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Vol. 44 • N. 176 Ottobre-Dicembre 2014

Farmaci che modulano l’espressione del dna: attuali e potenziali applicazioni in pediatria

ambiente e salute nel bambino

nuove terapie per la fibrosi cistica

Scienze “omiche” e biologia dei sistemi complessi: applicazioni in neurologia pediatricaLa genetica delle epilessie e le epilessie genetiche

Neurologia PeDiaTriCa (a cura di M. Ruggieri)

FroNTiere (a cura di A. Biondi, A. Iolascon, L.D. Notarangelo, M. Zeviani)

FoCus (a cura di G. Andria)

Tavola roToNDa (a cura di F. Sereni, F. Rusconi)

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DirettoreGeneroso Andria, Napoli

Comitato di DirezioneAndrea Biondi, MonzaFranco Chiarelli, ChietiGiovanni Cioni, PisaGiovanni Corsello, PalermoAchille Iolascon, NapoliAlberto Martini, GenovaPierpaolo Mastroiacovo, RomaLuigi Daniele Notarangelo, BostonLuca Ramenghi, GenovaFabio Sereni, MilanoRiccardo Troncone, Napoli

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Vol. 44 • N. 176Ottobre-Dicembre 2014

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Direttore Responsabile: Patrizia Alma Pacini

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INDICE numero 176 Ottobre-Dicembre 2014

NEurOlOgIa pEDIatrICa (a cura di Martino Ruggieri)

Presentazione

Scienze “omiche” e biologia dei sistemi complessi: applicazioni in neurologia pediatricaMartino Ruggieri, Vincenzo Salpietro, Valentina La Cognata, Giovanna Morello, Giulia Gentile, Daniela Concolino, Agata Polizzi, Sebastiano Cavallaro ..................................................................................................................................................... 211

la genetica delle epilessie e le epilessie geneticheGiuseppe Gobbi, Jasenka Sarajlija, Sara Leonardi, Elena Di Pietro, Federico Zara, Pasquale Striano ................................................. 226

FrONtIErE (a cura di Andrea Biondi, Achille Iolascon, Luigi D. Notarangelo, Massimo Zeviani)

Farmaci che modulano l’espressione del DNa: attuali e potenziali applicazioni in pediatriaGiovanna Russo, Milena La Spina, Piera Samperi, Luca Lo Nigro ........................................................................................................ 240

FOCuS (a cura di Generoso Andria)

Nuove terapie per la fibrosi cisticaValeria Raia, Fabiola De Gregorio, Antonella Tosco, Luigi Maiuri ......................................................................................................... 246

taVOla rOtONDa (a cura di Fabio Sereni, Franca Rusconi)

ambIENtE E SalutE NEl bambINO

presentazioneFabio Sereni ......................................................................................................................................................................................... 253

ambiente e malformazioni congenitePierpaolo Mastroiacovo ...................................................................................................................................................................... 254

Inquinamento atmosferico Francesco Forastiere ........................................................................................................................................................................... 256

Inquinamento e sviluppo cognitivoJordi Sunyer ........................................................................................................................................................................................ 258

Inquinamento e tumori infantiliCorrado Magnani ................................................................................................................................................................................. 260

Siti inquinati e salute infantileIvano Iavarone ..................................................................................................................................................................................... 261

Inquinamento e alterazioni del programming fetaleErnesto Burgio ..................................................................................................................................................................................... 262

Inquinamento e interferenti endocriniSergio Bernasconi ............................................................................................................................................................................... 264

ConclusioniFabio Sereni, Franca Rusconi, Generoso Andria .................................................................................................................................. 266

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La sezione di Neurologia pediatrica contiene due articoli di aggiornamento, uno di carattere più generale sulle recenti novità in questo campo, orientato però, in questo numero, verso un tema un po’ più specifico quale le scienze “omiche” e la biologia dei sistemi applicate a questa branca della pediatria, e il secondo focalizzato su entità nosologiche ben conosciute dalla comunità pediatrica (le sindromi epiletti-che) rivisitate alla luce delle più moderne conoscenze e dei progressi più significativi che si sono avuti negli ultimi anni. Il primo articolo riassume – nella sua prima sezione – i principi generali di un campo emergente delle scienze biomediche e non, le cosiddet-te scienze “omiche”, cioè quelle discipline che studiano grandi gruppi di molecole biologiche (per esempio, DNA, RNA, proteine, metaboliti) al fine di valutare i complessi effetti che queste molecole e le funzioni da loro attuate (per esempio, genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica) esercitano sui processi fisiologici e/o patologici all’interno degli organismi viventi. Tale approccio, che è di tipo olistico, ha il fine di poter comprendere, operando con metodi integrativi, principi operativi di livello più elevato, individuando nuove molecole e/o gruppi di molecole (marcatori biologici) che spieghino in maniera più completa (rispondano a) domande biologiche gerarchicamente più complesse (per esempio, patogenesi, storia naturale o successo terapeutico e prognosi di una malattia). Questi principi generali, nella seconda sezione dell’articolo, vengono applicati alla neurologia pediatrica, spiegando, attraverso il dialogo tra diverse piattaforme biologiche (biologia dei sistemi: per esempio, genomica vs. trascrittomica, trascrittomica vs. proteomica/metabolomica) la neurobiologia dello sviluppo del sistema nervoso e le diverse patologie del sistema nervoso in età pediatrica.Il secondo articolo riguarda la genetica delle varie forme d’epilessia e le forme genetiche di epilessia, cioè dell’affezione neurologica più frequente in età pediatrica. Il concetto di epilessia, sia in età evolutiva sia in quella adulta, è cambiato notevolmente negli ultimi anni proprio grazie ai progressi della metodologia e delle tecniche di genetica molecolare e biologia cellulare. Tranne poche e limitate forme la quasi totalità delle sindromi epilettiche ha origine genetica, e, dato interessante (ma in linea con le conoscenze derivate proprio dalle scienze omiche e dalla biologia dei sistemi) alcuni geni e le alterazioni di alcune proteine sottendono numerose forme di epilessia. Dato ancora più interessante, oggi possiamo meglio comprendere perché alcune forme di epilessia si presentano nel bambino (ma anche nell’adulto) all’interno di (in associazione a) fenotipi neurologici assai più complessi che non includono solo il disturbo parossistico di tipo epilettico, ma anche altri quadri neurologici, psichiatrici e/o comportamentali, quali ad esempio disturbi del movimento (per esempio, discinesie, distonie, forme di corea), deficit cognitivi, autismo e disturbi pervasivi dello sviluppo, cefalea, disturbi dell’apprendimento e/o disturbi del sonno. Comprendiamo anche che non è (o non è solo) il danno neuronale causato dal ripetersi delle convulsioni (epilessia) a causare i disturbi neurologici associati (per esempio, autismo, deficit cognitivo, disturbi del movimento) ma sono le errate interazioni tra le proteine anomale causate dal deficit genetico a comportare la molteplicità e la complessità dei disturbi neurologici associati. Si spiega così la gravità di alcuni quadri neurologici, la resistenza al trattamento con i farmaci antiepilettici e la complessità della storia naturale di alcune sindromi epiletti-che. Si intravede anche allo stesso tempo la potenzialità diagnostica delle metodiche oggi a nostra disposizione e la possibilità (presente in alcuni casi o) futura di terapie antiepilettiche genetiche.

Martino RuggieriDipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Pediatria, Università degli Studi di Catania

Neurologia pediatrica

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Ottobre-Dicembre 2014 • Vol. 44 • N. 176 • Pp. 211-225 neurologia pediatrica

Metodologia della ricerca bibliografica

La ricerca degli articoli rilevanti su scienze omiche [omics] e biologia dei sistemi [systems biology] in neurologia pediatrica è stata realizzata utilizzando le seguenti banche dati: (a) Pubmed; e (b) Embase. Le pa-role chiave utilizzate sono state: “genomics”; “transcriptomics”; “pro-teomics”; “metabolomics”; systems biology”; “neurology”; “neurobio-logy”; “brain”; “nervous system”; “children”; “childhood”; “pediatrics”. È stato utilizzato inoltre il seguente filtro: “years 0-18”. È stata attribuita maggiore importanza ai lavori pubblicati negli ultimi 3-5 anni.

Definizioni

Le scienze omiche studiano pools di molecole biologiche (es., ioni, acidi nucleici, proteine, enzimi), con svariate funzioni all’interno degli organismi viventi. Tali funzioni sono legate alle capacità, intrinseche a tali molecole, di potere trasformare (processo di traslazione) le loro strutture e i loro legami chimici e/o elettrostatici in processi energetici/biochimici volti alla creazio-ne di altre strutture o all’interazione con altre strutture, allo scopo ultimo di modificare/creare strutture o funzioni diverse da quelle originali.Esempio: il DNA, costituito da coppie di acidi nucleici legati da le-

Scienze “omiche” e biologia dei sistemi complessi: applicazioni in neurologia pediatrica

Martino Ruggieri1, Vincenzo Salpietro2, Valentina La Cognata3, Giovanna Morello3, Giulia Gentile3, Daniela Concolino4, Agata Polizzi5,6, Sebastiano Cavallaro3,6

1 Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Catania 2 Dipartimento di Scienze Pediatriche, Unità di Genetica e Immunologia Pediatrica, Università di Messina 3 Unità di Genomica Funzionale, Istituto di Scienze Neurologiche, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Catania 4 Dipartimento di Pediatria, Università degli Studi “Magna Grecia”, Catanzaro 5 Centro Nazionale delle Malattie Rare, Istituto Superiore di Sanità, Roma 6 Istituto di Scienze Neurologiche, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Catania/Catanzaro/Cosenza

RiassuntoLe scienze “omiche” si occupano dello studio di pool di molecole biologiche (es., ioni, acidi nucleici, proteine, enzimi) in determinati campioni biologici (per esempio, siero, urine, liquor, saliva, tessuti). Esse analizzano, nel loro insieme: (a) i geni del DNA (genomica) e le loro funzioni (genomica funzionale); (b) i trascritti del DNA, cioè l’RNA (trascrittomica); (c) le proteine (proteomica); (d) i metaboliti all’interno di un organismo (metabolomica). Studiano anche le interazioni tra queste molecole (interattomica) e tra queste molecole e i microrganismi della flora intestinale (microbiomica) o dell’ambiente (infettivoma/infettivomica), i cibi/nutrienti (nutribioma/nutribiomica) e l’ambiente in generale (ambientoma/ambientomica) nonché le modificazioni prodotte da tali interazioni sul DNA (epigenomica). Lo scopo di tale approccio olistico è quello di poter comprendere operando con approcci integrativi, principi operativi di livello più elevato, che nel complesso definiscono la biologia dei sistemi. Ciò al fine di potere rispondere a domande biologiche gerarchicamente più complicate (per esempio, patogenesi, storia naturale o successo terapeutico e prognosi di una malattia). Si avvalgono dell’impiego di tecniche di analisi genetica comparativa (array-CGH) o di variazioni del numero di copie del DNA (CNV) o di sequenziamento del DNA o computazionali che analizzano dati di decine, centinaia o migliaia di molecole/campioni. Tali metodiche sono oggi disponibili in svariati laboratori internazionali e nazionali. L’articolo analizza tali aspetti generali e di laboratorio e le applicazioni di ricerca e pratiche in neurologia pediatrica: per esempio, marcatori biologici nelle distrofie muscolari, nelle malattie immuno-mediate del sistema nervoso centrale, nelle encefalopatie epilettiche e ipossico-ischemiche, nei traumi cranici ed in neuroncologia; nuovi metaboliti in malattie neurodegenerative rare; analisi di sistemi e di reti neuronali/neurali in neurobiologia dello sviluppo.

SummaryThe “omics” focus on the study of pools of biological molecules (e.g., ions, nucleic acids, proteins, enzymes) in biological samples (e.g., serum, urines, cer-ebrospinal fluid, saliva, tissues). They analyse, as a whole: (a) DNA genes (genomics) and their functions (functional genomics); (b) DNA transcripts or RNA (transcriptomics); (c) proteins (proteomics); (d) metabolites (metabolomics). Omics also study reciprocal interactions occurring between such molecules (interactomics) and those between these molecules and the intestinal bacterial flora (microbiomics), the environmental bacterial flora (bacteriomics), food and nutrients (foodomics) and the environment (enviromics) or the environmental modifications affecting the structure of DNA (epigenomics). The aim of such holistic approach is to understand, operating via integrative approaches, higher and more complex hierarchical principles [e.g., (complex) systems biology] aimed in turn to reply to higher-level biological queries (e.g., pathogenesis, natural history or successful prognostic/therapeutic accomplishments). From a practical viewpoint omics use methodologies and techniques based on comparative array genome analysis (array-CGH), copy number variation (CNV), whole-genome sequencing or computed-based assays, which analyse dozens, hundreds or thousands of molecules/samples. These methodologies are currently available in a number of international and national laboratories. The present review article focuses on these general and laboratoy aspects and on the practical laboratory/bench-side applications in the field of paediatric neurology: e.g., biomarkers in muscular dystrophies, in immune-mediated diseases of central nervous system, in epileptic and hypoxic-ischaemic encephalopathies, in brain traumas and in neuroncology; new metabolites in neu-rodegenerative diseases; analysis of neuronal/neural networks and systems in developmental neurobiology.

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gami chimici/elettrostatici, può alterare tali legami, modificando temporaneamente o permanentemente la propria struttura, creando (tra le altre funzioni) un’altra struttura speculare (l’RNA), che attra-verso molteplici passaggi di modificazione della propria struttura, d’interazione con altre strutture e di analisi/interpretazione (“lettu-ra”) della propria sequenza strutturale, creerà strutture diverse dalle precedenti (le proteine) con funzioni, legami e interazioni differenti da quelle originali (Mortazavi et al., 2008; Cookson et al., 2009).Le scienze omiche hanno quindi l’obiettivo primario di analizzare nel loro insieme: (a) i geni contenuti nel DNA (genomica) e le loro molteplici funzioni (genomica funzionale); (b) il prodotto della trascrizione del DNA: l’RNA (trascrittomica); (c) le proteine codificate dal DNA attraverso l’RNA (proteomica); (d) le molecole che interagiscono all’interno di un organismo (meta-boliti: metabolomica). Tale analisi, negli organismi viventi, avviene in un determinato cam-pione biologico: es., siero, plasma, urine, liquor, condensato del re-spiro, saliva, secrezioni mucose, cellule e/o tessuti specifici. Tra gli altri obiettivi delle scienze omiche vi è anche quello di stu-diare le connessioni e le interazioni reciproche tra i pool di molecole biologiche (interattomica) e tra queste molecole e i microrganismi della flora intestinale (microbiomica), o quelli estranei a quest’am-biente (infettivomica), i cibi e/o i nutrienti (nutribiomica) e l’ambiente in generale (ambientomica).

Origine del termine “omiche”

L’Oxford English Dictionary [OED] riconosce diversi significati del suffisso -omiche (-omics). Uno tra questi è: “…in biologia cellulare e molecolare…. il suffisso -omiche è utilizzato per formare nomi con significato di… indicare tutti i costituenti analizzati collettivamente” (all costituents analysed collectively).Le origini del suffisso -oma, si fanno risalire agli ultimi decenni del XIX secolo con la creazione di termini biologici/botanici quali “scle-roma” o “rizoma”. Tali termini deriverebbero dall’utilizzo del suffisso greco (la sequenza) “οmα”, composta da due parti: -ο- mα- deri-vanti dalla scomposizione di -ο- (intesa nel senso di radice verbale) e -mα- (il vero suffisso greco utilizzato per formare nomi astratti). L’impiego di questa terminologia in campo biomedico risalirebbe agli inizi del XX secolo (1916-1920) con l’utilizzo del termine ”bio-ma” e ”genoma” (di origine tedesca), utilizzato per definire la “inte-rezza”, la “completezza” di una cosa o di un campo di studi (come accadeva per la parola genoma che voleva significare “tutta la co-stituzione genetica di un organismo”). Furono poi i bioinformatici e i biologi molecolari ad applicare tale suffisso in maniera più ampia ai loro studi e alle loro branche di studio: probabilmente a Hinxton (Cambridge), in Inghilterra, dove sorgevano la maggior parte dei pri-mi e più importanti laboratori di bioinformatica.

Approcci olistici per domande complesse

Le scienze omiche sono sistemi di studio scientifico e tecniche che permettono di analizzare insiemi di fattori complessi in maniera oli-stica: cioè, in biomedicina, pool di molecole biologiche, parti di una cellula o sistemi enzimatici, cellulari o tissutali, microrganismi o vie metaboliche, operanti all’interno degli organismi viventi in maniera complessa. Lo scopo di tale approccio olistico è quello di poter com-prendere operando con approcci integrativi, principi operativi biolo-gici di livello più elevato (complesso), applicabili a tutti gli organismi

viventi (Geshwind e Konokpa, 2009; Kell et al., 2007; Villoslada et al., 2009). Nelle scienze biologiche e mediche, non tutte le domande sono formulabili (e quindi risolvibili) direttamente attraverso la singo-la sperimentazione clinica e/o di laboratorio, essendo fenomeni spesso strutturati in una scala gerarchica di eventi, nella quale i livelli sono a loro volta determinati dall’ampiezza/complessità delle risposte che la ricerca si attende. In pratica, una singola domanda o alcuni tipi di domande possono essere risolte attraverso singole conferme sperimentali cliniche e/o di laboratorio che studiano una (sola) parte dell’insieme (modello della “dimostrazione sperimenta-le di un’ipotesi”). All’estremo opposto di questa gerarchia troviamo però domande più generali, più astratte o più complesse che non possiamo risolvere solo attraverso la dimostrazione di singoli esperi-menti clinici e di base. La risposta a tali quesiti complessi può essere ottenuta solo attraverso la creazione, costruzione e/o l’integrazione di modelli induttivi più complessi, per i quali è necessario un grado maggiore di astrazione e di visione d’insieme. L’astrazione, in questo caso, consiste nel sostituire la singola parte del sistema che si sta considerando con un modello simile, ma di struttura più semplice (Villoslada et al., 2009). Spesso i risultati di questo tipo di analisi forniscono risposte inattese o generano nuove domande che richie-dono successivi approcci.

Biologia dei sistemi complessi

L’integrazione di tutte le scienze e tecnologie omiche (principalmen-te: genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica), è definita biologia dei sistemi complessi (Geshwind e Konokpa, 2009; Villosla-da et al., 2009; Westerhoff et al., 2004) (Fig. 1). La novità principale offerta da tale approccio (sistemistico) è il mi-glioramento della comprensione di un sistema (che è un gruppo di entità, interconnesse, che formano un insieme integrato) conside-rato come l’insieme di molecole biologiche che lo compongono (e cioè geni, trascritti, proteine, metaboliti) (Fig. 1A). La biologia dei sistemi complessi e le varie tecnologie omiche a essa correlate han-no rivoluzionato negli ultimi anni l’approccio alle patologie umane innovando il metodo scientifico in ambito biomedico. Gli esperimenti di ricerca condotti attraverso l’utilizzo delle sempre crescenti tec-nologie di tipo omico non si basano, come accennato sopra, solita-mente su ipotesi pre-esistenti (da dimostrare sperimentalmente) ma più spesso generano, attraverso i risultati della ricerca stessa, nuove informazioni e nuove ipotesi che andranno poi analizzate e confer-mate da successivi studi (Emilsson et al., 2008; Kell et al., 2004).

Metodo riduzionistico vs. approccio sistemistico

Il procedimento di studio delle scienze omiche (e della biologia dei sistemi complessi), ripercorre in senso inverso, le tappe della ricerca biomedica: abbiamo categorizzato i sistemi degli organismi viventi in maniera riduzionistica, per caratteristiche anatomiche, funzio-ni biologiche o di sistemi/network, composizioni cellulari/tissutali, meccanismi di base molecolari/cellulari. Ciò ha contribuito a notevoli successi in campo biomedico: con questo tipo di procedimento, la dimostrazione di una semplice correlazione tra un parametro bio-logico e il verificarsi di malattia è stato considerato un successo, anche quando i meccanismi patogenetici della malattia rimanevano, per la maggior parte, sconosciuti. Il procedimento di studio di tipo omico e dei sistemi complessi, intende invece trasferire (traslare) le singole conoscenze, le singole dimostrazioni in sistemi assai più

Omiche e biologia dei sistemi in neurologia pediatrica

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complessi e di livello gerarchicamente più elevato, studiando non solo i componenti di un singolo sistema, ma anche le interazioni tra essi e le interazioni con il resto dell’ambiente (questo di tipo di procedimen-to è conosciuto come “pensiero sistemistico”) (Fig. 1). Ciò al fine di potere rispondere a esigenze e domande più elevate. Guardando al sistema nervoso, ad esempio, bisognerà pensare in termini di sistemi complessi di memoria, apprendimento, comportamento (come sistemi integrati, in senso trasversale) analizzando i diversi fenotipi neurologi-ci e sindromici e cercando di unirli in grandi categorie e gruppi.

Teoria del complesso e della complessità (proprietà emergenti)

L’analisi dei sistemi biologici offre la possibilità di studiare proprietà collettive, cioè proprietà che non possono essere predette dallo studio del comportamento di un singolo componente ma solo dallo studio dell’insieme di quei componenti. Nella biologia dei sistemi, così come nella scienza della complessità, queste proprietà collettive (intrinse-che) sono conosciute come emergenti perché sono generate (emer-gono) da numerose cause e non sono esclusivamente rappresentate dalla sommatoria di tali cause (Geshwind e Konokpa, 2009; Kell et al., 2007; Villoslada et al., 2009). Le proprietà (capacità) emergen-ti sono comuni a tutti i sistemi fisiologici e sono caratterizzate, ad esempio, dalla capacità di mantenere il volume ematico, la pressio-ne sanguigna, il pH tissutale o la temperatura corporea. Le proprietà emergenti del sistema nervoso (e più specificamente del cervello) includono, ad esempio, i processi di apprendimento, memoria ed emozioni che non possono essere spiegati solo dalla comprensione, anche molto dettagliata e completa, dei meccanismi di funziona-mento dei singoli neuroni, perché, in realtà, sono il risultato d’inte-

razioni non-casuali tra cellule altamente specializzate organizzate in reti assai complesse: quindi, la comprensione di tali funzioni/pro-prietà potrà essere attuata solo evitando di separare tali cellule/reti che andranno studiate nella loro interezza (teoria del complesso e delle complessità).

Cosa ci insegnano i sistemi complessi sociali: popolazioni, internet, reti aeroportuali

Un’applicazione, relativamente recente, della biologia dei sistemi è lo studio di tali sistemi/proprietà attraverso i modelli induttivi e le conoscenze derivate e traslate dall’osservazione delle interazioni tra altri grandi sistemi complessi conosciuti e studiati da più tempo: per esempio, interazioni tra popolazioni o tra gruppi sociali all’interno di popolazioni, sistemi computazionali e internet, sistemi aeroportuali. Per esempio, se all’interno di un sistema (una rete) aeroportuale complesso(a) internazionale (quindi una rete che può connettere diverse città all’interno di una nazione, ma principalmente connet-te diverse nazioni tra diversi continenti) all’improvviso, o progres-sivamente, si altera il normale funzionamento (per neve, vento o ghiaccio) di un nodo aeroportuale importante (l’aeroporto JFK di New York), questo mancato funzionamento genererà ripercussioni immediate sul traffico aereo locale del New Jersey (come, ritardi, mancate partenze), ed a poco a poco, anche su quello della costa orientale statunitense ed infine, a breve o medio termine, anche sul traffico aereo dei principali nodi aeroportuali europei, asiatici e così via. Quindi, il mancato funzionamento di un singolo nodo di una rete si ripercuote su altri nodi della rete e poi sull’insieme dei nodi di tutta la rete anche in aree distanti da quella del primo nodo non funzionante. La gravità del danno finale è legata all’impor-

Figura 1. (A) Network di geni, trascritti di m-RNA, proteine e metaboliti formano nel loro insieme il genoma, il trascrittoma, il proteoma ed il metaboloma e la loro interazione con l’ambiente (B) determina il fenotipo finale.

M. Ruggieri et al.

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tanza strategica del nodo colpito. Tale modello di funzionamento è stato (e viene) applicato al funzionamento dei nodi delle reti di geni e/o dei nodi e dei circuiti neuronali complessi del cervello e i modelli induttivi. Esempi sono gli studi di genomica funzionale e studi con risonanza magnetica trattografica (cioè analisi di deter-minati circuiti neuronali attraverso ricostruzioni con software dei metaboliti/trasmettitori che li attraversano) traslati alle malattie sistemiche o neurologiche complesse. Ciò, per meglio compren-dere come un danno in un determinato gene o in una determinata area cerebrale, possa ripercuotersi su altri geni o su altre regioni cerebrali viciniori o distanti.

Scienze omiche e dei sistemi complessi (applicazioni pratiche): marcatori biologici

Le tecnologie omiche hanno un potenziale di applicazione molto vasto che va dall’aumento della comprensione di svariati proces-si fisiologici e fisiopatologici, al loro impiego nello screening, nel-la diagnosi e nella valutazione della storia naturale, della risposta alla terapia e/o della prognosi di diverse patologie sia del bambino così come dell’adulto (Muntoni e Cross, 2015). La tendenza naturale delle strategie di ricerca omiche è quella di studiare contempora-neamente diverse molecole con l’obiettivo di identificare (singoli e gruppi di) marcatori biologici che intervengono in vari stadi di una patologia. Le caratteristiche ideali di un marcatore biologico sono la non invasività, il basso costo economico, la sensibilità e la specifici-tà: infine, è di fondamentale importanza che i risultati ottenuti siano facilmente replicabili da altri studi. Sotto quest’aspetto, le scienze omiche operano identificando continuamente nuove molecole e/o ruoli diversi inattesi di molecole già conosciute in precedenza (vedi sotto: sezione malattie neuromuscolari). Le tecnologie omiche stanno rivestendo crescente importanza ad esempio per l’identificazione di nuovi farmaci e per la valutazione della loro tossicità ed efficacia. Il settore della farmacogenomica è il risultato dell’interazione della genomica con la farmacologia e studia il ruolo dell’ereditarietà nella variazione interindividuale della risposta a determinate terapie, con la prospettiva dell’individualiz-zazione delle terapie stesse e dell’ottimizzazione della loro efficacia (Evans e Relling, 2004). L’incontro tra scienze omiche (per esempio, genomica funzionale) e studio del sistema nervoso (per esempio, neuroscienze) ha permes-so, ad esempio, sino a oggi, l’identificazione delle basi molecolari della diversità neuronale, della sinaptogenesi, di marcatori biologici di malattia, di meccanismi di malattia e di numerosi segnali all’in-terno delle vie metaboliche, e la creazione di piattaforme libere di scambio d’informazioni su scala genomica (Colantuoni et al., 2000; Caceres et al., 2003, Diaz 2009) (Fig. 2).

Omiche e sistemi complessi

Genoma e genomica

La genomica è lo studio sistematico del genoma, che rappresenta la quantità totale di DNA di una cellula o un organismo. Il genoma umano contiene oltre 3 miliardi di paia di basi ed almeno 25.000 geni codificanti. Le tecniche di DNA microarray consentono di misu-rare le differenze di espressione delle sequenze di DNA tra diversi individui, permettendo l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente. Queste tecniche consentono di rilevare la presen-za di anomalie come le inserzioni e/o le delezioni cromosomiche at-

traverso l’esame del CGH (Comparative genome hybridisation) array (Emilsson et al., 2008). Le più comuni varianti inter-individuali nelle sequenze del DNA sono i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), nei quali un nucleotide si sostituisce a un altro; questi polimorfismi possono avere un significato funzionale soltanto se il cambiamen-to determina la formazione di un codone che contiene un diverso amminoacido. I polimorfismi a singolo nucleotide possono avere un ruolo anche nella farmacogenomica, cioè nel prevedere le risposte individuali di alcuni pazienti ad alcuni farmaci.

Trascrittoma e trascrittomica

L’espressione dei geni è la parte fondamentale del processo attra-verso il quale il genotipo di un individuo può determinare un carat-teristico fenotipo (Enard et al., 2002; Faulkner et al., 2009; Watters et al., 2003) (Fig. 1). Le informazioni contenute nei geni vengono utilizzate per creare prodotti funzionali attraverso: a. la generazione di copie di RNA pre-messaggero attraverso il

processo di trascrizione, cioè quel processo di assemblaggio di (pre)m-RNA a partire dalla copiatura di una catena di DNA;

b. le modificazioni post-trascrizionali che producono diverse forme di RNA messaggero (m-RNA) codificante attraverso fenomeni di splicing (dall’inglese “montaggio”: fenomeno, cha avviene as-sieme o subito dopo la trascrizione del DNA, attraverso il quale il nascente pre/m-RMA viene modificato attraverso l’elimina-zione degli introni e l’unione degli esoni), capping (dall’inglese “incappucciare”: fenomeno attraverso il quale viene apposta una molecola di 7-metil-guanosina all’estremità 5’ terminale del pre-m-RNA che servirà per l’attacco del m-RNA al ribosoma) e poliadenilazione [aggiunta di una sequenza poliadenilica all’e-stremità 3OH del nascente catena di pre-m-RNA con funzioni importanti per la successiva lettura ribosomiale e traduzione];

c. la sintesi di proteine attraverso il processo di traduzione (as-semblaggio del ribosoma dalle due unità maggiore e minore attraverso l’unione di proteine ribosomiche e RNA ribosomiale, che fornirà i meccanismi per decodificare l’m-RNA e successiva lettura del m-RNA con aggiunta sequenziale di aminoacidi [tra-sportati dall’RNA di trasporto] alla nascente catena peptidica);

d. le modificazioni post-traslazionali delle proteine (de la Grange et al., 2010).

Ciascuna di queste fasi è influenzata da una complessa interazione di eventi che sono regolati a più livelli. La prima di queste fasi, la tra-scrizione, esprime la capacità della cellula di produrre un gruppo di molecole di RNA (o trascritti) che comprendono m-RNA codificante ma anche RNA di trasporto (t-RNA), RNA ribosomiale (r-RNA) e RNA non codificante (nc-RNA), quest’ultimo composto anche da picco-li frammenti di RNA (small-RNA o s-RNA) conosciuti anche come microRNA (miRNA) ed implicati nei processi di attivazione e repres-sione dell’RNA trascritto, cioè nelle modificazioni post-trascrizionali dell’RNA. Ciascuno di questi tipi di trascritto è presente nelle cellule, regolandone la vita e le funzioni biologiche. Il trascrittoma rappre-senta l’insieme di questi tipi di trascritto presenti in una cellula, in un tessuto o in un organismo (Dermitzakis, 2008).Il trascrittoma può essere considerato quindi una struttura molto complessa e dinamica che è sensibile alle varie fasi dello svilup-po degli organismi, cosi come all’ambiente dei vari tipi di cellule e tessuti nei quali viene espresso ed agli effetti di fattori esterni che possono influenzare sia i processi trascrizionali che quelli post-trascrizionali. La trascrittomica è quella branca delle scienze omiche che studia questo insieme (il trascrittoma), misurando l’espressione dei geni con indagini molecolari complicate che spaziano dalla tec-nologia microarray al sequenziamento diretto dell’RNA.


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L’obiettivo principale della trascrittomica è di misurare i trascritti e la loro espressione in relazione al tipo di cellule e/o tessuti, cosi come all’età dell’organismo in cui vengono misurati. Il profilo trascrittomi-co fornisce informazioni sulle molteplici differenze di espressione di un determinato gruppo di geni sotto l’influenza di vari fattori (Der-mitzakis, 2008; Geshwind e Konopka, 2009).Un singolo gene può esprimersi in molti modi, in relazione allo stadio di sviluppo della cellula e ad eventi esterni ed interni alla cellula. Diversi cambiamenti dell’espressione genica sono stati identificati come causa di patologie genetiche, multifattoriali e di disordini dello sviluppo (Cotton e Scriver 1998; Dermitzakis et al., 2008; Emilsson, et al., 2008; Buechel et al., 2011; Gregg, et al., 2008; Lahiry et al., 2010; Mudge, et al., 2008; Muers 2010). Anche la posizione, l’in-gombro sterico e le differenze dell’architettura territoriale tra i sin-goli cromosomi e più in generale del materiale genetico all’interno del nucleo gioca un ruolo importante per i processi di trascrizione ed espressione genica (Cremer et al., 2006). Ruoli importanti vengono infine assunti anche da fenomeni epigenetici causati dall’ambiente, alimentazione, dieta e calore nella modulazione del materiale ge-netico trasmesso, ad esempio, per via paterna (es., sperma, liquido seminale) (Rando 2012).

Proteoma e proteomica

Il proteoma è definito come l’insieme di tutte le proteine espresse in un sistema biologico (una cellula, un tessuto, o l’intero organismo)

(Theodorescu et al., 2007). Scopo della proteomica è di caratterizza-re le reti di proteine (i networks) interconnesse che operano scam-biando informazioni all’interno delle cellule e/o dell’organismo, con l’obiettivo di comprenderne le funzioni e le interazioni con agenti esterni (Petricoin et al. 2002).Il proteoma rappresenta quindi l’espressione dinamica sia dei geni che dei fattori ambientali ed il suo studio è altamente promettente per l’identificazione di nuovi marcatori biologici in varie patologie (Vlahou et al., 2005) (Fig. 2). L’impiego della proteomica ha già pro-dotto risultati importanti, identificando proteine che rappresentano marcatori biologici altamente sensibili (quali, l’alfa-fetoproteina sie-rica nelle malformazioni congenite del tubo neurale o nella sindrome di Down; gli antigeni carcino-embrionari in alcune patologie neopla-stiche) (Rifai et al., 2006).

Metabolomica

La metabolomica è la scienza omica che si basa sull’analisi e l’inter-pretazione delle funzioni dei metaboliti (molecole di basso peso mole-colare) di un determinato sistema biologico (cellula, tessuto, sistema, organismo) sotto l’influenza di una serie di condizioni (Kell et al., 2006; Wikoff et al., 2007). Tra tutte le tecnologie omiche la metabolomica è la più recente ed è considerata quella che si avvicina di più all’espres-sione definitiva del fenotipo, inteso come risultato dell’interazione tra geni ed ambiente. Le tecnologie metabolomiche hanno infatti la carat-teristica di studiare non soltanto le correlazioni genotipo/fenotipo, ma

Figura 2.Applicazioni della proteomica in medicina.

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anche quelle tra genotipo e ambiente (ambientoma in inglese enviro-mics) cioè l’insieme dei fattori ambientali che agiscono dall’esterno influenzando il fenotipo finale) (Fig. 3) (Emilsson et al., 2008). L’espressione del profilo metabolico (metaboloma) di uno specifico si-stema biologico è infatti il risultato finale delle informazioni contenute nel codice genetico, dopo la sovrapposizione di altri fattori non rela-tivi al genoma, come ad esempio l’interazione con i microorganismi commensali (microbioma), i fattori nutrizionali (nutribioma), gli agenti infettivi (infettivoma), l’esposizione a farmaci e/o sostanze tossiche (farmaco/tossico-genoma) (Urbanczyk-Wochniak et al., 2003). Poichè il metaboloma rappresenta il prodotto finale della trascrizione dei geni dopo l’impatto con i possibili fattori ambientali, tutti i cambiamenti del trascrittoma e del proteoma si rifletteranno sul profilo metabolico fina-le (cioè sul metaboloma). Per tale motivo la metabolomica può essere considerata la tecnologia più promettente nello studio del fenotipo complesso di un organismo (Dessì et al., 2014). I metodi impiegati per le analisi metabolomiche sono generalmente basati su indagini spettrometriche (spettrometria di massa, spet-trometria basata sulla risonanza magnetica nucleare o entrambe) (Fig. 4) (Fanos et al., 2013).

