Full Report Tyrosinase à¹ à¸ à¸£à¸ à¸ à¸²à¸£à¸¢à¹ à¸à¸¢ 2 ...

i

โครงการยอยท

การศกษาจลนศสาตรของการยงยงเอนไซมไทรซเนสของสารฟลาโวนอยดท

สกดแยกไดจากแกนคร

Studies on the tyrosinase inhibition kinetics of some flavonoids isolated from

Dalbergia parviflora

ภายใตชดโครงการ : การศกษาฤทธยบยงของสารสกดจากแกนครตอการทางานของ

เอนไซมไทโรซเนสจากเหด

Studies on the inhibitory effects of Dalbergia parviflora extract on the activity of

mushroom tyrosinase

โดย

วรวฒน พรหมเดน

และ

เทพพร โลมารกษ

งานวจยนไดรบการสนบสนนจากสถาบนวจยและพฒนา

มหาวทยาลยราชภฏบรรมย

พ.ศ. 2559

(ลขสทธของมหาวทยาลยราชภฏบรรมย)

ii

โครงการยอยท 2

การศกษาจลนศสาตรของการยงยงเอนไซมไทรซเนสของสารฟลาโวนอยดท

สกดแยกไดจากแกนคร

Studies on the tyrosinase inhibition kinetics of some flavonoids isolated from

Dalbergia parviflora

ภายใตชดโครงการ : การศกษาฤทธยบยงของสารสกดจากแกนครตอการทางานของ

เอนไซมไทโรซเนสจากเหด

Studies on the inhibitory effects of Dalbergia parviflora extract on the activity of

mushroom tyrosinase

โดย

วรวฒน พรหมเดน

และ

เทพพร โลมารกษ

งานวจยนไดรบการสนบสนนจากสถาบนวจยและพฒนา

มหาวทยาลยราชภฏบรรมย

พ.ศ. 2559

(ลขสทธของมหาวทยาลยราชภฏบรรมย)

เลขทสญญา 72/2559

i

กตตกรรมประกาศ

โครงการวจยนไดรบทนจากงบประมาณเพอจดสรรทนอดหนนการวจยประจาป

งบประมาณ 2559 มหาวทยาลยราชภฏบรรมย

ii

บทคดยอ

สารฟลาโวนอยด 4 ชนดทสกดแยกไดจากแกนคร ไดแก Khrinone (5), Cajanin (9),

(3RS)-3-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21) และ (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy

pterocarpan (27) ไดนาไปศกษาจลศาสตรการยบยงเอนไซมโดยสงเกตผลดวยปฏกรยาการ

ยบยงกจกรรมจาเพาะของ o- diphenolase ผลการศกษาเผยใหเหนวากลไลการยบยงของ

สารประกอบ (5) (9) (21) และ (27) เปนแบบชนด uncompetitive non-competitive mixed และ

competitive ตามลาดบ การคนพบองคความรพนฐานนทาใหสามารถสรปไดวาสารสกดจากแกน

ครมศกยภาพทจะเปนแหลงของผลตภณฑธรรมชาตสาหรบการประยกตใชเปนสารตานปฏกรยา

การเกดสนาตาล (anti-browning) โดยผานกลไกการยบยงการเกดปฏกรยาออกซเดชนของ

สารประกอบฟนอลโดยเอนไซมไทโรซเนส

คาสาคญ : คร สกข ฟลาโวนอยด ตวยบยงเอนไซมไทโรซเนส จลนศาสตรของเอนไซม

iii

ABSTRACT

Four flavonoids isolated from Dalbergia parviflora, namely Khrinone (5), Cajanin

(9), (3RS)-3-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21) and (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy

pterocarpan (27) were further studied for their inhibition kinetics on the o- diphenolase

activity of the mushroom tyrosinase. The results showed that the inhibition of (5), (9), (21)

and (27) were uncompetitive, non-competitive, mixed and competitive inhibitors,

respectively. Based on these findings, it was concluded that D. parviflora heartwood

extract is a potential source of natural product which might be used as anti-browning

agents that can inhibit the enzymatic oxidation of phenols by tyrosinase.

Keywords: Dalbergia parviflora, flavonoid, tyrosinase inhibitor, Enzyme kinetics

iv

สารบญเรอง

หนา

กตตกรรมประกาศ………………………………….…………………………………………....(i)

บทคดยอ (ภาษาไทย)………….…………………………………………………....................(ii)

บทคดยอ (ภาษาองกฤษ)……..…………………… ………………………………………….(iii)

สารบญเรอง…..………………………………………...………………………………...…….(iv)

สารบญรปภาพ…..………………………………………...………………….…………….....(vi)

สารบญตาราง……..……………………………………….…………………………..…..…..(vii)

บทท 1

บทนา…………………………………….………………………………………………..….……1

ความสาคญและทมาของปญหาททากาวจย….………………………………………………..….1

วตถประสงคของโครงการวจย………………….………………...……………………...…………2

ขอบเขตของโครงการวจย……………………….…………………...…………….……………….2

กรอบแนวความคดของโครงการวจย……………….……………...………………..……………..4

บทท 2

ทฤษฎและการทบทวนวรรณกรรมทเกยวของ………………………………………………...5

เอนไซมไทโรซเนส ..…………………………………………………………………….…………..5

คร …………………………………………………………………………………………………..6

ฟลาโวนอยดและไอโซฟลาโวนอยด…………………………………………………….…………..6

ฤทธทางชวภาพของฟลาโวนอยด…………………………………………………….…………....8

จลนศาสตรของของเอนไซม…..………………………….……………………………………….. 8

v

สารบญเรอง (ตอ)

หนา

บทท 3

วธการดาเนนการวจย…..……………………………………………………………………….18

เครองมอวทยาศาสตร….………………………………………………………………………….18

สารเคม / สารสกด / เอนไซม ….………………………………………………………………….18

การเตรยมสารสกดหยาบจากแกนคร ……………………………………………………………. 4

การวเคราะหฤทธของสารสกดตอการยบยงเอนไซมไทโรซเนส …………………………..…….. 18

การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร…..………..20

บทท 4

ผลการวจย……………………………………………………………………………………….20

การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร ……….…..22

บทท 5

สรปและอภปรายผลการวจย………………………………………………………………..…28

บรรณานกรม…………………………………………………………………….......................30

ภาคผนวก……………………………………………………………………............................33

ประวตนกวจย…..…………………………………...……………………………......................34

vi

สารบญรปภาพ

หนา

ภาพท . แผนผงแสดงขอบเขตและขนตอนของงานวจย………………..………………………

ภาพท .1 โครงสรางทางเคมของฟลาโวนอยด……………………………..….…………………9

ภาพท .2 โครงสรางทางเคมของไอโซฟลาโวนอยด……………………..……….……………….7

ภาพท . กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม …………….………………….7

ภาพท . กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม (Michaelis-Menten

saturation curve).………………………………………………………………………………..10

ภาพท . Double reciprocal plot ระหวาง /vo (แกน Y) และ / [S] ………………………13

ภาพท 2.6 สมการรปแบบของการยบยงเอนไซมแบบผนกลบไมได ……………….………….14

ภาพท 2.7 สมการรปแบบและกลไกของการยบยงแบบ Competitive ………………….….….15

ภาพท 2.8 สมการรปแบบและกลไกของการยบยงเอนไซมแบบ Uncompetitive …………..….16

ภาพท 2.9 สมการรปแบบและกลไกของการยบยงเอนไซมแบบ Noncompetitive……….…….17

ภาพท 4.1 โครงสรางของสารฟลาโวนอยด 4 ชนดทศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซม……...22

ภาพท 4.2 Michaelis-Menten saturation curve และ Lineweaver-Burk Plot ของเอนไซม

ไทโรซเนสโดยไมมการเตมตวยบยง……………………………………………………………….23


ไทโรซเนสโดยมการเตมตวยบยง Khrinone B (5) ………………...…………………………….24


ไทโรซเนสโดยมการเตมตวยบยง Cajanin (9) …………………..……………………………….25


ไทโรซเนสโดยไมมการเตมตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21)………….….26


ไทโรซเนสโดยไมมการเตมตวยบยง 6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy

pterocarpan (27) ………………………………………………………….…………………….27

vii

สารบญตาราง

หนา

ตารางท . แสดงรายการและปรมาตรของสวนผสมในปฏกรยาการวดคาการยบยง

เอนไซมไทโรซเนส…………………………………………………..……………………………..19

ตารางท . แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ

สารตงตน (L-Dopa) โดยไมมตวยบยง…….………………………………………………….….23


สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง Khrinone B (5) …………………..………………24


สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง Cajanin (9)……………………………………..…25


สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21) ….26

ตารางท .5 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ

สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy

pterocarpan (27)…………………………………………………………………………..…….27

1

บทท 1

บทนา

ความสาคญและทมาของปญหา

จลศาสตรของเอนไซม (enzyme kinetics) คอ การศกษาอตราเรวของปฏกรยา (reaction

rate) และการเปลยนแปลงอตราเรวของปฏกรยาเมอมการเปลยนแปลงปจจยบางอยาง เพอทา

ความเขาใจกลไกการทางานของเอนไซมนนๆ ได การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมจงเปนแนว

