de las ventajas del PCResiadetecci6nrapidayespecificadeiosacidosnucleicosde

microorganismos pat6genos en una muestra, con la caracteristica de tener una alta

especificidadysensibilidad.Lapruebapermiteunaobtenci6nrapidaderesultadosyse

pueden examinar varias muestras en corto tiempo.

REFERENCIAS BIBLlOGIUFlCAS

Cohen, S. y R. Bums, (2002). Vias de la pulpa. 8" ed., Elservier Science. pp 506­

507.

Bawngartner, JC, Falkler, W. Beckennan, T., (1992) "Experimentally induced

infection by oral anaerobic microorganisms in a mouse model" en Oral Microbiol

Immunol. Vo1.7pp.253-256.

Baumgartner, J.C.; Siqueira, J.F.; Xia, T. e l.N. Rocas, (2004) "Geographical

differences in bacteria detected in endodontic infections using polymerase chain

reaction" en Joumal ofendodontics Vol. 30,numero 3, pp. 141-144.

Fabricius, L.; Dahlen, G,; Ohman, A. y A, Moller, (1982) "Predominant indigenous

oral bacteria isolated from infected root canals after varied limesofclosure"en

Scandinavian Journal ofDental Restauration, Vol.90 numero 2,pp.134-44,

Fouad, AF.; Barry J.; Caimano, M.; Clawson, M.; Zhu, Q,; Carver, R.; Hazlett, K, y

JD.Radolf ,(2002) "PCR-Based Identification of Bacteria Associated with

Endodontic Infections" en Journal ofClinical Microbiology. Vol.40, pp.3223-3231.

Gomes, BPFA.; Jacinto, RC.; Pinheiro, ET.; Sousa, ELR.; Zaia ,AA,; Ferraz, CCR y

FJ. Souza-Filho, (2005) "Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis,

Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens in endodontic lesions detected by

culture and by PCR" en Oral Microbiology and Immunology, Vol.20 numero

4,pp,2JI-215.

Haapasalo M, Ranta H, Shah H. ,( 1986) "Black-pigmented Bacteroides spp in

human apical periodontilis" en Infectlmmun;Vo1.53,pp.149-53.

Hashioka, K.; Yamasaki, M.; Nakane, A.; Horiba, N. y H. Nakamura, (1992) ''The

relationship between clinical symptoms and anaerobic bacteria from infected root

canals" en Journal o/Endodontics Vol 18 numero II,pp.558-61.

Heimdahl, A.; Von Konow, L.;Satoh, T. y CEo Nord, (1985) "Clinical appearance

of orofacial infections of odontogenic origin in relation to microbiological findings"

en Journal o/Clinical Microbiology Vol.22, pp.299-302.

lung /Y., Choi BK, Kum KY, Roh BD, Lee Sl, Lee CY, Park OS. (2000)

"Molecular epidemiology and association of putative pathogens in root canal

infection"enloumal of Endodontics.; Vol 26numero IOpp.599-604

Kantz WE Y Henry CA., (1974) "Isolation and c1asification of anaerobic bacteria

from intact pulp chambers of non-vital teeth in man" en Archs Oral BioI; I: 91-9.

Kakehashi, S.; Stanley,H. y R. Fitzgerald ,(I 965)"The effects of surgical exposures

of dental pulps in germ-free and conventional laboratory rats" en Oral SurgeryOral

Medicine Oral Pathology and Endodontics VoI.20,pp.340-9.

Lana, M.; Ribeiro-Sobrinho, A.; Stehling, R.; Garcia, G.; Silva, B.; Hamdan, 1.;

Nicoli, 1.; Carvalho, M. y L. Farias ,(2001) "Microorganisms isolated from root

canals presenting necrotic pulp and their drug susceptibility in vitro" en Oral

Microbiology and Immunology Vol.16 numero 2,pp.1 00-5.

Lin, L.; Skribner, 1. y P. Gaengler, (1992) "Factors associated with endodontic

treatmentfailures"enJournalo/Endodontics 18,pp.625-627.

Molander, A.; Reit, C.; Dahlen, G. y T. Kvist ,(1998) "Microbiological status of

root-filled teeth with apical periodontitis" en International Endodontic Journal

31(1),pp.I-7.

Monbelli, A.; Mc Nabb, H. y N. Lang, (1991) "Black pigmenting Gram-negative

bacteria in Periodontal disease. Topographic distribution in the human dentition" en

Journal o/Periodontics Vol 26, pp.301-307.

Mondrag6n, 10. (1995) Endodoncia.l· ed.; Interamericana-Mc Graw Hill. pp 34.

Moromi NK. Bacterias orales y enfennedades sistemicas: una revision. Odontol

Sanmarquina.2004;8(1):30-34.

Peters, LB.; Wesselink, PRo y AJ. van Winkelhoff ,(2002) "Combinations of

bacterial species in endodontic infections" en International Endodontic Journal

Vol.35numero8,pp.698-702.

Perea, EJ. (2004) "La flora de la boca en la era de labiologiamolecular" 0ra1 Patol

0ra1 CirBucal., 9:1-10

Rolph, HJ.; Lermon, A.; Riggio, MP.; Saunders, P.; Mackenzie, D.; Coldero, L. y J.