Epigenomica

Infine, tutti quei cambiamenti che alterano la funzione e l’espressio-ne dei geni senza alterare la struttura del DNA, quali, metilazione del DNA e rimodellamento/compattamento della cromatica (modifica-zioni degli istoni), modificazione dei trascritti dell’RNA (da parte dei micro-RNA) e della codificazione delle proteine, modificazione degli stessi micro-RNA e modificazioni da prioni, e che possono essere o non essere ereditati, sono oggetto dello studio dell’epigenetica. Lo studio di tutti questi fenomeni considerati nel loro insieme è cono-sciuto come epigenomica (de la Grange et al., 2010).

Malattie genetiche “monogeniche” vs. “monotrascrittomiche” vs. “monoproteiche” In base alle conoscenze attuali e a quanto prima esposto, le malattie genetiche non dovrebbero essere più chiamate monogeniche, ma

(anche) monotrascrittomiche o monoproteomiche e probabilmente non esistono malattie monogeniche, ma malattie da (errata o alte-rata) interazione tra più geni, più trascritti o più proteine e quindi in ultima analisi, probabilmente, non esistono più malattie monogeni-che in senso stretto, ma tutte le malattie sono causate (prevalen-temente) da un singolo gene con associate alterazioni di altri geni o di diversi trascritti o diverse proteine o errate interazioni tra geni con trascritti e proteine o tra diversi trascritti e così via. Ci stiamo quindi muovendo e ci muoveremo sempre più tra breve verso un nuovo concetto di malattie genetiche, dove le mutazioni di singoli geni specifici non giustificano la complessità dei fenotipi (Samocha et al., 2014).

Il laboratorio delle scienze omicheLa preparazione di esperimenti che utilizzano le tecnologie omiche devono essere eseguiti secondo procedure standardizzate e ripro-ducibili (Brenner et al., 2000; Heinrich et al., 2007; MacArthur et al., 2014; Molynereaux et al., 2007; Pan et al., 2008; Samocha et al., 2014; Wang et al., 2008, 2009).In genomica, le tecniche di microarray possono essere applicate con varie finalità, tra queste la principale è sicuramente l’analisi dell’e-spressione genica. Il principio alla base del microarray è il legame selettivo delle molecole di m-RNA, attraverso l’appaiamento delle basi, a una sequenza di DNA complementare. Il DNA complementare viene prima amplificato da una reazione di polimerasi a catena (PCR) e successivamente immobilizzato su una griglia che funge da sup-porto solido per l’appaiamento con il DNA complementare (cDNA) che viene estratto (attraverso un processo di trascrizione inversa) dalle molecole di m-RNA che devono essere analizzate (Ramskold et al., 2009; MacArthur et al., 2014).I procedimenti iniziali di un esperimento di proteomica si basano sulla purificazione e il frazionamento (attraverso tecniche cromato-grafiche) dei campioni, in modo da ridurre la complessità del prote-oma da analizzare e interpretare. Questi procedimenti sono stretta-mente dipendenti dal tipo di campione biologico che si utilizza (es.,

Figura 3. Influenza dell’“ambientoma” materno (es., stile di vita e nutrizione della madre) sul feto e influenza dei fattori ambientali perinatali (es., modalità del parto, età gestazionale, adattamenti fisiologici) sul neonato e interazioni/influenze del patrimonio genetico (paterno/materno).


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plasma, siero, urine, liquor cefalo-rachidiano, ecc.). Nel caso delle urine, ad esempio, saranno necessarie varie tecniche aggiuntive di preparazione del campione che vanno dall’ultrafiltrazione alla pre-cipitazione, procedimenti necessari a rimuovere gli elettroliti e con-centrare le proteine presenti (Muers, 2010). Anche negli studi eseguiti con tecniche metabolomiche la prepara-zione degli esperimenti è correlata al tipo di campione da analizza-re. I campioni prima di essere analizzati devono infatti essere pre-trattati con tecniche di frazionamento (cromatografia o elettroforesi) che permettono la separazione delle varie componenti (proteine, metaboliti) sfruttandone le diverse proprietà chimico-fisiche (Fanos et al., 2013). La spettrometria di massa è la tecnica maggiormente utilizzata per identificare ed analizzare il proteoma e il metaboloma dei campioni biologici (Fig. 4). La spettrometria con risonanza magnetica nucleare presenta il limite di poter identificare i metaboliti solo se presenti in concentrazioni molto elevate (Ramskold et al., 2009). Gli studi che si basano su tecnologie omiche hanno la caratteristica di generare un enorme quantità di dati, per cui successivamente agli esperimenti in laboratorio sarà necessario utilizzare software di bio-informatica e statistica per eliminare i falsi positivi e per elaborare le informazioni al fine di creare modelli multidimensionali che spie-ghino le interazioni all’interno del sistema e tra i vari sistemi (Amaral et al., 2011; Gerhold et al., 2002; Human Genome Sequencing Con-sortium 2004; Irizarry et al., 2005; Kawasaki 2006; Landgraf et al.,

2007; Marioni et al., 2008; Pedotti et al., 2008; Hoen et al., 2008; Velculescu et al., 1995) (Fig. 5).

Scienze omiche e biologia dei sistemi complessi in neurologia pediatrica

Biologia dei sistemi complessi e neurobiologia dello sviluppo

La biologia dei sistemi complessi sta rivestendo un ruolo sempre maggiore in neurologia e nello studio del cervello umano (Arhonda-kis et al., 2011; Asmann et al., 2009; Barton et al., 1993; Catts et al., 2005; Chodroff et al., 2010; de Magalhaes et al., 2005; Fung et al., 2011; Kuss e Chen, 2008; Lockhart et al., 2011; Mexal et al., 2006; Myers et al., 2007; Nadler et al., 2006; Schonrock et al., 2010; St. Laurent et al., 2009; Strand et al., 2006; van der Brug et al., 2010; Zu et al., 2010). Un settore di ricerca strategico e a sé stante è quello rappresentato dall’applicazione delle tecnologie omiche nello studio delle malattie neurologiche del bambino e dei disturbi neurologici e psichiatrici nell’età dello sviluppo (Chodroff et al., 2010; Erray-Benchekroun et al., 2005; Fung et al., 2011; Ponjavic et al., 2009; Roth et al., 2006; Ziatts et al., 2011).L’approccio omico nell’ambito delle neuroscienze pediatriche offre infatti una interessante finestra di opportunità per la comprensione

Figura 4.Sequenza di indagini metabolomiche: dall’estrazione dei metaboliti, alla spettrometria di massa, acquisizione dei dati, selezione di caratteristiche comuni ai vari metaboliti, identificazione dei metaboliti, sino a giungere alla loro analisi e ricostruzione attraverso tecniche di bioinformatica per costruire vie (cascate) metaboliche comuni.

Figura 5. La misurazione dell’espressione di alcuni geni (espressi) nel sistema nervoso (A) permette di creare modelli di interconnessione tra tali geni volti a formare reti complesse (network) (B): l’analisi di queste reti complesse permette infine di rappresentare in maniera multidimensionale (C) le singole reti distinguendole e separandole in gruppi funzionali che comprendono differenti cellule del sistema nervoso (centrale) (adattata e modificata da Geschwind e Konopka, 2009).

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della complessa variabilità biologica dell’espressione dei geni, dei trascritti, delle proteine e dei metaboliti durante lo sviluppo delle strutture del sistema nervoso (dalla vita prenatale all’età evolutiva, sino a quella adulta) (Nadeau 2001). Com’è noto dall’embriologia, la maggior parte delle cellule cerebrali sono formate già prima della nascita, ma il peso dell’encefalo di un bambino alla nascita costituisce il 25% di quello che raggiungerà durante l’età adulta. Per qualche anno dopo la nascita, il sistema nervoso centrale continua ad accrescersi per raggiungere, entro l’e-tà di 2 anni, circa l’80% del peso di quello dell’adulto (Dekaban et al., 1978).I neuroni e le cellule del sistema nervoso centrale possono svilup-pare molte connessioni dopo la nascita, ma la maggior parte di que-ste si realizzano nel corso della prima infanzia, in risposta a nuove esperienze e stimoli di apprendimento. All’età di circa 20 anni il si-stema nervoso centrale avrà raggiunto una completa maturazione, anche se alcuni processi di sviluppo, come la mielinizzazione degli assoni, proseguiranno sino alla età adulta (Sowell et al., 2004). Du-rante l’età adulta (dopo i 50 anni) si verificano diversi cambiamenti correlati all’età caratterizzati dalla riduzione del peso e del volume dell’encefalo con diminuzione del numero dei neuroni (Masliah et al., 1993); una riduzione del numero delle sinapsi (Peters, 2008) ed una riduzione della sintesi dei neurotrasmettitori e della densità dei loro recettori (Wong et al., 1984; Amenta et al., 1991; Ota et al., 2006). Come risultato di questi cambiamenti, legati all’avanzare degli anni, il sistema nervoso centrale perde la sua plasticità e si osserva un certo grado di declino delle funzioni cognitive ed un aumento per-centuale delle malattie neurologiche correlate all’età (Burke et al., 2006; Salthouse et al., 2009). Questi cambiamenti sono dovuti a variazioni dinamiche a livello molecolare, che coinvolgono l’espressione genica (Hof et al., 2004; Hong et al., 2008; Lu et al., 2004; Masliah et al., 1993; Somel et al., 2006, 2009, 2010). Il trascrittoma del sistema nervoso centrale, così come quello degli altri tessuti, è infatti un sistema dinamico che cambia continuamente durante l’arco della vita, attraverso lo sviluppo dell’encefalo (Naumova et al., 2013). Alcuni studi hanno documentato un’associazione tra la trascrizione e lo sviluppo del sistema nervoso centrale ed hanno dimostrato il ruolo fondamentale dell’espressione dei geni nella formazione delle sinapsi e in vari altri aspetti legati alle funzioni mentali superiori (Diaz et al., 2002, 2009; Flavell et al., 2008). Nel sistema nervoso centrale si verificano numerosi cambiamenti ana-tomici, durante la vita prenatale e l’età pediatrica, sempre accompagnati da variazioni dinamiche nell’espressione genica a livello del tessuto ce-rebrale (Courchesne et al., 2000). Diversi studi di analisi dell’espressio-ne genomica nel SNC durante l’età dello sviluppo hanno documentato che l’organizzazione spaziale e temporale del trascrittoma nel SNC del feto durante la vita prenatale è più complessa di quella nelle fasi dello sviluppo successive alla nascita (Colantuoni et al., 2011; Johnson et al., 2009; Kang et al., 2011; Lambert et al., 2011; Somel et al., 2010). È stato documentato che il numero di geni espressi in specifiche regioni della neocorteccia gradualmente decresce attraverso i vari stadi dell’età evolutiva: dal 57,7% dei geni temporaneamente espressi durante la vita fetale al 9.1% espressi durante lo sviluppo post-natale (dalla nascita all’adolescenza), fino allo 0,7% espressi nella vita adulta (dai 20 ai 60 anni) (Kang et al., 2011). Alcuni geni coinvolti nello sviluppo del linguaggio e delle abilità lin-guistiche (FOXP2, CNTNAP2, CNTNAP5), ad esempio, sono altamen-te espressi nella vita fetale e nella prima infanzia, per poi essere progressivamente meno espressi durante lo sviluppo del bambino (Abrahams et al., 2007; Johnson et al., 2009).

Un esempio della dinamica temporale dell’espressione del trascrittoma nel SNC fetale è una riduzione delle differenze interemisferiche dell’e-spressione genica durante gli stadi prenatali dello sviluppo. Durante la vita intrauterina, già a partire dalla 14° settimana di gravidanza, è rico-noscibile una significativa asimmetria dell’espressione genica tra l’emi-sfero destro e quello sinistro (Sun et al., 2005): tale asimmetria si riduce progressivamente dopo la nascita, sino a scomparire completamente con l’inizio della vita adulta (Khaitovich et al., 2004). Gli studi di genomica funzionale hanno dimostrato che i geni coinvolti nella differenziazione neuronale, nella proliferazione cellulare e nel-la migrazione dei neuroni hanno la loro massima espressione nella corteccia del feto tra la 10° e la 13° settimana di gravidanza, e la loro espressione si riduce sensibilmente e gradualmente dopo la 17° settimana. I geni associati con lo sviluppo dei dendriti e delle sinapsi (compresi i geni che codificano per i canali ionici) hanno invece un notevole aumento della loro espressione nelle ultime fasi della vita fetale (dopo la 20°settimana) fino all’adolescenza (Kang et al., 2011). Nonostante l’espressione di geni a livello del sistema nervoso centrale sia maggiore durante la vita fetale che in qualsiasi altro stadio dello sviluppo, questa espressione rimane relativamente alta nel corso di tutta l’età pediatrica (specialmente nella prima infanzia) se comparata all’età adulta (Colantuoni et al., 2011). Gli studi di neurobiologia dello sviluppo hanno quindi fornito negli ultimi anni importanti informazioni sulla estrema variabilità dell’espressione genica del sistema nervoso centrale durante l’età evolutiva. L’applicazione di tali conoscenze rappresenta un’importante prospet-tiva di ricerca nell’ambito della neurologia pediatrica. Fasi precise della vita pre-natale costituiscono infatti il momento di insorgenza di determinate patologie genetiche e neurologiche di alcuni bambini, aprendo scenari sull’applicazione delle tecnologie omiche anche nella diagnosi pre-natale. Infine, tali conoscenze divengono/diverranno cru-ciali nella comprensione di determinate malattie proprie delle fasce d’età più piccole, che in fasi successive dello sviluppo, modificano le proprie caratteristiche fenotipiche evolvendo in forme sindromiche differenti o scomparendo del tutto. Le stesse conoscenze sono im-portanti per comprendere perché i fenotipi pediatrici neurologici sono talora totalmente differenti dalle rispettive controparti dell’età adulta. Alcune patologie infine presentano storie naturali diverse in età infan-tile precoce, in età pre-scolare vs. pre-puberale e nell’adolescenza.

Scienze omiche e malattie immuno-mediate del sistema nervoso centrale: sclerosi multipla

Un approccio di tipo omico è stato utilizzato negli ultimi anni in al-cuni studi per analizzare il profilo proteomico e metabolomico della sclerosi multipla (SM) a esordio in età pediatrica: ciò anche al fine di potere identificare eventuali marcatori biologici (precoci) per la diagnosi. Nello studio della SM a esordio nell’età adulta una delle maggiori limitazioni è rappresentata dal fatto che si assume che le alterazioni fisiopatologiche iniziali si siano verificate (da un punto di vista biologico) anche diversi anni prima dell’inizio delle manifesta-zioni cliniche. L’età pediatrica ben rappresenta invece una finestra temporale di opportunità importante per la comprensione fisiopa-tologica dei disordini demielinizzanti acquisiti e in particolare della SM, poiché consente di studiare più precocemente i fenomeni che si verificano in questo gruppo di patologie, sia a livello molecolare che clinico.In uno studio che ha analizzato il profilo proteomico di un gruppo di 9 pazienti pediatrici con diagnosi di SM ad esordio infantile vs. 9 bambini sani (selezionati come controllo per sesso ed età) (Rithidech


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et al., 2009) sono state estratte le proteine dal plasma utilizzando tecniche di elettroforesi bidimensionale su gel e il proteoma tota-le è stato poi analizzato con metodiche di spettrometria di mas-sa: è stato evidenziato un aumento dell’espressione di 12 proteine (alfa-1-glicoproteina acida 1, alfa-1-B-glicoproteina, transtiretina, apolipoproteina-C III, componente serico dell’amiloide P, fattore-I del complemento, clusterina, gelsolina, emopessina, chininogeno-1, hCG1993037 e proteina legante la vitamina D) ed è stato quindi ipo-tizzato il coinvolgimento di tali proteine nella patogenesi della SM infantile e la loro potenziale applicazione come marcatori biologici diagnostici e/o prognostici della malattia.In un altro studio più recente (Dhaunchak et al., 2012) (Fig. 6), 19 bambini sono stati arruolati prospetticamente al momento dell’e-sordio di patologia demielinizzante del sistema nervoso centrale. Il proteoma è stato estratto dal liquido cefalo-rachidiano, separato e analizzato con tecniche di spettrometria di massa. L’analisi proteo-mica ha evidenziato un aumento significativo del profilo di proteine strutturali dell’apparato gliale, tra cui la neurofuscina e la contactina: non sono stati evidenziati invece aumenti delle più importanti protei-ne compatte di membrana della mielina (es., proteina di membrana degli oligodendrociti, MOG) abitualmente implicate nella patogenesi della SM in età adulta (vs. altre glicoproteine degli oligodendrociti: vedi sotto). Anche in questo caso sono state formulate nuove ipotesi

sul coinvolgimento iniziale della glia, antecedente il danno mielinico, nella patogenesi degli eventi demielinizzanti della SM. Com’è noto da diversi studi epidemiologici e clinici, solo una piccola percentuale dei bambini che presentano un episodio isolato di demielinizzazione del sistema nervoso centrale, svilupperà in seguito SM, e in questi bambini l’intervallo tra il primo e il secondo episodio è solitamente inferiore ai 2 anni. Nello studio di Dhaunchak e collaboratori (2012), dei 19 bambini arruolati prospetticamente, 8/19 hanno sviluppato ulteriori episodi di demielinizzazione ed in questi è stata posta dia-gnosi di SM sulla base dei criteri clinici e neuroradiologici; 11/19 hanno invece presentato esclusivamente un unico episodio di de-mielinizzazione (definita in questo caso monofasica). L’analisi del profilo proteico del liquor all’esordio (primo attacco) ha identifica-to nel gruppo che ha sviluppato in seguito la SM (8/19 bambini), un aumento significativo della concentrazione di alcune proteine come la glicoproteina della mielina degli oligodendrociti (OMGP) e la gliomedina, entrambe molto importanti nell’assemblaggio dei nodi di Ranvier e degli assoni e della membrana esterna dell’apparato asso-gliale. L’espressione di tali proteine era invece assente o signi-ficativamente ridotta nel gruppo di bambini con demielinizzazione monofasica (n = 11/19). Questi risultati hanno suggerito l’importan-te ruolo dei nodi di Ranvier e delle membrane dell’apparato asso-gliale nell’evento fisiopatologico iniziale della SM ed hanno aperto la

Figura 6. (A) Espressione delle proteine dell’apparato gliale in uno studio proteomico su liquor in bambini affetti da patologia demielinizzante del sistema nervoso centrale; (B) proteine maggiormente espresse nel liquor nel gruppo di studio (neurofuscina, gliomedina e glicoproteina della mielina degli oligodendrociti); (C) caratterizzazione della struttura dell’apparato gliale e dell’insieme di proteine che lo costituiscono (adattata e modificata da Dhaunchak et al., 2012).

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strada a un potenziale impiego di tecnologie proteomiche sul liquor, a scopo predittivo e prognostico, per l’identificazione dei pazienti pediatrici esposti a maggiore rischio di sviluppare la SM dopo un singolo episodio di demielinizzazione del sistema nervoso centrale.

Scienze omiche e neuro-oncologiaLa possibilità di poter identificare delle proteine che servano da marcatori biologici per la diagnosi precoce, la classificazione (mo-lecolare), la prognosi/stratificazione del rischio e la risposta alla te-rapia delle neoplasie del sistema nervoso centrale in età pediatrica, rappresenta un’area di ricerca emergente nel settore della neuro-oncologia (Samuel et al., 2014). In modelli animali è stato dimostrato che l’analisi del profilo proteico sul liquor cefalorachidiano può rilevare la presenza di una neoplasia che interessa il sistema nervoso centrale, prima ancora che que-sta divenga sintomatica o identificabile con metodiche tradizionali (Within et al., 2012). Elevati livelli di alfa-fetoproteina e di beta-gonadotropina corionica umana nel siero e nel liquor sono considerati ottimi marcatori bio-logici diagnostici dei tumori cerebrali a cellule germinali e una loro riduzione durante la radioterapia è considerata alla stregua di una significativa risposta al trattamento (Legault et al., 2013). Altri marcatori biologici utilizzati recentemente, individuati grazie a studi di proteomica/metabolomica (in campioni biologici quali siero, urine, liquor e tessuti tumorali) e utilizzati in ambito neuro-oncologico pediatrico sono la fosfatasi alcalina placentare per il germinoma, la L-selectina per la leucemia linfoblastica acuta con coinvolgimento del sistema nervoso centrale, l’ostepontina per i tumori teratoidi e rab-doidi, la ciclofillina A per i gliomi pontini intrinseci diffusi, la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile per l’ependimoma e il me-dulloblastoma infantili (Saratsis et al., 2012; Samuel et al., 2014). Uno studio multicentrico di analisi proteomica sul liquor di bambini con diagnosi di medulloblastoma ha inoltre indicato i bassi livel-li di prostaglandina D2 sintetasi come un affidabile e significativo marcatore diagnostico di medulloblastoma infantile (Rajagopal et al., 2011). Uno studio volto ad analizzare il contenuto totale proteico e l’espres-sione di micro-RNA negli astrocitomi ad esordio in età pediatrica (Ruiz Esparza-Garrido et al., 2013), attraverso tecniche bidimensionali SDS-PAGE, spettrometria di massa (MALDI-TOF) ed analisi PCR me-diata RT(2) dei miRNA, ha evidenziato 49 proteine con alterati profili di espressione. Lo studio interattomico ha quindi dimostrato, per la prima volta, che alcune di queste 49 proteine isolate, la vimentina, la calreticulina e la proteina 14-3-3 epsilon, si comportano da proteine di tipo hub (di progressione tumorale) per gli astrocitomi in questa fascia d’età, individuando degli utili marcatori biologici di progressione che possono essere impiegati come fattori prognostici e terapeutici. Un altro studio (De Antonellis et al., 2014) ha impiegato tecniche di proteomica per analizzare gli effetti della sovra-espressione del miR-34a (una proteina diretta contro geni che codificano per proteine coin-volte nella proliferazione, invasività cellulare e apoptosi tumorale) nel neuroblastoma, impiegando un sistema d’induzione delle tetracicline in due linee cellulari tumorali di neuroblastoma (SHEP e SH-SY5Y) con marcatori post-metabolici. Delle 2.082 proteine identificate 186 subivano una regolazione (112/186 down-regolate e 74 up-regolate) e di queste 32 presentavano trascritti con sequenze miR-34a. Com-binando i dati di proteomica con curve di espressione genica sono stati identificati 7 prodotti proteici codificati da altrettanti geni (ALG13, TIMM13, TGM2, ABCF2, CTCF, Ki67, e LYAR) correlati con un decorso tumorale sfavorevole. Combinando infine questi dati con i dati con-

tenuti nei database delle vie metaboliche cellulari è stato riscontrato che queste 7 proteine regolano il ciclo, la proliferazione e l’adesione cellulare focale ed altre funzioni connesse all’aggressione e invasività tumorale (incluse alcune vie metaboliche conosciute come la GF-β, WNT, MAPK, e la FAK). La conclusione di questo elegante studio è l’identificazione di proteine bersaglio (precoce) del miR-34a che gio-cano ruoli importanti nella tumorigenesi del neuroblastoma e che potranno essere impiegate (assieme al miR-34a) in future strategie terapeutiche del neuroblastoma. L’identificazione di questi profili proteomici alterati presenta un po-tenziale importante nell’avanzamento della nostra comprensione dei meccanismi fisiopatologici alla base di diverse neoplasie cerebrali dell’infanzia, oltre a rivestire una grande utilità in ambito diagnostico e prognostico e nel follow-up dopo la terapia. Gli svantaggi dell’applicazione delle tecniche proteomiche nei pa-zienti pediatrici con neoplasie del sistema nervoso centrale riman-gono ancora oggi il rischio di risultati falsamenti positivi, la bassa specificità di alcuni di questi marcatori biologici e la loro limitata utilità per quelle neoplasie che non si sviluppano in prossimità del sistema ventricolare e del liquor cefalo-rachidiano (rischio di falsi negativi) (Samuel et al., 2014).

Scienze omiche, errori congeniti del metabolismo e malattie neurodegenerative

La metabolomica è stata utilizzata come tecnica per studiare diver-si errori congeniti del metabolismo, variabilmente caratterizzati da coinvolgimento neurologico e aspetti neurodegenerativi a carico del sistema nervoso centrale. Uno studio con spettrometria di massa ha documentato alterazioni metabolomiche specifiche per patologia nel plasma di un gruppo di bambini (n = 34) affetti da diversi errori congeniti del metaboli-smo (Janečková et al., 2012), inclusi difetti del metabolismo degli amminoacidi (fenilchetonuria, leucinosi, tirosinemia, argininemia, omocistinuria) deficit di carbamil fosfato sintetasi, deficit di ornitina transcarbamilasi, acidemie organiche (acidemia metilmalonica, aci-demia propionica, acidemia glutarica, acidemia isovalerica), e difetti mitocondriali (deficit di Acil CoA deidrogenasi a catena media, deficit di carnitina palmitoiltrasferasi II).In uno studio recente (Pastore A et al., 2013) con tecniche meta-bolomiche associate a tecniche di spettrofotometria è stato iden-tificato un deficit di glutatione ridotto (ed un aumento delle forme di glutatione ossidato) in un gruppo di bambini con encefalomiopa-tia mitocondriale da sindrome di Leigh geneticamente confermata. L’aumento del glutatione ridotto osservato nel corso della risposta alla terapia con para-benzochinonici (EPI-743) ha inoltre aperto fu-turi possibili scenari sull’utilizzo di questo marker come indicatore dell’efficacia della terapia.

Scienze omiche e patologie neuro-muscolari: distrofie/atrofie muscolari e neuropatie

La diagnosi delle più frequenti tra le patologie muscolari del bambi-no, la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e la Distrofia muscola-re di Becker (DMB), è tradizionalmente basata su metodiche invasive (biopsia muscolare) che tipicamente sono eseguite alla luce di segni clinici specifici e indici di laboratorio alterati (es., incremento sieri-co degli enzimi muscolari) e successivamente confermate da studi di genetica molecolare (le indagini genetiche possono precedere le metodiche più invasive). Negli ultimi anni alcuni studi basati su


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tecnologie omiche, hanno cercato di identificare marcatori biologici diagnostici alternativi nell’ambito delle distrofie muscolari infantili, che servano anche da indicatori di storia naturale e progressione (utili anche ai fini terapeutici). Studi su modelli animali e su campioni tissutali sierici (Cacchiarel-li et al., 2011a, 2011b) hanno dimostrato che, in seguito al danno muscolare, nel sangue di pazienti con DMD e DMB, oltre ai comuni enzimi muscolari (come CK), si osservano anche notevoli quantità di micro-RNA, ed in particolare che i miR-1, miR-133- e miR-206 rappresentano oggi dei validi marcatori biologici di danno muscolare e possono quindi essere impiegati nella diagnostica delle distrofie muscolari. Inoltre, correlano in maniera significativa con la storia naturale della malattia, riflettendo bene i parametri di gravità e di miglioramento/peggioramento terapeutico. Uno studio recente di proteomica che ha analizzato campioni raccolti da pazienti affetti da varie forme di distrofia muscolare (DMD, DMB) o portatori asintomatici, attraverso un consorzio (BIO-NMD) costituito in quattro aree geografiche diverse (inglesi e italiane) (Ayoglu et al., 2014) ha identificato un panel di 11 proteine con profili alterati: (a) in 4/11erano presenti in livelli elevati nel sangue dei pazienti affetti: anidrasi carbonica III (CA3 Ab#1), catena leggera della miosina (MYL3), malato deidrogenasi mitocondriale 2 (MDH2) e flavoproteina traspor-tatrice di elettroni A (ETFA); (b) tutte le 11 proteine identificate, com-prese anche le proteine CA3 Ab#2, TNNT3, CK, ETFB, beta-enolase-3 (ENO3), LCP1, PPM1F e COL6A1, avevano valori differenti a seconda della forma clinica (DMD vs. BMD), dello stato del paziente (deam-bulante vs. non deambulante) o delle capacità respiratorie. Lo studio dimostra come altre proteine, oltre alla classica proteina CK, possono avere concentrazioni elevate nel sangue e sono quindi coinvolte nella funzione muscolare e nei processi energetici del muscolo. Uno studio ha analizzato il profilo proteomico nelle urine di 53 pa-zienti pediatrici affetti da DMD, confrontandolo con un gruppo di controlli sani (n = 51) ed ha identificato diversi possibili marcatori diagnostici. Il dato più significativo emerso da questo studio è stato l’elevato livello di frazioni proteiche della titina, una proteina fisiolo-gicamente coinvolta nei meccanismi di elasticità della muscolatura scheletrica (Rouillon et al., 2014). Mutazioni del gene della titina erano state in precedenza associate a diverse forme di miopatie ereditarie (cardiomiopatia familiare, distrofia muscolare della tibia); questo studio proteomico ha quindi confermato il coinvolgimento di questa proteina nella fisiopatologia del danno muscolare nella DMD. Un’alterata escrezione urinaria della titina è stata riscontrata nello stesso studio anche in un gruppo di soggetti affetti da distrofia mu-scolare di Becker (DMB) e da distrofia scapolo-omerale (SHD). Un aumento significativo della concentrazione dei frammenti di titina è stato infine confermato nel modello animale con deficit di distrofina, soprattutto durante le prove da sforzo (Rouillon et al., 2014).La titina può quindi essere considerata come il primo marcatore bio-logico che offre la possibilità di uno screening semplice, non invasivo e non sofisticato (come l’indagine genetica) nelle distrofie muscolari, potenzialmente utile anche nel follow-up dei pazienti per valutare la risposta alla terapia. La limitazione consiste (attualmente) nella sua scarsa specificità, poiché tutte le patologie muscolari con danno del tessuto muscolare potrebbero potenzialmente associarsi ad una maggiore escrezione urinaria di titina. Uno studio pilota (Finkel et al., 2012) realizzato con un approccio trascrittomico, proteomico e metabolomico ha analizzato possibili marcatori biologici nel plasma e nelle urine di un’ampia coorte di bambini (n = 108) affetti da atrofia muscolare spinale (SMA tipo 1, 2 e 3), confermata con test genetico. Oltre ad essere state identificate numerose (n = 97) proteine plasmatiche come potenziali marcatori

biologici, è stata riscontrata una maggiore concentrazione di alcune proteine (CILP2, COMP, TNXB, THBS4, SPP1, COL2A1). Essendo mol-te di queste proteine implicate nella meccanica e nella fisiologia del tessuto connettivo, gli autori hanno ipotizzato che il loro aumento nel plasma possa essere il risultato del danno secondario del tessuto connettivo che si verifica nella storia naturale della SMA. Un altro studio (Mussche et al., 2012) ha analizzato comparativa-mente i profili proteici di 4 soggetti con neuropatia assonale gigante (GAN: una forma genetica di neuropatia con crescita esagerata degli assoni nei nervi periferici) e 4 controlli sani selezionati per sesso ed età, attraverso metodica iTRAQ. Sono stati evidenziati profili al-terati in divere proteine del citoscheletro (proteina ribosomiale L29 ed L37, galectina-1, nessina derivata dalla glia, aminopeptidasi-N e proteine nucleari legate alle proteine legate alla formina) con con-servazione del numero (n = 76) e dei profili delle proteine strutturali del citoscheletro (ciò malgrado il ruolo patogenetico conosciuto del-la gigassonina sia quello di degradazione delle proteine strutturali del citoscheletro). L’incrocio di tali informazioni con l’analisi dei dati contenuti nei database delle vie metaboliche cellulari ha evidenziato che tali proteine rivestono ruoli importanti nella regolazione/riorga-nizzazione del citoscheletro e sono determinanti per la formazione patologica di filamenti di tipo intermedio nella GAN. Quindi, in questo caso, lo studio proteomico non ha confermato il supposto meccani-smo patogenico della malattia, scoprendo allo stesso tempo mecca-nismi patogenetici differenti.

Scienze omiche ed encefalopatie epilettiche precoci: sindrome degli spasmi infantili

Studi metabolomici hanno evidenziato in varie forme di epilessia delle variazioni della concentrazione di alcuni aminoacidi plasma-tici, tra cui la riduzione plasmatica della treonina e del triptofano o l’aumento della glicina; alterazioni dei profili metabolomici dell’L-glutammato e dell’acido gamma-aminobutirrico sono state inoltre riscontrate nel plasma di pazienti con epilessia da difetti del meta-bolismo di questi neurotrasmettitori (Wei et al., 2012).Uno studio di proteomica su modelli animali affetti dalla sindrome degli spasmi infantili ha identificato, attraverso tecniche di elettro-foresi bidimensionale e spettrometria di massa, l’aumento di alcune proteine (CFL1, PKM2, PRPS2, DLAT, CKB, DPYSL3 e SNAP25) su campioni di tessuto cerebrale (Wang et al., 2014). Nello stesso stu-dio, in un altro gruppo di animali da esperimento con sindrome degli spasmi infantili e storia di stress perinatale, sono state evidenzia-te alterazioni del profilo proteomico con aumento dell’espressione di altre proteine (MDH1 e YWHAZ) a livello di campioni di tessuto cerebrale (Wang et al., 2014). Tali proteine sono coinvolte in molti meccanismi di regolazione energetica, rimodellamento neuronale e sviluppo del sistema nervoso centrale, e questi risultati hanno con-sentito di aggiungere nuove informazioni sulla patogenesi molecola-re degli spasmi epilettici. Sulla base di queste ricerche sperimentali, ulteriori studi con tec-niche metabolomiche saranno necessari in futuro per analizzare il profilo metabolomico nel plasma e nel liquor di bambini affetti da sindrome degli spasmi infantili.

Scienze omiche ed encefalopatia ipossico-ischemica

L’encefalopatia ipossico-ischemica (EII) è caratterizzata da una pa-togenesi multifattoriale che vede coinvolti diversi meccanismi tra

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cui l’accumulo intracellulare di calcio, il rilascio di amminoacidi ec-citatori e la produzione di specie reattive dell’ossigeno. Tutti questi eventi patologici culminano nell’alterazione della permeabilità della membrana mitocondriale e nella morte cellulare. L’ipotermia rappresenta a tutt’oggi il gold standard terapeuti-co della EII, ma secondo protocollo deve essere praticata entro le prime 6 ore di vita, dopo un’accurata valutazione clinica e neurologica del neonato (Scala di Sarnat). Quest’arco di tempo molto ristretto rende difficile il riconoscimento ed il trattamento tempestivo dei neonati con EII e per tale motivo, accanto alla valutazione clinica, diversi studi basati su tecniche proteomiche hanno proposto l’individuazione di possibili marcatori biologici diagnostici e prognostici, rivelandosi le indagini strumentali (es., risonanza magnetica/RM) spesso poco specifiche nella valuta-zione della gravità e nella prognosi a lungo termine (Nagdyman et al., 2003; Tekgul et al., 2004). Negli ultimi anni la metabolomica ha assunto un ruolo promet-tente in questo campo, data la complessa multifattorialità degli eventi patologici che conducono alla EII. Lo studio dei metabo-liti a basso peso molecolare può infatti fornire un quadro più informativo (se comparato allo studio di un numero limitato di proteine con la proteomica) di tutte le vie metaboliche moleco-lari coinvolte nel danno ipossico-ischemico del sistema nervoso centrale. La metabolomica potrebbe consentire in futuro lo studio accurato del fenotipo biochimico, quindi dell’insieme di fattori endogeni (geni, trascritti, proteine, metaboliti) ed esogeni (danno legato all’asfissia perinatale), che intervengono nella fisiopato-logia dell’EII.In un importante studio (Walsh et al., 2012), sono stati messi a confronto i profili metabolomici di pazienti appartenenti a 3 grup-pi diversi: (a) 31 neonati con EII diagnostica clinicamente (scala di Sarnat); (b) 40 neonati con asfissia perinatale ma senza segni di encefalopatia; e (c) 71 neonati sani. Dalle analisi dei metaboliti su siero estratto da sangue del cordone ombelicale è stato identificato un significativo aumento di 3 classi distinte di metaboliti (amminoa-cidi, acil-carnitine e fosfatidil-coline) nei neonati con asfissia ed EII (gruppi a e b) rispetto ai controlli sani (gruppo c). Di questi meta-boliti, le fosfatidil-coline sono risultate significativamente maggiori nel gruppo con asfissia senza encefalopatia (b) vs. i controlli (c); gli amminoacidi maggiori invece nel gruppo con EII (a) vs. i controlli(c). Infine le acil-carnitine, anche se aumentate in tutti i neonati con asfissia (n = 71) rispetto a quelli sani (n = 71) sono risultate note-volmente più elevate nel gruppo con EII (a) rispetto al gruppo con asfissia perinatale senza EII (b). Questi risultati incoraggiano la potenziale applicazione diagnostica di alcune classi di metaboliti e forniscono nuovi spunti di riflessione sulla fisiopatologia e le prospettive terapeutiche del danno ipossico-ische-mico nel neonato, confermando alcune ricerche precedenti. Com’è noto infatti, in seguito all’asfissia perinatale si verifica una riduzione delle reazioni di b-ossidazione con un ridotto utilizzo metabolico degli acidi grassi e conseguentemente avviene la mobilizzazione degli am-minoacidi plasmatici che vengono utilizzati come substrati energetici (Whitmer et al., 1978; Van Cappellen van Walsum et al., 2001). Queste variazioni biochimiche della EII assumono quindi oggi maggiore im-portanza alla luce dei risultati degli studi metabolomici, e rappresen-tano pertanto target di potenziali futuri trattamenti.