ปฏบตสาหรบการศกษาเชงลงภายหลงจากการศกษาเบองตพนแลวพบวามสารใดออกฤทธยบยง

เอนไซมทกาลงศกษาอย ซงโครงการวจยนไดมงเนนศกษาสารฟลาโวนอยดทสกดแยกไดจากแกนคร

(Dalbergia parviflora) ทมผลตอการยบยงเอนไซมไทโรซเนส ซงใชเอนไซมไทโรซเนสจากเหด

(mushroom tyrosinase) เปนตวแทนในการศกษา จากการศกษาเบองตนพบสารสกดฟลาโวนอยด

บรสทธจากแกนครจานวน 4 ชนด มฤทธยบยงเอนไซมไดดมาก จงควรนามาศกษาจนลศาสตรการ

ยบยง เพอใหเกดองคความรทางวทยาศาสตรทสามารถอธบายกลไกการยบยงและขอมลทาง

จลนศาสตรทไดจะเปนประโยชนในการใชเปรยบเทยบความแตกตางของตวยบยงทศกษาและตว

ยบยงอนๆ ทมรายงานมากอน

เอนไซมไทโรซเนสมความสมพนธกบการสงเคราะหเมลานนซงทาใหเกดสผวและยง

เกยวของกบการเกดสนาตาลในอาหารจาพวกผกผลไมและอาหารทะเล ดงนการศกษาตวยบยง

เอนไซมไทโรซเนสจงมโอกาสพฒนาเปนผลตภณฑดานอาหารและเครองสาอาง ทงนมรายงานวา

สารพฤกษเคมกลมฟลาโวนอยดทสกดไดจากพชมคณสมบตในการยบยงเอนไซมไทโรซเนส และ

คณะผ วจยไดเคยรายงานการคนพบสารฟลาโวนอยดทสกดแยกไดจากแกนครและฤทธตานอนมล

อสระของสารฟลาโวนอยดดงกลาวมาแลว ดงนนหากทาการวจยศกษาถงคณสมบตการออกฤทธ

ทางชวภาพอนๆ จะเปนการสรางโอกาสในการพฒนาองคความรและพฒนานวตกรรมใหม

2

สารพฤกษเคมทเปนองคประกอบในแกนคร (Dalbergia parviflora) พบวามสารประกอบ

ฟลาโวนอยดมากกวา 60 ชนด ซงงานวจยตางๆ ไดกลาวถงฤทธทางชวภาพของฟลาโวนอยดไว

อยางหลากหลาย เชน ฤทธตานอนมลอสระ (Fernandez-Panchon et al., 2008; Prochazkova et

al., 2011) ฤทธตานมะเรง ฤทธตานการอกเสบ (Kim et al., 2004) ฤทธในการตานจลชพประเภท

แบคทเรย เชอรา และไวรส (Tereschuk et al., 1997; Tsao et al., 1982; Yao et al., 2004) และ

รวมถงฤทธการยบยงเอนไซมชนดตางๆ ในระบบชวภาพ (Kongkamnerd et al., 2012;

Kongkamnerd et al., 2011) การสงเสรมการวจยดานสมนไพรและสารออกฤทธทางชวภาพจะเปน

การสรางความพรอมทางดานการผลตยารกษาโรค เครองสาอาง อาหาร รวมถงยากาจดโรคพชและ

เปนแผนหนงของการพฒนานวตกรรมดานสมนไพรไทยใหมประสทธภาพและไดรบการยอมรบมาก

ขน ในทางเศรษฐกจจะนาไปสการลดการนาเขาของสารเคมหรอสารสงเคราะห รวมถงการสงเสรม

ใหมการอนรกษพชพนธสมนไพร และประชาสมพนธใหทราบถงคณคาของทรพยากรธรรมชาตใน

ทองถน

วตถประสงคของโครงการวจย

เพอศกษาจนศาสตรของการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของสารฟลาโวนอยดบางชนดทพบ

แนวโนมการยงยงเอนไซมไทโรซเนส และรายงานคาทางจลนศาสตรของเอนไซม

ขอบเขตของโครงการวจย

งานวจยนทาการศกษาวจยภายในหองปฏบตการเพอศกษาฤทธและกลไกการยบยง

เอนไซมไทโรซเนสของเหดในหลอดทดลอง โดยการใชเทคนคการตดตามอตราการเกดปฏกรยาและ

อตราการยบยงปฏกรยาดวยวธทางสเปกโตรโฟโตรเมตร โดยยงไมมการพฒนาสารสกดใหเปน

ผลตภณฑสาหรบการใชเปนยาหรออาหาร และการวจยนยงไมมการทดลองในมนษยหรอสตว

3

ภาพท 1.1 แผนผงแสดงขอบเขตและขนตอนของงานวจย

4

กรอบแนวความคดของโครงการวจย

แกนครเปนสมนไพรทมาจากภมปญญาทองถนของไทย โดยพบวามการใชเปนยา

บารงรางกายและยาสาหรบสตร และคณะผ วจยไดศกษาวจยทางวทยาศาสตรเกยวกบฤทธตาน

อนมลอสระและพบวามฤทธตานอนมลอสระสง จงเหนสมควรศกษาฤทธทางชวภาพอนๆ ใหรอบ

ดาน โครงการวจยนจงไดพฒนางานวจยเดมใหมการแตกแขนงการวจยออกไปในเชงลก โดยมง

ประเดนหลกไปทการศกษาฤทธการยบยงเอนไซมไทโรซเนส เพอยนยนผลการออกฤทธทางชวภาพ

ในระดบหลอดทดลองกอนการประเมนแนวทางพฒนาไปสผลตภณฑ ทงนการนาภมปญญาทองถน

มาตรวจสอบในระดบหองปฏบตการเพอเพมขอมลทางวทยาศาสตร จะทาใหสามารถพฒนาขนเปน

ผลตภณฑทองถนทซงเปนทยอมรบไดในอนาคต โดยเฉพาะอยางยงทเกยวของกบอาหาร สขภาพ

และความงาม และเปนการสรางโอกาสในการพฒนาเทคโนโลยและนวตกรรมทมาจากภมปญญา

ทองถนเพอกลบคนสทองถน อนจะนามาซงโอกาสในการสรางรายไดและความยงยน

5

บทท 2

ทฤษฎและการทบทวนวรรณกรรมทเกยวของ

เอนไซมไทโรซเนส (tyrosinase, EC 1.14.18.1) เปนเอนไซมในทจดอยในกลมออกซโดร

ดกเทส (oxidoreductase) มชออนๆ เชน monophenol monooxygenase, phenolase, phenol

oxidase, tyrosine-dopa oxidase หรอ monophenol oxidase เปนตน เอนไซมไทโรซเนสเปน

เอนไซมชนด copper-containing enzyme พบอยในสงมชวตทหลากหลาย เชน ในจลนทรย สตว

และพช เอนไซมไทโรซเนสพบวามหนาทสาคญใน 3 ประเดนคอ

1) ในสตวเลยงลกดวยนมเอนไซมไทโรซเนสจะมหนาทเกยวของกบกระบวนการสงเคราะห

รงควตถเมลานน (melanin) ทอยภายในเซลลเมลาโนไซต (melanocytes) โดยทาหนาทเรงปฏกรยา

ออกซเดชนกบสารตงตนทงแอล-ไทโรซน (L-tyrosine) และแอล-โดปา (L-dopa) รวมกบออกซเจน

ไดเปนสารประกอบโดปาโครม (dopachrome) หลงจากนนจะเกดปฏกรยาโพลเมอไรเซชนโดยไม

อาศยเอนไซมเปนตวเรง ไดผลตภณฑเปนเมลานนชนดตางๆ ซงจะถกสงตอเพอสะสมยงเซลลเคราต

โนไซต (keratinocyte) และทาใหเกดลกษณะการแสดงออกของสผว สผม สขน และสนยนตา

นยนตา

2) เอนไซมกลมนยงพบวาเกยวของกบการเกดสนาตาล (enzymatic browning reaction)

ของอาหารประเภทพชผกผลไม โดยปฏกรยาการเกดสนาตาลทเกยวกบเอนไซมนเปนปฏกรยา

ออกซเดชน (oxidation) จะเกดขนเมอเซลลของสงมชวตเกดการชา ฉก ขาด เมอถกกระแทก บด หน

หรอสบทาใหเอนไซม

3) ในสตวกลมแมลงและครสเตเซยนพบวาเอนไซมนจะถกเรยกวา polyphenoloxidase

(PPO) กลมฟนอลออกซเดสมบทบาทสาคญตอระบบภมค มกนของแมลงมหนาทชวยใน

กระบวนการปองกนตวและเจรญเตบโต

6

คร (Dalbergia parviflora Roxb.) มชอสามญคอ Blackwood และชอทองถนไดแก กระซก

ซก สร และ สกข เปนตน จดอยวงศ (family) Fabaceae วงศยอย (subfamily) Faboideae อาจม

การสบสนกบตนสกข (Dalbergia candenatensis) ซงเปนพรรณไมในวงศเดยวกน งานวจย

เกยวกบสารพฤกษเคม (phytochemical) จากแกนครพบวามสารฟลาโวนอยด (flavonoid) มากกวา

60 ชนด และพบวาหลายชนดมฤทธคลายฮอรโมนเอสโตรเอสโตรเจน (Promden et al., ;

Songsiang et al., ) นอกจากนสารฟลาโวนอยดยงมรายงานวาเปนสารพฤกษเคมทม

คณสมบตตานอนมลอสระ (antioxidant) (Chen et al., ; Croft, ; Rice-Evans et al.,

) คณะผ วจยไดทาการศกษาสารกลมไอโซฟลาโวนอยดทสกดไดจากแกนครโดยวธ DPPH วธ

ORAC และวธ xanthine/xanthine oxidase ซงพบวามสารหลายชนดทแสดงสมบตตานอนมลอสระ

ได อกทงยงไดรายงานถงความสมพนธของโครงสรางทางเคมและฤทธตานอนมลอสระ (Promden

et al., ) สารฟลาโวนอยดจากแกนครจงเปนเปาหมายทจะนามาศกษาฤทธทางชวภาพท

เกยวของกบการพฒนายา ผลตภณฑเสรมอาหาร และเครองสาอาง

ฟลาโวนอยด (Flavonoids) และไอโซฟลาโวนอยด (Isoflavonoids)

ในเชงโครงสรางทางเคมของฟลาโวนอยดซงเปนสารพฤกษเคมในธรรมชาตพบวาม

โครงสรางหลกเปน C -C -C ประกอบกบการมหมแทนท (substitution group) ในตาแหนงตางๆ

ตามระบบการเรยกชอ IUPAC สามารถจดจาแนกฟลาโวนอยดไดดงน

1) ฟลาโวนอยด (flavonoid) หรอ ไบโอฟลาโวนอยด (bioflavonoid)