Bagg ,(2001) "Molecular Identification of Microorganisms from Endodontic

Infections" en Journal o/Clinical Microbiology Vo1.39 numero 9,pp.3282-3289.

Rogerio, CJ.; Montagner, F.; SignoreUi, FG.; Almeida, GC. y B.Gomez, (2008)

"Frequency, Microbial Interactions, and Antimicrobial Susceptibility of

Fusobacterium nucleatum and Fusobacterium necrophorum Isolated from Primary

Endodontic Infections" en Journal 0/ Endodontics Vo1.34 numero 12, pp.1451-

Saito 0, de Toledo LR, Mazza RJL, Tsai SM, Hofling JF, and Gonyalves RB.

(2006) "Identific~tion of bacteria in endodontic infections by sequence analysis of

168 rONA clone libraries" en Journal Med Microbiol Vol.55 pp.IOI-I07.

Silva, BL.; Nelson,FP.; Faria, G.; Souza, SM. Y IV. Ito, (2006)" Bacterial profile in

primary teeth with necrotic pulp and periapical lesions" eo Brazilian Dental Journal

Vo1.17numero2,pp.I44-l48.

Siqueira JF, De Uzeda M, Varejao E., (1995) "Sintomatologia c1inica persistente

devido a infeccion endodontica por Fusobacterium nucleatum" en Rev. Gaucha

OdontoIVoI.43,pp.149-52.

Siqueira, J.; Rocas, 1.; Alves, F. y K. Santos, (2004) "Selected Endodontic

Pathogens in the Apical Third of Infected Root Canals: A Molecular Investigation"

en Journal ofEndodontics Vo1.30 numero 9,pp. 638-643.

Siqueira, J.; Rocas, I.; Souto, R.; Uzeda, M. y A. Colombo, (2000) "Checkerboard

DNA-DNA hybridization analysis of endodontic infections" en Oral Surgery Oral

Medicine Oral Pathology Oral Radiology and Endodontics VoI.89,pp.744-8.

Siqueira, JF. y IN. Rocas, (2004)"Polymerase chain reaction-based analysis of

microorganisms associated with failed endodontic treatment" en Oral Surgery Oral

Medicine Oral Pathology Oral Radiology and Endodontics Vo1.97, pp.-94.

Sjogren, U.;Figdor,D.; Persson,S. yG. Sundqvist, (1997) "lnl1uence of infection

at the time of root filling on the outcome of endodontic treatment of teeth with

apical periodontitis" en International Endodontics Journal Vo1.30 numero

5,pp.297-306.

Sundqvist G., (1976) Bacteriological studies of necrotic dental pulps. Thesis, Umel't:

Umel't University, Odontological Dissertation. pp. 1-94.

Sundqvist, G.; Johansson, E. y U. Sjogren, (1989) "Prevalenceofblack-pigrnented

bacteroides species in root canal infections" en Journal of Endodontics Vol.15

numerol,pp.13-19.

28

Sundqvist, G., (1992) "Associations between microbial species in denial root canal

infections" en Oral Microbiology and Immunology Vo1.7,pp.257-262.

Sundqvisl, G., (1992) "Ecology of the root canal flora" en Journal of Endodontics

Vo1.l8 nlimero9, pp. 427-430.

Sundqvist G., (1994)'Taxonomy, ecology and pathogenicity of the root canal flora"

en Oral Surg Oral Med Oral Pathol Vol 78, pp. 522-30.

Anno 1. OPERACIONALlZACION DE VARIABLES

Nombrcdelavariabl.

MicroorganismoPresenciadc anaer6bicogram negativo.F.nuclearum preseotec:ninfecciones

c:ndod6nticasprimarias

Idt.ndfladO.moIKUlar dt FlI.IONderillM ,."dntJUrt u p.dtntes aiD periodODdtb .p~l crOnla dd Po.,..do dt [ndodo.d.dtl.UaJ'IenldadAutOftOmlldtYueatb.

A quiencorresponda:

Por este medio, bago constar que he sido cabalmente informado (a) y doy mi

consentimientoparaquesemerealiceunamuestrabacterianaendod6ntica,asi como tomas

radiograficasperiapicales.

Semehainformadoquealparticiparenestainvestigaci6n,noexisleriesgoparamisalud

nirniinlegridadfisica.

EI resultado de los datos oblenidos, radiografias y fOlografias que se lomen, podnin ser

utilizadas para los fines que la invesligaci6n del C. D. Gabriel Alvarado Cardenas requiera

parasuesludioypublicaci6n.

Firma de consenlimienlo

Testigo

Merida, Yucalan,Mexlco__de de20_.

Fotograffa I. Colocaci6n de la muestm amplificada para laelectroforesis en gel de

agarosaall%

(Laboralorio de Microbiologia Oral y Biologia Molecular. FOUADY)

Fotograffa 2. Cepa de referencia ATCC 25586 de Fusobacterium nucleatum

(Laboralorio de Microbiologla Oral y Biologla Molecular. FOUADY)

Anexo4

Figura I. F.nucleatum aislada en condu:t0s con ~ri~~~~~pical cr6nica.

Fuente: Trabajode investigaci6n: Identificaci6n molecular de Fusobacterium nucltarumen pacienlesconperiodoRlitisapicalcr6nicadeiPosgradodeEndodonciadelaUniversidadAutonomadeYuc8t.4n

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