Scienze omiche e traumi cranici L’individuazione di marcatori biologici di danno cerebrale trauma-tico è stata oggetto negli ultimi anni di intensa attività di ricerca in

campo neurologico negli ultimi anni. La possibilità di identificare un marcatore, complementare alle metodiche di imaging cere-brale, più sensibile e specifico di queste ultime e poco costoso, rappresenterebbe un ausilio di grande utilità nell’approccio al pa-ziente neurologico con trauma cranico. Negli ultimi anni è stata largamente studiata, la S100b sierica, una proteina che lega il cal-cio e che aumenta sensibilmente dopo il trauma cranico grave. La sua scarsa specificità (aumenta in conseguenza di tutti i processi che portano a danno cerebrale) ne ha limitato però l’effettiva effi-cacia diagnostica. In uno studio realizzato con approccio proteomico su un gruppo di bambini con trauma cranico grave (Glasgow Coma Score < 8), confermato dalle indagini di tomografia computerizzata (TC), è stata valutata l’espressione dei profili proteici su sangue (prelevato entro le prime 8 ore dall’evento traumatico) attraverso metodiche di spet-troscopia di massa. Dopo l’analisi dei dati proteomici, sono state identificate delle proteine (leucil-aminopeptidasi e la proteina pre-cursore della b-amiloide) che correlavano significativamente con la gravità del trauma cranico (Glasgow come Score). Ulteriori studi realizzati con tecniche omiche si renderanno neces-sari in futuro per identificare marcatori biologici sensibili e specifici che permettano di valutare la gravità e la prognosi del trauma crani-co nel paziente pediatrico.

Scienze omiche e malattie neurocutanee/amartomatosi

Alcuni studi, effettuati con l’ausilio di tecniche proteomiche, hanno fornito negli ultimi anni informazioni preziose sul fenotipo di alcu-ne malattie neurocutanee. Uno studio sperimentale (Hirayama et al., 2013) condotto su li-nee cellulari con ridotta espressione di neurofibromina (la proteina codificata dal gene NF1, della neurofibromatosi tipo 1, NF1) ha portato, attraverso tecniche di analisi proteomica, all’identificazio-ne di una nuova possibile via metabolica molecolare intracellulare (dineina-IC2-GR-COX-1) potenzialmente determinante nel fenotipo della NF1. La dineina è una proteina abbondantemente espressa nel sistema nervoso centrale e la sua interazione con altre proteine è fondamentale nel trasporto di vari metaboliti e neurotrasmettito-ri. Questa via è risultata particolarmente attiva nelle linee cellulare con deficit di neurofibromina e i risultati preliminari indicano un suo potenziale coinvolgimento nella patogenesi del danno neu-ronale e nel fenotipo neurocutaneo completo della NF1, aprendo scenari su future prospettive terapeutiche mirate ad un azione su questa via molecolare. Un altro studio (Mejia et al., 2013) su linee cellulari neuronali, re-alizzato con tecniche omiche, ha individuato recentemente una stretta interazione tra la proteina Hap-1 e la proteina amartina (co-dificata da uno dei due geni responsabili della sclerosi tuberosa, il gene TSC1). L’analisi proteomica ha dimostrato che un deficit di espressione della proteina Hap-1 si correla con una riduzione dell’attività dell’amartina e conseguenti alterazioni della morfolo-gia neuronale, specialmente a livello dell’ippocampo e del sistema limbico. Ciò ha permesso una nuova interpretazione della fisiopa-tologia dei disturbi pervasivi dello sviluppo e dello spettro autistico che si riscontrano frequentemente nei bambini affetti da sclerosi tuberosa. Ulteriori studi con approccio proteomico e metabolomico potreb-bero in futuro fornire informazioni importanti sulla storia naturale e la prognosi di molte sindromi neurocutanee in età pediatrica.


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Conclusioni

L’avvento delle tecnologie omiche ha avuto un impatto enorme nel settore delle neuroscienze, facilitando la comprensione della funzione di geni, proteine, metaboliti e delle loro interazioni con l’ambiente nel determinare fenotipi neurologici complessi. Le scienze omiche nel loro

insieme potrebbero presto riuscire a identificare numerosi meccanismi fisiologici e fisiopatologici che stanno alla base di molte patologie neuro-logiche del bambino. Esse rappresentano una nuova maniera di pensare in biomedicina. La futura applicazione di queste tecniche ha enormi po-tenzialità nell’avanzamento della pratica clinica per quanto riguarda la diagnosi, la prognosi e il follow-up del “bambino neurologico”.

Cosa sapevamo primaLa ricerca (biomedica) pediatrica generale e neurologica tradizionale hanno proceduto sinora prevalentemente categorizzando i sistemi degli organismi viventi in maniera riduzionistica, cioè per caratteristiche anatomiche, funzioni biologiche o di sistemi/network, composizioni cellulari/tissutali, mecca-nismi di base molecolari/cellulari. Ciò ha contribuito a notevoli successi in campo biomedico: con questo tipo di procedimento, la dimostrazione di una semplice correlazione tra un parametro biologico (es., l’alterazione di un gene, una proteina, un enzima, un’area cerebrale) e il verificarsi di una malattia è stato considerato un successo, anche quando i meccanismi patogenetici della malattia rimanevano, per la maggior parte, sconosciuti.

Cosa sappiamo adessoIl procedimento di studio di tipo omico e dei sistemi biologici complessi, intende invece trasferire (traslare) le singole conoscenze e le singole dimo-strazioni sperimentali scientifiche in sistemi assai più complessi e di livello gerarchicamente più elevato, studiando non solo i componenti di un singolo sistema ma anche le interazioni tra essi (es., il trascritto di un gene, cioè l’RNA, e il suo prodotto finale, cioè le proteine) e le interazioni con il resto dell’ambiente inteso in termini di insieme (pensiero sistemistico). Ciò al fine di potere rispondere a esigenze e domande più elevate in maniera olistica (meccanismi patogenetici e sistemi complessi: es., memoria, comportamento, apprendimento e relative patologie). In termini pratici le omiche studiano pool di molecole biologiche, parti di una cellula o complessi sistemi enzimatici, cellulari o tissutali, microrganismi, vie metaboliche o reti e sistemi variamente interconnessi tra loro. Ulteriori e preziose informazioni provengono dallo studio dei sistemi complessi sociali: es., interazioni tra popolazioni nel mondo, internet, nodi aeroportuali. Lo studio di tali sistemi applicato alla biologia dei sistemi, permette approcci diversi da quelli tradizionali allo studio delle reti e dei sistemi biologici (es., reti neurali, sistemi fisiologici).

Quali ricadute sulla pratica clinicaI primi risultati provenienti dal “laboratorio delle omiche” in neurologia pediatrica, hanno permesso l’identificazione delle basi molecolari della diversità neuronale, della sinaptogenesi e dello sviluppo del sistema nervoso nel bambino. Più di recente sono stati individuati nuovi marcatori biologici di malat-tia (es., nuove molecole nelle distrofie muscolari, malattie immuno-mediate del sistema nervoso ed encefalopatie epilettiche), che correlano meglio dei classici marcatori (es., enzimi muscolari, proteine della mielina, micro-RNA) con la storia naturale della malattia, la prognosi e l’efficacia terapeutica; nuovi (e inattesi) meccanismi di malattia e di segnali all’interno delle vie metaboliche. Si stanno creando, attraverso consorzi nazionali/internazionali piattaforme web per lo scambio d’informazioni su dati genetici, trascrittomici, proteomici e metabolomici. Inoltre, i costi delle piattaforme di laboratorio si stanno abbassando, rendendo disponibili tecnologie prima non affrontabili dai comuni laboratori e su più vasta scala.

Box di orientamento

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Martino Ruggieri, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Pediatria, A.O.U. “Policlinico - Vittorio Emanuele”, Presidio “G. Rodolico”, via S. Sofia 78, 95124 Catania - E-mail: [email protected]

Corrispondenza

226

Ottobre-Dicembre 2014 • Vol. 44 • N. 176 • Pp. 226-239 neurologia pediatrica

Metodologia della ricerca bibliografica La ricerca degli articoli più rilevanti degli ultimi anni utili ai fini di questa review è stata effettuata sulla banca bibliografica Medline, utilizzando come motore di ricerca PubMed e come parole chiave “Genetic Testing and Epilepsy”, “Genetic and Idiopathic Generalized and Partial Epilepsy”, “Genetic and Benign Generalized and Partial Epilepsy”, “Genetic and Epileptic Encephalopathy”.

IntroduzioneL’importanza di una predisposizione familiare nel determinare l’in-sorgenza del cosiddetto “morbo sacro” è nota fin dai tempi di Ippo-crate (400 a.C.). Ora noi sappiamo che le epilessie costituiscono un

eterogeneo gruppo di patologie multifattoriali, in gran parte determi-nate dall’interazione di fattori genetici e ambientali. Oltre alle epiles-sie dovute a una lesione cerebrale acquisita (epilessie sintomatiche), vi sono epilessie in cui l’insorgenza delle crisi è riconducibile a un danno cerebrale strutturale geneticamente determinato (malforma-tivo o metabolico) e altre in cui le crisi si manifestano in seguito a difetti funzionali dell’attività cerebrale, di solito geneticamente de-terminati (epilessie idiopatiche). Nelle ultime due decadi, la cosiddetta rivoluzione molecolare in me-dicina ha avuto un importante impatto anche nella diagnosi e nel trattamento delle epilessie, in particolare quelle idiopatiche e la ri-cerca genetica nell’epilessia rappresenta al momento una frontiera di studio altamente suggestiva e promettente.

la genetica delle epilessie e le epilessie genetiche

Giuseppe Gobbi, Jasenka Sarajlija, Sara Leonardi, Elena Di Pietro, Federico Zara*, Pasquale Striano**

Unità Operativa Complessa di Neuropsichiatria Infantile – IRCCS, Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna, Bologna * Laboratorio di Neurogenetica, Dipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, Oftalmologia, Genetica, Salute Maternità e Infanzia Università di Genova e Istituto G. Gaslini, Genova ** Unità Operativa di Neurologia Pediatrica e Malattie Muscolari, Dipartimento di Neuroscienze, Riabilitazione, Oftalmologia, Genetica, Salute Maternità e Infanzia Università di Genova e Istituto G. Gaslini, Genova

RiassuntoLe epilessie sono patologie neurologiche croniche caratterizzate dalla ricorrenza di crisi convulsive e classificate in base alla tipologia di questi eventi, a determinati criteri elettroencefalografici e alle cause sottostanti o anche ai sintomi associati. È nota, da tempo, la predisposizione familiare per queste patologie, così come la compresenza di sindromi epilettiche diverse all’interno di uno stesso nucleo familiare. Le moderne tecniche d’indagine genetica hanno permesso di individuare mutazioni in geni specifici. Nel caso delle encefalopatie epilettiche alcuni geni in particolare (e le proteine da essi codificate) possono essere comuni a più sindromi che nel tempo possono evolvere una nell’altra (es., FOXG1, CDKL5, STXBP1, ARX), essere associati a disturbi psi-chiatrici oltre al ritardo mentale (es., CDKL5, MECP2, PNKP, PCDH19) oppure combinarsi con vari tipi di disordini del movimento (es., STXBP1, ARX, FOXG1, KCNQ2). È importante inoltre notare che alcuni di questi geni si sovrappongono come agenti causali anche per forme di epilessia benigna (es., KCNQ2, SCN1A, SCN2A, TBC1D24). Le sindromi epilettiche benigne possono dipendere da difetti dei canali ionici (es., SCN1A, SCN2A, KCNQ2, KCNQ3), di alcuni recettori per i neurotrasmettitori (es., GABRA1, GABRB3, GABRD, GABRG2) oppure da alterazioni che coinvolgono altri tipi di proteine. Le epilessie benigne, per definizione, non sono associate ad anomalie evidenti al neuroimaging, ma possono associarsi a disturbi del movimento (es., PRRT2) o altri disturbi parossistici (es., EFHC1, CACNA1A, CACNB4). Le diverse sovrapposizioni fenotipiche tra le varie sindromi epilettiche ed i vari tipi di epilessia spesso non sono sottese da correlazioni genotipo-fenotipo univoche e quindi resta come caposaldo irrinunciabile il rigore clinico e la rivisitazione continua delle varie forme di epilessia considerate come patologie di “sistema”.

SummaryEpilepsies are chronic neurological disorders characterised by the occurrence of more than two seizures. The classification lays on the ictal features, the elec-troencephalographic criteria, the underlying causes and the associated signs/symptoms. Familiar predisposition and clustering of the different epileptic syn-dromes within the same family are well known phenomena. More advanced techniques for genetic analysis helped in recent years the search for specific gene mutations. We now know that, among the epileptic encephalopathies, for example, some genes are shared by a number of different epileptic syndromes, which in turn can evolve one into the other (e.g., FOXG1, CDKL5, STXBP1, ARX), can be associated to other-than-cognitive delay psychiatric disorders (e.g., CDKL5, MECP2, PNKP, PCDH19) or can be combined to movement disorders (e.g., STXBP1, ARX, FOXG1, KCNQ2). In addition, it is of note that some of these genes are involved both in epileptic encephalopathies and benign epilepsies (e.g., KCNQ2, SCN1A, SCN2A, TBC1D24). The benign epileptic syndromes are usually caused by mutations in the ion channel genes (e.g., SCN1A, SCN2A, KCNQ2, KCNQ3), in the neurotransmitter receptor genes (e.g., GABRA1, GABRB3, GABRD, GA-BRG2) or in other genes encoding for membrane or cellular structural proteins. By definition, brain imaging, in benign epilepsies does not reveal abnormalities: however, these forms can be associated to movement (e.g., PRRT2) or other paroxysmal disorders (e.g., EFHC1, CACNA1A, CACNB4). The various phenotypic overlaps between the different forms of epilepsy are often unassociated to overt genotype-phenotype correlations, thus it is still of outmost importance to keep a rigorous clinical work-up and to constantly review epilepsy definitions, which should be regarded as “system disorders”.

La genetica delle epilessie e le epilessie genetiche

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Definizione e classificazione delle crisi epilettiche e delle epilessie

L’epilessia è una patologia neurologica cronica caratterizzata da crisi epilettiche ricorrenti, che si ripetono nel tempo in modo spon-taneo e non sempre prevedibile, con frequenza e durata variabili. La diagnosi di epilessia è definita dall’occorrenza di due o più crisi epilettiche ad almeno 24 ore di distanza o dalla presenza di un’unica crisi nell’ambito di un’alterazione cerebrale persistente che renda elevata la probabilità di ulteriori crisi.Poiché le crisi epilettiche si verificano per un’alterazione della fun-zionalità dei neuroni provocando una scarica eccessiva (o ipersin-crona) e transitoria e poiché tale scarica può interessare una po-polazione neuronale limitata ad alcune aree cerebrali o coinvolgere tutto l’encefalo (Fisher et al., 2005), la semeiologia delle crisi epilet-tiche può essere molto variabile proprio a seconda delle popolazioni neuronali e dei circuiti cerebrali coinvolti (Tab. I per la classificazione delle crisi epilettiche).L’International League Against Epilepsy (ILAE) (Berg et al., 2010) propone di classificare le epilessie in epilessie da causa “gene-tica”, epilessie da causa “strutturale/metabolica” e epilessie da “causa sconosciuta”. Inoltre, in base al contesto clinico in cui si manifesta un’epilessia, la ILAE suggerisce di differenziare diversi quadri sindromici con lo scopo di permettere di pianificare l’iter diagnostico, indirizzare al meglio la scelta terapeutico-riabilitativa e, talvolta, anche prevedere la prognosi. Il concetto di sindrome epilettica è esclusivamente elettroclinico. La sindrome epilettica è costituita da una serie di sintomi e segni (età di esordio, tipo di crisi, eziologia, livello cognitivo e di sviluppo, quadro elettroence-falografico, fattori precipitanti le crisi e loro ricorrenza in veglia o in sonno, severità del quadro clinico e sua evoluzione, risposta alla

terapia antiepilettica) che si manifestano insieme a costituire una particolare condizione clinica (ILAE Classification, 1981) (Tab. II). Infine, da tempo l’osservazione clinica suggerisce che alcune sin-drome epilettiche possano rappresentare l’evoluzione di altre, come per esempio si suppone possa accadere per la Sindrome di Ohta-hara versus la Sindrome di West a sua volta versus la Sindrome di Lennox Gastaut (Nordli, 2012). Alla luce delle nuove acquisizioni in campo genetico questo assunto viene rafforzato dalla dimostra-zione che più quadri epilettici possono avere un comune substrato genetico. Da ciò prende avvio il tentativo di superare la dicotomia tra epilessia focale ed epilessia generalizzata, messa in atto da al-cuni studiosi che propongono la definizione di “Epilessia di Sistema” o “SystE”, secondo cui un quadro epilettologico può scaturire da una specifica sensibilità di un dato sistema neuronale per specifici fattori epilettogenici. Poiché alcune delle epilessie proposte come paradigma di SystE sono state identificate come geneticamente determinate, questo porterebbe a pensare al meccanismo genetico come sistema epilettogenico elettivo, sul quale ovviamente entrano in gioco altre variabili biologiche ed ambientali (Avanzini et al., 2012; Capovilla et al., 2013).

La genetica nelle epilessie

Le epilessie genetiche costituiscono circa il 30% di tutte le epilessie. Le epilessie genetiche possono verificarsi sia in assenza di un danno cerebrale dimostrabile (epilessie idiopatiche), che in presenza di lesione cerebrale (epilessie sintomatiche), che può essere essa stessa gene-ticamente determinata (malformazione cerebrale, malattia metabolica ecc.). Un’epilessia genetica può presentarsi anche associata a una le-sione cerebrale acquisita, potenzialmente epilettogena o no. In questi casi può essere molto difficile stabilire il vero rapporto causa-effetto. Nelle ultime due decadi, la cosiddetta rivoluzione molecolare in medi-cina ha avuto un importante impatto anche nel campo delle epilessie, in particolare quelle idiopatiche. Lo studio mirato all’identificazione dei geni che possono determinare o anche solo influenzare il rischio di sviluppare epilessia è molto importante, non solo per migliorare le nostre conoscenze nell’universo ancora molto ignoto della patogenesi dell’epilettogenesi in generale, ma soprattutto per le implicazioni di rilievo nella diagnosi, nella gestione clinica e nella cura del paziente con epilessia. I meccanismi genetici alla base delle epilessie ad oggi noti includono riarrangiamenti genomici (cromosomi ad anello, traslocazioni, mo-nosomie e trisomie), copy number variants (CNVs; riarrangiamenti submicroscopici, delezioni o duplicazioni che coinvolgono uno o più geni), ed alterazioni di singoli nucleotidi che risultano poi in mutazio-ni missenso, frameshift, o nonsenso.L’epilessia è un modello di malattia preminentemente poligenico, tuttavia ad oggi sono stati identificati anche modelli di epilessie mo-nogeniche. I dati genetici ottenuti su queste rare forme monogeni-che di epilessie idiopatiche hanno permesso di chiarire il ruolo pa-togenetico di canali ionici voltaggio- o ligando-dipendente. Possono inoltre verificarsi difetti di metilazione o disomie uniparentali in de-terminate regioni del DNA (es. sindromi di Prader-Willi e Angelman) che provocano acquisizione o perdita di funzione in geni tipicamente espressi rispettivamente solo nella copia materna o paterna.

La relazione genotipo-fenotipo

La relazione tra genotipo e fenotipo epilettico non è sempre lineare. Ad esempio, mutazioni missenso del gene SCN1A si associano ad

Tabella I. Classificazione delle crisi epilettiche (modifica da Berg et al., 2010).

Crisi generalizzate

• Tonico – cloniche• Assenze Tipiche Atipiche Assenze con caratteristiche peculiari Assenze miocloniche Mioclonie palpebrali• Miocloniche Miocloniche Mioclonico-atoniche Mioclonico-toniche• Cloniche• Toniche• Atoniche

Crisi parziali/focali

• Semeiologia variabile a seconda dell’area encefalica coinvolta:• Sensitive• Motorie• Sensitivo-motorie• Con automatismi motori• Con mioclono focale negativo• Gelastiche• Emicloniche

Non definibili se generalizzate o parziali

• Spasmi epilettici

G. Gobbi et al.

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epilessia con convulsioni febbrili plus (GEFS+) e allo stesso tempo a quadri più gravi quali la sindrome di Dravet. Questa espressività va-riabile potrebbe essere dovuta a geni modificatori, cioè geni capaci di modificare l’espressione di un altro gene principale, amplifican-dola oppure riducendola, così come a fattori ambientali non ancora conosciuti. Inoltre la mutazione può avere penetranza ridotta: due individui con la stessa mutazione genetica possono avere probabilità diversa di sviluppare epilessia. Infine è opportuno ricordare l’ete-rogeneità genetica: la stessa sindrome epilettica monogenica può essere provocata da mutazioni su geni differenti, infatti spesso più geni codificano per differenti subunità di uno stesso canale ionico (Gardiner, 2006).

Le tecniche di indagine genetica e loro indicazioni cliniche

Per determinare la causa genetica di un’epilessia sono oggi disponi-bili diverse tecniche d’indagine, che è importante conoscere al fine di scegliere quella più appropriata ed efficace a seconda del caso. È importante sottolineare, anche con i pazienti e le loro famiglie, che ogni tecnica ha comunque dei limiti e nessuna è ad oggi in grado di esplorare l’intero genoma in tutta la sua complessità. Ad esempio il sequenziamento degli esomi non identifica comunque le anomalie di metilazione o quelle delle regioni non codificanti (Tab. III).

Tecniche citogenetiche

L’analisi cromosomica (citogenetica) è tuttora valida, seppur in un numero esiguo di pazienti, per rilevare in un soggetto con epilessia associata a ritardo mentale ed eventualmente altre caratteristiche aberrazioni cromosomiche non rilevabili con gli array-CGH. L’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array-Compara-tive GenomicHybridization o Array-CGH) è una tecnica sviluppata per identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico o variazioni (variazioni del numero di copie “CNV”) del contenuto di piccole por-zioni cromosomiche, come duplicazioni/amplificazioni (presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA), o delezioni (perdite di porzioni di genoma). Il potere risolutivo dell’analisi è variabile: attualmente per scopi diagnostici vengono impiegati array tra 1 Mb e 100 kb, ovvero 100 volte più elevata rispetto alla citogenetica tradizionale. Inoltre, la tecnica Array-CGH è in grado anche di definire esatta-mente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra variazioni del numero di copie e patologia. Quando l’epilessia non è associata a ritardo mentale ed eventualmente altre caratteristiche, l’impatto diagnostico di tale tecnica sembra essere inferiore.

Tecniche di sequenziamento

Il sequenziamento Sanger è un metodo rapido per la determinazione delle sequenze di DNA mediante sintesi innescata con DNA polime-rasi (Fig. 1). Progressivamente sono stati messi a punto i cosiddetti sequenziamenti di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) che hanno permesso il sequenziamento ad una elevata velo-cità e con bassi costi.Il goal finale resta quello del Whole Genome Sequencing (WGS), ovvero il sequenziamento completo del DNA (sia nucleare sia mi-tocondriale) del genoma di un organismo in un unico esperimento. Tale opportunità rimane però estremamente dispendiosa per trovare applicazione nell’attività clinica. Si è scelto pertanto di sviluppare metodi alternativi, definiti “targhettati”, che si concentrano solo su regioni specifiche del genoma umano, rappresentando approcci a

Tabella II. Sindromi epilettiche (mod. da Berg et al, 2010).

Esordio in epoca neonatale

• Crisi familiari neonatali benigne (BFNS)• Encefalopatia mioclonica precoce (EME)• Encefalopatia epilettica a esordio infantile precoce (Sindrome di

Ohtahara)

Esordio in età infantile

• Crisi familiari neonatali-infantili benigne (BFNIS)• Crisi familiari infantili benigne (BFIS)• Epilessia generalizzata con convulsioni febbrili plus (GEFS+)• Epilessia mioclonica benigna dell’infanzia (BMEI)• Spasmi infantili (Sindrome di West)• Epilessia con crisi focali migranti• Epilessia mioclonica severa dell’infanzia (SMEI o sindrome di Dravet)• Epilessia con crisi mioclono-astatiche (EMAS o sindrome di Doose)• Epilessie miocloniche progressive (PME)• Convulsioni febbrili plus (FS+)

Esordio in età scolare

• Epilessia assenze del bambino (CAE)• Epilessia con assenze miocloniche (EMA)• Epilessia assenze con mioclonie palpebrali (sindrome di Jeavons)• Epilessia benigna con punte centro-temporali (BECTS o Epilessia

rolandica)• Epilessia con parossismi occipitali ad esordio precoce (sindrome di

Panayiotopoulos)• Epilessia con parossismi occipitali ad esordio tardivo (forma di

Gastaut)• Epilessia autosomica-dominante notturna del lobo frontale (ADNFLE)• Sindrome di Lennox-Gastaut (LGS)• Sindrome di Landau-Kleffner (LKS)• Epilessia con punte-onde continue nel sonno o stato epilettico

elettrico in sonno (CSWS, ESES)

Esordio in adolescenza – età adulta

• Epilessia con crisi tonico-cloniche generalizzate al risveglio• Epilessia mioclonica giovanile (JME o sindrome di Janz)• Epilessia assenze giovanile (JAE)• Epilessia autosomica dominante con caratteristiche uditive (ADEAF)• Altre epilessie familiari del lobo temporale

Indipendenti dall’età

• Epilessia familiare focale a foci variabili• Epilessie riflesse

Da lesioni specifiche o altre cause

• Epilessia del lobo temporale mesiale con sclerosi ippocampale• Sindrome di Rasmussen• Crisi gelastiche con amartoma ipotalamico• Sindrome emiconvulsione-emiplegia-epilessia

Strutturali/metaboliche

• Malformazioni dello sviluppo corticale (emimegalencefalia, eterotopie, etc.)• Sindromi neuro cutanee (sclerosi tuberosa, Sturge-Weber, etc.)• Tumori• Infezioni• Traumi• Angiomi• Insulti perinatali• Stroke

Epilessie da causa sconosciuta

Condizioni con crisi epilettiche tradizionalmente non diagnosticate come forme di epilessia per se

• Crisi neonatali benigne (BNS)• Convulsioni febbrili(FS)


229

prezzi accessibili per individuare eventuali varianti geniche asso-ciate alla malattia. Il sequenziamento di tutte le regioni codificanti le proteine del genoma, indicato anche come exome sequencing, è il candidato promettente: l’esoma costituisce circa l’1% del genoma umano richiedendo la sequenza di sole 30 Mb circa, il whole exome sequencing (WES) è solo 1/20 rispetto al WGS (Ng, Bigham et al., 2010), ma rappresenta un sottoinsieme altamente ricco del genoma in cui cercare le varianti con grande effetto sul fenotipo. L’exome sequencing è più utile per i disturbi con una probabile eterogeneità genetica. Questa strategia può essere estesa anche alle malattie con una genetica più complessa, attraverso l’analisi di campioni di dimensioni più grandi e lo studio dell’impatto funzionale delle va-rianti non sinonime identificate. Inoltre, il whole exome sequencing (WES) rappresenta una base promettente per la medicina genomica personalizzata; infatti grazie all’identificazione del gene causativo sarà possibile individuare il pathway proteico alterato che può forni-re il target per una terapia mirata. Lo studio di linkage non è adatto per le estremamente rare malattie mendeliane a causa della difficoltà nella raccolta di un numero ade-guato di individui affetti (di famiglie multigenerazionali) e famiglie per un studio statisticamente significativo e non è applicabile anche per i casi sporadici.

L’impatto della genetica sulle nuove acquisizioni in epilettologia

Le recenti scoperte genetiche stanno avendo un impatto rilevante nelle conoscenze di base dell’epilessia. Studi sperimentali da tem-po avevano individuato nella presenza di scariche fasiche intense

Tabella III. Metodiche di indagine genetica nelle epilessie (mod. da Olson 2014).

Tipo di indagine Descrizione Quando utilizzarla

Chromosomal microarray Si basa sull’ ibridazione di DNA del paziente con quel-lo di controllo su specifiche sonde Impiegati sia per individuare polimorfismi di un singolo nucleotide (SNP arrays) o per determinare riarrangiamenti cromoso-mici submicroscopici (Array-CGH) come le CNVs in diversi loci contemporaneamente.

Soprattutto quando l’epilessia si associa a ri-tardo di sviluppo, autismo e/o dimorfismi.

Sequenziamento di singolo gene Individua alterazioni nella sequenza delle basi azotate e se esse provocano alterazioni aminoacidiche

Quando si sospetta un’anomalia in un gene specifico (es. SLC2A1 per deficit di trasporto del glucosio)

Ricerca di duplicazioni/delezioni in un singolo gene

Valuta le CNV in un gene specifico Quando si sospetta un’anomalia in un gene specifico ma il sequenziamento è negativo

Ricerca di una mutazione specifica Sequenziamento per cercare una mutazione specifica Sui genitori per determinare il significato di una mutazione ancora sconosciuta

Panel di geni associati ad una patologia Sequenziamento ± ricerca duplicazioni/delezioni per un panel di geni

In disturbi associati a molti geni, come le en-cefalopatie epilettiche

Studi di metilazione Valuta anomalie di metilazione in regioni cromosomi-che specifiche

Sospetto di anomalie di metilazione, come la sindrome di Prader-Willi e Angelman

Fluorescent in situ hybridization (FISH) Sonde che individuano specifiche regioni cromoso-miche

Conferma di una delezione/duplicazione in re-gioni specifiche, es. 22q11

Cariotipo Rappresentazione di tutte le coppie cromosomiche di una cellula

In pazienti con dimorfismi o anomalie conge-nite multiple; sospetto di monosomie, trisomie o riarrangiamenti cromosomici

Sequenziamento dell’intero esoma o genoma Valuta alterazioni di sequenza e CNVs per l’intero eso-ma (solo sequenze codificanti) o genoma.

Quando c’è un forte sospetto di patologia ge-netica ma le indagini finora condotte non han-no portato risultati

Figura 1. Schema del metodo Sanger per il sequenziamento del DNA.

Primer per la replicazione

Filamento di DNA da sequenziare

Preparare quattro composti di reazione; includere in ciascun composto un diverso

nucleotide di replicazione-arresto

Primer di DNA

Separare i prodotti mediante elettroforesi su gel

Leggere la sequenza come complemento di bande

che contengono filamenti marcati

Prodotti di replicazione

della reazione “C”Primer

Primer

Primer

G. Gobbi et al.

230

di una popolazione di neuroni l’evento cellulare, noto come “pa-roxysmal depolarization shift” (PDS), alla base dell’epilettogenesi e il ruolo fondamentale delle correnti ioniche nel corso del suo svi-luppo, in particolare le correnti del sodio, del potassio, del calcio e del cloro attraverso canali attivati da neurotrasmettitori o variazioni del potenziale di membrana. La recente individuazione di mutazioni nei geni codificanti subunità di canali voltaggio-dipendenti del sodio, del potassio e del cloro, di recettori per l’acetilcolina e per il GABA in alcune forme di epilessia hanno confermato gli studi sperimentali e permettono di inserire oggi alcune forme di epilessia idiopatica tra le canalopatie. Tuttavia l’implicazione dei canali ionici in forme molto rare e ad ereditarietà esclusivamente autosomica dominante impone cautela nell’estendere il concetto di canalopatie a tutte le epilessie idiopatiche. Ad oggi infatti le basi genetiche delle forme comuni di epilessia idiopatica a ereditarietà complessa sono ignote.Un altro impatto importante è relativo proprio alla pratica clinica quotidiana. I dati epidemiologici rilevano che sindromi clinicamente diverse ricorrono nelle stesse famiglie, indicando l’esistenza di fat-tori ereditari comuni. L’identificazione di mutazioni – ad esempio in SCN1A, SCN1B, GABRG2 –, associate a diversi fenotipi in famiglie caratterizzate da fenotipi diversi conferma le osservazioni epidemio-logiche che le diverse sindromi si sviluppano dall’azione concomi-tante di fattori ereditari e background individuale. Relativamente alle nostre conoscenze, la genetica ha, inoltre, posto l’attenzione su specifici fenotipi familiari successivamente validati come nuove forme sindromiche, quali l’epilessia mioclonica benigna familiare dell’adulto, le crisi infantili benigne familiari e l’epilessia autosomica dominante del lobo temporale mesiale e laterale.

Le epilessie geneticheUn’epilessia genetica può essere sospettata sulla base di specifiche caratteristiche cliniche, anamnestiche ed esami strumentali, quali:• sintomi e segni tali da definire una specifica sindrome epilettica;• dismorfismi facciali o somatici;• anomalie congenite;• arresto, regressione o ritardo di sviluppo psicomotorio;• pattern EEG specifico;• RM peculiare;• resistenza al trattamento.Le epilessie genetiche sono state suddivise in encefalopatie epiletti-che dell’età evolutiva ed epilessie benigne dell’età evolutiva

Le encefalopatie epilettiche (EE) dell’età evolutiva

Le EE sono condizioni in cui l’epilessia causa o concorre a causare o aggravare il deterioramento cognitivo e/o comportamentale del sog-getto (Berg et al., 2010). Nelle EE più geni possono presentare un qua-dro epilettologico analogo, in associazione o meno a segni e sintomi di-stintivi sia a carico del sistema nervoso centrale che non (Mastrangelo e Leuzzi, 2012). Allo stesso modo diverse mutazioni nello stesso gene possono causare epilessie meno catastrofiche o non causare epilessia affatto, ma esprimersi con altri disturbi a carico del sistema nervoso centrale, quale il ritardo mentale, deficit di attenzione, disturbi compor-tamentali (Tavyev Asher e Scaglia, 2012; Olson et al., 2014)Nella Tabella IV sono state riportate le caratteristiche principali di al-cune delle più frequenti encefalopatie epilettiche, ordinate secondo l’età d’esordio e non secondo raggruppamento sindromico. Si sono volutamente escluse le encefalopatie miocloniche precoci da causa metabolica (EME), per le quali si rimanda a OMIM (omim.org), perché la loro evoluzione non è dovuta al tipo di encefalopatia epilettica di per sé, ma alla malattia metabolica che le sottende.

Sindrome di Ohtahara (SO) e l’encefalopatia mioclonica precoce (EME) Le encefalopatie ad esordio neonatale o precoce si configurano in particolare in due sindromi, la sindrome di Ohtahara (SO) e l’ence-falopatia mioclonica precoce (EME), raggruppate sotto la sigla EIEE (Early Infantile Epileptic Encephalopathy).