2) ไอโซฟลาโวนอยด (isoflavonoid) เกดจากโครงสรางของ 3-phenylchromen-4-one

3) นโอฟลาโวนอยด (neoflavonoid) เกดจากโครงสรางของ4-phenylcoumarine

ไอโซฟลาโวนอยดเปนสารประกอบในกลมฟลาโวนอยด มโครงสรางหลกมาจาก 3-

phenylchroman เปนสารประกอบทพบอยในสงมชวตอาณาจกรพช ความหลากของชนดของ

ไอโซฟลาโวนอยดขนอยกบจานวนและตาแหนงของหมแทนทบนวงแหวน และยงมความแตกตาง

หลากหลายของระดบออกซเดชนบนวงแหวน (Grotewold, 2006) ไอโซฟลาโวนอยดจงสามารถ

แบงเปนกลมยอยไดดงน

7

1. ไอโซฟลาแวน (isoflavan)

2. ไอโซฟลาโวน (isoflavone)

3. ไอโซฟลาวาโนน (isoflavanone)

ภาพท 2.1 โครงสรางทางเคมของฟลาโวนอยด (2-phenylbenzopyran) ไอโซฟลาโวนอยด (3-

benzopyran) และ นโอฟลาโวนอยด (4-benzopyran) แสดงการระบหมายเลขตาแหนงของหม

แทนทบนวงแหวน A B และ C

ภาพท 2.2 โครงสรางทางเคมของไอโซฟลาโวนอยด 3 ชนด คอ ไอโซฟลาแวน ไอโซฟลาโวน และไอ

โซฟลาวาโนน แสดงการระบหมายเลขตาแหนงของหมแทนทบนวงแหวน A B และ C

8

ฤทธทางชวภาพของฟลาโวนอยด

ในปจจบนนฟลาโวนอยดกาลงเปนทสนใจในวงการทศกษาเกยวกบสารตานอนมลอสระ

ซงฟลาโวนอยดเปนสารทมศกยภาพในการตานอนมลอสระทสงมาก (Devasagayam et al., 2004;

Nijveldt et al., 2001) สมบตในการตานอนมลอสระของสารฟลาโวนอยดพบวามความเกยวของกบ

ฤทธทางชวภาพอนๆ เชน การตานการอกเสบ (anti-inflammatory) (Kim et al., 2004) ยบยง

เอนไซมบางกลม เชน hydrolytic enzyme และ oxidative enzyme (Theos et al., 2005; Yang et

al., 2012)นอกจากนยงพบวาฟลาโวนอยดสามารถปองกนโรคหวใจและหลอดเลอด ยบยง

เซลลมะเรง และฟลาโวนอยดบางชนดอาจมศกยภาพทสามารถยบยงไวรส HIV ได (Yao et al.,

2004) ฤทธทางชวภาพทเกยวกบฤทธตานจลนทรยในสารประกอบฟลาโวนอยด ไดแก สารสกดจาก

ใบ Tagetes minuta ซงการใชเปนยาพนบานเพอรกษาโรคตดเชอในประเทศแถบอารเจนตนาซง

พบวามสารฟลาโวนอยดคอ quercetagetin- -arabinosyl-galactoside (Tereschuk et al., 1997)

สารสกดจาก Scutellaria baicalensis ซงเปนพชสมนไพรจนทใชรกษาโรคเยอหมฟนอกเสบและ

แผลตดเชอในชองปากพบวามสารฟลาโวน baicalein เปนสารออกฤทธหลก (Tsao et al., 1982)

มการศกษาถงฤทธของสารพฤกษเคมกลมฟลาโวนอยดทสามารถยบยงเอนไซมไทโรซเนส

ไดแก Glabrene และ Isoliquiritigenin ในรากชะเอม (Glycyrrhiza glabra L.)(Nerya et al., 2003)

Norartocarpetin จากเปลอกและรากของพชตระกลหมอน (Morus ihou) (Jeong et al., 2009; Ryu

et al., 2008) Taxifolin จากตนออนของพชจาพวกผกแพว (Polygonum hydropiper L.)(Miyazawa

and Tamura, 2007)

จลนศาสตรของของเอนไซม

ในป ค.ศ. วคเตอร เฮนร (Victor Henri, – ) ลโอนอร มเคลส (Leonor

Michaelis) และ มด เมนเทน (Maud Menten) ไดเสนอทฤษฎเอนไซมจลนศาสตร ซงยงคงใชกนอย

อยางแพรหลายในทกวนน ซงรจกกนในชอทเรยกวาจลนศาสตรของมเคลส-เมนเทน (Michaelis-

Menten kinetics) ซงหมายถงการศกษาปฏกรยาเคมทมเอนไซมเปนตวเรง ซงมการวดความเรว

การศกษาปจจยบางอยางทมผลกระทบตอความเรวการอธบายกลไกการเรงปฏกรยาและกลไกยบยง

เอนไซม

9

ความเรวของปฏกรยา (velocity)

เมอพจารณาสมการปฏกรยาทมตวเรงโดยทมซบสเตรตเพยงตวเดยวดงน

ปฏกรยาขนแรกเปนปฏกรยาทสามารถผนกลบไดโดยทโมเลกลเชงซอนของเอนไซมและซบสเตรต

(ES) จบกนดวยพนธะทไมใชพนธะโคเวเลนซ จากนนจงผนกลบเปนเอนไซม (E) และซบสเตรต (S)

ไดอยางรวดเรว สาหรบปฏกรยาในขนทสองมการเปลยนแปลงรปรางของโมเลกลเกดขนในโมเลกล

เชงซอน ES ทาใหไดผลตภณฑ (P) ซงจะแยกตวออกมาจากเอนไซมในทสด และเอนไซมยงคง

สามารถกลบมาจบกบซบสเตรตตวใหมได พรอมจะเรงปฏกรยาไดอก คา k+1 k-1 และ k2 คอ คาคงท

ของความเรว (rate constants) ของปฏกรยา ในการวดความเรวของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซมจะ

พบวาในชวงแรกของปฏกรยาความเขมขนของผลตภณฑทเกดขนจะแปรผนตรงกบเวลา แตหลงจาก

นนอตราการเพมของผลตภณฑจะลดลงและอาจหยดลง (ภาพท 2.3) ดวยเหตนในการศกษา

จลนศาสตรของเอนไซมจงตองวดความเรวของปฏกรยาในระหวางทกราฟของผลตภณฑและเวลายง

เปนเสนตรงอย ซงความชนของกราฟในระยะนหมายถงความเรวเรมตน (initial velocity, Vo)

(สกญญา สนทรส และวเชยร รมพณชยกจ. 2553 : 286)

ภาพท 2.3 กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม (progress curve) แสดงการ

เพมขนของผลตภณฑ [Product] กบ เวลา จะพบวาในระยะตนกราฟยงคงเปนเสนตรงและความชน

ของกราฟจะหมายถงคาความเรวเรมตน (Vo)

10

สมการของไมเคลส-เมนเทน (Michaelis-Menten equation)

เมอวาดกราฟระหวางความเรวเรมตนกบความเขมขนของซบสเตรตจะไดกราฟลกษณะเปน

ไฮเพอรโบลา (ภาพท 2.4) เปนทสงเกตวาเมอเพมความเขมขนของซบสเตรตในระยะเรมตน

ความเรวของปฏกรยาจะเพมขน แตเมอเพมความเขมขนของซบสเตรตระดบหนงจะไดความเรว

สงสด (Vmax) และหากเพมความเขมขนซบสเตรตตอไปอกความเรวของปฏกรยาจะคงทจะไมเพมขน

ทงนเนองมาจาก

1. ทความเขมขนของซบสเตรตมคาตา โมเลกลเอนไซมยงคงมบรเวณเรงทวางอยเปนจานวน

มาก ดงนนการเพมความเขมขนของซบสเตรตจะมผลทาใหความเรวเพมขนได

2. ทความเขมขนของซบสเตรตมคาสงมาก ความเรวของปฏกรยาจะไมขนกบความเขมขน

ของซบสเตรต เนองจากเอนไซมไมมบรเวณเรงทเหลอวาง และมซบสเตรตอสระเหลออยอกมาก

แมวาจะเพมซบสเตรตเขาไปอกกไมมทใหเขาจบบนเอนไซม อตราเรวกจงเกอบไมเพมขนใหสงเกตได

ภาพท 2.4 กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม (Michaelis-Menten saturation

curve) แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (vo) กบความเขมขนของซบสเตรต [S]

สามารถพจารณาความสมพนธของพารามเตอรทเกยวของกบจลนศาสตรของเอนไซมไดดงน

จากสมการ

11

จะไดวา ความเรวเรมตน vo มคาดงน

อยางไรกตาม ไมสามารถวดการเกดขนของ [ES] ไดโดยตรง แตทราบวาความเรวสงสด

(maximum velocity, Vmax) จะเกดขนเมอเอนไซมทงหมดอยในรป enzyme-substrate complex,

[ES] ดงนนความเขมขนรวมของเอนไซม [Etotal] จงเทากบ [E] + [ES] และสามารถเขยนสมการได

เปน

Vmax = k2[Etotal]

= k2 ([E]+[ES]) …………………….. (2)

นาสมการ (1) ตงแลวหารดวยสมการ (2) จะได

เมอ คาคงทการแตกตว (dissociation constant, Ks) มคา

หรอ

แทนคา [ES] ลงใน สมการ (2) จะได

ซงสมการ (3) คอ สมการของมเคลส-เมนเทน

12

ในป ค.ศ. จอรจ เอดเวรดบรกส (George Edward Briggs) และ จอหน เบอรดอน

แซนเดอรสน ฮอลเดน (John Burdon Sanderson Haldane) ไดเสนอแนวคดสภาวะคงท (steady

state concept) ของการเกด enzyme-substrate complex [ES] โดยกลาววาขณะทมการเรง

ปฏกรยาดวยเอนไซม ความเขมขนของ [ES] จะคงทเสมอ เนองจากการจบกนของเอนไซมและซบส

เตรตเกดขนอยางรวดเรวและผนกลบได จากนน ES จะสลายตวไดเปนผลตภณฑ (P) และเอนไซม

อสระ (E) ซงปฏกรยาขนตอนทสองนจะชากวามาก จงเปนขนกาหนดความเรวของปฏกรยา (rate-

limiting step)