Sindrome di Ohtahara (SO) La SO è caratterizzata da crisi toniche ad esordio precocissimo (dai primi giorni di vita fino ai 3-4 mesi), accompagnate da “burst-sup-pression” (BS) all’EEG (Nordli, 2012). Le crisi sono brevi, 10 secondi circa, e possono presentarsi isolate o in cluster, sia in sonno che in veglia. La sindrome si associa invariabilmente a deterioramento dello sviluppo psicomotorio, resistenza ai farmaci, cattiva prognosi, e anche evoluzione in sindrome di West (SW). ARX è un gene tipicamente associato alla SO e a vari altri segni. La gravità del quadro spesso ma non univocamente correla con il nu-mero e la sede di polialanine espanse, causando quadri diversi (SW e crisi miocloniche) (Mastrangelo e Leuzzi, 2012). MECP2 quando mutato nei maschi (Kamien et al., 2012) e FOXG1 sono responsabili di quadri encefalopatici precoci con ritardo men-tale, disturbi del movimento e alterazioni aspecifiche alla risonanza magnetica (Noh et al., 2012). Mutazioni in CDKL5 si manifestano precocemente (prima dei 3 mesi), sebbene raramente configurino un pattern BS vero e proprio all’EEG, presentano crisi toniche corrispondenti a diffuso appiattimento del tracciato seguito da anomalie focali (Bahi-Buisson et al., 2008). Il gene STXBP1 causa circa 10-30% dei casi di SO (Kamien et al., 2012), si associa a ritardo mentale grave, neuroimaging normale o con ipomielinizzazione aspecifica e vari disturbi del movimento dall’atassia alle discinesie (Mastrangelo e Leuzzi, 2012). PNKP codifica per una proteina coinvolta nella riparazione del DNA, si esprime attraverso mutazioni omozigoti o eterozigoti composte che portano a quadri di microcefalia, ritardo mentale e SO (Mastran-gelo e Leuzzi, 2012; Olson et al., 2014). Altri tipi di mutazioni a carico di questo gene possono dare quadri più lievi o non presentare epi-lessia affatto (Tavyev Asher e Scaglia, 2012).SCN2A e KCNQ2, geni codificanti per canali ionici, presentano un overlap con sindromi benigne e sono coinvolti anche in quadri chia-ramente encefalopatici associati o meno ad anomalie alla neuro-imaging, ritardo mentale, disturbi comportamentali e del movimento (Tavyev Asher e Scaglia, 2012). Infine, una disregolazione dei geni ARHGEF9, SRGAP2 e MEFC2 si manifesta tramite quadri di encefalopatia epilettica ad inizio precoce e prognosi peggiore di quanto non succeda quando la mutazione non comporti disregolazione (Tavyev Asher e Scaglia, 2012). Con il sempre maggior impiego delle tecniche avanzate di sequenziamen-to dell’esoma è stato inoltre possibile evidenziare il coinvolgimento di altri geni in singoli casi: KCNT1 e PIGQ1 (Martin et al., 2014), il gene CASK associato a ipoplasia pontocerebellare (Saitsu et al., 2012) e il gene BRAT1 che comporta anche microcefalia e dismorfi-smi (Saitsu et al., 2014)

Encefalopatia mioclonica precoce (EME) L’EME è caratterizzata da un esordio precoce (entro i tre mesi di età), mioclonie parcellari spesso associate a crisi parziali erratiche, raramente spasmi o mioclonie massive con pattern a BS all’EEG. Questo aspetto è più evidente in sonno. La prognosi è grave o in-fausta, non tende ad evolvere in altre sindromi epilettiche definite e la presenza di BS persiste all’EEG (Ohtahara e Yamatogi, 2006). Le


231

cause individuate si basano su vari deficit metabolici. Non vi sono anomalie strutturali specifiche alla neuroimaging. Riportare tutti i geni dei difetti biochimici meriterebbe una trattazione dedicata e ci limiteremo a citarne solo alcuni individuati recentemente. Tra que-sti si segnalano mutazioni del gene SCL25A22, che codifica per un trasportatore mitocondriale del GABA e che associa EME, microce-falia, retinite pigmentosa e ipotonia (Noh et al., 2012; Tavyev Asher e Scaglia, 2012), mutazioni del gene PNPO (17q21.32), codificante

per la piridossamina ossidasi, che può dare quadri di EME e che rispondono alla supplementazione con piridossal-fosfato (Noh et al., 2012), mutazioni a carico di ALDH7A1 (5q23.2), che può dare ipotonia, ipoplasia cerebellare, atrofia cerebrale diffusa e corpo cal-loso assottigliato oltre a crisi precoci che rispondono a piridossina e folati (Noh et al., 2012) e, infine, mutazioni del gene TBC1D24, che codifica per una proteina coinvolta nel trasporto vescicolare e che possono dare quadri analoghi (Olson et al., 2014).

Tabella IV. Encefalopatie epilettiche e relativi geni candidati.

Età media di esordio-

range

Tipo di crisi/Sindrome

Caratteristiche EEG Evoluzione Gene (nome)Localizzazione cromosomica

Modalità di trasmissione Tipo di mutazioni

Funzione della

proteina

Note

Neonatale o early infantile ovvero primi mesi da lattante (0-1/3-4 mese)

< 4 mesi Crisi toniche, spasmi- Sindrome di Ohtahara

Non specifiche burst suppression, attività disorganizzata, anomalie multifocali

Prognosi negativa ARX (aristaless-related homeobox )Xp22.13XR Mutazioni puntiformi, delezioni / duplicazioni di triplette.

Fattore di regolazione della trascrizione- espansione polyAruolo nella migrazione e differenziazione cellulare

Gravità del quadro dipenderebbe dal numero e sede polialanine in sovranumero; mutazioni troncanti

< 6 mesi Encefalopatia precoce con crisi convulsive ricorrenti

EEG intercritico normale Negativa, cambiano le crisi, evolve in S. di West, permane un’ epilessia farmacoresistente e ritardo mentale

CDKL5 (cyclin dependent kinase like5)Xp22.13XD Mutazioni specifiche, delezioni / duplicazioni, copy number variant

Non chiarita. Recentemente dimostrato che non agisce allo stesso modo del MecP2

Quadri più gravi nelle mutazioni troncanti che coinvolgono il dominio catalitico

Primi mesi di vita

Sindrome di Ohtahara crisi toniche

Burst suppression Negativa STXBP1 9q34.1AD Mutazioni eterozigoti missense, troncanti, microdelezioni

Proteina coinvolta nel rilascio sinaptico di vescicole

Crisi toniche Burst suppression PNKP 19q13.33AR Mutazioni puntiformi, di clivaggio

Enzima coinvolto nella riparazione del DNA

Altre mutazioni danno quadri più lievi

Crisi toniche Burst suppression atipica Evoluzione verso sindrome di West

SRGAP2Rottura del gene per traslocazione bilanciata

Implicato nella migrazione neuronale

Crisi toniche + iperekplexia

Negativa ARHGEF9Mutazioni missense, “rottura” del gene per traslocazioni bilanciate, microdelezioni

Cofattore per lo scambio di guanine nella divisione cellulare; clustering di recettori inibitori post-sinaptici

I casi con “gain of function” sembrano più gravi

>3 mesi Toniche e tonico- cloniche

Negativa FOXG114q13ADMutazioni puntiformi, delezioni

Fattore di trascrizione coinvolto nello sviluppo telencefalico

Negativa, riportato exitus precoce

MECP2Xq28 XD-fenomeni di inattivazione alterataMutazioni puntiformi, microdelezioni

Regolatore della trascrizione, necessario alla maturazione cerebrale.

Quadro precoce nei maschi e letale

MEF2C 5q14.3 Rottura del gene per traslocazione

Migrazione e differenziazione neuronale

Alterazioni nella regolazione dell’espressione genica di MEF2C

Prima settimana di vita

Crisi toniche associate o meno a componente clonica focale (arto, volto) e apnea

Attività di fondo asincrona con burst suppression o attività epilettiforme multifocale

Le crisi possono risolversi verso i tre anni ma il ritardo cognitivo permane

KCNQ220q13.33ARMutazioni missense

Canale potassio, proteina transmembrana

Stesso gene coinvolte nell’epilessia neonatale benigna

segue Tab. IV

G. Gobbi et al.

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Età media di esordio- range

Tipo di crisi/Sindrome

Caratteristiche EEG Evoluzione Gene (nome)Localizzazione cromosomicaModalità di trasmissione Tipo di mutazioni

Funzione della proteina

Note

Lattante e Prima Infanzia (1 mese - 2 anni)

< 6 mesi Epilessia parziale a crisi migranti

KCNT1Mutazioni puntiformi “gain of function”

Sottofamiglia T dei canali del potassio

Gain of function, gene coinvolto anche in ADNFLE

< 6 Encefalopatie con Spasmi Infantili

Encefalopatia precoce con crisi convulsive ricorrenti

EEG intercritico normale Negativa CDKL5 (cyclin dependent kinase like5)Xp22.13 XD Mutazioni specifiche, delezioni/duplicazioni, copy number variant

Non chiarita. Recentemente dimostrato che non agisce allo stesso modo del MecP2Spasmi infantili Ipsaritmia

Crisi toniche e miocloniche resistenti alla terapia

Anomalie focali e multifocali, attività lenta ampio voltata, attività theta diffusa, ritmi pseudo periodici

Crisi toniche spasmi infantili

Ipsaritmia Negativa STXBP1 9q34.1AD Mutazioni eterozigoti missense, troncanti, microdelezioni

Proteina coinvolta nel rilascio sinaptico di vescicole

Crisi toniche e spasmi infantili

Negativa PLCbeta120p12.3AR

Enzima coinvolto nei segnali cellulari

Delezione omozigote nella regione promoter

Spasmi infantili Ipsartimia Negativa ARX (aristaless-related homeobox )Xp22.13XR Analisi di sequenza, mutazioni specifiche, delezioni/duplicazioni.

Fattore di regolazione della trascrizione- espansione polyAruolo nella migrazione e differenziazione cellulare

Gravità del quadro dipenderebbe dal numero e sede polialanine in sovranumero; mutazioni troncanti

Spasmi infantili Ipsartimia SPTAN19q33-34AD Mutazioni puntiformi, delezioni, mutazioni “disruption”

Proteina del citoscheletro coinvolta nella stabilità assonale

In alcuni casi l’ipomielinizzazione migliora con il tempo.

Spasmi infantili MAGI27q11.23-q21.1

Impalcatura cellulare per recettori pre e post sinaptici

Sindrome di Dravet: Crisi polimorfe emicloniche, miocloniche, assenze atipiche, suscettibilità agli stati febbrili.

Punte e polipunte onda generalizzata su progressivo rallentamento dell’attività di fondo

Variabile ma in maggioranza persistenza delle crisi e ritardo cognitivo

SCN1A2q24.3AD Mutazioni puntiformi, delezioni

Subunità alfa del canale del sodio, varie mutazioni, diminuisce l’attività inibitoria del GABA con conseguente aumento della suscettibilità neuronale

Possibili geni modulatori, (SCN8A), (CACNB4), (SCN9A)

6-36 mesi EFMR: Diversi tipi di crisi febbrili e afebbrili

PCDH19Xq22

Proteina di membrana che controlla l’adesione cellulare

Gene mutato anche in pazienti epilettici senza ritardo mentale e in FIRES

Seconda Infanzia e oltre (2 anni-5 anni)

Sindrome di Lennox Gastaut (crisi frontali notturne, atoniche assenze atipiche)

Attività di fondo lenta anomalie multifocali, scariche di punta onda lente, attività rapida generalizzata parossistica

Negativa

ESES Punte-onda generalizzate continue nel sonno lento

Permane deficit cognitivo

GRIN2A16p13.2ADMutazioni puntiformi, troncanti e di clivaggio

Sindrome di Landau-Kleffner

Anomalie continue sulle regioni temporo-parietali

Permane deficit di linguaggio

GRIN2A16p13.2AD

Abbreviazioni. AD: autosomica dominante; AR: autosomica recessiva; XD: X-linked dominante; XR: X-linked recessiva

continua Tab. IV


233

Sindrome di West (SW) La SW insorge al 6° mese di vita (4-8 mesi) ed è caratterizzata dalla triade: spasmi tonici in flessione di solito in cluster, quadro EEG di ipsaritmia, regressione psicomotoria. Può essere l’evoluzione di una SO o costituire una fase transitoria di una forma EME. Può evolvere in sindrome di Lennox-Gastaut (SLG). Il gene CDKL5 e il FOXG1dopo un esordio più precoce e aspecifico possono presentarsi con quadro tipico di SW nelle fasi successive di malattia (Bahi-Buisson et al., 2008; Noh et al., 2012).Il gene ARX sarebbe responsabile di circa 5% dei casi maschili di SW (Kamien et al., 2012), associando anche distonia e disturbi dello spettro autistico (Mastrangelo e Leuzzi, 2012). Analogamente, STXBP1 causa SO ma anche SW (Noh et al., 2012) senza peraltro mostrare anomalie specifiche alla neuroimaging (Mastrangelo e Leuzzi, 2012). Altri geni candidati per la SW sono SPTAN1, PNKP, ST3GAL3, MAGI1 e PLCβ1 (Mastrangelo e Leuzzi, 2012; Tavyev Asher e Scaglia, 2012; Edvardson et al 2013).

Epilessia parziale maligna a crisi migranti (MMPSI) La MMPSI è caratterizzata da crisi focali polimorfe e arresto dello sviluppo psicomotorio nei primi sei mesi di vita. Le crisi sono tipi-camente farmacoresistenti e le scariche epilettiformi si evidenziano in varie aree di entrambi gli emisferi, “migrando” da una regione all’altra dell’encefalo. Non sono evidenti anomalie strutturali alla neuroimaging all’esordio e può mostrare successivamente assot-tigliamento del corpo calloso e ipomielinizzazione. Entrambi i sessi sono coinvolti in egual misura. Mutazioni che aumentano la funzione del gene KCNT1 sono state recentemente individuate in pazienti con questa sindrome (Barcia et al., 2012). Il gene codifica per un canale del potassio ed è stato già identificato in pazienti con epilessia del lobo frontale con crisi notturne autosomica dominante (ADNFLE). Al-tri autori riportano il possibile coinvolgimento di SCN8A ma non è chiaro se come agente eziologico o come gene modulatore in quan-to il gene KCNT1 non è stato contemporaneamente saggiato (Ohba et al., 2014). Altro gene coinvolto è il TBC1D24 (Olson et al., 2014) e ulteriori report di casi aneddotici implicano mutazioni di SCN1A associati a dismorfismi (Carranza Rojo et al., 2011; Freilich et al., 2011), SCN2A (Dhamija et al., 2013) oppure SCL25A22 con un qua-dro decisamente severo e decesso precoce (Poduri et al., 2013).

Sindrome di Dravet (SD) La SD si presenta tipicamente con crisi prolungate febbrili genera-lizzate o emicloniche nel primo anno di vita (6 mesi), e prosegue con crisi polimorfe, generalizzate (miocloniche e assenze atipiche) oppu-re parziali, mentre l’EEG intercritico è poco significativo. I bambini, che solitamente hanno sviluppo psicomotorio regolare all’esordio, vanno incontro ad arresto delle acquisizioni di varia entità (www.epilepsydiagnosis.org). Nella maggioranza dei casi, è associata a mutazioni nel gene SCN1A (2q24.3- AD) codificante per il canale del sodio neuronale. Le mutazioni sono generalmente puntiformi ma possono esserci anche delezioni o duplicazioni. La maggioranza dei casi è data da mutazioni de novo. L’indagine va condotta anche nei genitori al fine di stabilire il rischio di ricorrenza (Noh et al., 2012, Mastrangelo e Leuzzi, 2012). La gravità del quadro sembra essere più accentuata nelle mutazioni troncanti, ma una chiara correlazio-ne genotipo fenotipo non è stabilita (Tavyev Asher e Scaglia, 2012). Inoltre, lo stesso gene può essere mutato anche in forme benigne di epilessia. La positività all’indagine genetica in questo caso riveste anche un’importanza terapeutica in quanto esiste una specifica in-dicazione terapeutica (stiripentolo, acido valproico, benzodiazepine,

levetiracetam, topiramato e dieta chetogena) e una specifica con-troindicazione per farmaci con azione sui canali del sodio (lamotiri-gina, fenitoina, vigabatrin, oxcarbazepina e carbamazepina) (Noh et al., 2012). Anche i geni SCN2A, SCN8A, SCN9A e CACNA1A sono sta-ti riscontrati mutati in alcuni casi di SD, ma con un ruolo verosimil-mente di “gene modificatore” e in senso peggiorativo (Mastrangelo e Leuzzi, 2012; Ohmori et al., 2013, Mulley et al., 2013). Si sta pro-filando sempre di più il fenotipo legato al gene CHD2 caratterizzato dalla prevalenza di crisi miocloniche e che sembra non sovrapporsi alla SD (Suls et al 2013), quasi a indurre a ritenerla una forma a sé stante. SCN1B è stato identificato in alcuni casi casi di DS, ma uno studio multicentrico recente ha dimostrato che non si possa ritene-re rilevante nella maggioranza dei casi (Kim et al., 2013). Altri geni coinvolti sono GABRA1 e STXBP1 (Carvill et al., 2014). Certamente l’impiego sistematico delle nuove tecniche aiuterà a chiarire l’evi-dente variabilità genetica e gli effetti delle mutazioni dei vari geni (ovvero l’impatto di un meccanismo poligenico nelle varie forme di epilessia).

Sindrome di Lennox-Gastaut (LGS) Vi sono altre forme di epilessia tipiche di questa fascia di età per le quali però non sono stati ritrovati dei geni specifici al momento. La LGS esordisce tra i 2 e i 5 anni, in un terzo dei soggetti preceduta da SW e si esprime con crisi toniche notturne, assenze atipiche, crisi di caduta e raramente crisi miocloniche, arresto e regressione dello sviluppo cognitivo, turbe comportamentali in età tardo infan-tile e adolescenziale (www.epilepsydiagnosis.org). Anche se non vi sono report di geni specifici, è da tener presente che molti pazienti manifestano prima la SW e ancor prima la SO e di conseguenza l’eziologia genetica è responsabile anche della LGS (Nordli, 2012). Vi sono alcuni report di mutazione del gene CHD2 (Lund et al., 2014) di pazienti con SLG atipica.

Sindrome di Doose o epilessia mioclono-astatica (PMMA) La PMMA si manifesta tra i 6 mesi e i 6 anni di età. Spesso le crisi febbrili e le crisi tonico-cloniche generalizzate precedono la compar-sa di episodi mioclono-astatici e atonici. I maschi sono più colpiti e i soggetti non hanno deficit neurologici o cognitivi all’esordio, mentre possono svilupparli successivamente. All’EEG si osservano scariche generalizzate di punte e polipunte onda (www.epilepsydiagnosis.org). Nonostante numerosi studi e una certa ricorrenza familiare di sindromi epilettiche non è stato possibile individuare dei geni spe-cifici della PMMA. Mutazioni dei geni SCN1A e GABRG2 o SCL2A1 sono state descritte, ma con ruolo da definire (Tang e Pal, 2012).

Sindrome di Landau Kleffner (LKS) e encefalopatia epilettica con punte onda continue nel sonno (ESES/CSWS) La LKS, afasia acquisita dai 2 agli 8 anni con o senza crisi epiletti-che ma con anomalie epilettiformi sulle regioni temporoparietali, e l’ESES(CSWS), caratterizzata da regressione cognitiva e turbe com-portamentali associate al tipico quadro EEG di POCS con o senza franche crisi epilettiche, sono risultate associate in alcuni casi a mutazioni del gene GRIN2A (Olson et al., 2014).

Encefalopatia epilettica da mutazione del gene PCDH19 L’encefalopatia epilettica da mutazione del gene PCDH19, codifican-te per la protocaderina, ha caratteristiche distintive. Le crisi poli-morfe, febbrili e afebbrili, insorgono tra i 6 e i 36 mesi di età, asso-ciandosi a vari gradi di ritardo mentale e turbe del comportamento (Tavyev Asher e Scaglia, 2012).

G. Gobbi et al.

234

Altre encefalopatie epilettiche in corso di definizione sindromica

Progressivamente con la diffusione dell’impiego delle moderne tec-niche di sequenziamento del DNA, si aggiungono nuovi geni a que-sto elenco e si espandono i fenotipi correlati ai geni già noti.HCN1, che codifica per un canale a iperpolarizzazione attivata da nucleotidi ciclici, è stato allo stesso modo identificato come agente eziologico in soggetti con fenotipo simil-Dravet, privi di mutazioni di SCN1A o PCDH19, che presentano crisi polimorfe febbrili o afebbri-li precocemente e successivamente assenze atipiche con o senza mioclonie, crisi parziali, ritardo mentale a vario grado e disturbi com-portamentali (Nava et al., 2014).Mutazioni nel gene SYNGAP1 portano ad un esordio di crisi compre-so tra i 6 mesi e i 3 anni. Gli eventi critici sono polimorfi e i soggetti presentano regressione con outcome sfavorevole che sfocia in ri-tardo mentale moderato o severo (Carvill et al., 2013). Mutazioni a carico dello stesso gene erano state rinvenute in popolazioni con ritardo mentale ed epilessia controllata dalla terapia. In effetti SYN-GAP1 si candida come potenziale eziologia genetica per le epiles-sie generalizzate, in quanto i pazienti hanno mostrato epilessia con assenze miocloniche, crisi tonico cloniche generalizzate febbrili e afebbrili, crisi atoniche e assenze atipiche controllate o meno dalla terapia farmacologia, ma invariabilmente associate disturbi cogniti-vi, dell’attenzione o dello spettro autistico.

Le epilessie benigne dell’età evolutiva

Vengono definite epilessie benigne quelle epilessie che presentano un buon outcome in termini clinici, terapeutici (buona farmacore-sponsività) e di sviluppo cognitivo. Anche nello studio genetico delle epilessie benigne non è possibile definire una relazione lineare tra fenotipo e genotipo, e viceversa (eterogeneità genetica) (Allen et al., 2014). Nella Tabella V sono riassunte le caratteristiche principali delle epi-lessie benigne per le quali sono noti geni candidati.

Crisi neonatali benigne familiari BFNSs/neonatali-infantili benigne familiari BFNISs /infantili benigne familiari BFISs

Costituiscono il paradigma delle epilessie benigne per eccellenza (Specchio e Vigevano, 2006). Differiscono tra loro per l’età di esordio (pochi giorni di vita, entro i 6 mesi e dopo i 6 mesi rispettivamente). Le BFNSs sono caratterizzate da crisi focali di breve durata (1-2 minuti) che possono ricorrere anche con grande frequenza (fino a 30 al gior-no). Molte crisi iniziano con un’attività motoria di tipo clonico con ap-nea, cui fanno seguito vocalizzi, movimenti oculari, segni autonomici, automatismi motori e clonie focali o generalizzate. Le crisi si risolvono spontaneamente in genere entro 1-6 mesi dall’esordio (comunque entro l’anno di vita). Le BFNISs sono caratterizzate da crisi di bre-vissima durata (inferiore al minuto) che possono ricorrere anche con frequenza pluriquotidiana. Sono caratterizzate perlopiù da crisi tonico-cloniche e recedono spontaneamente entro il primo anno di vita. Le BFISs presentano caratteristiche cliniche sovrapponibili. Talvolta può essere indicata la terapia farmacologica con ottima risposta clinica (Weckhuysen et al., 2013; Zara et al., 2013; Matalon et al., 2014).

Epilessia notturna autosomica dominante del lobo frontale

È stata la prima sindrome focale autosomica dominante, ereditata da singolo gene a essere descritta. Si manifesta nella tarda infanzia e in circa il 90% dei casi prima dei 20 anni, può persistere fino all’età adulta. Le crisi si manifestano durante il sonno o subito prima del risveglio, sono molto frequenti, quasi ogni notte, e sono caratte-rizzate da crisi di tipo ipermotorio (improvvisi, bruschi e afinalistici cambiamenti di posizione, sobbalzi, movimenti di pedalamento degli

arti e delle braccia) cui può seguire secondaria generalizzazione. Non vi sono fenomeni postictali. Solo in un terzo dei casi s’instaura una certa farmacoresistenza.

Epilessia familiare del lobo temporale

Esordisce tra l’infanzia e l’età adulta con una netta prevalenza in adolescenza. Le crisi sono focali, caratterizzate da un’aura uditiva con talora con secondaria generalizzazione. Non sono evidenti ano-malie strutturali cerebrali, il decorso è benigno e spesso resta non diagnosticata. Per contro ancora scarsi e non univoci i dati sulle forme mesiali, con o senza sclerosi dell’ippocampo.

Epilessia Genetica con Convulsioni Febbrili Plus (Generalized Epilepsy Febrile Seizures plus GEFS+) Descritta nel 1997 dalla scuola australiana si caratterizza per la coesistenza in più membri di una stessa famiglia di fenotipi clini-ci differenti, quali convulsioni afebbrili generalizzate o parziali, crisi tonico-cloniche, assenze, crisi mioclono astatiche, crisi miocloniche o atoniche. La sindrome delle CFplus è caratterizzata anche dalla ricorrenza di CF oltre i 6 anni di età e dalla coesistenza di convulsioni afebbrili di tipo tonico-clonico (Piro et al., 2011).

Epilessia mioclonica familiare infantile (FIME) Esordio nella prima infanzia con crisi miocloniche brevi con coinvolgi-mento del capo, degli occhi, degli arti superiori e più raramente inferiori (in quest’ultimo caso possono causare occasionali cadute), senza com-promissione del contatto. Le crisi possono comparire isolate o in brevi grappoli. Lo sviluppo psicomotorio è nella norma (Afawi et al., 2013).

Epilessie generalizzate idiopatiche (IGEs) Comprendono fenotipi clinici differenti, di cui i quattro più noti sono l’epi-lessia con assenze dell’infanzia (CAE-Piccolo male), l’epilessia giovanile con assenze (JAE), l’epilessia mioclonica giovanile (JME-Sd di Janz) e l’epilessia generalizzata idiopatica con fenotipi variabili (GTCS at ran-domy). Queste condizioni possono coesistere all’interno della stessa famiglia e manifestarsi persino nello stesso individuo (Fig. 2).

Figura 2. La comorbidità dei sottofenotipi delle diverse forme di epilessie gene-ralizzate idiopatiche (IGEs) suggerisce in tali forme la condivisione dei fattori di suscettibilità genetica. CAE: epilessia con assenze dell’infan-zia; JAE: epilessia con assenze giovanili; JME: epilessia mioclonica gio-vanilE; GTCS: epilessia con crisi generalizzate “at random”.


235

Tabella V. Epilessie benigne e relativi geni canditati.

Epilessia Età media di esordio

Tipo principale di crisi

Evoluzione(benigna/maligna)

GeneLocalizzazione cromosomicaModalità di

trasmissione

Funzione della

proteina

Note

Crisi Neonatali Benigne Familiari(BFNSs)

tipo 1OMIM #121200

Primi giorni di vita (epoca neonatale)

Crisi toniche pluriquotidiane seguite talvolta da una fase clonica generalizzata. Solitamente crisi brevi e frequenti, talvolta in grappoli caratterizzate da deviazione del capo e degli occhi, staring, cianosi.

Benigna (remissione entro l’anno di vita)

KCNQ220q13.33AD

Canale voltaggio-dipendente del potassio, sottofamiglia KQT-like, tipo 2

Anche in EEEI 7OMIM#613720

tipo 2 OMIM # 121201

KCNQ38q24.22AD


Crisi Neonatali-Infantili Benigne Familiari(BFNISs)

Da pochi giorni ai 6 mesi

Tonico/cloniche-focali, atoniche di brevissima durata (meno di 10 sec)

Benigne (remissione spontanea entro il primo anno di vita, nessuna altra crisi nel follow-up successivo)

SCN2A2q24.3 AD

Canali del Sodio voltaggio dipendente, sub unità alfa, tipo 2

Anche in EEEI 11 OMIM #613721

Da pochi giorni ai 6 mesi

Clusters di crisi focali o tonico-cloniche

KCNQ220q13.33AD


Crisi Infantili Benigne Familiari(BFISs)

tipo 3OMIM# 607745

Tra i 3 e gli 8 mesi di età

Crisi tonico-cloniche. Benigna (non modifica della prognosi con FAE)

SCN2A2q24


Anche in EEEI 11 OMIM#613721

tipo 2OMIM# 605751

Tra i 4 e gli 8 mesi di età

Crisi focali /tonico-cloniche. Alcune sporadiche descrizioni di crisi febbrili al follow-up (intorno ai 12-18 mesi)

Benigna (talvolta terapia nel primo anno con CBZ, VPA 0 PB)

PRRT216p11.2 AD

Proteina 2 transmembrana ricca di prolina

Con o senza coreoatetosi parossistica OMIM# 602066Discinesia chinesigenica periodica OMIM#128200

Tra i 3 e gli 8 mesi di età (6 mesi mediamente)

Crisi focali con generalizzazione secondaria (deviazione del capo e degli occhi, ipertono diffuso e cianosi, seguiti da clonie bilaterali)

Benigna KCNQ220q13.33 AD


tra i 3 e gli 8 mesi di età (intorno ai 6 mesi)

Crisi brevi, della durata di circa 2 min, pluriquotidiane in clusters. Spesso focali (ma possono anche essere generalizzate) con ipertono diffuso (associato a scosse agli arti) e deviazione del capo o staring con pdc e cianosi

Benigne con completo controllo delle crisi con VPA PB o CBZ. L a terapia può solitamente essere sospesa tra 1-3 anni di età (al follow-up non epilessia, né crisi febbrili)

KCNQ38q24.22AD


Crisi Infantili Benigne Familiari con emicrania emiplegica familiareOMIM#602481

ATP1A21q23.2 AD

ATPasi, trasportatore Na/K, polipeptide alfa 2

Epilessia Notturna del Lobo Frontale

tipo 1OMIM# 600513

età infantile Frequenti, improvvise brusche crisi caratterizzate da movimenti afinanilistici durante il sonno

Solitamente le crisi persistono fino all’età adulta

CHRNA420q13.33AD

Recettore colinergico, Nicotinico, Alfa 4

tipo 2OMIM#603204

15q24AD

tipo 3OMIM# 605375

CHRNB21p21.3 AD

Recettore colinergico, Nicotinico, Beta 2

tipo 4OMIM# 610353

CHRNA28p21.2AD

Recettore colinergico, Nicotinico, Alfa 2

segue Tab. V

G. Gobbi et al.

236





trasmissione

Funzione della

proteina

Note

Epilessia Genetica con Convulsioni Febbrili Plus (GEFS+)

tipo 2OMIM# 604403

Crisi tra i 6 mesi ed i 6 anni. Caratteristica persistenza delle crisi febbrili oltre i 6 anni

Ampio spettro di fenotipi (Crisi generalizzate associate a febbre, crisi tonico-cloniche, crisi parziali, assenze)

Generalmente benigna (2-7% dei bambini sviluppano crisi afebbrili nel corso della vita)

SCN1A2q24.3AD

Canali del Sodio voltaggio dipendenti, Subunità alfa, tipo 1

Anche in Sindrome Dravet OMIM# 607208

FEB 3A OMIM# 604403

Emicrania emiplegica familiareOMIM#609634

tipo 1OMIM# 604233

SCN1B19q13.12AD

Canali del Sodio voltaggio dipendenti, sub unità beta, tipo 1

SCN2A2q24.3AD


Anche in EEEI 11OMIM #613721

tipo 7 OMIM# 613863

SCN 9A2q24.3

Canali del Sodio voltaggio dipendenti, sub unità alfa, tipo IX

Anche FEB 3B OMIM#613863

tipo 3OMIM# 611277

GABR G25q34 AD

Recettore del GABAa, sub unità gamma,tipo 2

Anche FEB 8 OMIM# 611277

Epilessia a tipo assenze infantiliOMIM# 607681

tipo 5 OMIM# 613060

GABR D1p36.33AD

Recettore del GABAa, sub unità delta

Descritto anche nelle Epilessie Idiopatiche Generalizzate e nelle Epilessie miocloniche giovanili OMIM#613060

tipo 4OMIM#609800

2p2

tipo 8OMIM#613828

6q16.3-q 22.31 AD

tipo 6 OMIM#612279

8p23-p21

Epilessia mioclonica familiare infantile (FIME)OMIM# 605021

Prima infanzia Esordio con crisi miocloniche, CF e Crisi tonico-cloniche

Benigne con buona risposta ai FAE

TBC1D2416p13.3

TBC 1 domain family, Tipo24

Anche in EEEI 16OMIM# 615338

Epilessia Familiare del Lobo Temporaletipo 1OMIM#600512

Esordio tra gli 8 ed i 19 anni

Crisi parziali originate dal lobo temporale, spesso associate a sintomi sensoriali (più stesso di natura uditiva ma anche olfattiva, visiva o a tipo vertigini), autonomici (gastrici/epigastrici, tachicardia) e/o fisico-emotivi (paura, depersonalizzazione dejavu)

Evoluzione benigna. Solitamente posti in terapia con PHE o CBZ

LGI 110q23.33 AD

Leucine-rich gene, glioma inactivated, 1

Epilessia Mioclonica giovanile (Sd di Janz)

OMIM#611136

Età adolescenziale (II decade di vita)

Presenza di grappoli mioclonici massivi al risveglio talvolta associate ad assenze atipiche

Buon controllo delle crisi con terapia (VPA).

GABRA 15q34 AR

Recettore GABA, alfa 1 #611136

Anche in EEEI19OMIM#615744Anche epilssia a tipo assenze infantili OMIM#611136

OMIM#254770 EFHC16p12.2 AD

EF-hand domain containing protein 1

Atassia episodica tipo 2OMIM#108500

Epilessia generalizzata idiopatica con fenotipi variabili OMIM#614847

Variabile con due picchi (uno infantile 4-10 anni e 6-12 anni)

Diversi fenotipi descritti (crisi a tipo assenze infantili e giovanili, crisi miocloniche giovanili, epilessia grande male)

Prognosi buona con risoluzione in adolescenza bo subito dopo.

SLC2A11q34.2

Solute Carrier family 2 (facilitated glucose transporter) tipo 1

Anche in epilessia a tipo assenze giovaniliOMIM#607631

continua Tab. V

segue Tab. V


237





trasmissione

Funzione della

proteina

Note

Epilessia generalizzata idiopatica

OMIM#607682

Due picchi (uno infantile 4-10 anni e 6-12 anni)

Diversi fenotipi descritti Prognosi buona con risoluzione in adolescenza bo subito dopo.

CACNB42q22 AD

Canale del Calcio voltaggio dipendente, subunità beta, tipo 4

Gene implicato anche nella Sd da deficit GLUT1 e nella distonia tipo 9

Atassia episodica tipo 5 OMIM#613855

OMIM#607682 Due picchi (4-10 anni e 6-12 anni)

Diversi fenotipi descritti Prognosi buona con risoluzione in adolescenza o subito dopo.

CACNA1A19p13.2 AD

Canale del Calcio voltaggio dipendente, tipo P/Q, subunità alfa 1A

Atassia episodica tipo 2OMIM#108500

Epilessia a tipo assenza

Forma infantileOMIM#607681

6-7 anni di età (forma infantile), età puberale (forma giovanile).

Crisi a tipo assenza pluriquotidiane

Prognosi benigna con remissione entro la fine dell’adolescenza.

GABR G2

5q34

Recettore del GABAa, subunità gamma, tipo 2

OMIM#611942 CACNA1H16 p 13.3

Canale del Calcio voltaggio dipendente, tipo T, subunità alfa 1

OMIM#600131 8q24

OMIM#612269 GABRB315q 12

Recettore GABA, Beta 3

Forma giovanileOMIM# 607631

EFHC16p12.2

EF-hand domain containing protein 1

Atassia episodica tipo 2 OMIM#108500

Epilessia Mioclonica giovanile OMIM#254770

Abbreviazioni. AD: autosomica dominante; AR: autosomica recessiva.

continua Tab. V

Epilessia assenze dell’infanzia (CAE-Piccolo Male) e epilessia assenze giovanile (JAE) Esordiscono rispettivamente intorno ai 4-10 anni (epilessia-assenze dell’infanzia) e 6-12 anni (epilessia-assenze dell’adolescenza). Clini-camente sono caratterizzata dalla comparsa di assenze caratterizzate da improvvisa e momentanea perdita di contatto con l’ambiente della durata variabile tra i 10 e i 30 secondi). Le assenze possono ricorrere numerose volte nel corso della giornata con picchi fino anche a 50-100 crisi al giorno nella CAE o essere più sporadiche come nella JAE. L’EEG critico ed intercritico è caratteristico per la presenza di scariche parossistiche di punte-onde lente di 3 cicli al secondo. Lo sviluppo psicomotorio è nella norma. La prognosi è solitamente buona e questa forma di epilessia si risolve sempre in l’adolescenza o subito dopo.

Epilessia mioclonica giovanile (JME-Sd di Janz) Esordio tre i 12 e i 18 anni, con crisi tonico-cloniche generalizzate e mioclonie, che si verificano tipicamente al risveglio. La coscienza è solitamente conservata. In circa 1/3 dei casi si verificano crisi di as-senza. L’eccessiva stanchezza e la carenza di sonno sono potenziali fattori scatenanti. L’EEG intercritico mostra tipicamente scariche di polipunte seguite da onde lente irregolari a frequenza di 1-3 Hz; in quello critico le crisi miocloniche correlano con scariche di polipun-ta-onda a 3-4-6 Hz. La risposta alla terapia farmacologica (acido valproico, clonazepam, levetiracetam) è buona, con ottimo controllo delle crisi, ma vi è alta ricorrenza delle crisi alla sospensione.

Epilessia generalizzata idiopatica con fenotipi variabili (GTCS at randomy)Gruppo caratterizzato da diversi quadri fenotipici (crisi a tipo as-

senze infantili e giovanili, crisi miocloniche giovanili, epilessia grande male), con anomalie EEG bilaterali sincrone e simmetriche con caratteristiche peculiari del quadro clinico presentato. Han-no una prognosi buona con risoluzione entro l’età adolescenziale (Fig. 2).

Conclusioni e considerazioni personaliIl percorso clinico diagnostico per lo studio della genetica dell’epi-lessia è molto articolato, spesso indaginoso e molto dispendioso in termini di tempo. Poiché i risultati talvolta possono avere significato non univoco o ancora sconosciuto, occorre delucidare i contenuti del referto alla famiglia. Non va dimenticato come invece proprio gli studi di genetica abbiano permesso in altri casi di definire condizioni cliniche complesse e non inquadrabili in sindromi specifiche, oppure categorizzare sottotipi peculiari. Pertanto il clinico non deve rinunciare ad approfondire la geneti-ca dell’epilessia poiché essa sta diventando uno strumento sempre più importante e di valore, sia in termini di ricerca che di clinica, consentendo una più accurata definizione diagnostica e prognostica e corroborando una più coerente scelta farmacologica. Certamen-te per assicurare una corretta gestione delle indagini genetiche nei pazienti con sindromi epilettiche è indispensabile una stretta colla-borazione tra il genetista e l’epilettologo pediatra, che ha il compito di un lavoro clinico rigoroso, che comprenda la descrizione della semeiologia delle crisi, l’analisi elettroencefalografica, le indagini di neuroimaging e la valutazione neuropsicologica.

G. Gobbi et al.

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Cosa sapevamo primaNella seconda metà dello scorso secolo sapevamo che una concordanza completa per la stessa forma sindromica si osservava solo nel 25 % delle fa-miglie e che era più alta nei parenti di primo grado e ancora di più nei gemelli monozigoti rispetto ai gemelli di zigoti. Si sapeva che un maggiore rischio di epilessia era nei parenti di un paziente affetto da epilessia rispetto alla popolazione generale e che il rischio aumentava in presenza di un pattern EEG di punta-onda generalizzato. Lo sviluppo delle tecniche di indagine citogenetica aveva permesso di studiare le epilessie nelle sindromi cromosomiche, negli alberi familiari dove la patologia era particolarmente rappresentata.

Cosa sappiamo adessoNegli ultimi venti anni sono stati fatti enormi progressi grazie allo sviluppo delle tecniche di genetica molecolare. Oltre alla continua scoperta di nuovi geni che sottendono le diverse forme di epilessia, le recenti individuazioni di mutazioni nei geni codificanti subunità di canali voltaggio-dipendenti del sodio, del potassio e del cloro, di recettori per l’acetilcolina e per il GABA stanno aumentando le nostre conoscenze di base sull’eziopatogenesi dell’e-pilettogenesi. Si intravedono importanti prospettive attraverso il disegno di nuovi farmaci mirati a specifici meccanismi patogenetici, oppure ad azione specifica su proteine mutate, fino ad una terapia genica sostitutiva nelle forme più gravi. Queste nozioni, inoltre, potrebbero portare a progressi nel campo della farmacogenomica, ossia nel prevedere la risposta del soggetto ad un trattamento, in termini sia di efficacia che di tollerabilità.

Quali ricadute sulla pratica clinicaLe attuali conoscenze impongono un lavoro clinico rigoroso di inquadramento diagnostico che comprenda i dati clinici, elettrofisiologici, neuroradiologici e neuropsicologici del soggetto e spingono ad avvalersi dei panel di geni che si vanno man mano predisponendo nei vari laboratori specializzati in Italia e a livello internazionale, al fine di studiare il maggior numero di geni in un dato pazienti. Ne consegue una maggior accuratezza e rapidità diagnostica che, corroborata dall’interpretazione dei dati da parte del clinico, permette inoltre di intraprendere scelte terapeutiche più adeguate nonché un corretto counseling familiare.

Sito internet che fornisce molte informazioni rispetto alle sindromi epilettiche, alle indagini genetiche disponibili e ai centri dove possono essere svolte: www.genetests.org

Box di orientamento


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* L’autore passa in revisione le encefalopatie epilettiche e le loro basi genetiche.

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Giuseppe Gobbi, Unità Operativa Complessa di Neuropsichiatria Infantile, IRCCS, Istituto delle Scienze Neurologiche, via Altura 3, 40139 Bologna - E-mail: [email protected]

Corrispondenza

240

Ottobre-Dicembre 2014 • Vol. 44 • N. 176 • Pp. 240-245 Frontiere

IntroduzioneL’Epigenetica è definita come quella parte della genetica che fa riferimento ad alterazioni ereditabili che modificano l’espressione genica, pur non alterando la sequenza del DNA (Dawson e Kouza-rides, 2012). I farmaci capaci di modulare l’espressione del DNA, potrebbero attivare o inattivare geni la cui funzione è strettamente legata alla patogenesi di una specifica malattia. Per queste ragioni, un approccio terapeutico innovativo definito “epigenetico” è poten-zialmente efficace in numerose patologie ancora oggi ad elevata mortalità e/o morbilità, o comunque per tante malattie in cui le cure convenzionali non riescono a risolvere tutti gli aspetti clinici cor-relati. Tuttavia l’applicabilità clinica di questa strategia terapeutica è ancora molto ridotta, soprattutto in pediatria. In questo articolo passeremo in rassegna le conoscenze oggi disponibili, orientandoci secondo le applicazioni cliniche già avviate o in fase avanzata di sperimentazione.

Meccanismi di controllo epigenetico ed espressione genica

I meccanismi alla base di queste modifiche sono diversi, inducendo l’attivazione o l’inattivazione di specifici geni. Questo spiega perché le cellule differenziate in un organismo pluricellulare esprimono solo i geni necessari alla loro attività. Il DNA eucariota esiste in forma di cromatina, che è costituita da unità di nucleosomi, sequenze di 147 paia di basi di DNA avvolte attorno ad un complesso ottamerico costituito da due dei seguen-ti Istoni H2A, H2B, H3 e H4 (Lunger et al., 1997). I cambiamenti dinamici nella struttura della cromatina sono descritti nella Figu-ra 1. Le parti compatte di cromatina sono ricche in nucleosomi e generalmente “silenziano” la trascrizione, rendendo il DNA inac-

cessibile. La perdita della conformazione in nucleosomi aumenta l’accessibilità alla cromatina, favorendo il legame con i regolatori trascrizionali. Il controllo della trascrizione è governato dai meccanismi di 1. metilazione del DNA; 2. modifiche post-traduzionali delle proteine istoniche; 3. azioni di enzimi ATP-dipendenti che rimodellano la cromatina; 4. scambio di varianti istoniche con istoni canonici.Le code sporgenti N-terminali degli istoni sono sottoposte a mo-dificazioni chimiche, che includono l’acetilazione, la metilazione, la fosforilazione, l’ubiquitinizzazione, la sumoilazione e la bioti-nilazione (Dawson e Kouzarides, 2012). La maggior parte delle alterazioni degli istoni sono reversibili attraverso le azioni degli enzimi che modificano gli istoni (Histon Modifiers). L’acetilazione degli istoni sui residui di lisina è associata all’attivazione tra-scrizionale, mediante attività opposte d’istone-acetiltransferasi (HAT) e istone-deacetilasi (HDAC) (Dawson e Kouzarides, 2012). La metilazione degli istoni è notevolmente più complessa, e coinvolge i residui di lisina, arginina e istidina. La metilazione della lisina degli istoni ha esiti diversi, dipendenti dal residuo che viene modificato e dall’entità della modifica (mono-, di- o tri-metilazione). La scoperta di enzimi che demetilano la lisina, ha rivoluzionato l’idea che le metilazioni degli istoni siano irre-versibili (Kooistra e Helin, 2012).

Epigenetica, malattie del bambino e farmaci

Sin dagli inizi del 2000 si riteneva che soltanto tre patologie fos-sero indiscutibilmente legate all’epigenetica: la sindrome di Rett,

Farmaci che modulano l’espressione del DNa: attuali e potenziali applicazioni in pediatria

Giovanna Russo, Milena La Spina, Piera Samperi, Luca Lo NigroCentro di Riferimento Regionale di Ematologia e Oncologia Pediatrica, Azienda Policlinico – OVE, Università di Catania

RiassuntoI farmaci capaci di modulare l’espressione del DNA potrebbero attivare o inattivare geni la cui funzione è strettamente legata alla patogenesi di una speci-fica malattia. La terapia “epigenetica” si pone l’obiettivo di modulare l’attività principalmente coinvolta nel meccanismo patogenetico della malattia stessa (metilazione o deacetilazione) come nelle malattie mielo-linfoproliferative, o di indurre la trascrizione e quindi la sintesi di proteine normalmente inespresse come nell’emoglobinopatie ereditarie. Nel primo caso, il ricorso a farmaci demetilanti e inibitori delle iston-deacetilasi ha portato alla remissione completa in casi refrattari. Nel caso delle emoglobinopatie ereditarie (beta talassemia e malattia drepanocitica) la somministrazione dell’Idrossi-Urea (HU) ha indotto l’espressione di HbF con conseguente beneficio clinico. Le potenzialità di queste nuove forme di trattamento sono notevoli, con possibilità di applicazione sia in campo oncologico che potenzialmente anche nella malattie ad eziopatogenesi autoimmune.

SummaryDrugs capable of modulating the expression of DNA could activate or inactivate genes whose function is closely linked to the pathogenesis of a specific disease. This “epigenetic” therapy aims to modulate activities primarily involved in the pathogenic mechanism of the disease itself (methylation or deacetylation) as in myelo-lymphoproliferative diseases, or to induce the transcription and thus protein synthesis normally unexpressed as in hereditary hemoglobinopathies. In the former case, the use of demethylating drugs and histone deacetylase inhibitors led to complete remission in refractory cases. In the latter case of hereditary hemoglobinopathies (beta thalassemia and sickle cell disease) the administration of hydroxy-urea (HU) induced the expression of HbF resulting in clinical benefit. This type of treatment has an enormous potential application; these drugs are planned to be part of treatment for certain tumors with current poor prognosis; moreover the potential use for curing the immune system diseases such as those with autoimmune etiology is in the way to be explored.

Farmaci ed epigenetica in pediatria

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la Sindrome dell’X fragile e la sindrome da instabilità centromerica ICF (Wright e Saul, 2013). Oggi si ritiene che numerose patologie a eziopatogenesi multifattoriale potrebbero essere indotte da altera-zioni epigenetiche; in primo luogo i tumori, seguiti dalle sindromi neurodegenerative, le distrofie muscolari (Consalvi et al., 2011), le malattie reumatiche (Gay e Wilson, 2014), le patologie psichia-triche. È consolidato che i “modulatori epigenetici” hanno un ruo-lo fondamentale nella carcinogenesi, rappresentando potenziali target terapeutici nelle malattie oncologiche dell’età pediatrica (Lawlor e Thiele, 2012). Se in alcuni casi la terapia “epigenetica” si pone l’obiettivo di modulare l’attività principalmente coinvolta nel meccanismo patogenetico della malattia (metilazione o dea-cetilazione) come nel caso delle malattie mielo-linfoproliferative, in altri casi tale terapia induce la trascrizione e quindi la sintesi di proteine normalmente inespresse: è il caso dell’emoglobinopatie ereditarie.

Emoglobinopatie ereditarie

La beta talassemia (BT) e la malattia drepanocitica (SCD) sono ca-ratterizzati dalla diminuzione o totale assenza della HbA (α2β2) con anemia emolitica cronica con vario grado di trasfusione-dipenden-za. Nella BT l’eccesso di catene α causa danno alla membrana eritrocitaria, apoptosi degli eritroblasti ed emolisi intramidollare con conseguente eritropoiesi inefficace. Nella SCD, l’alterazione strutturale della catene β dell’Hb comporta polimerizzazione del-l’HbS, con conseguente vaso-occlusione, ischemia e danno tissu-tale. Un’importante strategia terapeutica è quella di far aumentare la produzione di HbF (α

2g2), con lo scopo di correggere lo sbilan-ciamento delle catene α/non-α nella BT e di sostituire la catena βS anomala nella SCD. La presenza di HbF nella BT diminuisce l’accumulo e la precipitazio-ne delle catene α e riduce l’eritropoiesi inefficace; nella SCD inibi-

Figura 1.Meccanismi di controllo epigenetico della trascrizione. Il complesso di rimodellamento della cromatina può ristrutturare e riposizionare gli ottameri istonici utilizzando l’ATP per regolare l’accesso al DNA e favorire il legame dei fattori regolatori della trascrizione, come i fattori pro-trascrizionali, co-attivatori e la machinery della trascrizione, compreso il complesso della Polymerase (Pol) II. Le “code” degli istoni possono esser modificate da reazioni tipo la fosforilazione, l’acetilazione e la metilazione. Tutto ciò può avvenire grazie all’intervento dei “modificatori istonici” ovvero le iston-acetilasi, -metilasi e –chinasi. Gli “Istoni Varianti” (H2A.Z e H3.3) fiancheggiano le regioni non-nucleosomiche dei promotori che possono essere attivamente trascritti e altri elementi regolatori. Gli RNA-non codificanti (non-coding RNA) sono in grado di mantenere lo stato di etero-cromatina (modificato da Lim et al., 2013)ATP, adenosin trifosfato; ADP, adenosin difosfato; TSS, sito di start trascrizionale; Me, metilazione; P, fosforilazione; Ac, acetilazione; TF, fattore di trascrizione; RE, elementi di risposta; R, arginina; K, lisina; T, treonina; S, serina.

G. Russo et al.

242

sce la polimerizzazione dell’HbS mediante la formazione di molecole ibride (α2β

Sg), le quali si intercalano nei polimeri e ne interrompono l’accrescimento. Elevati livelli di HbF si associano a minore frequen-za delle crisi dolorose, minor numero di episodi di accidenti cere-brovascolari.L’idrossiurea (HU), farmaco citotossico, si è dimostrato efficace nell’indurre la sintesi di HbF. Il meccanismo d’azione dell’HU a livello dell’eritropoiesi verosimilmente è correlato all’inibizione della ribo-nucleasi riduttasi, enzima chiave nella conversione dei ribonucleotidi in desossi-ribonucletotidi, che entrano nella struttura base del DNA. Il “commissionamento” verso la linea eritropoietica avviene, sotto l’influenza di un insieme di citochine, a partire della cellula stami-nale totipotente verso i progenitori multipotenti mieloidi, poi verso le BFU-e (burst forming unit-erythroid) e le CFU-e (colony forming unit-erytroid). Esistono due vie di differenziazione funzionale verso le CFU-e e i globuli rossi maturi. La via principale procede dalle BFU-e mature, nelle quali l’espressione di HbF è spenta, verso globuli rossi di tipo adulto, esprimenti solo HbA. La via secondaria va dalle BFU-e primitive esprimenti ancora l’HbF. Questa via permetterebbe la formazione di “cellule F”, popolazione particolare di globuli rossi circolanti, contenenti sia HbF che HbA. Gli episodi di rigenerazione midollare rapida, come quelli indotti dall’effetto dell’HU, favoriscono questa via di differenziazione a partire dei precursori primitivi e la produzione di cellule F, inducendo una “riprogrammazione” del com-partimento dei progenitori eritroidi (Mabaera R, et al. 2008). L’effica-cia clinica osservata nella SCD potrebbe comunque essere correlata anche al miglioramento della morfologia e della deformabilità eri-trocitaria, alla diminuzione dei leucociti, alla riduzione dell’emolisi e all’aumento della produzione di ossido nitirico. Nella SCD, l’efficacia clinica e la scarsa tossicità dell’HU sono state ampiamente dimo-strate da uno studio pilota che ha descritto una riduzione signifi-cativa dell’incidenza delle crisi dolorose, degli episodi di sindrome acuta polmonare, del fabbisogno trasfusionale e della mortalità nei pazienti trattati con HU (Charache et al., 1995). Successivamente, numerose sperimentazioni cliniche hanno esteso le indicazioni d’u-so ai bambini, anche nel primo anno di vita (Kinney et al., 1999; Wang et al., 2011; Ware e Helms, 2012).Gli effetti collaterali relativi all’uso dell’HU sono rari; il più frequente è l’ipoplasia midollare che è reversibile e richiede il monitoraggio della crasi ematica. Il potenziale mutageno e teratogeno sono bassi (Ferster et al., 2003)Le indicazioni, controindicazioni e le raccomandazioni d’uso dell’HU relativamente all’età pediatrica sono dettagliatamente descritte nel-le linee-guida pediatriche AIEOP (Associazione Italiana di Ematologia ed Oncologia Pediatrica, http://www.aieop.org/files/files_htmlarea/tutto%20giu12.pdf. (Colombatti et al., 2013).L’HU nella BT non ha ottenuto i risultati sperati: i pazienti, con for-ma grave di malattia, trasfusioni dipendenti, che hanno risposto, sono riusciti solo ad allungare l’intervallo tra le trasfusioni. In alcuni pazienti con BT intermedia invece si è osservato un effetto sulla concentrazione totale dell’Hb e dell’HbF ed è stata osservata una ri-duzione dell’emolisi e dell’ematopoiesi extramidollare; in alcuni casi si sono avuti effetti benefici sul fabbisogno trasfusionale. Rimane comunque una quota rilevante di pazienti (20-30%) che non rispon-de (Musallam et al., 2013). Il problema più rilevante che limita l’uso dell’HU nella BT è l’ampia variabilità di risposta da paziente a paziente, probabilmente dovuto a caratteristiche genetiche individuali, che influenzano la farmacoci-netica e farmacodinamica (Ware RE et al., 2011).Sono stati ipotizzati due possibili meccanismi per spiegare la diffe-renza di risposta all’HU. Uno si basa sul fatto che i precursori eritroidi

dei pazienti reagiscono in maniera diversa alla somministrazione di HU, per cui mentre le cellule dei pazienti responder incrementano efficacemente la produzione di HbF, le cellule dei pazienti non-responder sono maggiormente suscettibili all’effetto citotossico dell’HU, facendo prevalere quindi i fenomeni apoptotici (Pourfarza-det al., 2013).L’altro meccanismo ipotizzato spiega la differenza di risposta con una differenza basale, per cui i pazienti responder hanno già, pri-ma del trattamento stesso, livelli più alti di Hb e di HbF e quindi il modesto incremento ottenuto con l’HU è sufficiente a produrre una risposta ematologica significativa (Banan et al., 2012).Nonostante l’effetto dell’HU su anemia e fabbisogno trasfusionale, la terapia con HU andrebbe valutata in un quadro clinico complessivo, avendo evidenze che la terapia trasfusionale, soprattutto nella BT intermedia, porti benefici su diverse manifestazioni della malattia, come ad esempio, le possibili complicazioni cerebro-vascolari che, stando a quanto noto per la SCD, non vengono prevenute dall’HU (Ware et al., 2012).Un’indicazione clinica all’uso dell’HU nella BT è la soppressione di emopoiesi extra-midollare, complicanza che può avere conseguen-ze cliniche rilevanti, come la compressione del midollo spinale (Ka-rimi et al., 2014). Osservando che i neonati di madri diabetiche avevano un ritardato switch dell’HbF all’HbA, fu ipotizzato che gli elevati livelli d’idrossi-butirrato presenti nelle donne diabetiche potevano essere in grado di indurre la produzione di HbF. I trial che seguirono dimostrarono che i pazienti trattati con il butirrato mostravano un aumento dei livelli di g-mRNA ed un aumento della sintesi delle catene g. Ele-menti predittivi della risposta al trattamento sembrerebbero essere gli elevati livelli di HbF (> 4,5%), gli alti livelli di HbF nei genitori e gli alti livelli di eritropoietina (Musallam et al., 2013). Il trattamento con i butirrati è ben tollerato e gli effetti collaterali sono limitati a di-sturbi gastrointestinali. La migliore risposta al trattamento ottenuta nei pazienti con SCD rispetto ai pazienti con BT sembrerebbe essere correlata all’azione che i butirrati esplicano sugli altri geni globinici: aumentano l’espressione dei geni α nei progenitori eritroidi dei pa-zienti con BT, mentre riducono i livelli di m-RNA dell’α globina nei pazienti con SCD (Musallam et al., 2013).

Malattie mielo-linfoproliferative

Agenti demetilanti

Il principale rappresentante di questa categoria di farmaci è l’aza-citidina (Vidaza®) che ha mostrato degli ottimi risultati negli adulti affetti da mielodisplasia (MDS), leucemia mielo-monocitica croni-ca (LMMC) o leucemia mieloide acuta (LMA) (Tasian et al., 2014). L’alterazione più studiata della metilazione del DNA è il cosiddet-to “silenziamento” dei geni onco-soppressori da ipermetilazione delle isole CpG all’interno della regione del promotore (Dawson e Kouzarides, 2012). L’azacitidina e la decitabina (5-aza-2’-Desossi-citidina – Dacogen®) sono analoghi della citidina. In origine, erano considerati come farmaci citotossici. Tuttavia, è stato scoperto che una bassa dose di questi farmaci potrebbe causare la demetilazio-ne mediante l’inattivazione della DNA metiltransferasi-1 (DNMT-1), l’enzima responsabile della metilazione del DNA (Stresemann e Lyko, 2008). Basse dosi di azacitidina o decitabina sono in grado di indurre la ri-espressione di geni precedentemente silenziati. La riattivazione di geni che regolano il ciclo cellulare può così indurre il differenziamento cellulare, ridurre la proliferazione e/o attivare l’apoptosi.


243

Recentemente è stata riportata la remissione completa in tre casi su otto bambini affetti da LAM recidivata o resistente, trattati con deci-tabina in monoterapia (Phillips et al., 2013). Studi di fase 1 su aza-citidina e decitabina in associazione alla chemioterapia nei bambini con leucemie acute recidivate o refrattarie sono già in programma (ClinicalTrials.gov: NCT01861002, NCT01853228). In linea con quanto avviene negli USA, in Europa l’ITCC (Innovative Therapies for Children with Cancer) ha in corso uno studio collaborativo, prospettico, inter-nazionale, di fase I/II per stabilire la dose raccomandata e l’efficacia preliminare dell’azacitidina in bambini con nuova diagnosi e/o recidiva di MDS o leucemia mielomonocitica giovanile (JMML). Nel protocollo, ITCC-0015, vengono studiati due dosi nel Livello 1 (75 mg/mq/die) e nel Livello 2 (100 mg/mq/die) (www.itcc-consortium.org).

Inibitori delle Iston-Deacetilasi

Sono stati identificati 18 HDAC negli esseri umani, 11 sono zinco-dipendenti, e vengono distribuiti in quattro classi a seconda dell’o-mologia con le HDAC di lievito (Abujamra et al., 2010). Gli inibitori di HDAC (HDI) sono oggetto di studio e di sperimentazione con l’obiet-tivo di modificare l’espressione dei geni “silenziati” dall’iperattività delle HDAC (Tab. I). Infatti, gli HDI promuovono l’apoptosi, inducono l’arresto del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare, impedendo la trasformazione maligna (Abujamra et al., 2010). Essi sono sud-divisi in diverse classi strutturali, tra cui acidi grassi a catena corta (come l’acido valproico e i butirrati), gli idrossamici (come vorinostat e tricostatina-A), i ciclico-tetrapeptidi (come trapoxin e depsipeptide), i benzamidi (ad esempio MS-275) e molti altri composti (Abujamra

et al., 2010). Il vorinostat (Suberoylamilide Acid idrossamico, SAHA) blocca l’attività enzimatica delle HDAC sia di Classe I (HDAC1, -2 e -3) che di Classe II (HDAC6) (Lawlor e Thiele, 2012). In Fase 1, il vo-rinostat è stato utilizzato in pazienti pediatrici con leucemia o tumori solidi (Fouladi et al. 2010), stabilendo la dose massima tollerata in 230 mg/mq/die (via orale). L’acido valproico (VPA) è un acido grasso a catena corta ed è definito un HDI debole, ma la sua disponibilità a lungo termine come farmaco antiepilettico ha spinto la sua valutazio-ne in oncologia come modulatore dell’attività epigenetica. VPA induce una forte inibizione della crescita cellulare nella LAM-FAB M5 (THP-1, MM6 e MOLM-13), attivando un arresto in G1 del ciclo cellulare p53-indipendente e quindi l’apoptosi (Tonelli et al., 2006). Diversi studi hanno dimostrato che VPA è più efficace in combinazione con altri agenti. In uno studio di fase 1-2, che prevedeva la combinazione di decitabine e VPA in 54 pazienti con la leucemia acuta refrattaria e con una età mediana alla diagnosi di 60 anni sono stati arruolati anche sette pazienti pediatrici di età compresa tra 4 a 21 anni: tre pazienti hanno mostrato una risposta completa nel midollo, e 1 paziente ha presentato solo il 6% di blasti midollari. Nessuno, nei casi pediatrici presentati, ha mostrato rilevanti eventi di tossicità correlati alla tera-pia (Garcia-Manero et al., 2006). In un altro studio di fase 1-2, che ha valutato la combinazione di azacitidina, VPA e acido trans-retinoico (ATRA) in 53 pazienti con leucemia mieloide acuta o mielodisplastica ad alto rischio, con un’età mediana alla diagnosi di 69 anni, sono stati coinvolti anche tre pazienti pediatrici, con induzione di una risposta midollare in un caso (Soriano et al., 2007).

Tabella I.Elenco dei farmaci che intervengono nella modulazione dell’espressione genomica, dei rispettivi target, dello stato di applicazione in clinica e della patologia di riferimento, prevalentemente di tipo oncologico (da Lawlor e Thiele 2012) . Modificatori epigenetici Target Stato Tumore

Inibitori HDAC

• Vorinista (SAHA) (Zolinza®)• Romidepsin (FK228) (Istodax®)

• Entinostat (SNDX-275)• Panobinostat (LBH589)• Belinostat (PDX101)

• Acido Valproico

• PCI-34051

HDAC1-3,6HDAC1-3,8 (Debole)HDAC6,4HDAC1HDAC1-4HDAC1-4 (Debole)HDAC8HDAC1-3 (Debole)HDAC8HDAC8

FDA Ped. Fase IFDA Ped. Fase I

Fase IIFase IFase I

Ped. Fase I

Pre-clinico

Linfoma cutaneo a cellule T/Recidiva tumori solidi

Tumore al senoLinfoma

Recidiva tumori solidi

Tumori solidi refrattari o tumori del SNC

Modificatori degli istoni acetilati• JQ1 KAC Pre-clinico Linfoma, tumori MYC-mediati

Inibitori HMT

• Inibitori EZH2 (Epizyme, Inc.)• 3-Deazaneplanocin A, DZNep• EPZ004777 (Epizyme, Inc.)

EZH2EZH2DOT1L

Pre-clinicoLinfoma con mutazione EZH2

LLA & LMA con riarrangiamento MLL

Inibitori dell’istone demetilasi• Inibitori delle monoaminossidasi: Pargyline,

LSD1 clorgyline, tranylcypromine (Parnate®)

• Analoghi poliamminici delle bisguanidinasi

LSD1

LSD1

Pre-clinico FDA

Pre-clinico

Inibitori della metilazione del DNA• Decitibine (Dacogen®) Azacytidine (Vidaza®)

• Zebularine

DNMT

DNMT

FDA

Trials clinici

Sindromi mielodisplastiche, Leucemia Mieloide Acuta (o LMA)

Sindromi mielodisplastiche, Leucemia Mieloide Acuta (o LMA)

G. Russo et al.

244

Oncologia pediatricaNel neuroblastoma ad alto rischio con amplificazione del MYCN, a dispetto dell’elevata intensità dei protocolli attuati, la progno-si rimane scadente, con percentuale di sopravvivenza inferiore al 5% nelle forme metastatiche in progressione o in recidiva (Ca-lafiore et al., 2013). È riportato che nuove mutazioni in corso di recidiva di neuroblastoma sono rare, mentre l’attività degli enzimi HMT è spesso elevata; la conseguente metilazione degli istoni è responsabile del silenziamento di geni oncosoppressori codificanti per proteine pro-apoptotiche (Bell et al., 2014). Farmaci inibito-ri di HMTs sono stati in grado di riattivare l’espressione dei geni proapoptotici, enfatizzando il potenziale della terapia epigenetica nel neuroblastoma. I tumori cerebrali rappresentano la forma più comune di tumore solido dell’età pediatrica e il medulloblastoma è la variante più frequente, rappresentando circa il 20% di tutti gli istotipi. Il trattamento si avvale della chirurgia, chemioterapia e ra-dioterapia, raggiungendo percentuali di sopravvivenza a 5 anni del 40% nella fascia di rischio alta e del 80-90% nella fascia di rischio bassa. Si distinguono 4 sottotipi: WNT, SHH, gruppo 3 e gruppo 4 che differiscono per istologia, biologia molecolare, genetica e prognosi e si ritiene che siano il risultato di un’alterazione di diffe-renti pathway nello sviluppo cerebrale. Un’attivazione abnorme di questi pathway porta ad una perdita del normale controllo del ciclo cellulare ed una disfunzione dell’apoptosi con proliferazione cellu-lare soprattutto cerebellare, rappresentando così potenziali target per nuovi farmaci (Gay e Wilson, 2014).

Reumatologia e malattie muscolariAgenti in grado di demetilare il DNA o de-acetilare alcune proteine

istoniche potrebbero essere efficaci nel trattamento dell’artrite reu-matoide (Gay e Wilson, 2014). Alterazioni dell’epigenoma sono state riscontrate anche in forme idiopatiche o farmaco-indotte di lupus eritematoso sistemico (LES), in particolare, ridotti livelli di metilazio-ne del DNA genomico dei T linfociti periferici sono stati riscontrati in soggetti affetti da LES rispetto a controlli sani. Secondo recenti studi, gli HDI dimostrano un ruolo promettente nella cura delle malattie reumatiche per il loro potente effetto antinfiammatorio; tuttavia, pri-ma di passare all’applicazione clinica, è necessaria una maggiore specificità terapeutica attraverso una maggiore comprensione dei meccanismi molecolari che controllano l’epigenoma (Lim et al., 2013). Evidenze sperimentali e precliniche hanno dimostrato il ruo-lo chiave degli HDAC nel controllo della progressione della distrofia muscolare (Consalvi et al., 2011).

Conclusioni e prospettive future

L’introduzione di questi farmaci in terapie di prima linea, in asso-ciazione ad altre molecole, nei bambini affetti da mielodisplasie o leucemie acute offrirà una migliore chance terapeutica. L’obiettivo principale comunque resta quello di individuare i farmaci che con scarsi effetti collaterali riescono ad indurre la guarigione o il netto miglioramento della qualità di vita nelle malattie croniche, come nel caso delle emoglobinopatie. Questi farmaci sono oggetto di speri-mentazioni in bambini affetti da tumori a prognosi severa. Infine la caratterizzazione di meccanismi epigenetici in cui il sistema immu-nitario svolge un ruolo cruciale, come nelle malattie a patogenesi autoimmunitaria, potrà offrire un razionale al trattamento “epigene-tico” per tutti quei bambini che ancora oggi sono sottoposti a terapie sintomatiche.

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** Questo studio, di altissimo valore statistico, in doppio cieco, randomizzato, ha dimostrato incontrovertibilmente l’efficacia clinica dell’HU nella SCD.

Colombatti R, Perrotta S, Samperi P, et al. on behalf of the Italian Association of

Cosa sapevamo prima• Numerose patologie a eziopatogenesi multifattoriale potrebbero essere indotte da alterazioni epigenetiche.• L’espressione del DNA può esser modulata da farmaci che potenzialmente possono attivare o inattivare geni la cui funzione è strettamente legata

alla patogenesi di una specifica malattia.

Cosa sappiamo adesso• I processi di metilazione e di acetilazione sono cruciali per il controllo della trascrizione.• Farmaci diretti a modificare tali reazioni sono capaci di modulare l’espressione della malattia e la gravità dei sintomi.• L’introduzione dell’idrossiurea nei pazienti con drepanocitosi ha cambiato il decorso di malattie croniche gravi e invalidanti come la SCD e come la BT.• La somministrazione di farmaci demetilanti e degli inibitori delle iston-deacetilasi (HDI) ha permesso il raggiungimento della remissione completa

in bambini con malattie mielo-linfoproliferative resistenti alla chemioterapia convenzionale.

Quali prospettive per il futuro• Inserimento di questi farmaci in terapie di prima linea, in associazione ad altri farmaci, per bambini affetti da mielodisplasie o leucemie acute. • Sperimentazione di questi farmaci in bambini con tumori a prognosi severa.• Caratterizzazione di meccanismi epigenetici in malattie in cui il sistema immunitario svolge un ruolo cruciale, come quelle a patogenesi autoim-

munitaria.

Box di orientamento


245

Pediatric Hematology-Oncology (AIEOP) Sickle Cell Disease Working Group. Or-ganizing national responses for rare blood disorders: the Italian experience with sickle cell disease in childhood. Orphanet Journal of Rare Disease 2013;8:169.

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Dawson MA, Kouzarides T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell 2012;150:12-27.

** Questo articolo elenca tutti i meccanismi epigenetici correlati al cancro e le relative terapie “mirate”: dal bancone (bench) del laboratorio al letto del malato (bedside). Ferster A, Sariban E, Meuleman N; Belgian Registry of Sickle Cell Disease pa-tients treated with Hydroxyurea. Malignancies in sickle cell disease patients treated with hydroxyurea. British Journal of Haematology 2003;123:368-9. Fouladi M, Park JR, Stewart CF, et al. Pediatric phase I trial and pharmacokinetic study of vorinostat: a Children’s Oncology Group phase I consortium report. Jour-nal of Clinical Oncology 2010;28:3623-9.