จากสมการขางตนจะเหนวาปรมาณของ ES จะขนกบปรมาณของเอนไซมและซบสเตรต

ดงนนหากมปรมาณซบสเตรตมากเกนพอ ภายหลงจากท ES กลายเปนผลตภณฑแลว เอนไซมอสระ

จะจบกบซบสเตรตตวใหม ไดเปน ES จงทาให ES มคาคงท สภาวะนเรยกวาสภาวะคงท (steady

state)

ดงนน ความเรวของการสราง ES = k1 [E][S]

ความเรวของการสลาย ES = k-1[ES] + k2[ES]

ณ ทสภาวะคงท ความเรวของการสราง ES = ความเรวของการสลาย ES

ดงนน k1 [E][S] = (k-1 + k2) [ES]

หรอ

Km ในสมการ (4) เรยกวาคาคงทของมเคลส เมนเทน (Michaelis-Menten constant) เปนตวแปร

สาคญในการศกษาจลนศาสตรของเอนไซม มหนวยเปนโมลาร (Molar)

จากสมการ (4) จะไดวา

แทนคา [ES] ลงใน สมการ (2) จะได

13

เรยกสมการ (5) วา Briggs-Haldane equation ซงคลายกบสมการ (3) แตปจจบนสมการ

ทงสอง มกถกเรยกรวมไปวาเปน สมการมเคลส-เมนเทน (Michaelis-Menten equation)

เมอเขยนกราฟระหวาง ความเรว vo กบ [S] จะไดกราฟดงรปท 2.4

เพอใหการหาคาพารามเตอรตาง ๆ สะดวกยงขน ฮานส ไลนวเวอร (Hans Lineweaver)

และดน เบรก (Dean Burk) ไดแปลงสมการมเคลส-เมนเทน (สมการ ) ใหเปนสวนกลบ ไดดงน

สมการ ( ) เรยกวา สมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) และเมอเขยน

กราฟระหวาง /vo เปนแกน Y และ / [S] เปนแกน X จะไดกราฟเสนตรงดงภาพท 2.5

เรยกวา กราฟไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk plot) ซงจะทาใหสามารถหาคา Km และ

Vmax เปนไปไดอยางถกตองแมนยากวาการใชกราฟตามภาพท 2.4

ภาพท 2.5 Double reciprocal plot ระหวาง 1/vo (แกน Y) และ 1 / [S] (แกน X) ตามสมการไลนว

เวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) จะไดจดตดแกน Y เปน 1/ Vmax, จดตดแกน Xเปน -1/Km

และความชนคอ Km/ Vmax

14

ตวยบยงเอนไซม (enzyme inhibitor)

ตวยบยงเอนไซมคอโมเลกลทสามารถจบกบเอนไซมและทาใหเอนไซมเรงปฏกรยาไดลดลง ซง

หลกการนนามาประยกตใชเปนยาปฏชวนะและยารกษาโรคทเกยวของกบเอนไซม ในระบบเมแทบอ

ลซม การทางานของตวยบยงเอนไซมสามารถจาแนกเปน ประเภทคอ ยบยงแบบถาวรหรอผนกลบ

ไมได (irreversible inhibition) และยบยงแบบผนกลบได (reversible inhibition) (สกญญา สนทรส

และวเชยร รมพณชยกจ. 2553 : 296)

การยบยงแบบถาวรหรอผนกลบไมได (irreversible inhibition)

การยบยงแบบผนกลบไมไดหรอการยบยงอยางถาวรเกดจากการเตมสารทเมอจบกบเอนไซม

แลวเกดพนธะโคเวเลนซ ซงมความคงตวมากและเปนการทาลายหมฟงกชนทจาเปนสาหรบการเรง

ปฏกรยาของเอนไซมไปอยางถาวรโดยไมสามารถเกดปฏกรยาผนกลบได

ภาพท 2.6 สมการรปแบบของการยบยงเอนไซมแบบผนกลบไมได

การยบยงแบบผนกลบได (reversible inhibition)

การยบยงแบบผนกลบไดนนสามารถแยกเอาตวยบยงออกจากเอนไซมหรอทาใหตวยบยงเจอ

จางลงเพอทาใหเอนไซมกลบมประสทธภาพเหมอนเดมไดลกษณะการยบยงแบบผนกลบไดแบงเปน

3 แบบคอ

1. การยบยงแบบแขงขน (competitive inhibition)

การยบยงชนดนจะมตวยบยง (I) ทมลกษณะโครงสรางคลายกบซบสเตรตมาก จงสามารถ

เขาจบกบบรเวณเรง (active site) บนเอนไซมอสระ (E) โดยทตวยบยงจะไมสามารถจบกบ ES ได

การยบยงแบบแขงขนนสามารถผนกลบได (reversible) เนองจากตวยบยงและซบสเตรต พยายาม

แขงขนเพอแยงเขาจบกบบรเวณเรงของเอนไซม หากตวใดมความเขมขนมากกวากจะมโอกาสเขา

จบไดดกวา การยบยงชนดนสามารถแกไขไดโดยการเพมความเขมขนซบสเตรต

15

ภาพท 2.7 (ก) สมการรปแบบของการยบยงแบบแขงขน (ข) ภาพจาลองการการยบยงแบบแขงขน

(ค) ผลของตวยบยงแบบแขงขนแสดงดวยกราฟของ Lineweaver-Burk เมอแปรคาความเขมขนของ

ตวยงยงจากทไมมตวยบยง (α = ) และเมอเพมความเขมขนเพมขนเปน α = , …ผลลพธทาง

จลนศาสตรของเอนไซมทมตวยบยงแบบแขงขนคอ คา Km เพมขน ในขณะท Vmax คงท

ทมาของภาพ : (Cox และ Nelson. 2008 : 201-202)

(ก) (ข)

(ค)

16

2. การยบยงแบบไมแขงขนแบบ Uncompetitive ตวยบยงชนดนจะจบเฉพาะ

สารประกอบเชงซอนของเอนไซมซบสเตรต (ES) อยางแบบผนกลบไดเกดเปน ESI ซงไมสามารถเกด

เปนผลตภณฑได ตวยบยงจะไมสามารถจบกบเอนไซมอสระได การจบของซบสเตรตกบเอนไซม

อาจทาใหเอนไซมเกดการเปลยนโครงรปไปจนทาใหตวยบยงจบดวยได ตวยบยงชนดนจะไมแขงขน

กบซบสเตรตในการเขาจบกบบรเวณเรง ดงนนจงไมสามารถแกไขผลการยบยงทเกดขนโดยการเพม

ความเขมขนของซบสเตรต รปแบบของการยบยงเขยนไดดงน

ภาพท 2.8 (ก) สมการรปแบบของการยบยงแบบ Uncompetitive (ข) ภาพจาลองการยบยงแบบ

Uncompetitive ( ค ) ผ ล ข อง ตว ยบ ย ง แ บ บ Uncompetitive แ ส ด ง ด ว ยก รา ฟ ข อ ง

Lineweaver-Burk เมอแปรคาความเขมขนของตวยบยงจากทไมมตวยบยง (α’ = ) และเมอเพม

ความเขมขนเพมขนเปน α’ =1.5, 2… ผลลพธทางจลนศาสตรของเอนไซมทมตวยบยงแบบ

Uncompetitive คอ ทงคา Km และ Vmax ลดลง ทมาของภาพ : (Cox และ Nelson. 2008 : 201-202)

(ก) (ข)

(ค)

17

3. การยบยงแบบไมแขงขนแบบ Noncompetitive เปนการยบยงโดยตว ยบยงเขาจบ

บรเวณทไมใชบรเวณเรง ซงสามารถเขาจบไดทงกบ E หรอ ES ตวยบยงจะทาใหโครงสรางของ

เอนไซมเปลยนไป ทาใหหมเรง (catalytic group) ไมสามารถทางานไดตามปกตหรอไมอยใน

ตาแหนงทเหมาะสมในการเรงปฏกรยา จงเปลยนซบสเตรตใหเปนผลตภณฑไดนอยลงหรอไมไดเลย

ถาการจบกนของซบสเตรตหรอตวยบยงเปนอสระตอกน (KI = K´I) จะเรยกวาการยบยงแบบ pure

noncompetitive inhibition แตถาการเขาจบของซบสเตรตมผลตอการเขาจบของตวยบยง หรอ การ

เขาจบของตวยบยงมผลตอการเขาจบของซบสเตรต (KI ‡ K´ I) จะทาใหมลกษณะคลายการ

แขงขน จงเรยกการยบยงแบบนวา การยบยงแบบผสม (mixed inhibition)

ภาพท 2.9 (ก) สมการรปแบบของการยบยงแบบ Noncompetitive (ข) ภาพจาลองการยบยงแบบ

Noncompetitive (ค) ผลของตวยบยงแบบ pure noncompetitive แสดงดวยกราฟของ

Lineweaver-Burk เมอแปรคาความเขมขนของตวยงยง ผลลพธทางจลนศาสตรของเอนไซมทมตว

ยบยงแบบ pure noncompetitive คอ ทงคา Km คงท และ Vmax ลดลง และ (ง) ผลของตวยบยงแบบ

ผสม (mixed) คอ คา Km เพมขน ในขณะท Vmax ลดลง ทมาของภาพ : (Cox และ Nelson. 2008 : 201-202)

(ก) (ข)

(ค) (ง)

18

บทท 3

วธการดาเนนการวจย

เครองมอวทยาศาสตร

1. เครองชงทศนยม 4 ตาแหนง

2. สเปกโตรโฟโตมเตอรแบบ microplate reader (Visible)

3. ปเปต และ มลตชลเนลปเปตขนาดตางๆ

4. จานหลมขนาด 96 ชอง (96 well plate)

สารเคม / สารสกด / เอนไซม

1. DMSO

2. Methanol

3. Sodium dihydrogen phosphate / Sodium hydrogen phosphate

4. Mushroom tyrosinase lyophilized powder (CAS Number 9002-10-2)

(T3824, Sigma-Aldrich)