** Questo articolo presenta per la prima volta l’utilizzo del SAHA nei bambini.Garcia-Manero G, Kantarjian HM, Sanchez-Gonzalez B, et al. Phase 1/2 study of the combination of 5-aza-2’-deoxycytidine with valproic acid in patients with leukemia. Blood 2006;108:3271–9.

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** Questo studio ha permesso di estendere le indicazioni all’uso di HU anche all’età pediatrica, allontanando i timori per i potenziali effetti tossici.

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** L’articolo riesce a condensare l’attuale ruolo dell’epigenetica in oncologia pediatrica e le future prospettive per l’applicazione di terapie mirate con “far-maci epigenetici”.

Lim PS, Li J, Halloway AF, Rao S. Epigenetic regulation of inducible gene expres-sion in the immune system. Immunology 2013;139:285-93.

* Questa review mostra i meccanismi di controllo della trascrizione, soprattutti nei linfociti T e le potenzialità dell’uso dei farmaci specifici per le malattie carat-terizzate dall’iper-attività del sistema immunitario.

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* Questo articolo introduce per la prima volta l’aspetto dell’eterogeneità della risposta all’Idrossiurea geneticamente determinata.

Phillips CL, Davies SM, McMasters R, et al. Low dose decitabine in very high risk relapsed or refractory acute myeloid leukemia in children and young adults. British Journal of Haematology 2013;161:406-10.

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* Prime indicazioni di utilizzo di farmaci “epigenetici” in un sottotipo di leucemia acuta che non risponde bene alle terapie convenzionali.

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** Questo studio ha permesso di estendere le indicazioni all’uso di HU anche al primo anno di vita e ha posto l’indicazione alla prevenzione della dattilite.

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Giovanna Russo, U.O.C. Emato-Oncologia Pediatrica, Azienda Policlinico-Vittorio Emanuele, Università di Catania, via Santa Sofia 78, 95123 Catania -Tel. +39 095 3782683 - Fax +39 095 3781154 - E-mail: [email protected]

Corrispondenza

246

Ottobre-Dicembre 2014 • Vol. 44 • N. 176 • Pp. 246-252 Focus

Introduzione

La clinica della fibrosi cistica

La fibrosi cistica (FC), la più comune malattia genetica della popola-zione caucasica a prognosi severa, è causata da mutazioni del gene CFTR che codifica per una proteina CFTR (Cystic Fibrosis Transmem-brane Regulator) (CFTR) (Kerem et al., 1989), composta da 1480 ami-noacidi che regola il flusso di ioni, quali cloro e bicarbonati, e fluidi a livello della membrana apicale delle cellule epiteliali. La sua incidenza, variabile a seconda delle aree geografiche, oscilla fra 1 su 2500 e 1 su 3500 nati vivi (Farrell, 2008); la frequenza del portatore è compresa tra 1:25 e 1:30. L’anomala funzione di canale della proteina espressa sulla membrana delle cellule secretive determina il fenotipo clinico nella sua forma classica con sintomi caratteristici a livello del polmone e del pancreas, dell’apparato gastrointestinale, del fegato e dell’appa-rato riproduttivo (O’Sullivan e Freedman, 2009). Una peculiarità della FC è l’eterogeneità clinica, con decorso molto variabile da soggetto a soggetto: alcuni infatti presentano ileo da meconio alla nascita, sintomi respiratori e prognosi severa, altri in-vece hanno scarse manifestazioni polmonari e decorso clinico be-nigno (Dequeker et al., 2009). Dal momento della scoperta del gene

CFTR sul braccio lungo del cromosoma 7 nel 1989 molti progressi sono stati registrati sul ruolo delle mutazioni del gene CFTR (ad oggi se ne conoscono circa 2000) che determinano alterazioni di strut-tura o di funzione della proteina CFTR, sebbene in misura diversa e con conseguenze cliniche variabili (Tab. I).

Mutazioni e correlazione genotipo-fenotipo

La mutazione più diffusa, la F508del, varia notevolmente nelle diver-se popolazioni: rappresenta il 50% circa delle mutazioni nell’Europa meridionale, e l’80-90% nelle popolazioni del Nord-Europa. Altre mutazioni presentano una frequenza compresa fra il 2 e il 5%, men-tre alcune sono caratteristiche di particolari gruppi etnici. Le mutazioni di cui si conosce l’effetto sulla proteina CFTR sono state suddivise in classi (classificate da I a V). Le mutazioni di classe I, II e III alterano la quantità e funzione della proteina, non consen-tendone affatto la produzione (classe I) o producendo una proteina molto difettosa (classe II e III). Le mutazioni di classe IV consentono la sintesi di una proteina difettosa, ma capace di svolgere, seppure in piccolissima misura, la sua funzione; quelle di classe V determi-nano la produzione di una certa quota, anche se piccola, di proteina normale (Tab. II). Nonostante sia stata dimostrata una correlazione

Nuove terapie per la fibrosi cistica

Valeria Raia,, Fabiola De Gregorio, Antonella Tosco, Luigi Maiuri* **

Dipartimento di Scienze Mediche Traslazionali, Centro Regionale Fibrosi Cistica, Università di Napoli Federico II; * Istituto Europeo per la Ricerca in Fibrosi Cistica, Istituto Scientifico San Raffaele, Milano; **Dipartimento di Scienze della Salute, Università del Piemonte Orientale, Novara

RiassuntoLa fibrosi cistica è una malattia genetica causata da mutazioni localizzate nel gene CFTR. Nuove strategie terapeutiche “mutazioni-specifiche” attualmente in corso sono rivolte a correggere il difetto di base della proteina CFTR codificata dal gene. Sfortunatamente nessuna di queste terapie sembra in grado al momento attuale di correggere la mutazione più frequente F508del. In questo articolo discutiamo come la manipolazione della proteostasi e il ripristino del meccanismo dell’autofagia, deficitario nella fibrosi cistica, rappresentino una opzione terapeutica alternativa per il recupero e la stabilizzazione della funzione della proteina F508del-CFTR in membrana. La correzione dell’ambiente intracellulare, mediante regolatori di proteostasi, può costituire una stra-tegia alternativa promettente per il trattamento di pazienti omozigoti per la mutazione F508del, con conseguente controllo dell’infiammazione polmonare.

SummaryCystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) gene. New strategies aiming at correcting the basic defect of CFTR protein are emerging as new mutation-specific treatment. Unfortunately no therapies are available for the most common CFTR mutant, the F508del. We focus on the manipulation of proteostasis and autophagy as a new CFTR-repairing option to rescue and stabilize functional F508del-CFTR in CF. Here we discuss how targeting the intracellular environment surrounding the misfolded mutant CFTR, instead of directly targeting mutant protein, could constitute an attractive therapeutic option to treat F508del-CFTR homozygous patients to control lung inflammation.

Tabella I. La clinica della fibrosi cistica.

Un gene CFTR sul cromosoma 7

Molte mutazioni Circa 2.000 varianti geniche con conseguenze cliniche variabili

Diversa espressione clinica Molti sintomi nella espressione classica di malattia, pochi sintomi nella espressione atipica di malattia

Terapie convenzionali Mucolitici, mucoregolatori, antibiotici per via sistemica e per aerosol, antiinfiammatori

Nuove terapie Correttori, potenziatori, modulatori di proteostasi


247

fra le mutazioni che incidono di più sulla sintesi e sulla funzione della proteina e i sintomi più gravi di malattia, in particolare con lo stato di compromissione pancreatica, altri fattori sia di tipo genetico (geni modulatori) che ambientale possono concorrere a determinare un fenotipo diverso anche con genotipi identici.

Stato dell’arte delle attuali terapie

Nonostante la sopravvivenza sia notevolmente migliorata, l’evo-luzione della malattia polmonare rappresenta ancora la principale causa di morbidità e mortalità in FC. Pertanto le terapie attuali, come l’antibioticoterapia per via sistemica e per aerosol, sono prevalen-temente orientate a prevenire, quando possibile, e a monitorare gli effetti secondari alle ripetute infezioni respiratorie acute che carat-terizzano i soggetti affetti da FC. Negli ultimi anni numerosi studi in vitro e in vivo hanno correlato il deficit funzionale della proteina CFTR alla disregolazione della rispo-sta infiammatoria. Tuttavia, le terapie antiinfiammatorie attualmente utilizzate in FC sono indirizzate alla correzione di eventi a valle del difetto di base della malattia (Belcher et al., 2010).Sebbene la terapia genica sia in teoria il gold standard per la cura dei pazienti con FC, i risultati ottenuti sono stati insoddisfacenti (Amaral et al., 2011). La terapia cellulare è ancora in fase di studio e non ci sono al momento risultati che consentano la trasferibilità al paziente.

Strategie per la correzione del difetto di base in FC

La conoscenza dei meccanismi attraverso cui le mutazioni identifi-cate nel gene CFTR conducono alla difettiva funzione della proteina mutata ha aperto la strada alla terapia di riparazione del difetto di base (CFTR repairing therapy), che introduce il nuovo concetto di terapie specifiche per le diverse classi di mutazioni. Questa tera-pia si basa sull’uso di piccole molecole capaci di i) incrementare la funzione della CFTR mutata (potenziatori) o ii) correggere il traffico intracellulare della proteina (correttori). Il primo approccio è mirato al recupero della funzione dei mutanti della CFTR capaci di raggiun-gere la membrana plasmatica delle cellule, ma incapaci di svolgere una normale funzione di canale ionico. Queste proteine mutate sono quindi bersaglio ideale per molecole disegnate per aumentare la probabilità di apertura del canale ionico della proteina che “risiede” in membrana. L’uso dei correttori è al contrario teoricamente indica-to per mutanti con difettivo ripiegamento della proteina (misfolding), che, a causa del loro difetto conformazionale, rimangono intrappolati nel reticolo endoplasmico (RE) nel corso dei processi di “folding” e sono degradati dal proteasoma. Un ampio e costoso programma di “drug discovery” attualmente in corso utilizza un approccio di “highthroughput screening”, che mira a selezionare, fra milioni di molecole, quelle candidate a divenire potenziatori o correttori del-la CFTR per il trasferimento alla terapia. Una di queste molecole, il potenziatore VX-770 (Ivacaftor, Kalideco, Vertex Co.) (Ramsey et al., 2011), ha superato tutte le fasi della sperimentazione clinica e

si è rivelato efficace in vivo nel migliorare il trasporto di cloro e la funzione polmonare in pazienti con una rara mutazione di classe III, la G551D, presente in meno del 5% dei pazienti con FC, che codifica per una proteina capace di raggiungere la superficie cellulare, ma che presenta un difetto della funzione di canale del cloro. Questa terapia è già disponibile sul mercato, seppure a costi molto elevati, in molti paesi europei e americani.

Misfolding e controlli di qualità

Come previsto, la sperimentazione del VX-770 in pazienti con la più comune mutazione della CFTR, la delezione di fenilalanina in posi-zione 508 (F508del), presente nel 70% circa dei pazienti FC (Far-rell, 2008) non ha dato alcun beneficio clinico. Questa mutazione di Classe II, infatti, codifica per una proteina che non riesce ad essere completamente ripiegata, è trattenuta nel RE, dove è prematura-mente degradata, non riuscendo a trafficare verso il Golgi per essere glicosilata e quindi trasportata sulla membrana cellulare, sede di at-tività del canale ionico CFTR. La F508del-CFTR conserva la funzione di canale ionico, sia pur incompleta per un parziale difetto di “ga-ting”, quando è trasportata in membrana mediante manipolazioni sperimentali, come l’incubazione a basse temperature, o attraverso l’uso di molecole “chaperons” in grado di accompagnare la protei-na attraverso il suo percorso difficoltoso all’interno della cellula. Fra queste molecole, il correttore VX-809 si è rivelato il più efficace nei sistemi in vitro. Tuttavia, i risultati di un trial clinico in pazienti omo-zigoti per la F508del-CFTR sono stati insoddisfacenti (Clancy et al., 2012), anche quando il VX-809 (Lumacaftor) è stato somministra-to in associazione al potenziatore VX-770 (Ivacaftor) (Boyle et al., 2014). La scarsa efficacia di questa combinazione terapeutica è mo-tivata da studi recenti (Okiyoneda et al., 2010) che dimostrano come, una volta trasportata in membrana dai correttori, la F508delCFTR è instabile, in quanto è rapidamente ubiquitinata ed avviata verso la degradazione lisosomiale. Questo secondo meccanismo di controllo di qualità non consente alla F508del-CFTR di risiedere in membrana tanto a lungo da essere disponibile per l’azione dei potenziatori. Inol-tre, due gruppi di ricerca hanno dimostrato che il potenziatore VX-770 compromette la stabilità della F508del-CFTR dopo il suo arrivo in membrana (Veit et al., 2014; Cholon et al., 2014). Queste eviden-ze, sperimentali e cliniche, suggeriscono che la principale necessità della “drug discovery” in FC è quella di identificare molecole capaci non solo di favorire il traffico della F508del-CFTR verso la superficie cellulare, ma anche di stabilizzarla in membrana per poter ipotizzare un beneficio clinico nei pazienti.

Nuovi scenari di terapia: correggere senza correttori e stabilizzare senza potenziatoriL’attuale strategia di identificazione di nuovi e più potenti corretto-ri mediante “highthroughput screening” (approccio “top-down”) è basata sulla ricerca di molecole che interagiscono con la proteina

Tabella II. La Classificazione delle mutazioni in fibrosi cistica.

Classe I Difetto di sintesi della proteina CFTR

Classe II Difetto di maturazione della proteina che non è in grado di raggiungere la membrana cellulare

Classe III Difetto di regolazione: la proteina raggiunge la membrana, ma non è in grado di rispondere ai segnali di attivazione del canale del cloro

Classe IV Normale sintesi della proteina CFTR, ma funzione ridotta

Classe V Ridotta sintesi della proteina CFTR, ma funzione normale

V. Raia et al.

248

CFTR mutata favorendone il traffico verso la membrana. Altre strate-gie mirano alla ricerca di piccole molecole che modulano le proteine “chaperons” che interagiscono con la CFTR (Roth et al., 2014). Re-centemente, un approccio radicalmente diverso è emerso nel pano-rama delle potenziali terapie di correzione del difetto di base in FC. Questa strategia differisce dalle terapie con correttori in quanto i) segue un percorso “bottom-up”, cioè parte dalla conoscenza delle alterazioni di vie di segnale intracellulare conseguenti alla difettiva funzione della CFTR; ii) ha come bersaglio diretto non la CFTR muta-ta, ma l’ambiente cellulare in cui questa è costretta a muoversi per raggiungere la membrana; interviene, cioè, correggendo le altera-zioni della “proteostasi” nelle cellule FC.

Alterazioni della proteostasi in FC: il difetto dell’autofagia

Questa strategia nasce dalla dimostrazione che il difetto funzionale di CFTR innesca una cascata di eventi che conducono a un blocco dell’autofagia (Luciani et al., 2010), un meccanismo di sopravvivenza che le cellule adottano in risposta a vari tipi di stress (Mariño et al., 2014). Il difetto di CFTR determina un incremento dei livelli di spe-cie reattive all’ossigeno (ROS), favorendo una persistente attivazione della transglutaminasi tissutale (TG2), una proteina multifunzionale e con variegata localizzazione intracellulare che, in presenza di elevate concentrazioni di ioni calcio, induce “cross-linking”, ubiquitinazione e sequestro in stazioni di deposito intracellulare (aggresomi) di varie proteine-substrato, come le molecole ad azione anti-infiammatoria PPARg e IK-Bα (Maiuri et al., 2008; Luciani et al., 2009), e soprattutto di beclin1, proteina cruciale nel processo di autofagia. Il “cross-lin-king” di beclin1 spiazza dal RE, sede di azione fisiologica, il complesso di proteine fondamentali per l’autofagia che interagiscono con beclin1 (Vps34, Vps15, AMBRA1, ATG14) e lo sequestra in aggresomi (Luciani et al., 2010) (Fig. 1A). Ciò porta a inibizione della formazione degli autofagosomi, vescicole a doppia membrana che servono a inglobare proteine danneggiate e anche organelli intracellulari, per poi fondersi con i lisosomi per la degradazione. Il blocco dell’autofagia induce ac-cumulo di p62/SQSTM1, una proteina legante ubiquitina che favorisce la formazione degli aggresomi (Luciani et al., 2010).La rilevanza patogenetica di questo meccanismo è evidenziata dal fat-to che, ripristinando i livelli di beclin1 sia mediante diretta iperespres-sione genica che con molecole che inibiscono l’attività della TG2, quali la cistamina o la sua forma ridotta cisteamina (Fig. 1B), non solo si ri-pristina la risposta autofagica, ma si ottiene un efficace controllo della infiammazione polmonare in vivo in un modello murino omozigote per la F508del-CFTR. Il ripristino della risposta autofagica favorisce anche il traffico della F508del-CFTR verso la membrana plasmatica, ristabi-lendo una sufficiente funzione della CFTR senza l’ausilio di correttori o potenziatori della CFTR (Luciani et al., 2010; Luciani et al., 2012). Queste evidenze dimostrano che è sufficiente correggere le alterazioni dell’ambiente intracellulare delle cellule epiteliali FC, conseguenti al deficit di funzione della CFTR, per ripristinare il corretto traffico e la funzione della proteina mutata. In questo nuovo scenario la CFTR si colloca come pivot del mantenimento dell’equilibrio omeostatico delle cellule epiteliali attraverso la regolazione dell’attività della TG2, che agisce quale principale regolatore del network post-traslazionale, e influenzando l’autofagia, orchestratrice della proteostasi e della rispo-sta integrata allo stress (Kroemer et al., 2010).

Nuove strategie a confronto per la terapia della FC

Il goal della terapia riparatrice del difetto di base della CFTR è non solo quello di garantire un corretto traffico della proteina mutata ver-so la superficie cellulare, ma anche e soprattutto quello di stabiliz-zare la proteina in membrana. La cisteamina, in qualità di regolatore

della proteostasi, ma non i noti correttori della CFTR, stabilizza la F508del-CFTR sulla membrana delle cellule epiteliali per oltre 24 h dopo la sua rimozione e riduce l’infiammazione polmonare in omogenati di polmone di topi omozigoti per F508del-CFTR anche dopo oltre una settimana di sospensione del trattamento. Le ragioni dell’aumentata stabilità della CFTR in membrana sono legate al ri-pristino della autofagia che i) riduce i livelli di p62 e il conseguente avvio della CFTR alla degradazione lisosomiale; ii) ripristina i livelli di fosfatidil-inositolo 3-fosfato, una molecola fondamentale per il traf-fico endosomiale e “recycling” delle proteine di membrana, fra cui la CFTR stessa e il recettore per la transferrina. Pertanto, la presenza della CFTR funzionante in membrana interrompe il circolo vizioso che porta all’autofagia e all’infiammazione, illustrato in Figura 1, e sostiene per un periodo dopo la sospensione la sua stessa perma-nenza in membrana (Luciani et al., 2012; Villella et al 2013).

La ricerca pre-clinica nel modello di medicina traslazionale

Il trasferimento dei risultati della ricerca a trial clinici su pazienti richiede un rigoroso percorso di validazione pre-clinica che segua le tappe della ricerca traslazionale. Le evidenze ottenute su sistemi in vitro e su linee cellulari devono essere validate in vivo in idonei mo-delli animali di malattia e poi testate su cellule primarie provenienti da pazienti affetti (Fig. 2).Il primo obiettivo è perseguibile in FC grazie alla disponibilità di dif-ferenti modelli animali murini di malattia. L’effetto della cisteamina è stato validato su topi omozigoti per la F508del-CFTR. Questi espe-rimenti hanno evidenziato che la somministrazione orale di cistea-mina i) ripristina la funzione della CFTR; ii) riduce la mortalità per occlusione intestinale nelle prime settimane di vita dal 50% al 9% circa; iii) riduce significativamente l’infiammazione polmonare nei topi adulti. Quest’ultimo effetto della cisteamina si estende per oltre due settimane dopo la sospensione del trattamento, confermando i dati ottenuti sulle cellule. Pertanto, l’identificazione di sostanze capaci di prolungare gli effetti benefici della cisteamina dopo sospensione della terapia potrebbe essere di grande utilità per i pazienti e limitare gli eventuali effetti collaterali del farmaco. Ulteriori studi in modelli cellulari, e conse-guente validazione in vivo in modelli animali, hanno dimostrato che l’associazione con un flavonoide contenuto nel tè verde, l’epigallo-catechin gallato (EGCG), prolunga in vitro e in vivo gli effetti della cisteamina dopo la sospensione. Infatti, fra i diversi effetti di questa sostanza “naturale”, utilizzata come integratore alimentare, c’è la capacità di inibire la protein chinasi 2(CK2), maggiore responsabile dei processi di frammentazione della CFTR che favorisce la sua in-stabilità. Sebbene l’EGCG non sia efficace come agente di recupero della F508del-CFTR da sola, è invece in grado di prolungare gli ef-fetti benefici della cisteamina sulle cellule e sui modelli animali (De Stefano et al., 2014). La coerenza di un percorso pre-clinico dovrebbe essere validata su cellule primarie prelevate direttamente dal paziente per valutare l’e-ventuale responsività al trattamento. Il prelievo di cellule epiteliali nasali mediante brushing rappresenta una procedura semplice e ben tollerata. Studi recenti dimostrano che l’epitelio nasale è una finestra appropriata sul polmone in quanto riproduce le caratteristi-che fenotipiche delle cellule bronchiali, principale sede di patologia in FC. L’incubazione delle cellule nasali con la combinazione di ciste-amina ed EGCG ha confermato i dati in vitro, consentendo, inoltre, di predire la responsività al trattamento nel singolo paziente (De Ste-fano et al., 2014). Questo approccio potrebbe configurarsi come un elemento utile nel contesto di una personalizzazione dell’approccio terapeutico.


249

Figura 1.A. Il difetto di CFTR induce un aumento di ROS con conseguente persistenza di elevati livelli di TG2. L’attivazione della TG2 induce cross-linking di beclin 1 e sequestro funzionale dell’interattoma di beclin 1 con conseguente blocco dell’autofagia, aumentati livelli di p62 e accumulo di proteine ubiquitinate in aggresomi. Questo processo sostiene un circolo vizioso che induce ulteriori incrementi di ROS e infiammazione. La F508del-CFTR, in parte degradata attraverso il proteasoma, accumula anche in aggresomi a causa del blocco di autofagia con sovraccarico del proteasoma e non può raggiungere il Golgi per essere glicosilata e trasportata in membrana.B. Il trattamento con cisteamina interrompe il circolo vizioso e favorisce una normale risposta autofagica. Conseguentemente, la F508del-CFTR traffica verso la membrana plasmatica ove permane per un periodo anche dopo sospensione del trattamento con cisteamina. L’aggiunta di epigal-licatechin gallato riduce la frammentazione della CFTR e prolunga gli effetti benefici della cisteamina dopo washout.

A

B

V. Raia et al.

250

Il trasferimento della ricerca pre-clinica al paziente

Recentemente uno studio clinico in aperto di Fase II (De Stefano et al., 2014) ha testato gli effetti della combinazione sequenziale di ci-steamina ed EGCG in 10 pazienti con FC omozigoti per la mutazione F508del-CFTR. Il trasferimento dalla ricerca pre-clinica alla clinica è agevolato se le sostanze da testare hanno già un noto profilo di tollerabilità. La cisteamina (nome commerciale Cystagon) è un far-maco approvato dalla Food and Drug Administration per la terapia di pazienti con cistinosi, una rara malattia da accumulo lisosomiale, e l’EGCG (nome commerciale Epinerve) è utilizzato come integratore alimentare. Lo studio clinico in oggetto ha dimostrato il raggiungi-mento degli obiettivi primari evidenziando un recupero della funzio-ne della CFTR sia a livello respiratorio, mediante analisi dell’efflusso di cloro in cellule prelevate a fresco da brushing nasale prima e dopo trattamento, sia attraverso la determinazione dei livelli di cloro nel sudore, test ancora utilizzato per la diagnosi di FC. Il trattamento ha determinato un aumento dell’efflusso ionico nell’epitelio nasale con valori pari a oltre il 20% dei controlli sani ed una riduzione del cloro nel sudore di oltre il 20% rispetto al valore basale con valori pari o al di sotto dei 60 mmol/L in 7 pazienti. È di rilievo che l’incremen-to di funzione a livello dell’epitelio nasale mostra una significativa correlazione inversa con la riduzione del cloro nel sudore. Inoltre il trattamento riduce drammaticamente i livelli di citochine pro-infiammatorie, sia a livello nasale che nell’espettorato dei pazienti.Questo modello a cascata di ricerca traslazionale ha permesso di trasferire al paziente una strategia terapeutica ragionata, validata dalla ricerca preclinica, per favorire il recupero della funzione della F508del-CFTR attraverso il ripristino dell’autofagia.

Prospettive futureI recenti progressi della ricerca nella terapia della FC indicano che correggere l’ambiente intracellulare attraverso regolatori di proteo-stasi, anziché accompagnare la CFTR mutata in membrana mediante correttori, rappresenta una strategia alternativa promettente, da con-fermare in studi clinici multicentrici controllati con placebo. Inoltre, indirizzare la ricerca verso l’identificazione di molecole/farmaci già in uso in altre patologie umane o sostanze presenti in natura, con profilo di sicurezza noto, costituisce un approccio sostenibile in termini di costi e di trasferibilità clinica, sia per il paziente che per il sistema sanitario, limitando i costi eccessivi dell’“highthroughput screening” (approccio “top-down”). L’approccio “bottom-up” alla ricerca di nuo-vi farmaci, cioè basato sulla conoscenza dei meccanismi di malattia, consente inoltre di individuare marcatori “patogenetici” di risposta precoce al trattamento e di poter anche implementare test di pre-dittività di efficacia sul singolo paziente, nell’ottica di un percorso di medicina personalizzata.

ConclusioniUn’alterazione della proteostasi per destabilizzazione di proteine, sia causata da mutazioni, come nella FC, che da condizioni di stress o da in-vecchiamento, è alla base di molte malattie conformazionali (da alterata conformazione di proteine) quali malattie neurodegenerative o diabete di tipo II. Il sistema proteostasico è probabilmente specifico per differenti tipi di cellule e tessuti (Balch et al., 2008) e questo spiega come molte malattie conformazionali, quali le malattie neurodegenerative, si mani-festino con caratteristiche di specificità di tessuto, sebbene le proteine coinvolte siano distribuite in maniera quasi ubiquitaria.

Figura 2.Rappresentazione schematica delle tappe della ricerca traslazionale (e ricerca traslazionale inversa) nel processo di drug discovery in fibrosi cistica.


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Bibliografia

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Cholon DM, Quinney NL, Fulcher ML, et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of ΔF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med 2014;6:246.

** Questo studio, insieme allo studio di Veit (*Ref. 21), fornisce il razionale e il proof-of-concept della inefficacia del trattamento combinato con il correttore VX-809 e il potenziatore VX-770 nei pazienti FC con mutazione F508del.

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De Stefano D, Villella VR, Esposito S, et al. Restoration of CFTR function in patients with cystic fibrosis carrying the F508del-CFTR mutation. Autophagy 2014, Oct 1.

** Lo studio fornisce la prima evidenza in letteratura di un recupero della funzio-ne della F508del-CFTR in vivo nei pazienti omozigoti per tale mutazione.

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** Prima evidenza in letteratura di un difetto di autofagia nelle cellule epiteliali respiratorie FC che coinvolge l’attivazione della transglutaminasi tissutale.

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Okiyoneda T, Barriere H, Bagdany M, et al. Peripheral protein quality control re-moves unfolded CFTR from the plasma membrane. Science 2010;329:805-10.

* Dimostrazione della instabilità in membrana della F508del-CFTR dopo rescue da parte di correttori. Un secondo meccanismo di controllo di qualità a livello della membrana.

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La FC rappresenta il prototipo di malattia conformazionale in cui la CFTR orchestra il network proteostasico della cellula epiteliale. La CFTR rappresenta un raro esempio di proteina che deve essere pienamente funzionante per evitare la sua stessa degradazione e di-smissione dalla membrana plasmatica (Villella et al., 2013), rivelan-do una stretta connessione fra funzione della proteina e regolazione della proteostasi. Il ripristino della funzione della CFTR interrompe il circolo vizioso che compromette la sua stessa stabilità e funzione e spiega come un trattamento che stabilizzi la CFTR in membrana possa avere un effetto prolungato sul fenotipo cellulare.L’autofagia è un processo essenziale per l’equilibrio della pro-teostasi (Kroemer et al., 2010). Ristabilire un’adeguata risposta autofagica consente di ripristinare il traffico intracellulare e la sta-

bilità della F508del-CFTR e di conseguenza ristabilire l’omeostasi cellulare. Questo approccio “bottom-up” di “drug discovery”, cioè disegna-to sui meccanismi patogenetici, indica che la identificazione delle proteine essenziali per l’omeostasi di un determinato ambiente cellulare nella sede principale di malattia, può offrire prospettive terapeutiche interessanti nelle malattie conformazionali. Modulare i meccanismi intracellulari che in ultima analisi connettono “mi-sfolding” e “malfunction” (invece di avere come bersaglio il difetto strutturale) di una proteina chiave per l’omeostasi di un ambiente cellulare rilevante per la malattia, come le cellule epiteliali per la FC, può rappresentare un approccio innovativo per molte malattie conformazionali.

Cosa sapevamo primaLa Fibrosi Cistica rappresenta la più comune malattia genetica a prognosi severa. L’identificazione del gene della Fibrosi Cistica (CFTR) localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7 ha aperto la strada verso una possibile terapia genica che è tuttavia fallita per la non disponibilità di vettori virali o sintetici adeguati. Pertanto, la terapia si basa prevalentemente sulla cura dei sintomi respiratori ed intestinali e sulle complicanze.

Cosa sappiamo adessoLa variabilità del genotipo della Fibrosi Cistica è correlata alla presenza di numerose mutazioni del gene CFTR suddivise in diverse classi che determi-nano la diversa sintesi, espressione e funzione della proteina CFTR. Questo ha permesso di identificare nuove terapie in grado di correggere il difetto della proteina mutata (cosiddetti correttori che non sono ancora efficaci nel paziente affetto da FC) o di potenziare la funzione della proteina mutata sulla membrana cellulare (cosiddetti potenziatori, risultati efficaci in soggetti con FC e mutazioni di gating di classe III). L’identificazione del difetto di autofagia nella FC rappresenta una possibile nuova strategia di intervento per le mutazioni più frequenti di classe II.

Quali ricadute sulla pratica clinicaIl ripristino del difetto di autofagia alterato nella FC, attraverso la combinazione di un farmaco, già in uso per altre indicazioni, e di un integratore alimen-tare è in grado di recuperare la funzione di una proteina chiave nella genesi della fibrosi cistica, riducendo l’infiammazione polmonare dei pazienti. Tale dimostrazione costituisce un’innovazione concettuale molto importante, in quanto dimostra che è possibile correggere il difetto di base con strategie di terapia diverse da quelle sino a oggi percorse.

Box di orientamento

V. Raia et al.

252

** Prima evidenza in letteratura dell’efficacia clinica di un potenziatore della CFTR in pazienti con una rara mutazione (G551D) di classe III.

Roth DM, Hutt DM, Tong J, et al. Modulation of the maladaptive stress response to manage diseases of protein folding. PLoS Biol 2014; 11 Nov 18.

Verkman AS, Galietta LJ. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov 2009;8:153-71.

Veit G, Avramescu RG, Perdomo D, et al. Some gating potentiators, includ-ing VX-770, diminish ΔF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med 2014;6:246ra97.

Villella VR, Esposito S, Bruscia EM, et al. Disease-relevant proteostasis regu-lation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Cell Death Diff 2013;20:1101-15.

Valeria Raia, Dipartimento di Scienze Mediche Traslazionali, Centro Regionale Fibrosi Cistica, Università di Napoli Federico II, via S. Pansini 5, 80131 Napoli - E-mail: [email protected]

Corrispondenza

Ottobre-Dicembre 2014 • Vol. 44 • N. 176 • Pp. 253-266 tavola rotonda

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ambiente e salute nel bambino

tavola rotonda

70° Congresso Italiano di Pediatria (Palermo, 14 giugno 2014)

A cura di Fabio Sereni, Franca Rusconi

Fabio Sereni Prof. Emerito di Pediatria, Università degli Studi di Milano

Franca Rusconi Unità di Epidemiologia, A.O.U. Anna Meyer, Firenze

SommarioPresentazione, Fabio Sereni Ambiente e malformazioni congenite, Pierpaolo MastroiacovoInquinamento atmosferico, Francesco ForastiereInquinamento e sviluppo cognitivo, Jordi SunyerInquinamento e tumori infantili, Corrado MagnaniSiti inquinati e salute infantile, Ivano IavaroneInquinamento e alterazioni del programming fetale, Ernesto BurgioInquinamento e interferenti endocrini, Sergio BernasconiConclusioni, Fabio Sereni, Franca Rusconi, Generoso Andria

Fabio Sereni: La Direzione di Prospettive ha accettato con entusiasmo il suggerimento del Prof. Giovanni Corsello, di organiz-zare una Tavola Rotonda al Congresso Nazionale della Società Italiana di Pediatria sul tema “Ambiente e Salute Infantile”, ed è grata a Franca Rusconi che, con la sua specifica competenza di epidemiologa e i suoi rapporti personali con molti dei ricercatori intervenuti ha reso possibile questa Tavola Rotonda. I possibili danni da inquinamento alla salute infantile sono un tema che la nostra rivista ha già parzialmente affrontato, allorché tre anni orsono invitò Umberto Simeone a scrivere un articolo per la rubrica Frontiere intitolato “L’origine precoce della salute e della malattia: la nuova sfida dei pediatri”. Compito che Simeone e i suoi collaboratori hanno assolto egregiamente, ma che era necessariamente limitato ad uno specifico limite temporale, e cioè al periodo feto-neonatale.Tornare sull’argomento, estendendolo a patologie e periodi di vita diversi, fornendo il punto di vista e il contributo originale di numerosi autorevoli ricercatori, è stato sicuramente molto opportuno. E nelle nostre scelte siamo stati confortati dai tanti pediatri che hanno gremito l’aula ove si è svolta la Tavola Rotonda.Il testo che Franca Rusconi ed io abbiamo preparato è una testimonianza fedele di quanto i vari autori hanno esposto, anche se necessariamente in forma riassuntiva. Ma il lettore, da questo testo, potrà anche trarre lo spunto per approfondire le sue nozioni in questo importante, nuovo capitolo di patologia pediatrica, approfittando del fatto che abbiamo invitato gli Autori a integrare quanto hanno detto con opportune, puntuali citazioni bibliografiche.In effetti quindi questa Tavola Rotonda, così come l’abbiamo tradotta per Prospettive può essere considerata un vero e proprio “mini dossier”.

Tavola Rotonda

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Ambiente e malformazioni congenite

Pierpaolo MastroiacovoDirettore dell’International Centre on Birth Defects and Prematurity

Fabio Sereni: La parola, per primo, a Pierpaolo Mastroiacovo, per lunghi, recenti anni direttore, impareggiabile, di Prospettive in Pe-diatria.Pierpaolo è stato chiamato a partecipare a questa Tavola Rotonda come autorità, riconosciuta internazionalmente, per quanto riguarda l’epidemiologia e il monitoraggio della incidenza e prevalenza delle malformazioni congenite. Non per nulla dirige, da molti anni, l’Inter-national Centre on Birth Defects and Prematurity da lui fondato, che studia queste problematiche e che è stato “Collaborating Center” dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS-WHO).Ma, prima di fare, se sarà possibile, il punto su quanto è stato fino ad oggi accertato, in tema di “ambiente e malformazioni congenite”, vorremmo che aprissi questa Tavola Rotonda rispondendo ad una domanda molto generale: la presa di coscienza che da inquinamento ambientale possono derivare gravi danni alla salute di intere po-polazioni risale a molti decenni orsono. Vi sono stati episodi storici gravissimi. Abbiamo imparato la lezione?