5. Dalbergia parviflora extract

6. Flavonoids (isolated from Dalbergia parviflora)

การวเคราะหฤทธของสารสกดตอการยบยงเอนไซมไทโรซเนส

1. เตรยมสารละลายสารสกดหยาบ หรอ สารละลายสารฟลาโวนอยดบรสทธทความเขมขน

5 mg/mL โดยใชตวทาละลายคอ 50% (v/v) DMSO

2. เตรยมสารละลาย 2.5 mM L-DOPA ใน 20 mM phosphate buffer (PB) pH 6.8

3. เตรยมสารละลายเอนไซมไทโรซเนส (Mushroom tyrosinase, E.C. . . . , Sigma)

ความเขมขน 100 Unit/mL ใน 20 mM phosphate buffer (PB) pH 6.8

4. เตรยมปฏกรยาในจานหลมขนาด 96 หลม (ตารางท 3.1) ซงประกอบไปดวย 20 mM

phosphate buffer (PB) pH 6.8 จานวน 140 µL สารสกดตวอยางทตองการทดสอบทความเขมขน

ตางๆ จานวน 20 µL สารละลายเอนไซมไทโรซเนส 100 Unit/mLจานวน 20 µL จากนนนาไปบมท

19

อณหภม °C เปนเวลา 10 นาท แลวจงเตม . mM L-DOPA จานวน 20 µL เพอเรมตนปฏกรยา

และนาไปบมทอณหภม °C เปนเวลา 20 นาท นาสารละลายผสมปฏกรยาไปวดคาการดดกลน

แสงทความยาวคลน nm พรอมกบทาการทดลองชดควบคมโดยใชสารละลาย 50% DMSO

จานวน 20 µL แทนการใชสารละลายสารสกด

5. คานวณรอยละการยบยงเอนไซมไทโรซเนส (% inhibition) จากสตรตอไปน

% inhibition = {[(∆Ac - ∆AB) - (∆AS - ∆AB)] / (∆Ac - ∆AB)}× 100

เมอ ∆AC = ผลตางของคาการดดกลนแสงท 475 นาโนเมตร ทเวลา 10 นาท และ 0 นาท

ของการทดลองกลมควบคม (control)

เมอ ∆AB = ผลตางของคาการดดกลนแสงท 475 นาโนเมตร ทเวลา 10 นาท และ 0 นาท

ของการทดลองกลม Blank

∆AS = ผลตางของคาการดดกลนแสงท 475นาโนเมตร ทเวลา 10 นาท และ 0 ของการ

ทดลองกลมทใชสารสกด (Blank)

คา IC50 (concentration providing 50% inhibition) สามารถคานวณไดจากการวาดกราฟ

ของรอยละการยบยง (%inhibition) กบคาความเขมขนของสารสกดแลวสรางสมการความสมพนธ

เชงเสนเพอเทยบกลบเปนคาความเขมขนของสารสกดททาใหมการยบยงเอนไซมไทโรซเนสไดท

รอยละ 50

ตารางท 3.1 แสดงรายการและปรมาตรของสวนผสมในปฏกรยาการวดคาการยบยง

เอนไซมไทโรซเนส

ปฏกรยา

Phosphate

Buffer

pH 6.8

สาร

สกด

50%

DMSO

100 Unit/mL

Mushroom

tyrosinase

2.5 mM

L-DOPA

Total

volume

(µL) (µL) (µL) (µL) (µL) (µL)

C (control) 140 - 20 20 20 200

S (Sample) 140 20 - 20 20 200

B (Blank) 160 20 - 20 - 200

Final conc. - Various* 5% 10 U/Rx 0.25 mM

*สารสกดทาการแปรผนความเขมขนระดบตางๆ (0-1000 µM หรอ 0-1000 µg/mL)

20

การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร

สารฟลาโวนอยดบรสทธทแสดงฤทธยบยงเอนไซมไทโรซเนสไดสงจะถกคดเลอกมาศกษา

จลนศาสตรการยบยงเอนไซมโดยใชหลกของไลนวเวอร และเบรก (Lineweaver and Burk double-

reciprocal plot)(Lineweaver and Burk, 1934) ซงจะทาการวดอตราเรวเรมตนของปฏกรยา (V0)

ทมและไมมตวยบยง โดยแปรผนความเขนขนซบสเตรต L-DOPA ทความเขมขน , . , . ,

. และ . mM โดยทาการทดลองในลกษณะเดยวกบการวเคราะหฤทธของสารสกดตอการ

ยบยงเอนไซมไทโรซเนสทในจานหลมไมโคเพลทแตจะวดอตราเรวเรมตนของปฏกรยาซงจะตองอาน

คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 475 นาโนเมตรททกๆ 30 วนาท เปนเวลา 10 นาท และทาการ

วเคราะหผลดวยโปรแกรม GraphPad Prism software (version . ) เพอรายงานคาทาง

จลนศาสตรของเอนไซมและวเคราะหชนดของกลไกการยบยง

21

บทท 4

ผลการวจย

การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร

สารสกดบรสทธจานวน 4 ชนดไดแก Khrinone B ( ) Cajanin ( ) ( RS)- '-hydroxy- -

methyoxy vestitol ( ) และ ( aR, aR)- , -dihydroxy- -methoxy pterocarpan ( ) (ภาพท

. ) ทพบวามฤทธยบยงเอนไซมไทโรซเนสสง โดยมคา IC ตากวา 100 µM ไดถกนามาศกษา

จลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยใชความสมพนธจากสมการของ Michaelis-Menten

และการวาดกราฟแบบ Lineweaver-Burk ซงแสดงถงชนดของการยบยง (type of inhibition) ของ

สารประกอบ , , และ ทงนในสภาวะทไมมตวยบยงเอนไซมคาอตราเรวสงสด (Vmax) ของ

การเกด dopachrome โดยเอนไซมนคอ . 5 ΔA /min โดยคานวนหาจากกราฟของ

Lineweaver-Burk ทพจารณาจดตดแกน Y และคา Km ตอ L-DOPA คอ . ± . µM โดย

คานวนหาจากกราฟของ Lineweaver-Burk ทพจารณาจดตดแกน X แสดงดงตารางท 4.1 และภาพ

ท 4.2

พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ Khrinone B ( ) ระบวาเปนการ

ยบยงชนด uncompetitive inhibitor ตอเอนไซมไทโรซเนส ตางๆ (ตารางท 4.2 และภาพท 4.3) โดย

มคาคงทการยบยง (Ki) เปน . ± . µM ซงลกษณะของการยบยงชนด uncompetitive inhibitor

ตวยบยงจะเขาจบกบ enzyme-substrate complex และลดอตรการเกดผลตภณฑ ทงน enzyme-

inhibitor-substrate complex (EIS) ยงคงเกดปฏกรยาผนกลบไดและยงสามารถเกดผลตภณฑได

จงเปนเหตใหคา Km และ Vmax ลดลง

พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ Cajanin ( ) เผยวาเปนการ

ยบยงชนด non-competitive inhibitor ตอเอนไซมไทโรซเนส (ตารางท 4.3 และภาพท 4.4) ซง

ลกษณะของการยบยงชนด non-competitive inhibitor ตวยบยงและซบสเตรตจะสามารถเขาจบกบ

เอนไซมไดตลอดเวลาโดยมตาแหนงจบคนละตาแหนงกน เมอทงตวยบยงและซบสเตรต เขาจบกบ

เอนไซมแลวจะเกดเปน enzyme-substrate-inhibitor complex (ESI) ทซงไมสามารถเกดเปน

ผลตภณฑตอไปได แตสามารถผนกลบไปเปน enzyme-substrate complex (ES) หรอ enzyme-

inhibitor complex (EI) ดงนนจงพบวาคา Vmax ลดลง โดยไมมผลตอคา Km คาคงทการยบยง (Ki)

ของการเขาจบระหวางตวยบยงกบเอนไซม และระหวางซบสเตรตกบเอนไซมจงเทากน และจากการ

ทดลองนมคาเปน . ± . µM

22

พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy

vestitol (21) แสดงใหเหนวาเปนการยบยงชนด mixed inhibition (ตารางท 4.4 และภาพท 4.5) ม

คาคงทการยบยง (Ki) เปน . ± . µM การยบยงแบบผสมนตวยบยงจะสามารถจบกบเอนไซม

ทตาแหนงเดยวกบซบสเตรต คา Km อาจคงทหรอมการเปลยนแปลงกไดแตคา Vmax ทสงเกตไดจะ

ลดลง

พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ ( aR, aR)- , -dihydroxy- -

methoxy pterocarpan ( ) พบวาเปนการยบยงชนด competitive inhibition (ตารางท 4.5 และ

ภาพท 4.6) มคาคงทการยบยง (Ki) เปน . ± . µM กลไกการยบบงชนด competitive inhibition

ตวยบยงจะรบกวนการเขาจบของซบสเตรตบนตาแหนงจบของเอนไซม เปนเหตใหคา Km เพมสงขน

โดยไมผลกระทบตอคา Vmax

ภาพท 4.1 โครงสรางของสารฟลาโวนอยด 4 ชนดทนามาศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซม

ไทโรซเนสจากเหด

23

ตารางท 4.1 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ

สารตงตน (L-Dopa) โดยไมมตวยบยง

Subsrate (L-Dopa)

(mM) ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)

0.0625 0.00429

0.125 0.00771

0.25 0.01203

0.5 0.01564

1 0.01903

ภาพท 4.2 (ก) กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยา (Michaelis-Menten saturation curve) ทเรง

ดวยเอนไซมไทโรซเนส แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (Vo) กบความเขมขนของ

ซบสเตรต [L-Dopa] โดยไมมการเตมตวยบยง (ข) Double reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอร

เบรก (Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน X คอ -1/Km และความชน

คอ Km/ Vmax

ก

ข

24


สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง Khrinone B ( )

Subsrate (L-Dopa)

(mM)

ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)

ความเขมขนของตวยบยง Khrinone B ( )

0 µM 18.196 µM 27.21 µM 54.62 µM 109.24µM

0.0625 0.004440 0.004340001 0.004079999 0.003670 0.003400

0.1250 0.007400 0.007390 0.006610001 0.005760 0.005170

0.2500 0.012130 0.010490 0.010210 0.008339998 0.007220

0.5000 0.01648536 0.013890 0.013300 0.010990 0.009150

1.0000 0.02051593 0.017420 0.016490 0.012980 0.010470



ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง Khrinone B ( ) (ข) Double

reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax

จดตดแกน X คอ -1/Km และความชนคอ Km/ Vmax

ก

ข

25

ตารางท4.3 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ

สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง Cajanin (9)

Subsrate (L-Dopa)

(mM)


ความเขมขนของตวยบยง Cajanin (9)

0 µM 24.97 µM 37.44 µM 74.88 µM 149.77 µM

0.0625 0.00429 0.00306 0.00259 0.00201 0.0016

0.1250 0.00771 0.00430 0.00423 0.00333 0.0028

0.2500 0.01203 0.00820 0.00772 0.00640 0.00417

0.5000 0.01564 0.01085 0.00932 0.00719 0.00583

1.0000 0.01903 0.01441 0.01223 0.00930 0.00748



ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง Cajanin (9) (ข) Double reciprocal

plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน

X คอ -1/Km และความชนคอ Km/ Vmax

ก

ข

26


สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21)

Subsrate (L-Dopa)

(mM)


ความเขมขนของตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21)

0 µM 25.26 µM 51.11 µM 102.20 µM 204.40 µM

0.0625 0.00429 0.002860 0.002460 0.002060 0.0017

0.1250 0.00771 0.004800 0.003910 0.003489 0.00312

0.2500 0.01203 0.008240 0.007570 0.006260 0.00521

0.5000 0.01564 0.012130 0.009160 0.008970 0.00741

1.0000 0.01903 0.014641 0.012690 0.011690 0.0099



ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy

vestitol (21) (ข) Double reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk

equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน X คอ -1/Km และความชนคอ Km/ Vmax

ก

ข

27


สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy pterocarpan (27)

Subsrate (L-Dopa)

(mM)


ความเขมขนของตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy pterocarpan

(27)

0 µM 1.64 µM 3.28 µM 6.55 µM

0.0625 0.00521823 0.004218 0.003412 0.002774

0.1250 0.00844834 0.007110 0.005890 0.004934

0.2500 0.01124181 0.009700 0.008860 0.007430

0.5000 0.01622181 0.014300 0.012510 0.011170

1.0000 0.02068944 0.019100 0.019035 0.017230



ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-

methoxy pterocarpan (27) (ข) Double reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก

(Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน X คอ -1/Km และความชนคอ

Km/ Vmax

ก

ข

28

บทท 5

สรปและอภปรายผลการวจย

จากตวอยางสารสกดฟลาโวนอยดบรสทธจานวน 11 ชนดทสกจากแกนคร พบวามสาร 4

ชนดทใหคา IC50 ตากวา 100 µM ซงไดแก Khrinone B ( ) Cajanin ( ) ( RS)- '-hydroxy- -

methyoxy vestitol ( ) และ ( aR, aR)- , -dihydroxy- -methoxy pterocarpan ( ) ซงได

นามาศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนส เพอรายงานผลการวเคราะหชนดของการยบยง

และคาคงทการยบยง (Ki) ซงคา Ki จะแตกตางจากคา IC50 โดยทคา Ki จะมประโยชนในการบงบอก

ถงศกยภาพของความเปนตวยบยงของสารแตละชนด ในขณะทคา IC50 จะใชปรยบเทยบผลการ

ทดลองทกระทาในสภาวะเดยวกน เนองจากคา IC50 อาจแปรผนไปเมอเปลยนแปลงสภาวะการ

ทดลองบางอยางเชน ความเขมขนซบสเตรต ความเขมขนเอนไซม อณหภมและระยะเวลาการบม

ปฏกรยา นอกจากนงานวจยนยงไดทดลองใชกรดโคจกเปนชดการทดลองควบคมผลบวกซงไดผล

การวเคราะหทางจลนศาสตรการยบยงเปนการยบยงแบบผสม (mixed inhibition) มคา Ki เปน

7.5 ± 1.0 µM เมอเปรยบเทยบกบสารประกอบ ( aR, aR)- , -dxiihydroxy- -methoxy

pterocarpan ( ) ทมคา Ki เปน 6.4 ± 0.9 µM แสดงใหเหนวาสารประกอบ 27 มประสทธภาพการ

ยบยงเทยบเทากบกรดโคจก ในขณะทสารประกอบออกซเรสเวอราทรอลไดเคยมรานงานการวจย

กอนหนานวาใหผลการยบยงเปนชนด non-competitive ตอเอนไซมไทโรซเนส และมคา Ki เปน .

µM (Alam et al., 2009)

การศกษาตวยบยงของเอนไซม ทาใหทราบกลไกการออกฤทธของสารเคมตาง ๆ ตอระบบ

ชวภาพและยงเปนเครองมอทดในการศกษากลไกการทางานของเอนไซมในรายละเอยด การยบยง

ของสารฟลาโวนอยดแตละชนดทสกดแยกไดจากแกนครพบวา มการยบยงแบบแขงขน

(competitive) และ การยบยงแบบไมแขงขน (non-competitive และ uncompetitive) การยบยง

แบบแขงขนตวยบยงจะเขาจบบนโมเลกลของเอนไซมบรเวณเดยวกบสารตงตน ในขณะทการยบยง

แบบไมแขงขนตวยบยงจะเขาจบกนคนละบรเวณกบสารตงตน ซงการยบยงแบบไมแขงขนมกจะเปน

ความสามารถในการเปลยนโครงรปของเอนไซมหรอกระทบตอจลนศาสตรของเอนไซม

29

การยบยงแบบแขงขน (competitive inhibition) ทพบในกรณของ ( aR, aR)- , -

dihydroxy- -methoxy pterocarpan ( ) อาจสนนษฐานไดวาการยบยงลกษณะนตวยบยงมหม

ฟงกชนบางตาแหนงคลายกบซบสเตรต (S) จงสามารถแยงเขาจบกบบรเวณเรง (active site) บน

เอนไซมได การยบยงแบบแขงขนนสามารถผนกลบได (reversible) เพราะวาตวยบยงและสารตงตน

พยายามแขงขนแยงกนเขาจบกบบรเวณเรงของเอนไซม หากตวใดมความเขมขนมากกวา กจะเขา

จบไดดกวา และการยบยงแบบนเปนการยบยงแบบยอนกลบได โดยการกาจดตวยบยงออกไปจาก

สารละลาย หรอโดยการเพมความเขมขนของสารตงตน สารตงตนทมจานวนความเขมขนสงกวาจะ

เขาแยงจบทบรเวณเรง ทาใหตวยบยงหลดออกไปจากบรเวณเรง

การยบยงแบบไมแขงขนแบบ pure noncompetitive inhibition ทพบในกรณของ Cajanin

( ) เปนการยบยงโดยตวยบยงเขาจบททไมใชบรเวณเรง โดยเขาจบไดทงกบสารเชงซอนเอนไซม-

สารตงตน (ES complex) และเอนไซมอสระ (E) หรอกลาวอกอยางหนงวาตวยบยงชนดน สามารถ

เขาจบกบเอนไซมได โดยไมสนใจวามสารตงตนจบอยกบเอนไซมหรอไม นอกจากนตวยบยงแบบน

ไมรบกวนการจบของสารตงตนทบรเวณเรง แตจะทาใหโครงสรางของเอนไซมเปลยนไป ทาให

catalytic group ของเอนไซมไมสามารถทางานไดตามปกต จงเปลยนสารตงตนใหเปนผลตภณฑได

นอยลงหรอเปลยนไมไดเลย ในขณะท ( RS)- '-hydroxy- -methyoxy vestitol ( ) สามารถเขา

จบไดกบทงเอนไซมอสระ (E) หรอ ES complex ไดเชนเดยวกน แตเมอภายหลงจากทตวยบยงเขา

จบแลว มผลทาใหเกดการเปลยนแปลงของเอนไซมทาให affinity ของเอนไซมตอซบสเตรต

เปลยนแปลงไป ซงอาจจะทาใหสารเชงซอนเอนไซม-ตวยบยง (EI complex) จบกบซบสเตรตไดมาก

ขนหรอลดลงจากเดม ดงนนจงไดเรยกตวยบยงนใหมเปน mixed type inhibitor

การยบยงแบบไมแขงขนแบบท uncompetitive inhibition ทพบในกรณของ Khrinone B

( ) เปนการยบยงโดยตวยบยงเขาจบเฉพาะกบสารประกอบเชงซอนเอนไซม-สารตงตน (ES

complex) แตไมจบกบเอนไซมอสระ (E) ผลของการจบของตวยบยงทาใหเอนไซมเสยโครงรปไป ทา

ใหความสามารถในการเปลยนสารตงตนใหเปนผลตภณฑลดลงหรอหมดไป อยางไรกตาม เมอนาไป

วเคราะหตามสมการของไมเคลส-เมนเทน และเขยนกราฟตามสมการลายวฟเวอรเบอรก พบวาทง

คาคงทของไมเคลส (Km) และคาความเรวสงสด (Vmax) กลบลดลง

30

บรรณานกรม

สกญญา สนทรส และวเชยร รมพณชยกจ. (2553). ชวโมเลกล. พมพครงท 3. กรงเทพฯ :

สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย.

Alam, N., Shim, M. J., Lee, M. W., Shin, P. G., Yoo, Y. B., Lee, T. S., 2009. Vegetative

Growth and Phylogenetic Relationship of Commercially Cultivated Strains of Pleurotus

eryngii based on ITS sequence and RAPD. Mycobiology 37, 258-266.

Chen, Z. Y., Chan, P. T., Ho, K. Y., Fung, K. P., Wang, J., 1996. Antioxidant activity of

natural flavonoids is governed by number and location of their aromatic hydroxyl

groups. Chem Phys Lipids 79, 157-163.

Croft, K. D., 1998. The chemistry and biological effects of flavonoids and phenolic acids.

Ann N Y Acad Sci 854, 435-442.

Devasagayam, T. P., Tilak, J. C., Boloor, K. K., Sane, K. S., Ghaskadbi, S. S., Lele, R.

D., 2004. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future

prospects. J Assoc Physicians India 52, 794-804.

Fernandez-Panchon, M. S., Villano, D., Troncoso, A. M., Garcia-Parrilla, M. C., 2008.