Pierpaolo Mastroiacovo: Dirò subito, che non abbiamo imparato la lezione.I sistemi di sorveglianza sugli effetti patogeni da inquinamento sono rimasti, per lo più, confinati alle malformazioni nel periodo neona-tale.Stiamo perdendo l’occasione di utilizzare indicatori semplici ma pre-ziosi, come il peso alla nascita, la prematurità, gli aborti spontanei per ricercare e documentare un eventuale rapporto tra inquinamen-to e danno al feto. Sarebbe forse opportuno ragionare in termini di esito aggregato della gravidanza, in termini cioè di “bambino non normale” per cause ambientali. Ma mi piace accogliere la proposta di Sereni, e iniziare questa relazione ricordando, brevemente, tre tragici episodi oramai storici, per poi cercare di riassumere quanto, da questi ed altri episodi, si è imparato e abbiamo accertato, in tema di effetti patogeni sul feto da inquinamento, con particolare riferi-mento, ma non solo, alle malformazioni.Nel 1955 una strana forma di paralisi cerebrale, accompagnata da insufficienza cognitiva e segni di compromissione cerebellare, fu scoperta nel villaggio di Minamata in Giappone. Tre anni dopo fu scoperto che la causa era l’inquinamento da metilmercurio del mare e dei pesci prodotto da un’industria che produceva acetaldeide. Questo evento ci ha insegnato che un prodotto chimico può causare disabilità nella prole, senza provocare né sintomi materni, né malfor-mazioni evidenti alla nascita (Herada, Crit Rev Toxicol 1955).Il secondo episodio avvenne sempre in Giappone nel 1968: l’uso di olio di riso contaminato da policlorobifenile (PCB) e dibenzofurano policlorurato (PCDD) avvelenò oltre 1500 donne che presentarono la malattia di Yusho, caratterizzata da disturbi mestruali, manifesta-zioni cutanee e oculari, e depressione immunologica. I loro figli, nati molti anni dopo, presentavano nel sangue livelli misurabili di que-ste sostanze che correlevano inversamente con il peso neonatale (Tsukimori et al., Environ Int. 2012). La lezione: l’esposizione a certe

sostanze chimiche, avvenuta diversi anni prima, produce effetti sulla prole che si manifestano con riduzione del peso neonatale; l’esito causato dalla sostanza chimica non è la malformazione ma il peso del neonato.Il terzo episodio ci ha riguardato direttamente: Nel 1976 si è verifica-to il noto incidente a Seveso con immissione nella zona circostante di TCDD, una pericolosa diossina che provocò tra l’altro 193 casi di cloracne. Non fu evidente un aumento di malformazioni (Mastroiaco-vo et al., JAMA 1988), ma i livelli misurabili di TCDD erano presenti dopo molti anni nelle persone colpite da cloracne e, osservazione più sorprendente, i maschi esposti prima dei 19 anni e con livelli misurabili di TCDD nel sangue avevano più spesso figli di sesso fem-minile (62%, contro l’atteso 49%, Mocarelli et al., Lancet 2000). La lezione: a livello di popolazione anche uno spostamento del rapporto tra sessi può essere una spia di problemi ambientali.Da questi disastri, e non solo, in questi ultimi 50 anni abbiamo impa-rato che: 1) le sostanze chimiche possono causare un’ampia gamma di problemi di salute nelle future generazioni, problemi di tipo mul-tifattoriale che comprendono, oltre alle malformazioni congenite, la prematurità, la restrizione della crescita prenatale, le disabilità (tra cui l’autismo) e certi tumori (es.: tumore di Wilms, tumori cerebrali, leucemie), tutte patologie che nel complesso causale multifattoria-le prevedono oltre alla componente genetica quella ambientale che interviene prima della nascita e talora prima del concepimento; 2) l’esposizione nociva può essere materna o paterna, 3) l’esposizione nociva può essere avvenuta molti anni prima dell’evento riprodut-tivo.

Fabio Sereni: Appare chiaro, da quanto ci hai finora detto, che una trattazione che si limiti ad un esclusiva valutazione della relazione tra esposizione materna durante la gravidanza ad un fattore ambientale e le malformazioni congenite sarebbe parziale e, anche fuorviante.

Pierpaolo Mastroiacovo: Certamente sì.Sia nella conduzione delle ricerche che nella loro analisi, la possibi-lità della non-specificità del danno causato ad un nuovo organismo umano non dovrebbe essere trascurata, anzi dovrebbe essere va-lorizzata e tenuta ben presente. In altre parole sono convinto che la ricerca sugli effetti dei fattori ambientali sullo sviluppo prenatale dovrebbe avere una visione d’insieme e considerare come esito pri-mario e prioritario il “nato non normale” con adeguato follow-up, senza distinzione se affetto da una patologia evidente nel periodo neonatale (es: malformazione o restrizione della crescita prenata-le) o nei primi anni di vita (es: tumore o disabilità cognitiva). Fatta questa premessa, per rimanere al compito assegnatomi in questa tavola rotonda focalizzerò la mia attenzione sulle malformazioni, con qualche accenno al peso neonatale e alla prematurità.L’analisi delle ricerche disponibili nella letteratura corrente sulla re-lazione causale “nell’uomo” tra fattori ambientali in senso stretto (sostanze chimiche presenti nei luoghi di lavoro o nell’ambiente in cui viviamo giornalmente) e malformazioni, è estremamente com-plessa e per certi versi contraddittoria. Si veda ad esempio una re-visione pubblicata nel 2010 (Mattison, Curr Opin Pediatr 2010). Esi-stono notevoli difficoltà metodologiche che impediscono di ottenere risultati robusti e spendibili sul piano teorico e pratico. Alcune sono comuni alla ricerca epidemiologica nell’ambito dei fattori ambientali tra cui la carenza di: (a) robusti indicatori di esposizione, (b) studi di valutazione delle esposizioni multiple che possono interagire in modo sinergico tra loro, (c) ampio range dei livelli di esposizione. Tali carenze saranno di certo ripetutamente sottolineate in altri in-terventi di questa tavola rotonda. Altre difficoltà sono peculiari della

Ambiente e salute nel bambino

255

ricerca epidemiologica sulle malformazioni congenite: (a) relativa rarità, soprattutto di fenotipi specifici; (b) incertezza sull’effetto: specifico per fenotipo o generalizzato a tutti i fenotipi malformati-vi; (c) carente definizione di “soggetto esposto”: oltre la madre in gravidanza andrebbe sempre considerato il padre, e la madre prima del concepimento. Tutte queste problematiche spiegano in parte le incertezze e le contraddizioni esistenti. Per il futuro è necessario che queste carenze siano evitate e vengano promossi soprattutto gli studi “caso-controllo annidati in coorti prospettiche” con prelievi di idoneo materiale biologico (es: siero, urine, capelli, unghie) alla prima e precoce visita ostetrica sia alla madre che al padre per il successivo dosaggio di biomarkers di esposizione.

Fabio Sereni: Comprendo, da quanto ci hai finora detto, tutte le riserve metodologiche che hai desiderato premettere a delle con-siderazioni conclusive sul tema malformazioni congenite e fattori inquinanti. È necessario, ed opportuno, non considerare solamente le malformazioni, ma deve essere estesa l’attenzione, più estesa-mente, al danno fetale (e infantile). Ma ti sei preparato molto diligentemente, a questa Tavola Rotonda.E hai preparato una tabella, molto aggiornata ed esaustiva, delle principali metanalisi e revisioni sistematiche pubblicate di recente sull’argomento (Tab. I).Ti pregherei di mostrarcela e commentarla.

Tabella I. Revisione di metanalisi o revisioni sistematiche che hanno analizzato il ruolo di sostanze chimiche ed esiti selezionati della gravidanza.

Esposizione Esito, solo se positivo Autore

Fumo di tabacco ambientale Natimortalità + 23% Malformazioni +13%

Leonardi-Bee et al., Pediatrics 2011

Fumo di tabacco ambientale 62 g in meno del PNMalformazioni + 18%

Salmasi et al., Acta Obst Gyn 2010

Fumo di tabacco ambientale 30 g in meno (1)Basso peso + 32%

Leonardi-Bee et al., Arch Dis Childh Fetal Neonatal Ed, 2008

Inquinamento ambientaleNO2 SO2

ToF + 20%, CoAo + 17%ToF + 3%, Co Ao + 7%

Vrijheid et al., Env Health Perspect 2011

Inquinamento ambientale COCONO2PM 2,5PM10PM10

17 gr in meno del PN per 1 ppmPrematurità + 4% per 1 ppm28 gr in meno del PN per 20 ppb Basso peso + 5% per 10mcg/m3 Basso peso + 10% per 20 mcg/m3Prematurità + 6% per 20 mcg/m3

Stieb et al., Environ Res 2012

Inquinamento ambientale SO2PM 2,5PM 10

PrematuritàBasso peso, prematurità, SGASGA

Shah et al., Environ Int 2011

Inquinamento casalingo (combustibili solidi)

Basso peso + 45% Misra et al., J Trop Pediatr 2012

Inquinamento casalingo (combustibili solidi)

Basso peso + 38%Natimortalità + 51%66 g in meno del PN

Pope et al., Epidem Rev 2010

Clorazione acqua Malformazioni + 34% (soltanto DTN + 49% e urinari +131%)

Hwang et al., Arch Environ Health 2003

Clorazione acqua Nessuna relazione con peso o prematurità Grellier et al., Epidemiology 2010

Clorazione acqua Malformazioni +17% (soltanto DIV + 59%)

Nieuwenhuijsen et al., Environ Health Perspect. 2009

PCB e DDE (misurati nel sangue cordonale)

150 g in meno di PN per ogni mcg/L di PCB-153 nel sangue cordonale7 g in meno di PN per ogni mcg/L di p,p’-DDE nel sangue cordonale

Govarts et al., Env Health Perspec 2012

Solventi, occupazione paterna Malformazioni + 47%, soprattutto DTN + 86% Logman et al., Am J Ind Med 2005

Solventi, occupazione materna Malformazioni + 64%, aborti spontanei + 25% McMartin et al., Am J Ind Med 1998

Pesticidi, occupazione materna Schisi orali + 37% Romitti et al., Cleft Palate Cran J 2007

Pesticidi, occupazione maternal o paterna Ipospadia + 36% - materna e +19% paterna Rochelau et al., J Pediatr Urol, 2009

Residenza vicino a discariche e inceneritori

Debole associazione con difetti del tubo neurale e cardiaci, maggiore per schisi orali e difetti del sistema urinario. Nessuna associazione con peso, nati morti e sex ratio,

Ashworh et al., Environ Int 2014

Erbicidi, agent orange Malformazioni + 95% (esposizione in Vietnam si + 200%, no + 29%) Ngo et al., Int J Epidem 2009

Erbicidi, agent orange DTN + 102% (esposizione in Vietnam si + 122%, no + 92%) Ngo et al., Int J Epidem 2006

Occupazione in ospedale, anestetici e chemioterapici

Risultati non conclusive per abortività spontanea e malformazioni Quansah & Jaakkola, J Wom Health, 2010

Studio multicentrico europeo che ha coordinato vari studi di coorte di alta qualità. CoAo: coartazioe aortica; DDE: diclorodifenilcdicloroetilene, metabolita del DDT; DTN: difetti del tubo neurale; SGA: small for gestational age; PCB:policlorobifenili; ToF: tetralogia di Fallot

Tavola Rotonda

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Pierpaolo Mastroiacovo: Allo scopo di ragionare prevalente-mente su dati robusti ho esaminato accuratamente tutte le me-tanalisi disponibili nel campo delle malformazioni congenite e di altre due condizioni congenite che potrebbero essere comprese nel continuum biologico del danno ambientale: prematurità e basso peso neonatale. Ho escluso le metanalisi (numerose) che valutavano come esito leucemia o tumori infantili, o altre pato-logie dell’infanzia.Il quadro che ne emerge è presentato nella tabella. In estrema sinte-si si possono proporre le seguenti riflessioni. Molte metanalisi sono datate, poco utili; per ogni metanalisi dovrebbe essere seguito il cri-terio suggerito dalla Collaborazione Cochrane; vanno aggiornate o indicate come non più valide.A volte le metanalisi sono troppo specifiche, gli autori dovrebbero almeno suggerire di indagare o metanalizzare anche altri esiti o altre tipologie di esposizione.Gli studi che hanno valutato marcatori biologici sono limitati, abbiamo una sola metanalisi (Govarts et al., Env Health Perspec 2012).In genere il rischio associato alle sostanze chimiche è di modeste dimensioni, ma è ovvio che i nostri sforzi debbano essere rivolti ad evitare l’evitabile e ancora più rilevante è la riflessione che dob-biamo tener presente non solo il rischio relativo (RR) ma anche la frequenza dell’esposizione, ovvero la frazione attribuibile nella po-polazione. Ad esempio consideriamo prematurità e inquinamento da PM10. Il rischio relativo per gli esposti è di 1,06 (6% di incre-mento), ma se consideriamo una popolazione di una città in cui il 100% delle gravidanze è esposto, per ogni 10.000 nati invece di 650 prematuri ne avremo 686, ovvero 36 in più dovuti all’inquina-mento da PM10.Il ruolo dell’esposizione paterna non va sottovalutato, si vedano i ri-schi associati a esposizione paterna lavorativa (ma quanto elevata? Irripetibile nella popolazione generale?) a pesticidi e solventi (Tab. I).L’effetto delle varie sostanze chimiche non è limitato alle malforma-zioni, lo abbiamo già sottolineato.Infine l’annoso problema: è utile valutare le malformazioni in gene-rale o è meglio specificare il più possibile i vari difetti?E non ultimo la trascurata attenzione alle anomalie minori.

Fabio Sereni: Bene. Complimenti. Sei stato veramente esaustivo.Ma non vorrei che tu concludessi senza aggiungere alcune con-siderazioni sull’ottavo e ultimo punto delle tue riflessioni alla ta-bella, quello riguardante la “trascurata attenzione alle anomalie minori”.

Pierpaolo Mastroiacovo: Credo proprio che le malformazioni mino-ri siano un marker di esito da non trascurare.Mi riferisco a quelle malformazioni che non alterano lo stato di salu-te di chi ne è portatore, che sono ben note ai genetisti clinici, come marker di anomalo sviluppo prenatale e come utili segni per indiriz-zare la diagnosi di sindromi genetiche. Ma la ricerca epidemiologica le ha trascurate del tutto per una serie di motivi che sarebbe troppo lungo esaminare in questa sede. Le recenti osservazioni sulla rela-zione tra interferenti endocrini e anomalie minori, quali la distanza anogenitale, l’idrocele (Small et al., Environ Health Perspect 2009) e la lunghezza del pene (El Kholy et al., J Pediatr Endocrinol Metab 2013) suggeriscono che non dovrebbero essere trascurate per la loro frequenza e per la loro patogenesi, che implica la possibilità di utilizzare campioni di studio di dimensioni molto più limitate di quelli necessari negli studi su malformazioni maggiori, e per il minimo co-sto del rilevamento.

Inquinamento atmosferico

Francesco ForastiereUnità di Epidemiologia eziologica e occupazionale, Dipartimento di Epidemiologia del Servizio Sanitario Regionale del Lazio, Roma

Fabio Sereni: Ti ringrazio, Pierpaolo. Devo proprio dire che abbiamo fatto bene a farti parlare per primo, perché, oltre che aver riassunto egregiamente lo stato attuale delle nostre nozioni in tema di inqui-namento e danni al feto (con un riferimento particolare alle malfor-mazioni) hai anche impostato egregiamente il tema generale della Tavola Rotonda, inquinamento e salute infantile.A Pierpaolo Mastroiacovo segue Francesco Forastiere, ricercatore del Dipartimento di Epidemiologia del Servizio sanitario regionale della Regione Lazio, noto per i suoi studi sull’inquinamento, in parti-colare, ed è la ragione per cui l’abbiamo invitato, sugli effetti anche in età pediatrica dell’inquinamento atmosferico.

Francesco Forastiere: Il mio compito è quello di inquadrare, a gran-di linee, lo stato attuale delle conoscenze su “inquinamento e salute infantile”. Ma, innanzitutto, desidero ringraziare Franca per avere ricordato la nostra antica collaborazione per quanto stiamo oggi stu-diando insieme in tema di inquinamento e patologia respiratoria.Stiamo ora seguendo prospetticamente dalla nascita una coorte di 3.000 bambini (coorte Piccolipiù, www.piccolipiu.it), i più grandi dei quali ora hanno tre anni, coorte che continueremo a monitorare, per quanto riguarda la salute, fino a 6 anni. La nostra collaborazione con i pediatri è stata quindi continua, in tanti anni. E questo è motivo di soddisfazione.Nella prima parte della mia relazione vorrei illustrare alcune nozioni fondamentali sulle particelle inquinanti e sulle nuove tecnologie per monitorare la loro presenza. Nella seconda parte della mia relazione riassumerò quanto oggi è noto in tema di inquinamento e patologie respiratorie infantili. Ovviamente gli inquinanti ambientali sono molto numerosi (ossidi di azoto, anidride solforosa, ossido di carbonio, ecc.), ma le particelle sospese hanno un’importanza particolare perché a esse sono stati associati gli effetti sanitari più rilevanti. Differiscono notevolmente in dimensioni. Le dimensioni del particolato dipendono dalle fonti da cui originano (Fig. 1).Ma devo ricordare che a parte le differenze di dimensioni (e di origi-ne), la differenza forse più importante è data dalle componenti delle particelle. L’interesse scientifico attuale è comprendere quali sono, oltre alla dimensione, le componenti del particolato che hanno signi-ficato tossicologico.Deve essere subito sottolineato che in Italia vi è un’alta variabilità geografica dei livelli di concentrazione dell’inquinamento da polveri sospese, come è bene evidenziato dalla Figura 2. Limitandoci alla concentrazione di PM2.5 e cioè alle particelle patologicamente più significative, le aree particolarmente critiche sono la pianura pada-na, le grandi città e le zone industriali.ESCAPE è uno studio europeo che ha monitorato con metodi uni-formi l’inquinamento in diverse città europee studiandone gli effetti a lungo termine sulla morbosità e sulla mortalità per tutte le cause, pubblicato sul Lancet lo scorso anno (Pedersen et al., Lancet 2013; Beelen et al., Lancet 2014).


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Questo studio ha documentato, con metodi di accertamento unifor-mi, l’inquinamento da PM2.5 in numerose città europee. Particolar-mente preoccupanti sono i dati rilevati a Torino (Fig. 3) (Eeftens et al., Atmosf Env 2012).

Franca Rusconi: Sei stato molto esauriente. Non siamo sicuramen-te messi bene, sia in temi assoluti che relativi alle altre nazioni eu-ropee, in tema di inquinamento atmosferico.Ma avevi promesso di accennare anche alle nuove metodologie di monitoraggio. Cosa puoi dirci a questo proposito?

Francesco Forastiere: Finora si è lavorato con dati raccolti dalle centraline, posizionate in località diverse, e con una affidabilità re-lativa.Da alcuni anni (dal 2003) ci possiamo fortunatamente giovare di una tecnologia più avanzata e avvalerci, quindi, di dati di inquinamento più affidabili e continui. Un satellite NASA, ogni giorno, tra le 10 e le 11 del mattino, fornisce dati di densità ottica dell’aerosol corrispon-denti all’inquinamento atmosferico da particelle. Sono dati di grande dettaglio, avendo una granularità di un solo chilometro.La Figura 4 (che mostro come esemplificativa) riporta le immagini satellitari nell’atmosfera dell’Italia settentrionale e centrale, durante una settimana lavorativa e un week end dell’agosto 2004. Sono evi-denti le differenze. Stiamo lavorando in collaborazione con l’Harvard University di Boston per trarre significative informazioni da questi dati.

Figura 1. Dimensioni e origine delle particelle sospese (particolato).

Figura 2. Rappresentazione modellistica della concentrazione media annuale di PM2.5 in Italia, griglia 4*4 Km. Modello MINNI (Modello Integrato Nazio-nale) (da Zanini et al. 2011).

Figura 3. Concentrazioni di PM 2.5 in città Europee (studio ESCAPE) e limiti fissati da Environmental Protection Agency e dall’Unione Europea (mod. da Eeftens M et al., Atmosf Env 2012).

Figura 4. Immagini satellitari della densità ottica dell’atmosfera nell’Italia set-tentrionale e centrale durante una settimana lavorativa e un weekend dell’agosto 2004. La risoluzione è di 1 Km.

Tavola Rotonda

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Franca Rusconi: Bene, ci hai molto chiaramente illustrato lo stato attuale delle metodologie di accertamento dell’inquinamento atmo-sferico.Ma una volta acquisiti i dati, quali indicazioni sanitarie possiamo trarne?

Francesco Forastiere: A fronte dei livelli attuali, accertati, di in-quinamento, e sulla base di quanto sappiamo sulla tossicità delle particelle sospese, vi è una chiara incongruenza tra quanto racco-mandato dall’OMS per ridurre in modo significativo gli effetti negati-vi dell’inquinamento atmosferico e quanto ammesso dalla Comunità Europea (e, conseguentemente, dalle singole legislazioni nazionali) (Tab. I).Come si può notare la Comunità Europea ammette come possibi-li concentrazioni di inquinanti significativamente superiori a quelli suggeriti dall’OMS. Si sperava che nel 2013 l’Unione Europea avreb-be rivisto questi limiti di concentrazione, ma ciò non è avvenuto. È particolarmente grave il valore significativamente più alto di PM2.5 (25 µg/m3 per l’Unione Europea rispetto a 10 µg/m3 per l’OMS). Il risultato pratico di ciò è paradossale: il medico consiglia al cittadino di non fumare, quando la regolamentazione europea gli concede 10 sigarette al giorno!

Franca Rusconi: Molte grazie, ma ti abbiamo qui chiamato anche per fare il punto su “inquinamento e patologia respiratoria nell’infan-zia”. Cosa ci dici a proposito?

Francesco Forastiere: Sono perfettamente d’accordo con Pierpaolo Mastroiacovo. Non è utile citare singoli lavori, ma è molto più signifi-cativo una valutazione critica della letteratura recente.A questo proposito ho preparato una tabella (Tab. II) da cui si può desumere che non vi è dubbio che vi siano effetti dannosi a breve

termine, relativi sia a frequenza di infezioni respiratorie, all’aggra-vamento dell’asma bronchiale e alla funzionalità respiratoria. A lun-go termine, solo per la funzionalità respiratoria non vi sono dubbi, mentre l’evidenza per l’asma è limitata e l’associazione causale con infezioni respiratorie solo possibile.Mi piace chiudere questo mio intervento citando i risultati di una ricerca italiana pubblicati nel 2014 (Ranzi et al., Occup Environm Med 2014). Si è trattato di uno studio prospettico, longitudinale con controlli a 6 mesi, 15 mesi, 4 anni e 7 anni di un numero limitato di bambini. Si è valutata la prevalenza e la incidenza dell’asma, del-lo wheezing, della dispnea e della tosse. Abbiamo constatato una chiara tendenza a un aumento di questi parametri, ma i risultati, tranne che in un singolo caso, sono statisticamente non significativi. Occorrono senza dubbio studi più estesi.

Inquinamento e sviluppo cognitivo

Jordi SunyerCentre for Research in Environmental Epidemiology (CREAL), Barcelona

Franca Rusconi: I due primi ottimi interventi, di Pierpaolo Mastro-iacovo e di Francesco Forastiere, oltre a puntualizzare le attuali conoscenze sulla rilevanza dell’inquinamento atmosferico nella pa-togenesi di importanti patologie infantili, hanno anche molto bene chiarito gli attuali limiti metodologici, e informato sulle moderne tecnologie che permetteranno, in un futuro prossimo, conoscenze

Tabella I. Raccomandazioni dell’OMS (Air Quality Guidelines 2005) e standard stabiliti dalla Comunità Europea.

Inquinante Tempo medio AQG, OMS Standard CE

ParticolatoPM2.5

PM10

1 anno24 ore (99° percentile)

1 anno24 ore (99° percentile)

10 µg/m3 25 µg/m3 20 µg/m3

50 µg/m3

25 µg/m3 --

40 µg/m3 50 µg/m3***

Ozono, O3 8 ore, massimo giornaliero 100 µg/m3 120 µg/m3***

Biossido azoto, NO2 1 anno1 ora

40 µg/m3 200 µg/m3

40 µg/m3

200 µg/m3***

Diossido zolfo, SO2 24 ore10 minuti

20 µg/m3 500 µg/m3

125 µg/m3***350 µg/m3*** (1 ora)

Tabella II. Evidenze scientifiche del nesso causale a breve e a lungo termine tra inquinamento atmosferico e malattie respiratorie e funzione polmonare in età pediatrica (OMS 2005).

Problematica Evidenze di un nesso a breve termine Evidenze di un nesso a lungo termine

Infezioni respiratorie Sufficienti+++

Suggestive++

Asma Sufficienti+++

Limitate+

Funzione polmonare Sufficienti+++

Sufficienti+++


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sempre più approfondite. Sono state quindi, queste relazioni, anche un’opportuna premessa culturale e conoscitiva alle relazioni che se-guiranno.Il prossimo intervento è di Jordi Sunyer, uno dei Direttori scientifi-ci del CREAL (Centre de Recerca en Epidemiologia Ambiental), ben noto centro di ricerche epidemiologiche relative all’ambiente di Bar-cellona.Ho conosciuto Jordi Sunyer molti anni orsono, allorché si occupava soprattutto di ambiente e patologia respiratoria, ma ben ricordo che fin da allora esprimeva l’intenzione di iniziare ricerche su patologie diverse e per molti aspetti più rilevanti, come quelle relative allo sviluppo neurocognitivo. Questo è accaduto, e con grande successo. Anche per questo sono molto lieta di dargli la parola.

Jordi Sunyer: Ringrazio per l’invito. Ho rapporti molto stretti con l’epidemiologia Italiana, e con l’Istituto Superiore di Sanità, e anche per questo sono lieto di essere qui, questa mattina.Vorrei iniziare con alcune informazioni “fondamentali”. Francesco Forastiere vi ha già schematicamente spiegato quali sono i molti inquinanti dell’atmosfera, la diversa dimensione del “particolato”, le sostanze chimiche che sono state accertate essere particolarmente tossiche, e per le quali la barriera ematoencefalica non è protettiva. Su questi punti, quindi, non mi soffermerò. Iniziamo solo ora ad avere sicure evidenze sulle diverse modalità pa-togenetiche del danno da inquinamento al sistema nervoso centrale, derivanti per lo più da ricerche sull’animale da esperimento. Io credo si possa ragionevolmente sostenere che il possibile danno si realizzi attraverso una attivazione della microglia, con neuroinfiammazione, stress ossidativo e aggregazione proteica. Il maggior colpevole a li-vello di inquinamento atmosferico è il particolato ultrasottile (PM0.1, < 0,1 mm) che si deposita negli alveoli e può dare inizio ad una cascata infiammatoria, alterando il livello delle citochine circolanti (TNF-α e IL-1) che possono agire su un potente mediatore dell’in-fiammazione (CPX-2) nell’endotelio cerebrale; alternativamente le particelle possono essere trasportate direttamente al cervello attra-verso le vie olfattive e attivare qui i meccanismi infiammatori. Non posso a questo punto, non citare il fantastico lavoro di una ricer-catrice messicana che ha documentato non solo su animali (cani), ma anche su materiale autoptico di bambini, l’accumulo abnorme di amiloide nell’encefalo assieme a note di infiammazione periva-scolare, da attribuire direttamente all’inquinamento atmosferico (Calderón-Garcidueñas et al., BioMed Research International 2013). Le due tabelle di questa prima parte della mia relazione riassumono quelle che a mio parere sono le principali basi cognitive del danno celebrale da inquinamento.Nella prima sono elencate una serie di meccanismi attraverso i qua-li il particolato atmosferico può indurre danno celebrale in modelli animali (Tab. I), la seconda elenca 10 sostanze sicuramente neu-rotossiche riscontrabili in atmosfere inquinate (Tab. II), così come risultano da due pubblicazioni su Lancet (Grandjean & Landrigan, Lancet 2006; Grandjean & Landrigan, Lancet Neurology 2012).

Franca Rusconi: Grazie Jordi, hai finora ottimamente inquadrato la patogenesi del danno celebrale da inquinamento, citando una serie di lavori recenti a questo riguardo. Immagino che la seconda parte della tua relazione sarà dedicata alle evidenze cliniche. Siamo ansiosi di conoscerle. Ce le puoi rias-sumere?

Jordi Sunyer: Lo farò, con piacere, descrivendo per sommi capi due nostre ricerche che considero molto indicative.

La prima è una ricerca prospettica in 5 diverse località spagnole su 2.644 gravidanze i cui bambini sono stati seguiti fino a 24 mesi, con dati sull’esposizione a inquinamento atmosferico a partire dal-la gravidanza e sviluppo neuropsicologico, riguardante circa 2.000 bambini.I dati raccolti ci permettono di affermare che se la madre gravida vive in un ambiente inquinato lo sviluppo neurologico del bambino è ritardato.In particolare abbiamo riscontrato un associazione tra le esposizioni delle madri gravide a idrocarburi (benzene) e alterato sviluppo neu-ropsicologico del prodotto del concepimento, con anche un proba-bile rilievo della dieta che la madre assume sulla entità del ritardo dello sviluppo neuropsicologico. Infatti si è osservato un maggior danno da inquinamento per una scarsa assunzione nella dieta ma-terna di cibi con attività antiossidante (frutta, vegetali).Questi dati sono stati confermati da altri studi, in Cina, ma anche negli Usa. Francesco Forastiere vi ha già citato lo studio ESCAPE. Noi abbiamo usato lo stesso protocollo, aggiungendo al progetto iniziale altre lo-calità spagnole, con l’intento di documentare un eventuale effetto dannoso da inquinamento atmosferico anche sullo sviluppo neuro-motorio, a partire dalla gravidanza. I risultati che abbiamo ottenuto non sono stati significativi per lo sviluppo cognitivo, probabilmente per metodologie di accertamento non uniformi, anche se abbiamo osservato un trend per un effetto negativo. L’esposizione a NO2 (traffico veicolare) era associata con un ritardo dello sviluppo psico-motorio (Guxens, Epidemiology 2014). Vorrei concludere questa relazione riassumendo brevemente i risul-tati di una nostra recente ricerca sulle scuole di Barcellona (Rivas, I Environm Int 2014), intesa ad accertare se l’inquinamento atmo-sferico possa provocare un effetto negativo sull’attività cognitiva

Tabella I. Meccanismi attraverso cui il particolato atmosferico può indurre dan-no cerebrale in modelli animali.• Traslocazione diretta (Elder 2006, Yokota 2011)• Integrità della barriera (Pöss 2013, Oppenheim 2013, Heiday 2014)• Attivazione della microglia (Levesque 2011, Pöss 2013, Oppenheim 2013,

Heiday 2014)• Infiammazione cerebrale (Campbell 2005, 2009, Kleinman 2008, van Berlo

2010, Gerlofs-Nijland 2010, Levesque 2011, Fonken 2011)• Neurotossicità dopaminergica (Curtis 2010, Levesque 2013)• Disfunzione glutaminergica neuronale (Morgan 2011, Davis2013, Cory-

Slechta 2014)• Alterazioni della memoria (Zanchi 2010, Forben 2011, Yokota 2011)

Tabella II. Sostanze per cui è documentato un danno neurotossico.• Piombo• Metilmercurio• Policlorobifenili• Arsenico• Toluene• Manganese• Fluoruro• Tetracloroetilene• Clorpirifos • DDT-DDE• Polibromodifenileteri (PBDE)

Tavola Rotonda

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(attenzione, memoria) e anche indurre problemi comportamentali, degli scolari. Abbiamo anche studiato alcuni aspetti della funzionali-tà celebrale con la risonanza magnetica funzionale.La ricerca è stata effettuata in 39 scuole, per un totale di 2.878 sco-lari, ognuno dei quali è stato esaminato clinicamente 4 volte. Sono state eseguite 298 risonanze magnetiche.Nei bambini che frequentavano scuole con elevati livelli elevati di inquinamento (interno ed esterno) abbiamo riscontrato dati signi-ficativamente peggiori di “working memory” e di “executive atten-tion”. È stata anche riscontrata una maggiore incidenza di problemi comportamentali. Le particelle originate dal traffico (ma non quelle minerali) si sono dimostrate responsabili degli effetti dannosi.

Inquinamento e tumori infantiliCorrado MagnaniDipartimento di Medicina Traslazionale Università del Piemonte Orientale, Novara; AIRTUM

Franca Rusconi: Ho ora il piacere di presentare Corrado Magnani che ci parlerà delle conoscenze attuali in tema di esposizioni am-bientali e tumori infantili. Corrado Magnani che insegna all’Universi-tà del Piemonte Orientale è autore nel Rapporto AIRTUM-AIEOP 2012 sui Tumori infantili (Epidemiologia e Prevenzione 2013) di un capi-tolo su “Le cause e i fattori di rischio delle neoplasie pediatriche”.