Antioxidant activity of phenolic compounds: from in vitro results to in vivo evidence.

Crit Rev Food Sci Nutr 48, 649-671.

Grotewold, E., 2006. The Science of Flavonoids. Springer, Ohio, USA.

Jeong, S. H., Ryu, Y. B., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Baek, Y. S., Kang, J. E., Lee,

W. S., Park, K. H., 2009. Tyrosinase inhibitory polyphenols from roots of Morus ihou.

J Agric Food Chem 57, 1195-1203.

Kim, H. P., Son, K. H., Chang, H. W., Kang, S. S., 2004. Anti-inflammatory plant

flavonoids and cellular action mechanisms. J Pharmacol Sci 96, 229-245.

Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Capua, I., Beneduce, L., Gallotta,

A., Pengo, P., Fassina, G., Miertus, S., De-Eknamkul, W., 2012. A screening assay

for neuraminidase inhibitors using neuraminidases N1 and N3 from a baculovirus

expression system. J Enzyme Inhib Med Chem 27, 5-11.

31

Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Capua, I., Beneduce, L., Gallotta,

A., Pengo, P., Fassina, G., Monthakantirat, O., Umehara, K., De-Eknamkul, W.,

Miertus, S., 2011. The quenching effect of flavonoids on 4-methylumbelliferone, a

potential pitfall in fluorimetric neuraminidase inhibition assays. J Biomol Screen 16,

755-764.

Lineweaver, H., Burk, D., 1934. The Determination of Enzyme Dissociation Constants.

Journal of the American Chemical Society 56, 658–666.

Miyazawa, M., Tamura, N., 2007. Inhibitory compound of tyrosinase activity from the

sprout of Polygonum hydropiper L. (Benitade). Biol Pharm Bull 30, 595-597.

Nerya, O., Vaya, J., Musa, R., Izrael, S., Ben-Arie, R., Tamir, S., 2003. Glabrene and

isoliquiritigenin as tyrosinase inhibitors from licorice roots. J Agric Food Chem 51,

1201-1207.

Nijveldt, R. J., van Nood, E., van Hoorn, D. E., Boelens, P. G., van Norren, K., van

Leeuwen, P. A., 2001. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and

potential applications. Am J Clin Nutr 74, 418-425.

Prochazkova, D., Bousova, I., Wilhelmova, N., 2011. Antioxidant and prooxidant

properties of flavonoids. Fitoterapia. 82, 513-523

Promden, W., Monthakantirat, O., Umehara, K., Noguchi, H., De-Eknamkul, W., 2014.

Structure and antioxidant activity relationships of isoflavonoids from Dalbergia

parviflora. Molecules 19, 2226-2237.

Rice-Evans, C. A., Miller, N. J., Paganga, G., 1996. Structure-antioxidant activity

relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 20, 933-956.

Ryu, Y. B., Ha, T. J., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Gal, S. W., Park, K. H., 2008.

Inhibitory effects on mushroom tyrosinase by flavones from the stem barks of Morus

ihou (S.) Koidz. J Enzyme Inhib Med Chem 23, 922-930.

Songsiang, U., Wanich, S., Pitchuanchom, S., Netsopa, S., Uanporn, K., Yenjai, C., 2009.

Bioactive constituents from the stems of Dalbergia parviflora. Fitoterapia 80, 427-431.

Tereschuk, M. L., Riera, M. V., Castro, G. R., Abdala, L. R., 1997. Antimicrobial activity of

flavonoids from leaves of Tagetes minuta. J Ethnopharmacol 56, 227-232.

32

Theos, A. C., Tenza, D., Martina, J. A., Hurbain, I., Peden, A. A., Sviderskaya, E. V.,

Stewart, A., Robinson, M. S., Bennett, D. C., Cutler, D. F., Bonifacino, J. S., Marks,

M. S., Raposo, G., 2005. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase

sorting from endosomes to melanosomes. Mol Biol Cell 16, 5356-5372.

Tsao, T. F., Newman, M. G., Kwok, Y. Y., Horikoshi, A. K., 1982. Effect of Chinese and

western antimicrobial agents on selected oral bacteria. J Dent Res 61, 1103-1106.

Yang, H. L., Chen, S. C., Senthil Kumar, K. J., Yu, K. N., Lee Chao, P. D., Tsai, S. Y.,

Hou, Y. C., Hseu, Y. C., 2012. Antioxidant and anti-inflammatory potential of

hesperetin metabolites obtained from hesperetin-administered rat serum: an ex vivo

approach. J Agric Food Chem 60, 522-532.

Yao, L. H., Jiang, Y. M., Shi, J., Tomas-Barberan, F. A., Datta, N., Singanusong, R.,

Chen, S. S., 2004. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods Hum Nutr

59, 113-122.

33

ภาคผนวก

34

ประวตนกวจย

1. นายวรวฒน พรมเดน (Worrawat Promden, Ph.D)

เลขหมายบตรประจาตวประชาชน 3311100069820

ตาแหนงปจจบน ผชวยศาสตราจารย

หนวยงานทสงกดและสถานทอยทตดตอไดสะดวก

สาขาวทยาศาสตรทวไป คณะครศาสตร มหาวทยาลยราชภฏบรรมย เลขท ถ.จระ

ต.ในเมอง อ.เมอง จ.บรรมย

หมายเลขโทรศพทเคลอนท 089-424-2324

ไปรษณยอเลกทรอนกส (e-mail) [email protected]

ประวตการศกษา

ปทจบการศกษา ชอสถานศกษา ไดรบปรญญา/สาขา

พ.ศ. 2547 จฬาลงกรณมหาวทยาลย วทยาศาสตรบณฑต (วท.บ) สาขาชวเคม

พ.ศ. 2550 มหาวทยาลยรามคาแหง ศลปศาสตรบณฑต (ศศ.บ) สาขาปรชญา

พ.ศ. 2551 จฬาลงกรณมหาวทยาลย วทยาศาสตรดษฎบณฑต (วท.ด) สาขาชวเคม

สาขาวชาการทมความชานาญพเศษ

อณชววทยาและพนธวศกรรมในแบคทเรย ผลตภณฑธรรมชาตและสารตานอนมลอสระ

ประสบการณทเกยวของกบการบรหารงานวจย

พ.ศ. 2553-2555 ผประสานงานหลก หนวยปฏบตงานวจยผลตภณฑธรรมชาตและ

เทคโนโลยชวภาพ คณะเภสชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

การเผยแพรผลงานวจย Publications (5 ปยอนหลง)

งานวจยตพมพในวารสารวชาการ

1. Worrawat Promden, Alisa S. Vangnai, Piamsook Pongsawasdi, Osao Adachi, Kazunobu

Matsushita & Hirohide Toyama. Disruption of quinoprotein ethanol dehydrogenase gene

35

and adjacent genes in Pseudomonas putida HK5. FEMS Microbiology Letters, 280 (2),

203-209, March 2008.

2. Worrawat Promden, Alisa S. Vangnai, Hirohide Toyama, Kazunobu Matsushita, and

Piamsook Pongsawasdi. Analysis of promoter activities of the genes encoding three

quinoprotein alcohol dehydrogenases of Pseudomonas putida HK5. Microbiology, 155,

594-603, February 2009.

3. Fuminori Fukaya, Worrawat Promden, Takashi Hibino, Yoshito Tanaka, Tatsunosuke

Nakamura, and Teruhiro Takabe. An Mrp-like cluster in the halotolerant cyanobacterium

Aphanothece halophytica functions as a Na+/H+ antiporter. Applied and Environmental

Microbiology, 75, 6626-6629, October 2009.

4. Nana Yamada, Worrawat Promden, Koji Yamane, Hideto Tamagake, Takashi Hibino,

Yoshito Tanaka, and Teruhiro Takabe. Preferential accumulation of betaine uncoupled to

choline monooxygenase in young leaves of Sugar beet -Importance of long distance

translocation of betaine under normal and salt-stressed conditions. Journal of Plant

Physiology, 116(18), 2058-2070, December 2009.

5. Alisa S. Vangnai, Worawat Promden, Wanchai De-Eknamkul, Kazunobu Matsushita,

and Hirohide Toyama. Molecular characterization and heterologous expression of quinate

dehydrogenase gene from Gluconobacter oxydans IFO3244. Biochemistry (Moscow),

75(4), 452-459, May 2010.

6. Kanteera Soontharapirakkul, Worrawat Promden, Nana Yamada, Hakuto Kageyama,

Aran Incharoensakdi, Atsuko Iwamoto-Kihara, and Teruhiro Takabe. Halotolerant

cyanobacterium Aphanothece halophytica contains a Na+-dependent F1F0-ATP synthase

with potential role in salt tolerance. Journal of Biological Chemistry, 286(12), 10169–

10176, March, 2011.

36

7. Nana Yamada, Suriyan Cha-Um, Hakuto Kageyama, Worrawat Promden, Yoshito

Tanaka, Chalermpol Kirdmanee and Teruhiro Takabe. Isolation and characterization of

proline/betaine transporter gene from oil palm. Tree Physiology 31, 462–468, April, 2011.

8. Pithi Chanvorachote, Sudjit Luanpitpong, Preedakorn Chunhacha, Worrawat Promden,

Virote Sriuranpong, Expression of CA125 and cisplatin susceptibility of pleural effusion-

derived human lung cancer cells from a Thai patient. Oncology Letters, 252-256, May,

2012.

9. Worrawat Promden, Orawan Monthakantirat, Kaoru Umehara, Hiroshi Noguchi and

Wanchai De-Eknamkul. Structure and Antioxidant Activity Relationships of Isoflavonoids

from Dalbergia parviflora. Molecules, 19, pp. 2226-2237. February, 2014.

10. Siriluk Sintupachee, Worrawat Promden, Nattaya Ngamrojanavanich, Worapan

Sitthithaworn,Wanchai De-Eknamkul. Functional expression of a putative geraniol 8-

hydroxylase by reconstitution of bacterially expressed plant CYP76F45 and

NADPHcytochrome P450 reductase CPR I from Croton stellatopilosus Ohba.

Phytochemistry, 118, pp. 204–215. October,2015.