Corrado Magnani: Due brevissime premesse. Una trattazione, seppure sintetica, sull’associazione tra ambiente e tumore infantile deve essere impostata con una accezione molto ampia. Non solo tumore e inquinamento ambientale, ma tutto ciò che, dall’ambiente esterno, può esercitare azione dannosa, come il fumo passivo, ra-diazioni e altro. Il secondo punto è relativo al problema, molto delica-to, degli strumenti usati per la valutazione e l’analisi epidemiologica. Innanzitutto sono necessari studi di coorti di dimensioni adeguate oppure studi caso controllo di grandi dimensioni, per avere numeri sufficienti. I registri dei tumori forniscono informazioni preziose sulla frequenza delle malattie, ma di solito non includono informazioni sui fattori confondenti la relazione tra esposizione e sviluppo di tumore.Vorrei innanzitutto fornire alcuni dati “preliminari”. Ogni anno l’inci-denza dei tumori infantili (età 0-14 anni) nei Paesi europei varia da 130 a 150 casi per milione. L’Italia è, con la Finlandia, uno dei paesi in cui l’incidenza è maggiore. In alcuni paesi, tra cui gli USA, si è registrato negli ultimi anni un aumento della incidenza, pari a circa l’1% all’anno. In Italia è stato osservato un trend di aumento della frequenza di tu-mori infantili negli anni 1988-2002 (Rapporto I Tumori in Italia 2008) ma non si è più osservato nel periodo successivo con dati fino al 2008, quando invece si è osservato un trend di riduzione dell’in-cidenza (I Tumori in Italia. I tumori dei bambini e degli adolescenti Rapporto AIRTUM 2012) (http://www.registri-tumori.it/cms/it/pub-blicazioniAIRTUM. http://www.registri-tumori.it/PDF/AIRTUM2012/EP37_1_s1_175_1-6.pdf). L’interpretazione dei trend in generale e soprattutto di discordanze tra periodi successivi è complessa e incerta, tanto più che si tratta di statistiche basate su numeri relati-vamente piccoli, pertanto con elevata variabilità casuale.Per venire al tema di questo Convegno, da un lato dobbiamo ricor-dare che le evidenze certe sui fattori di rischio per i tumori infantili

sono limitate e pochi agenti, in particolare radiazioni ionizzanti e uso di dietilstilbestrolo durante la gravidanza. Peraltro molte esposizioni, anche a fattori presenti nell’ambiente, sono state studiate in rela-zione alla possibile associazione con tumori infantili. Vorrei a questo proposito citare alcuni esempi.La relazione tra la variazione del rischio di leucemia infantile in rela-zione all’interazione con agenti infettivi. Si tratta di ipotesi di ricerca stimolate dallo studio dei clusters di leucemia infantile, in particolare a partire dal cluster di Sellafield. Due sono le principali linee di ricer-ca: la prima sostenuta da Kinlen ipotizza che la leucemia infantile sia associata ad agenti infettivi e che il rischio aumenti in ‘popolazioni isolate’ e quindi con bassa immunità di gruppo quando vengono in contatto con l’agente infettivo. L’ipotesi di Kinlen ha avuto supporto dall’osservazione epidemiologica ma non è stato ancora identifica-to l’agente eziologico. L’ipotesi di Greaves sostiene che lo sviluppo della leucemia infantile avvenga in seguito a eventi, di cui il primo è una mutazione genetica che avviene nel periodo prenatale ed il secondo è la promozione dello sviluppo del clone cellulare mutato, in seguito a una risposta anomala del sistema immunitario a stimoli da infezioni non specifiche. A sostegno dell’ipotesi di Greaves sono in particolare l’osservazione di cloni cellulari mutati in prelievi ematici di neonati e l’evidenza epidemiologica di un aumento del rischio di leucemia tra i bambini cha hanno avuto esposizione tardiva a stimoli infettivi.L’esposizione ambientale a radiazioni ionizzanti. Tralasciando gli ef-fetti delle esplosioni atomiche di Hiroshima e Nagasaki, l’esempio più eclatante negli anni recenti è costituito dall’epidemia di tumori tiroidei in Bielorussia, conseguente all’incidente nucleare di Cherno-bil. In Italia non vi è un problema da esposizione ambientale a iodio 131, ma vi è aperto il problema dei possibili effetti dannosi delle radiazioni gamma e del radon di origine ambientale, per cui sono opportuni approfondimenti.Infine, negli ultimi anni si sono accumulati dati significativi sull’im-portanza nella carcinogenesi dell’esposizione al fumo di tabacco, a solventi e a pesticidi. Il fumo di tabacco è un noto cancerogeno e nelle categorie dei solventi e dei pesticidi sono incluse sostanze con noti o sospetti effetti cancerogeni.Inoltre, quando si discute di incidenza di tumori infantili e della loro causa, non ci si deve limitare a considerare esclusivamente la vita extrauterina, ma si deve anche considerare la possibilità di un danno esercitato nel corso della vita endouterina e anche ancor prima del concepimento.È opportuno quindi dedicare alcuni minuti di questa esposizione ai fattori prenatali come cause di tumori infantili.A questo proposito vorrei citare la ricerca di Miligi et al. (Occup En-viron Med 2013) che hanno analizzato i dati dello studio SETIL che hanno riportato un aumento statisticamente significativo del rischio di leucemia in bambini nati da madri esposte, durante la gravidanza a solventi, aromatici e alifatici. Sono studi molto difficili da compiere, occorrono protocolli ad hoc, personale esperto, anamnesi molto det-tagliate. Perché la ricerca sia valida occorre che l’anamnesi includa dati sulla specificità dei solventi usati, sui tempi e sulle modalità di lavoro. Si tratta di esposizioni relativamente frequenti, ad esempio nello studio SETIL risultano essere stati esposti a solventi l’8% delle madri e il 18% dei padri dei soggetti di controllo (popolazione ge-nerale).Un’altra possibile causa ambientale di aumentato rischio di tumori infantili, è costituita dall’esposizione, in particolare nel periodo pre-natale, a pesticidi. Vorrei citare un lavoro di metanalisi (Vinson et al., Occup Environm Med 2011) che ha documentato in studi caso-controllo un aumento del rischio di leucemia e linfoma in bambini


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le cui madri erano state esposte prima della nascita e un aumento di tumori cerebrali per esposizione prenatale paterna. È un campo ancora molto aperto. Ricerche future dovranno chiarire quali pesti-cidi sono coinvolti in particolare. Oggi questi studi si avvalgono delle competenze di igiene industriale. Un igienista industriale esperto è in grado di stimare la presenza, nei luoghi di lavoro, degli agenti chimici, ad esempio solventi, in uso per le lavorazioni. Per il futuro occorrerà raggiungere la stessa competenza per i pesticidi usati in agricoltura, rapportati alle tipologie delle coltivazioni, alle modalità e al luogo di lavorazione, ai tempi di esposizione, ecc.Per concludere, i dati che attualmente abbiamo concernenti il gran-de tema relativo ad ambiente e tumori infantili sono molto scarsi. Ma le ricerche in corso sono promettenti. Mi piace concludere citando la ricerca internazionale, attuale, su questo tema condotta dal Con-sorzio Internazionale per le Leucemie Infantili, iniziata sotto la guida della Professoressa Pat Buffler, purtroppo mancata l’anno scorso (Metayer et al., 2013).

Siti inquinati e salute infantileIvano IavaroneDipartimento Ambiente e Prevenzione Primaria, Istituto Superiore di Sanità (Roma) e WHO Collaborating Centre for Environmental Health in Contaminated Sites

Franca Rusconi: Abbiamo la fortuna di avere qui con noi, oggi, Ivano Iavarone. Per chi non fosse a conoscenza, il dottor Iavarone lavora all’Istituto Superiore di Sanità (ISS), ed è responsabile di una serie di iniziative tese a monitorare la salute, anche infantile, in una numerosa serie di siti, caratterizzati, in Italia, da elevato inquina-mento ambientale.A Ivano Iavarone chiedo innanzitutto: dopo aver inteso quanto è stato accertato sugli effetti dannosi alla salute infantile dell’inquinamento, ci puoi assicurare che questo grosso problema di salute pubblica è preso in adeguata considerazione dalle autorità sanitarie?

Ivano Iavarone: Credo proprio di poter rispondere affermativamente.La protezione della salute infantile dall’inquinamento ambientale è una priorità di sanità pubblica. Il piano Globale di Azione sul tema Ambiente e Salute nell’infanzia dell’Organizzazione Mondiale della Sanità per il 2010-2015 (http://www.who.int/ceh/en/) evidenzia che l’urbanizzazione incontrollata, le nuove tecnologie, l’industrializzazione nei paesi in via di sviluppo, il degrado degli ecosistemi e gli impatti del cambiamento climatico rap-presentano condizioni emergenti di rischio per la salute infantile (http://who.int/ceh/en/). Le conclusioni della Quinta Conferenza Ministeriale Ambiente e Salute indicano la necessità di garantire pari opportunità a ciascun bambino di poter disporre entro il 2020 di acqua sicura, dieta sana, migliore qualità dell’aria e un ambiente privo di sostanze chimiche tossiche (www.euro.int/parma2010). Coerentemente con queste indica-zioni il Piano Sanitario Nazionale 2011-13 sottolinea che la salute delle fasce più vulnerabili della popolazione deve costituire un obiettivo privi-legiato su cui fondare le misure di prevenzione e di gestione dei rischi in tutti gli ambiti considerati (http://www.salute.gov.it/).Che all’interno della doverosa attenzione della salute nei siti inqui-nati ci debba essere particolare attenzione per l’infanzia, è, a mio parere, fuori discussione.Rispetto agli adulti, i bambini sperimentano livelli più elevati di esposizione agli inquinanti ambientali e presentano una maggiore

vulnerabilità agli effetti di tali esposizioni a causa di caratteristiche comportamentali, fisiologiche e correlate all’immaturità di organi e apparati specifica dell’età infantile. Inoltre, i bambini non sono in grado di adottare stili di vita opportuni ad evitare i rischi associati all’esposizione ad inquinanti presenti nell’ambiente. L’esposizione ad acqua, aria, suolo e cibo contaminati può causare malattie ga-strointestinali e respiratorie, difetti congeniti e disordini dello svilup-po neurologico, responsabili di circa 1/6 del carico totale di patologie infantili (www.euro.who.int/parma2010).

Franca Rusconi: Le intenzioni sono quindi buone. Ma come epi-demiologo ci puoi comunicare alcuni risultati delle ricerche che da tempo state conducendo all’Istituto Superiore di Sanità, sulla salute, in Italia, nei siti inquinati?

Ivano Iavarone: In totale, in Italia 5,5 milioni di persone, compren-denti circa un milione di bambini e giovani sotto i 20 anni, risiedono nei 44 siti di interesse nazionale per le bonifiche (SIN) studiati nel progetto “Sentieri”, e tra questi circa il 60% appartengono ai gruppi socioeconomici più svantaggiati.L’Istituto Superiore di Sanità (ISS) è in prima linea sul tema della promozione della salute infantile nelle aree contaminate. Un appro-fondimento dello studio SENTIERI, coordinato dall’ISS, relativo al periodo 1995-2009 (http://www.registri-tumori.it/cms/it/Rapp2012) ha evidenziato alcune criticità per i bambini: sul totale dei 44 SIN, nel primo anno di vita, sono stati registrati eccessi del 4% e del 5% ri-spettivamente per la mortalità generale e per le condizioni morbose perinatali. In 8 dei 44 SIN (18%) la mortalità generale è in eccesso nel primo anno di vita, e in 11 SIN (25%) un eccesso di mortalità è presente in almeno una delle fasce considerate per l’età infantile (0-1 anno; 0-14 anni e 0-19 anni). L’aumento del numero di decessi tra i bambini registrato nelle 44 aree SIN è un “evento sentinella” che indica la necessità di indagini più approfondite, quali ad esem-pio l’analisi dell’incidenza dei tumori infantili. A tal riguardo, attraverso lo studio collaborativo tra ISS ed AIRTUM (Associazione Italiana dei Registri Tumori) è stato possibile avere una prima stima dell’incidenza dei tumori infantili nel complesso dei 23 SIN coperti da Registri Tumori. I dati, presentati nell’ambito della XVIII Riunione Annuale AIRTUM (Taranto, 9-11 aprile 2014 – http://www.registri-tumori.it/cms/it/node/2892) mostrano che in 10 anni (1996-2005) nei 23 SIN, ci sono stati 1127 casi di tumori maligni in età 0-24 anni, di cui 51 casi nel primo anno di vita, 451 in età pe-diatrica (0-14 anni), 234 tra gli adolescenti (15-19anni) e 442 in età giovanile (20-24 anni). I dati mostrano una distribuzione eterogenea ed è opportuno approfondire le analisi della distribuzione temporale del rischio per sede del tumore e per SIN.

Franca Rusconi: Hai citato dati riguardanti soprattutto la mortalità e l’incidenza di tu-mori infantili. Ma, per completare la tua esposizione puoi informarci anche su altri dati che state raccogliendo, che riguardano l’inciden-za di altre patologie nei bambini che abitano nei siti inquinati?

Ivano Iavarone: Il tema della salute infantile nei siti contami-nati è affrontato, per la prima volta, in modo sistematico da una proposta progettuale dell’ISS denominata “SENTIERI KIDS” (h t tp : / /www.ep ip rev. i t /pubb l i caz ione/ep idemio l -p rev-2014-38-2-suppl-1). Il Progetto propone la creazione di un osser-vatorio permanente per monitorare lo stato di salute dei bambini che risiedono nelle aree contaminate, grazie ad un gruppo di lavoro multi-istituzionale che considera una gamma di indicatori sanitari

Tavola Rotonda

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quali la mortalità, l’incidenza dei tumori, i dati dei ricoveri ospedalieri e dei certificati di assistenza al parto. Particolare attenzione viene rivolta agli aspetti della comunicazione degli elementi conoscitivi, a supporto della pianificazione di attività di prevenzione primaria e di promozione della salute dei bambini, coerentemente con gli impegni stabiliti nell’ultima Conferenza Ministeriale Europea su Ambiente e Salute per l’infanzia.Tutte queste attività vengono proposte dall’ISS, presso il quale ha sede l’unico Centro Collaborativo OMS su Ambiente e Salute nei Siti Contaminati (http://www.iss.it/chis/). Il proseguimento delle attività di monitoraggio della salute infantile nei SIN dipende però fortemen-te dalla possibilità che SENTIERI KIDS riceva finanziamenti ad hoc, cosa che purtroppo fino ad oggi non è avvenuta.Ma sono in grado, fin da ora, di anticipare alcune linee guida per l’attività futura, Innanzitutto dovrà proseguire il nostro impegno e uno studio più approfondito sull’incidenza dei tumori infantili. Dob-biamo però anche colmare deficit di informazioni riguardanti il ruolo dell’ambiente nell’insorgenza di altre malattie rare e (o) complesse, come sono ad esempio le malformazioni; dobbiamo iniziare a valu-tare, soprattutto in presenza di esposizioni a numerose sostanze di interesse tossicologico (che nei siti contaminati è spesso la regola), quali specifici contaminanti siano causa o concausa dell’aumento di rischio di determinate malattie infantili. A tal fine, è necessario approfondire le conoscenze sui meccanismi biologici alla base del-le patologie dell’infanzia e valutare adeguatamente le interazioni gene-ambiente nella formulazione di specifiche ipotesi eziologiche.Vorrei infine dire che appare necessaria (e urgente) una strategia della comunicazione e dell’informazione più tempestiva e completa. A tal riguardo, anticipo che a breve verrà pubblicata sul sito dell’Isti-tuto Superiore di Sanità una relazione che riguarda un aggiornamen-to dello studio SENTIERI per la cosiddetta “Terra dei fuochi” e per il SIN di Taranto (http://www.iss.it/pres/?lang=1&id=1432&tipo=6). Questa relazione, che è il frutto di incarichi istituzionali affidati all’ISS, presenterà un’analisi del profilo sanitario degli adulti e dei bambini che risiedono in queste aree contaminate.

Inquinamento e alterazioni del programming fetale

Ernesto BurgioComitato Scientifico ISDE (International Society of Doctors for Environment)

Fabio Sereni: Ti ringrazio Iavarone per la tua completa esposi-zione.Io credo che il messaggio finale con cui hai chiuso la tua relazione, e cioè la necessità che sia significativamente potenziata la informa-zione affinché sia possibile una prevenzione efficace, sia stato molto importante.La parola ora a Ernesto Burgio che tratterà un tema trasversale cui hanno già accennato alcuni precedenti relatori, e cioè il ruolo dell’in-quinamento sulla programmazione fetale.

Ernesto Burgio: Farò del mio meglio, nei dieci minuti che mi sono stati concessi, non sarà semplice illustrare alcune slide che ho pre-parato e che sono piuttosto complesse. In genere si dice che una slide dovrebbe essere chiara, semplice e lineare. Quelle che pro-

ietterò sono esattamente il contrario, ma sono necessarie per far comprendere il mio punto di vista.Da alcuni anni io lavoro nell’ambito di ECERI, un Istituto di ricerca sul cancro che ha sede a Bruxelles, cercando di mettere a fuoco i meccanismi patogenetici per cui l’origine di molte patologie (e in primis del cancro) dovrebbe essere cercata in modo assai diverso da come si è fatto finora.Sostanzialmente proporrò sette parole chiave (Fig. 1) necessarie a capire che stiamo vivendo una trasformazione epidemiologica di grande portata e, in larga misura, inattesa.Vorrei a questo proposito proporre alcuni dati indicativi.Secondo il CDC di Atlanta i bambini con autismo (o disturbi dello spettro autistico) sono passati negli USA da 1:1500 (anni ’70-’80) a 1:70 circa, e 1:6 bambini soffrirebbero oggi di patologie del neuro-sviluppo. Anche le malattie neurodegenerative stanno aumentando in modo drammatico e sembrerebbero riconoscere un meccanismo patogenetico per certi versi comune. A questo proposito ringra-zio Sunyer che ha citato gli studi epidemiologi condotti a Città del Messico, che hanno documentato la presenza di depositi abnormi di beta-amiloide nel lobo frontale e nell’ippocampo di giovani mor-ti per causa accidentale (quindi fondamentalmente sani) secondari all’inquinamento. (Calderón-Garcidueñas et al., Toxicol Pathol 2002; Calderón-Garcidueñas et al., Toxicol Pathol. 2007). E a conferma ri-corderei anche gli studi sperimentali condotti su scimmiette esposte a inquinamento da metalli in gravidanza, la cui prole si è ammalata di Malattia di Alzheimer (Wu et al., J Neurosci 2008). Vorrei anche ricordare i dati, molto indicativi, di aumento di inciden-za e prevalenza di obesità e diabete di tipo 2. Circa un terzo degli abitanti in USA è oggi patologicamente obeso e anche in questo caso si è passati da tassi di prevalenza del 10-12% al 35% in meno di 30 anni. E l’aumento più preoccupante riguarda anche in questo caso i bambini (Wang et al., Int J Pediatr Obes 2006).Vi è poi il capitolo dei tumori infantili. Gli studi epidemiologici sono significativi, soprattutto se letti in modo diverso e appropriato (il vecchio modello delle mutazioni stocastiche del DNA che si ac-cumulano nel tempo, evidentemente non è in grado di spiegare questi dati). Da venticinque anni a questa parte un grande studio epidemiologico condotto dalla IARC sui registri tumori di tutt’Euro-pa (69 registri di tumori in Europa per un totale di oltre 150.000 tu-mori infantili) ha documentato un aumento generale dell’incidenza dei tumori infantili dell’1% all’anno. Ma il dato più significativo è che l’incidenza dei tumori insorti nel primo anno di età è cresciuta del doppio (e in Italia addirittura del triplo) (Steliarova-Foucher E et al., Eur J Cancer 2006; Rapporto AIRTUM 2008, Epidemiologia & Prevenzione 2008) 1. Il cancro non è quindi oggi soltanto una malattia prevalente nell’an-ziano, ma sta aumentando di incidenza anche nei giovani e nei bam-bini. Inoltre si registra un incremento preoccupante di neoplasie che non erano, in precedenza, appannaggio dell’infanzia, come linfomi e rabdomiosarcomi (Burgio, Epidemiol Prev 2013). Da questi dati appare chiaro che i fattori patogenetici ambientali, da esposizione transplacentare e gametica (transgenerazionale), hanno un peso sempre maggiore nell’aumento dell’incidenza dei tumori infantili e che è sempre di più in discussione lo stesso modello do-minante di cancerogenesi tuttora basato sulla teoria dell’accumulo

1 Nota dei curatori della Tavola Rotonda: Magnani nella sua relazione cita come un aumento dell’incidenza di tumori infantili sia stato documentato nel rapporto AI-RTUM 2008 , ma non nel successivo rapporto 2012 , quando è stata documentata una diminuzione dell’incidenza.


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progressivo di mutazioni stocastiche del DNA. (Burgio & Migliore, Mol Biol Rep 2014).Nel 1997 il grande biologo molecolare Richard Strohmann ha pub-blicato, su Nature Biotechnology, un articolo che per molti di noi è stato un fulmine a ciel sereno. Ha ammonito: lo schema tradi-zionale che determina il fenotipo non può e non deve essere più considerato quello lineare DNA-RNA-PROTEINA; dovremmo cerca-re di immaginare un network molecolare molto più complesso, co-stituito da reti epigenetiche in grado di intercettare e processare le informazioni provenienti dall’esterno della cellula e di rispondere di conseguenza. Ciò significa, in ultima analisi, che l’ambiente ha un importanza fondamentale del definire il fenotipo. In altre parole il DNA non deve essere più considerato l’essenza del genoma. I meccanismi epigenetici sono i meccanismi attraverso cui le in-formazioni che vengono dall’esterno (in specie nel corso dell’on-togenesi embrio-fetale) vengono tradotte in fenotipo. Questo si-gnifica che tutte le trasformazioni stabili del nostro fenotipo, tanto in ambito fisiologico che patologico, sono indotte da informazioni provenienti dall’ambiente, modulate dall’epigenoma e condiziona-te dalla sequenza del DNA (id est: che non c’è patologia che non sia al contempo ambientale e genetica). L’epigenetica non è quindi unicamente lo studio delle modificazio-ni dell’espressione del DNA indotte da fattori esterni, come viene comunemente affermato. Ma anche e soprattutto dei meccanismi per cui si stabiliscono modificazioni stabili del genoma e quindi del fenotipo, soprattutto nel corso delle prime fasi dello sviluppo onto-genetico (Gluckman et al., Early Hum Dev 2005). Alcune di queste modifiche coinvolgono i gameti e possono esser trasmesse da una generazione all’altra (trasmissione “transgenerazionale”) (Skinner, Mol Cell Endocrinol 2014). I meccanismi epigenetici condizionano dunque profondamente l’ontogenesi: si pensi a come può essere in-fluenzata la sinaptogenesi, le cui alterazioni sembrerebbero essere all’origine dell’autismo e degli altri disturbi del neurosviluppo, che abbiamo visto in grande aumento (Lyall et al., Int J Epidemiol 2014). A questo punto potremmo addirittura affermare che il vero pro-

gramma genetico individuale è quello che si forma nei mesi della vita fetale ed è profondamente condizionato da fattori esterni, e non solo quello, dipendente dal DNA originale, formatosi al mo-mento del concepimento. In altre parole vi è il DNA, quasi iden-tico in individui diversi, prodotto nel corso della filogenesi. Ma vi è anche il programma epigenetico che si forma nei 9 mesi di vita embrio-fetale in modo attivo, reattivo, adattativo e potenzialmen-te predittivo. La gran parte delle malattie croniche, degenerative, tumorali, e anche infiammatorie, la cui incidenza sta aumentando in tutto il mondo, sono con tutta probabilità conseguenza dei pro-cessi adattativi epigenetici. O, per meglio dire, di un mismatch tra questo programma epigenetico e un ambiente che cambia troppo in fretta (Gluckman, Hanson. The conceptual basis for the deve-lopmental origins of health and disease. In: Gluckman e Hanson, ed. Developmental origins of health and disease. Cambridge: Cam-bridge University Press 2006). Non basta quindi studiare “l’esposoma”: non sono solo i fattori in-quinanti a influire sulla programmazione in utero del DNA. È vero che campi elettromagnetici o molecole inquinanti come ad esempio gli interferenti endocrini, agiscono soprattutto in questo periodo (con effetti che si vedranno solo nel medio lungo termine ed anche o so-prattutto da una generazione all’altra). Ma anche lo stress materno-fetale e la nutrizione materna svolgono un ruolo importante. Gli studi epidemiologici tradizionali, quindi, non possono che svelare la punta dell’iceberg (le patologie conseguenti a esposizione diretta a fattori epigenotossici e genotossici). Se è vero che le principali modifiche epigenetiche e programmatiche da fattori esterni avvengono nel corso della vita embrio-fetale o addirittura nei gameti, è evidente che le principali conseguenze si vedranno dopo decenni o addirittura nelle generazioni successive: secondo quella che oggi viene definita Teoria delle Origini Fetali delle Malattie dell’Adulto (Fig. 2). Ed è evi-dente che gli attuali metodi di studio e valutazione del rischio e del danno (epidemiologici e tossicologici) dovranno tenere sempre più conto di questo cambio di paradigma (Gluckman et al., Early Hum Dev 2005).

Figura 1. La transizione epidemiologica del XX secolo: dalla genetica all’epigenetica.

Tavola Rotonda

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Inquinamento e interferenti endocrini

Sergio BernasconiClinica Pediatrica, Università di Parma

Fabio Sereni: La parola ora a Sergio Bernasconi, dell’Università di Parma, a voi tutti ben noto come endocrinologo pediatra di chiara fama, che ci parlerà di un altro, recente, importantissimo capitolo relativo agli inquinanti, e cioè quello degli interferenti endocrini.Sergio Bernasconi: 2 Vorrei iniziare con la definizione di interferenti endocrini o endocrine disruptors (EDs).Il Comitato Scientifico dell’EFSA (l’Ente Europeo per la Sicurezza Ali-mentare) ha recentemente suggerito di definire EDs tutte quelle so-stanze in grado di possedere un’attività endocrina e di determinare un effetto collaterale negativo a livello di un singolo organismo sano o di una sottopopolazione di individui; inoltre è necessario che vi sia una plausibile correlazione tra questi due aspetti (EFSA Journal 2013). Gli interferenti endocrini sono ubiquitari, essendo presenti in pesti-cidi, prodotti per la pulizia della casa e per quella personale, oggetti di plastica, vernici, apparecchiature sanitarie, polveri. Attualmente

2 Con la collaborazione del dott. Roberto Caragnulo, Clinica pediatrica, Università di Parma.

sono state identificate più di 800 sostanze chimiche che possono rientrare in questa categoria ma quelle studiate sono molto poche e va inoltre ricordato che, nei soli Stati Uniti, arrivano sul mercato ogni anno oltre 2.000 prodotti chimici che, nella maggior parte dei casi, non vengono testati sul piano tossicologico. Infine molti degli EDs vengono utilizzati in paesi a basso o medio reddito, in cui spesso mancano le strutture tecniche di controllo.Ma la domanda ovvia cui devo cercare di rispondere, dopo avere sottolineato che l’aria che respiriamo, l’acqua che beviamo, e i cibi che ogni giorno mangiamo sono oggi veicolo possibile di sostanze tossiche che se assunte in certi periodi della vita possono alterare l’omeostasi endocrina, è io credo, la seguente: “Quali sono i possibili danni alla salute determinati dagli EDs, ed è possibile stabilire soglie quantitative e temporali che non devono essere superate?”.A questa domanda è difficile, oggi, dare risposte esaurienti. Non vi è infatti dubbio che i possibili danni che gli EDs possono provocare sullo stato di salute sono fonte di vivace discussione tra chi so-stiene che le evidenze epidemiologiche, cliniche e sperimentali ne dimostrino l’effetto dannoso (Bergman et al., Environmental Health 2013) e chi non le ritiene sufficientemente robuste per arrivare a delle conclusioni (Dietrich et al., Chemical-Biological Interactions 2013). Ne consegue che varie organizzazioni e società scientifiche hanno suggerito un atteggiamento per lo meno precauzionale, in modo particolare per i periodi a maggior rischio quali la gestazio-ne e l’età evolutiva (Van Den Berg, Lancet 2013) in attesa che i punti in discussione siano chiariti. Le diverse opinioni trovano una loro giustificazione in vari fattori che rendono difficile la ricerca in questo settore (Bourguignon et al., Current Opinion in Pediatrics 2010). Tra questi vanno ricordati: 1) la possibilità che gli effet-ti biologici non siano dovuti alla singola sostanza generalmente

Figura 2. Finestra temporale di suscettibilità per alcune patologie (DOHAD: Developmental Origins of Health and Disease).


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studiata ma all’azione combinata di varie sostanze che possono avere azioni agoniste e/o antagoniste; 2) la difficoltà a correlare all’esposizione pre-natale il dato clinico spesso evidente molto lontano dalla nascita; 3) il fatto che l’azione di molti EDs sia di tipo non-monotonico e che quindi debba essere studiata con approcci diversi rispetto a quelli della tossicologia classica (Vandenberg et al., Endocrine Review 2012); 4) la natura chimica della sostanza in esame e la sua metabolizzazione. Per esempio il Bisfenolo-A è moderatamente lipolitico ma viene metabolizzato dopo l’inge-stione in forma solubile in acqua e rapidamente escreto per cui

il suo dosaggio nelle urine non riflette necessariamente i livelli di esposizione cronica. Da tutto ciò consegue che nei prossimi anni è necessario intensificare le ricerche sugli EDs, utilizzando metodo-logie che tengano conto e superino i limiti delle esperienze passate (Zoellere et al., Endocrinology 2012) in modo da giungere ad una normativa ampiamente condivisa.Ma per rispondere alla domanda fondamentale che mi sono fatto, e cioè quali siano gli effetti dannosi alla salute finora dimostrati o, comunque molto possibili in base ad osservazioni cliniche, mostro una tabella riassuntiva (Tab. I) pubblicata nell’ormai lontano 2010

Tabella I. Esempi di azione su vari organi, apparati e sistemi svolta da alcuni EDs (mod. da Bourguignon et al., Current Opinion in Pediatrics 2010).

Organi o sistemi interessati Fenotipo Sistema endocrino coinvolto EDs coinvolti

Cervello Alterazioni capacità cognitive e psicomotorie

Ormoni tiroidei PCBs, BPA

Differenziazione sessuale Ipospadia, criptorchidismo, aumentata distanza ano-

genitale

Steroidi sessuali DES, Ftalati

Sistema riproduttivo

Apparato genitale femminile

Mammella

Testicolo

Prostata

Sistema neuroendocrino

Anomalie strutturali, tumori

Anomalie strutturali; telarca prematuro; tumori

Oligospermia; tumori

Tumori

Tempo della pubertà; alterazioni ovulazione;

comportamento sessuale

Steroidi sessuali DES

DES, DDT, BPA

Ftalati, PCBs

DES, BPA, PCBs

DDT, DES, PCBs

Tessuto adiposo e bilancio energetico Obesità viscerale; sindrome metabolica

PPAR-Y Steroidi sessuali

BPA

Legenda: BPA= bisfenolo; DDT= diclorodifeniltricloroetano; DES= dietilstilbestrolo; PCBs= bifenili policlorinati; PPAR-Y = peroxisome proliferator-activated receptor gamma.

Tabella II. Conosci, riduci, previeni gli interferenti endocrini. Un decalogo per il bambino (Ministero dell’Ambiente).

LIMITA O EVITA PRIVILEGIA O SOSTITUISCI

1. Evita il ristagno di aria e polvere negli ambienti chiusi dove i bambini piccoli gattonano o giocano in terra

Garantisci il ricambio di aria negli ambienti chiusi ed effettua una adeguata e periodica pulizia; assicura una corretta manutenzione degli aspirapolveri (pulizia filtri e camera di raccolta, sostituzione sacchi ove presenti)

2. Se hai pavimenti in PVC contenenti DEHP su cui giocano i bambini, utilizza un tappeto in fibra non trattata

3. Limita l’uso di capi di abbigliamento per l’infanzia con trattamenti opzionali idrore-pellenti o antimacchia

Privilegia capi di abbigliamento di origine e composizione ben identificabili

4. Evita materassi per lettini con rivestimento o telo impermeabile non conforme alle norme vigenti e comunque evita rivestimenti per materassi in PVC morbido conte-nente DEHP

5. Utilizza fodere in fibre non trattate se hai fasciatoi e/o passeggini rivestiti in PVC morbido contenente DEHP; in generale, evita che i bambini entrino in contatto con la bocca con oggetti in PVC

6. Per scaldare latte, bevande e pappe utilizza contenitori integri e solo secondo le in-dicazioni del produttore

7. Lascia che i liquidi caldi si raffreddino prima di travasarli in contenitori di plastica non destinati all’uso ad elevate temperature

8. Lava accuratamente biberon e altri contenitori dopo la sterilizzazione; non utilizzare biberon in policarbonato (non più consentiti)

9. Abitua il bambino a consumare alimenti freschi e di stagione; risciacqua frutta e ver-dura in scatola prima del consumo

10. Evita il consumo di alimenti con parti carbonizzate o bruciate Per la cottura dei cibi destinati ai bambini, privilegia metodi che preservino il contenuto di vitamine idrosolubili (ad es. cottura a vapore)

Tavola Rotonda

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da J.P. Bourguignon e AS Parent. Sono state prese in considerazione quattro sostanze chimiche molto diffuse nell’ambiente.Da questa tabella dobbiamo sicuramente partire per sollecitare comportamenti, da parte delle famiglie e della autorità sanitarie, che limitino, per quanto possibile i rischi.Il Ministero dell’Ambiente ha pubblicato una serie di raccomanda-zioni riassunte nella Tabella II, che mostro e che chiude questo mio forzatamente breve, intervento.

CONCLUSIONIFabio Sereni, Franca Rusconi, Generoso Andria

Quando abbiamo programmato di organizzare questa Tavola Roton-da, ci proponevamo di offrire una visione sufficientemente comple-ta dei notevoli progressi che sono stati compiuti negli ultimi anni nell’accertare i danni che l’inquinamento ambientale può arrecare alla salute infantile. Se questa informazione è stata trasmessa al pediatra che ha avuto la pazienza di leggere il lungo resoconto, po-tremo ritenerci soddisfatti.Si consideri che non sono passati molti anni da quando clinici, igie-nisti ed epidemiologi concentravano attenzione e ricerche quasi esclusivamente sui possibili danni che l’inquinamento poteva indur-re sulla funzione respiratoria, e anche, ma in misura molto più limi-tata, sull’incidenza di tumori e malformazioni maggiori. Gli esperti convenuti a Palermo hanno chiaramente documentato che l’inqui-namento, inteso in senso lato e quindi non solo atmosferico, può determinare effetti negativi sulla salute e sullo sviluppo del bambino che fino a poco tempo fa non erano sospettati. Si pensi ai disturbi

cognitivi sulla popolazione scolastica, che Jordi Sunyer ha ricordato, all’attenzione che va posta non solo sull’incidenza di malformazioni “maggiori”, ma anche sulla incidenza di malformazioni “minori” e soprattutto su effetti non specifici, come il basso peso neonatale e la prematurità (Pierpaolo Mastroiacovo), e ai possibili effetti negativi determinati degli interferenti endocrini, che sono stati illustrati da Sergio Bernasconi. Così come è aperto l’importantissimo capitolo delle modificazioni epigenetiche da inquinanti, su cui Ernesto Burgio ci ha intrattenuto.Certo che molta strada si deve ancora fare prima di giungere a una soddisfacente conoscenza delle effettive conseguenze dannose sul-le future generazioni dello sconsiderato aumento dell’inquinamento che ha caratterizzato il nostro pianeta nella seconda metà del secolo XX e in questo inizio del XXI secolo.Ma abbiamo oggi, come Forastiere, Iavarone e altri hanno ben do-cumentato, possibilità di monitorizzazioni molto più efficienti che nel passato, per analisi quantitative e qualitative degli agenti inquinanti, e anche per una copertura temporale più continua. Manca però un impegno sistematico e un salto qualitativo delle ricerche, come Ma-gnani, Mastroiacovo e altri hanno ben sottolineato, che contempli il possibile effetto sinergico di esposizioni multiple, il danno prenatale o anche trasmesso geneticamente da padre o madre esposti.Per concludere una considerazione molto generale. A noi sembra che il significato ultimo e più importante di questa Tavola Rotonda non possa non essere che un urgente monito alla politica. Per pro-teggere la salute infantile non è più sufficiente una visione di politica sanitaria solo o prevalentemente medica. La visione deve essere allargata, significativamente, con interventi radicali per prevenire i danni che l’inquinamento non solo atmosferico può arrecare alla salute del bambino.

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Ottobre-Dicembre 2014 • Vol. 44 • N. 176 • Pp. 267 tavola rotonda

tavola rotonda di “prospettive in pediatria”

Facoltà di Biotecnologie dell’Università Federico IIAula Magna

Via T. De Amicis, 95 - Napoli

23 gennaio 201511.00-14.00

Programmi di screening neonatale per malattie metaboliche ereditarie

Moderatori: Generoso Andria (Napoli), Fabio Sereni (Milano)

I programmi in atto in Europa e in Italia DomenicaTaruscio (Roma) Le evidenze scientifiche per le scelte politiche Carlo Dionisi Vici (Roma)

I provvedimenti legislativi italiani Serena Battilomo (Roma)

Il punto di vista della sanità pubblica e delle regioni Paola Facchin (Padova) Il follow-up e la presa in carico dei pazienti Maria Alice Donati (Firenze) Il punto di vista delle Associazioni e dell’opinione pubblica Manuela Vaccarotto (Padova)

Aspetti etici Sara Casati (Roma)

La Tavola Rotonda di Prospettive in Pediatria apre il Corso di formazione per pediatri:

L’assistenza pediatrica per le malattie rare: il modello delle sindromi genetiche e delle malattie metaboliche ereditarie

organizzato dal Centro di Coordinamento Malattie Rare - Regione Campania.

Per informazioni sul Corso di formazione (Napoli, 23-24 gennaio 2015) rivolgersi a: Center Comunicazione e Congressi srlVia Gaetano Quagliariello, 27 80131 NapoliTel: 08119578490 - Fax: [email protected] - www.centercongressi.it

Finito di stampare nel mese di Dicembre 2014presso le Industrie Grafiche della Pacini Editore S.p.A.

Via A. Gherardesca • 56121 Ospedaletto • PisaTelefono 050 313011 • Telefax 050 3130300

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