บทความวชาการ

วรวฒน พรหมเดน. (2556). ชวเคมของเอนไซมแอลกอฮอลดไฮโดรจเนสในแบคทเรย. วารสาร

วจย มข., 18(6), หนา 1003-1020.

ประวตการไดรบทน

1. พ.ศ. 2548-2550 : ทน โครงการปรญญาเอกกาญจนาภเษก รนท 8 สานกงานกองทนสนบสนน

การวจย (สกว.)

2. พ.ศ. 2551-2552 : ทนนกวจย สถาบนวจยมหาวทยาลยเมโจ (Meijo University) เมองนาโกยา

ประเทศญป น

37

3. พ.ศ. 2553-2554 : ทนนกวจยหลงปรญญากองทนเอกรชดาภเษกสมโภช บณฑตวทยาลย

จฬาลงกรณมหาวทยาลย

4. พ.ศ. 2557: ทนสนบสนนโครงการวจย ประจาปงบประมาณ 2557 โดยสานกบรหารโครงการ

สงเสรมการวจยในอดมศกษาและพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต





38

. นายเทพพร โลมารกษ (Tepporn Lomarak, Ph.D)

เลขหมายบตรประจาตวประชาชน

ตาแหนงปจจบน อาจารย (พนกงานมหาวทยาลย)

หนวยงานทสงกด สาขาวทยาศาสตรทวไป คณะครศาสตร มหาวทยาลยราชภฏบรรมย

เลขท ถ.จระ ต.ในเมอง อ.เมอง จ.บรรมย

สถานทอยทตดตอไดสะดวก สาขาวทยาศาสตรทวไป คณะครศาสตร มหาวทยาลยราช

ภฏบรรมย เลขท ถ.จระ ต.ในเมอง อ.เมอง จ.บรรมย

หมายเลขโทรศพทเคลอนท

ไปรษณยอเลกทรอนกส (e-mail) [email protected]

ประวตการศกษา

การศกษา ระดบการศกษา สถานศกษา

การศกษาดษฎบณฑต (วทยาศาสตรศกษา) มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ

ประกาศนยบตรบณฑต สาขาวชาชพคร มหาวทยาลยขอนแกน

วทยาศาสตรบณฑต สาขาเคม มหาวทยาลยอบลราชธาน

สาขาวชาการทมความชานาญพเศษ (แตกตางจากวฒการศกษา) : การวจยทางดานการสอน

วทยาศาสตรการใชสอออนไลนสาหรบการสอนวทยาศาสตร และการนเทศนกศกษาฝกประสบกาณ

วชาชพคร

ผลงานวจย:

. Enhancing High School Students' Conceptual Understanding of Chemical Bonding by

Using Learning Units Incorporated with Information Processing Theory

. A Development of High School Chemical Bonding Learning Units Incorporated with

Information Processing Theory

39

ปรญญาการศกษาดษฎบณฑต (วทยาศาสตรศกษา)

ประธานกรรมการทปรกษา: ผชวยศาสตราจารย ดร. จนดา แตมบรรจง

กรรมการทปรกษา: รองศาสตราจารย ดร. สมสรร วงษอยนอย

ดร. ปรชาญ เดชศร

แหลงตพมพ: วารสารศรนครนทรวโรฒวจยและพฒนา (สาขามนษยศาสตรและสงคมศาสตร)

มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ ปท ฉบบท มกราคม-มถนายน พ.ศ.

Alam, N., Shi m, M. J., Lee, M. W., Shin, P . G., Yo o, Y. B., Lee, T. S., 2009. Vegetative Growth and Phylogenetic Relatio nshi p o f Com mercially Cultivated Strains o f Pleur otus eryngii ba sed o n ITS seq uen ce and RAPD. My cobi ology 37, 258-2 66. Chen, Z. Y., Cha n, P. T., Ho , K. Y., Fung, K. P., Wang, J., 1996. A ntioxi dant activity of natural flavonoi ds is govern ed by num ber and lo cation of their aromatic hydroxyl group s. Chem P hys Lipi ds 79, 1 57-163. Croft, K. D ., 1998 . The che mistry and biol ogical effe cts o f flavo noid s and phenolic aci ds. An n N Y Acad Sci 854, 435-4 42. Devasagayam, T. P., Tilak, J. C., B oloor, K. K., Sane, K. S., Ghaskadbi, S. S., Lele, R. D., 20 04. Free radical s and anti oxidants in h uma n health: curre nt status and future pros pects. J Ass oc P hysicians India 5 2, 794-80 4. Fernandez -Panchon, M. S., Villano, D., Tronco so, A. M., Gar cia-Parrilla, M. C ., 2008. Antioxi dant activity of phen olic c om pou nd s: fro m in vitro res ults to in vivo eviden ce. Crit Rev Fo od Sci Nutr 48, 649 -671. Grotewold, E., 2 006. T he Scien ce o f Flavonoi ds. Springer, Ohi o, USA. Jeong, S. H., Ryu, Y. B., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Baek, Y. S., Kang, J. E., Lee, W. S., Park, K. H., 200 9. Tyrosinase inhi bitory polyphenols fro m root s of M orus ihou. J Agric Food C hem 57, 11 95-1203. Kim, H. P. , Son, K. H., Cha ng, H. W., Kang, S. S., 2004 . Anti-in flammatory plant flavonoi ds an d cellular action mechanisms. J Pharmacol Sci 96, 229-245. Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Ca pua, I., Benedu ce, L., Gallotta, A., Pengo, P., Fassina, G., Miertus, S., De-Eknamkul, W., 2 012. A screening assay for neuraminidas e inhibit ors usi ng neura minida ses N 1 and N 3 fro m a ba culoviru s expressio n system. J Enzyme I nhi b Med Che m 27, 5-1 1. Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Ca pua, I., Benedu ce, L., Gallotta, A., Pengo, P., Fassina, G., Mo nthakantirat, O., U mehara, K ., De-Eknamkul, W., Miertus, S., 2 011. Th e que nc hing effect of flavon oids o n 4-methylum bellifero ne, a p otential pitfall in fl uori metric neuramini dase inhibition assays. J Biom ol Scree n 16, 75 5-7 64. Lineweaver, H., Burk, D., 19 34. The Deter mination o f Enzyme Diss ociation Co nstants. Jour nal o f the Ameri can C hemi cal Society 56, 658–666. Miyazawa, M., Tamura, N., 2007 . Inhi bitory co mp ound o f tyrosinase a ctivity from the s prout o f Polyg onu m hydropi per L. (Benita de). Biol P harm B ull 30, 59 5-5 97. Nerya, O., Vaya, J., Musa, R., I zrael, S., Ben -Arie, R. , Tamir, S., 200 3. Glabre ne and isoliquiritigeni n as tyrosinase inhibitor s fro m licorice roots. J Agric Food Chem 51, 1201-1207. Nijveldt, R. J., van No od, E., van Hoorn, D. E., B oelens, P. G., van N orren, K., van Leeuwen, P . A., 2001. Flavon oids: a review of probable me chani sms of action an d potential applications. Am J Clin Nutr 74, 418 -425. Proc hazkova, D., Bous ova, I., Wilhelmova, N., 201 1. Antioxi dant an d prooxidant prop erties of flavon oids. Fitoterapia. Prom den, W., Mo nthakantirat, O., U mehara, K ., Nog uchi, H., De-Eknamkul, W., 20 14. Structure a nd antio xida nt activity relationships of isoflavo noid s from Dalbergia parviflor a. Molecules 1 9, 222 6-2 237. Rice-Evans, C. A., Miller, N. J., Paganga, G., 1996. Struct ure-a ntioxi dant activity relationship s of flavon oids and p henoli c acids. Free Ra dic Bi ol Med 20, 933 -956. Ryu, Y. B., Ha , T. J., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Gal, S. W., Park, K . H., 200 8. Inhi bitory effects on mushroom tyrosinas e by flavo nes fr om th e stem barks of Morus ihou (S.) Koidz. J Enzyme Inhi b Med C he m 23, 922-9 30. Songsiang, U., Wani ch, S., Pitc huan ch om , S., Netso pa, S., Uan porn, K., Yenjai, C., 200 9. Bioa ctive co nstituents from the stems of Dalbergia parviflora. Fitoterapia 80, 427 -431. Teresch uk, M. L., Riera, M. V., Castro, G. R., Ab dala, L. R., 199 7. Antimi crobial activity of flavon oids fr om leave s of T agetes mi nuta. J Ethnopharmacol 56, 22 7-2 32. Theos, A. C ., Tenza, D ., Martina, J. A., Hurbain, I., Pede n, A. A., Sviderskaya, E. V., Stewart, A., Robins on, M. S., B ennett, D. C., Cutler, D. F., Boni faci no, J. S., Marks, M. S., Ra pos o, G., 20 05. Fun ction s of a daptor pr otein (A P)-3 and AP -1 in tyrosinase s orting from endos om es to melanoso mes. Mol Biol C ell 16, 5356-5372. Tsao, T. F., New man, M. G ., Kwok, Y. Y., H orikoshi, A. K. , 1982. Effect o f Chi nese a nd western a ntimicr obial agents on sele cted oral bacteria. J Dent Re s 61, 1103-1106. Yang, H. L., Chen, S. C., Senthil K umar, K . J., Yu, K. N., Lee Chao, P. D., Tsai, S. Y., Hou, Y. C., Hseu, Y. C., 20 12. Antio xidant and anti-i nfla mmatory p otential o f hes peretin m etabolites obtained fro m hes peretin -ad ministere d rat serum : an ex vivo ap proa ch. J Agric Foo d Che m 60, 522 -532. Yao, L. H., J iang, Y. M., Shi, J ., To mas -Bar beran, F. A., Datta, N., Singan usong, R., Che n, S. S., 2004. Flavon oids i n fo od an d their health bene fits. Plant Fo ods Hum Nutr 59, 113-1 22.

Full Report Tyrosinase à¹ à¸ à¸£à¸ à¸ à¸²à¸£à¸¢à¹ à¸à¸¢ 2 ...

Documents

Transcript of Full Report Tyrosinase à¹ à¸ à¸£à¸ à¸ à¸²à¸£à¸¢à¹ à¸à¸¢ 2 ...